CN108137661A - 用于在乳腺癌患者中预测他莫昔芬响应的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了对BQ323636.1特异性的单克隆抗体，和其用于在乳腺癌患者中预测他莫昔芬耐药性的用途。

Description

用于在乳腺癌患者中预测他莫昔芬响应的单克隆抗体
发明背景
乳腺癌是世界上最常见类型的影响女性的恶性肿瘤。在乳腺癌的情况下，雌激素受体(ER)信号传导途径是基本的促增殖途径。在其通过与雌激素结合而活化时，ER直接通过其基因组途径或间接通过非-基因组途径(包括PI3K/AKT途径)，激活靶基因转录和细胞生长。
约70%的乳腺癌患者表达雌激素受体α (ERα)，可用内分泌疗法治疗。他莫昔芬是在乳腺的背景下作为雌激素的拮抗剂起作用的选择性雌激素受体调节剂(SERM)，并且是对ER+患者最通常处方的抗-雌激素药物以预防乳腺癌复发或转移。他莫昔芬与ER结合触发核协阻抑物2 (NCOR2，亦称为SMRT)以及其它协阻抑物例如GPS2、TBLR1、HDAC3等的募集，和抑制促增殖ER信号传导途径(Sharma, Saxena et al. 2006, Zhang, Chang et al. 2006,Cheng和Kao 2009)。尽管他莫昔芬在预防疾病复发和改善患者存活中相对安全和显著的抗肿瘤活性，但耐药性是一个突出的问题，具有高达50%的无响应患者，并且许多初始响应者经历复发(Ring和Dowsett 2004)。
已广泛研究了成为他莫昔芬耐药性的原因的机制，但仍未充分理解。耐药性可能起因于提及的一个或多个因素：(a) 异常的他莫昔芬代谢，其影响其生物利用度；(b) 生长因子受体途径和它们的下游靶标的失调；(c) 共调节剂的表达/功能改变；(d) 雌激素受体表达或功能的丧失；等等。
尚没有可用的稳健生物标志物来预测乳腺癌患者对他莫昔芬治疗的响应。因此，几乎所有阳性ERα状态的患者将被处方他莫昔芬。一些患者对该药物有耐药性，但在临床医生意识到该药物无效时，癌症已经扩散和转移。
在2006年，美国食品和药品管理局(FDA)建议在他莫昔芬的标签上包括关于CYP2D6基因型和它们对患者结果的潜在影响的信息，但没有达成关于基因分型是否应被要求或考虑为非强制的共识(de Souza和Olopade 2011)。从那时起，已经公开了解决CYP2D6和他莫昔芬耐药性之间的关系的更多临床研究，但结果不一致和相矛盾。CYP2D6是催化他莫昔芬的4-羟基化的代谢酶(Dehal和Kupfer 1997, Coller, Krebsfaenger et al.2002)。在死亡率方面，一些研究表明CYP2D6基因型与较短的无复发存活期和无疾病存活期有关，而其它研究不能发现这样的联系(Dezentje, Guchelaar et al. 2009, Hoskins,Carey et al. 2009)。另外14个研究报道了CYP2D6和疾病复发之间的联系，但它们大多数没有发现统计学显著关系。因此，没有足够可靠的数据来证明对于乳腺癌的辅助疗法实现个体CYP2D6基因分型，和仍有疑问CYP2D6是否可用作预测他莫昔芬耐药性的稳健的生物标志物。
发明简述
本发明总体上涉及对NCOR2的剪接变体(称为BQ323636.1，BQ323636.1具有SEQ ID NO:1的序列)特异性的单克隆抗体、和其作为雌激素受体阳性乳腺癌患者的他莫昔芬响应的预测物的用途。
在一个方面，本发明提供了结合NCOR2的剪接变体的抗体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。剪接变体具有SEQ ID NO: 1的序列。
在一些实施方案中，抗体结合具有QRTWRSRCASWP (SEQ ID NO: 2)的序列的NCOR2的表位。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是选自Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') 2、Fv、双抗体、单链抗体片段或包含多个不同的抗体片段的多特异性抗体的抗体片段。在一些实施方案中，抗体缀合或共价结合至可检测部分。
在另一方面，本发明提供了通过嵌合或人源化结合NCOR2的剪接变体的抗体获得的抗体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。
在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包含结合NCOR2的剪接变体的抗体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物，任选地进一步包含特异性识别任何上述权利要求的抗体的标记的第二抗体。
在另一方面，本发明提供了产生结合NCOR2的剪接变体的抗体的杂交瘤或重组宿主细胞，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。
在另一方面，本发明提供了测定癌症患者的他莫昔芬耐药性的方法，包括：
(a) 从受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中NCOR2的剪接变体的表达水平，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照中的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明癌症是他莫昔芬耐药性的。在一些实施方案中，剪接变体具有SEQ ID NO: 1的序列。
在一些实施方案中，本发明的方法的比较步骤包括使样品与特异性识别具有SEQID NO: 2的序列的NCOR2的表位的抗体接触；和检测抗体和NCOR2的剪接变体之间的复合物。在一些实施方案中，在免疫测定法中NCOR2的剪接变体与特异性识别NCOR2的剪接变体的抗体接触，所述免疫测定法选自放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法和狭线印迹测定法。
在另一方面，本发明提供了测定他莫昔芬-治疗的受试者是否处于癌症复发的风险中或处于转移的风险中的方法，包括：
(a) 从受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中具有SEQ ID NO: 1的序列的NCOR2的剪接变体的表达水平，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照中的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明受试者处于癌症复发的风险中，或处于转移的风险中。
在提供的方法的一些实施方案中，受试者是人。在提供的方法的一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
附图简述
图1 (A)显示BQ323636.1的全长肽序列(SEQ ID NO: 1)，用红色突出显示了BQ323636.1-特异性单克隆抗体的表位(SEQ ID NO: 2)。图1 (B)显示具有用ELISA选择的最高效价的抗原特异性抗体产生的四个克隆(C1、D12、G4、H8)的图表，所述ELISA经应用以评价抗原-抗体特异性结合。
图2显示在(A) 蛋白质印迹、(B) 免疫沉淀、(C) 免疫荧光染色和(D) 免疫组织化学染色的应用中测试的抗-BQ323636.1抗体的四个克隆。在测试的四个克隆中，D12和G4显示最佳性能。
图3表明(A) 在他莫昔芬耐药性细胞系AK47和LCC2中BQ323636.1以较高水平表达，和(B) BQ323636.1的异常过表达诱导他莫昔芬耐药性。
图4表明BQ323636.1过表达在体内赋予对他莫昔芬的耐药性。(A) 对照细胞系ZR75-载体和MCF7-载体，初始是他莫昔芬敏感的，对他莫昔芬治疗响应良好。(B) 两个BQ323636.1过表达细胞系ZR75-BQ32363.61和MCF7-BQ323636.1，对他莫昔芬治疗有耐药性，因为在治疗和对照组之间比较，没有肿瘤生长变化。
图5表明在从存档乳腺癌患者的石蜡块的355个病例构建的组织微阵列上，使用免疫组织化学染色，对于他莫昔芬耐药性，BQ323636.1的预测值。对于已接受他莫昔芬治疗的患者，(A) 通过卡方检验(p=3.90 x 10-6)，核BQ323636.1过表达与他莫昔芬耐药性(定义为接受他莫昔芬治疗并随后发生疾病复发或转移的患者)显著相关。(B) 在后来发现是他莫昔芬耐药性的患者中核BQ323636.1显著更高(Mann-Whitney U秩检验, p=4.02 x 10-6)。
图6显示，(A) 核BQ323636.1过表达与疾病复发显著相关(卡方检验, p=3.47 x10-4)；(B) 在后来发生疾病复发的患者中核BQ323636.1显著更高(Mann-Whitney U秩检验,p=3.54 x 10-4)。
图7显示，(A) 核BQ323636.1过表达与癌症转移显著相关(卡方检验, p=1.72 x10-6)；(B) 在后来发生转移的患者中核BQ323636.1显著更高(Mann-Whitney U秩检验, p=1.78 x 10-6)。
图8表明通过Kaplan-Meier评估，使用免疫组织化学染色作为预后标志物的BQ323636.1的值。(A) 各临床参数的样品分布。(B) 核BQ323636.1过表达与较差的总体存活显著相关(时序检验, p=6.28 x 10-5)。(C) 核BQ323636.1过表达与较差的疾病特异性存活显著相关(时序检验, p=1.31 x 10-4)。
图9表明通过cox-回归分析，使用免疫组织化学染色作为预后标志物的BQ323636.1的值。(A) 在单变量分析上，核BQ323636.1过表达与较差的总体存活显著相关(风险比率= 1.842, p=0.000)，其在多变量分析上仍然显著(风险比率= 2.41, p=0.000)。(B) 在单变量分析上，核BQ323636.1过表达与较差的疾病特异性存活显著相关(风险比率=2.10, p=0.000)，其在多变量分析上也仍然显著(风险比率= 3.2, p=0.000)。
图10显示通过基于慢病毒的系统产生的稳定过表达BQ323636.1 ((A) ZR75-BQ323636.1和(B) MCF7-BQ323636.1)的细胞系。转染效率通过GFP信号监测。BQ323636.1的过表达进一步通过蛋白质印迹和qPCR证实。
图11显示Ig可变结构域引物的数个组合的PCR结果。
图12显示本发明的单克隆抗体的VH氨基酸序列比对。
图13显示本发明的单克隆抗体的VL氨基酸序列比对。
图14显示本发明的单克隆抗体的重链的CDR环的图示。
图15显示本发明的单克隆抗体的轻链的CDR环的图示。
序列简述
SEQ ID NO: 1是BQ323636.1，NCOR2的剪接变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2是本发明的抗体结合的BQ323636.1，NCOR2的剪接变体的区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3是本发明的单克隆抗体的VH共有氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4是VH2.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5是VH2.2的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6是VH2.3的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 7是VH2.5的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 8是VH2.6的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 9是VH2.1的核酸序列。
SEQ ID NO: 10是VH2.2的核酸序列。
SEQ ID NO: 11是VH2.3的核酸序列。
SEQ ID NO: 12是VH2.5的核酸序列。
SEQ ID NO: 13是VH2.6的核酸序列。
SEQ ID NO: 14是VK2.1的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15是VK2.2的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 16是VK2(2).2的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17是VK2(2).3的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 18是VK2(2).5的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 19是VK2(2).6的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 20是VK2.1的核酸序列。
SEQ ID NO: 21是VK2.2的核酸序列。
SEQ ID NO: 22是VK2(2).2的核酸序列。
SEQ ID NO: 23是VK2(2).3的核酸序列。
SEQ ID NO: 24是VK2(2).5的核酸序列。
SEQ ID NO: 25是VK2(2).6的核酸序列。
SEQ ID NO: 26是本发明的单克隆抗体的VL共有氨基酸序列。
发明详述
根据37 CFR 1.14和35 U.S.C. 122，在确保在本专利申请待审期间对于由对其授权的专利和商标局确定的人而言获得培养物将是可行的条件下，已将细胞培养物D12保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures)。该保藏被指定为保藏号DSM ACC3272和将是可利用的，如在其中提交本申请的对应申请或其后续申请的国家中外国专利法所要求的。然而应理解，保藏的可用性不构成在减损由政府行为授予的专利权的情况下实施本发明的许可。
此外，根据微生物保藏的布达佩斯条约的规定，本保藏物将被贮存并且对公众可利用，即，使其存活和不受污染持续在最近要求提供保藏的样品后至少5年的时间，和在任何情况下，在保藏日之后至少30年的时间或公开该培养物的任何可授权专利的可实施期限的所有必要措施下将其贮存。当需要时，如果保藏中心由于保藏条件导致不能够提供样品，保藏者有责任替换保藏物。关于本培养物保藏的公众可用性的所有限制，将在公开它的专利授权后不能撤回地被移除。
申请人之前已经鉴定了NCOR2的剪接变体(NCOR2亦称为SMRT)，称为BQ323636.1，其与乳腺癌的他莫昔芬耐药性有关(Zhang L, Gong C, et al, 2013)。BQ323636.1剪接变体的特征为在mRNA剪接期间跳跃的外显子11，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物，与其野生型相比仅保留N-末端片段(Zhang, Gong et al. 2013)。
本发明提供了对于BQ323636.1特异性的抗体。本发明还提供了包括使用单克隆BQ323636.1抗体来预测患者对他莫昔芬治疗的响应的方法。开发这样的可靠生物标志物使得在早期阶段将合适的替代疗法给予乳腺癌患者成为可能，而不遭受不需要的他莫昔芬副作用。预测哪些患者将对他莫昔芬有响应和哪些患者没有响应，提供了提供正确的早期治疗以改善疾病结果的有利能力。
在一个方面，本发明提供了结合具有SEQ ID NO: 1的序列的NCOR2的剪接变体的抗体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。
在一些实施方案中，抗体结合具有SEQ ID NO: 2的序列的NCOR2的表位。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是选自Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') 2、Fv、双抗体、单链抗体片段或包含多个不同的抗体片段的多特异性抗体的抗体片段。在一些实施方案中，抗体缀合或共价结合至可检测部分。
在另一方面，本发明提供了通过嵌合或人源化结合NCOR2的剪接变体的抗体获得的抗体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。在一些实施方案中，剪接变体具有SEQ ID NO: 1的序列。在一些实施方案中，抗体结合具有SEQ ID NO: 2的序列的NCOR2剪接变体上的表位。
术语"抗体"可与术语“免疫球蛋白”互换使用，和在本文定义为在响应抗原或免疫原时由动物或免疫系统的细胞合成的蛋白。本文使用的术语抗体还指其片段。抗体的特征为对抗原上称为"抗原决定簇"或"表位"的位点的特异性亲和力。抗原可以是天然存在的或人工改造的。本发明使用的免疫球蛋白分子可具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类的免疫球蛋白分子。
抗体可包括多克隆或单克隆抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，还包括所述免疫球蛋白分子的片段或聚合物，和人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要该分子保持结合NCOR2剪接变体的表位的能力。可使用本文所述的体外测定法，或通过类似方法，测试抗体的所需活性，之后可根据已知的临床测试方法证实和量化体内治疗和/或诊断活性。
本发明使用的抗体包括所有物种，和抗原靶标可来自任何物种。最优选地，抗体是人抗原-结合抗体，和其片段，和包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fvs (scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs (sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原-结合抗体片段，包括单链抗体，可仅包含可变区，或可变区与铰链区、CH1、CH2和/或CH3结构域的整体或部分的组合。单链抗体经过氨基酸桥通过连接Fv区的重链和轻链片段形成，产生单链多肽。本发明还包括包含可变区与铰链区、CH1、CH2和/或CH3结构域的任何组合的抗原-结合片段。
本发明可使用的抗体和适体可通过本领域已知的任何合适的方法产生。单克隆抗体可使用本领域已知的任何技术制备，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术，或其组合。本文使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。该术语是指源自单一克隆的任何抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生其的方法。使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规和众所周知的。类似地，产生和筛选特异性适体的方法是本领域常规和众所周知的。
在一些情况下，在本发明中可能需要使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分源自不同的动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的，和可包括剪接来自具有合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因以及来自具有合适的生物学活性的人抗体分子的基因。人源化抗体是结合所需抗原的来自非-人物种抗体的抗体分子，其具有来自非-人物种的一个或多个互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。对于人患者的治疗性治疗，完全人抗体可能是需要的。人抗体可通过本领域已知的各种方法制备。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有SEQ ID NO: 3的VH氨基酸序列和/或SEQID NO: 26的VL氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供试剂盒，其包含结合NCOR2的剪接变体的抗体或适体，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物，任选地进一步包含特异性识别抗-变体-NCOR2抗体或适体的标记的第二抗体或适体。剪接变体包含SEQ ID NO: 1的序列。
在另一方面，本发明提供了产生结合NCOR2的剪接变体的抗体的杂交瘤或重组宿主细胞，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。剪接变体包含SEQ ID NO: 1的序列。
在另一方面，本发明提供了测定癌症受试者的他莫昔芬耐药性的方法，包括：
(a) 从受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中NCOR2的剪接变体的表达水平，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照中的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明癌症是他莫昔芬耐药性的。在一些实施方案中，剪接变体具有SEQ ID NO: 1的序列。
在一些实施方案中，本发明的方法比较步骤包括使样品与特异性识别具有SEQ IDNO: 2的序列的NCOR2的表位的抗体或适体接触；和检测抗体或适体和NCOR2的剪接变体之间的复合物。在一些实施方案中，在免疫测定法中NCOR2的剪接变体与特异性识别NCOR2的剪接变体的抗体接触，所述免疫测定法选自放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法和狭线印迹测定法。
在另一方面，本发明提供了测定他莫昔芬-治疗的受试者是否处于癌症复发的风险中或处于转移的风险中的方法，包括：
(a) 从受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中具有SEQ ID NO: 1的序列的NCOR2的剪接变体的表达水平，其中剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明受试者处于癌症复发的风险中，或处于转移的风险中。
在提供的方法的一些实施方案中，受试者是人。在提供的方法的一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
本发明特别可使用的抗体或其抗体片段和适体特异性结合包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的表位。
无需进一步详细描述，认为使用前文的描述，本领域技术人员可最大程度地利用本发明。以举例说明的方式而不是以限制的方式，提供以下实施例。尽管已提供了特定的实施例，但上文的描述是说明性的而不是限制性的。前文描述的实施方案的任何一个或多个特征可以任何方式与本发明的任何其它实施方案的一个或多个特征组合。此外，本领域技术人员在阅读本说明书后，本发明的许多变化将变得显而易见。
本申请中引用的所有出版物和专利文件通过在相关部分中引用结合到本文中，为所有目的，至如同这样的各个出版物或专利文件被如此单独指示一样的相同程度。在本文件中通过引用各个参考文献，申请人并非承认任何特定的参考文献是其发明的"现有技术"。
实施例
本文描述的方法、抗体和试剂盒在以下实施例中进一步说明，其通过举例说明的方式提供和不意图是限制性的。将理解，显示的组分的要素的比例变化和替代方案对本领域技术人员而言将是显而易见的，和在本发明的实施方案的范围内。提供理论方面，并且应理解申请人不试图受限于提供的理论。所有份数或量，除非另外指明，为按重量计。
以下材料和方法用于本文例举的所有方法、抗体和试剂盒。
细胞系 - 人乳腺癌细胞系MCF7和ZR-75-1购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)和通过短串联重复序列分析重新验证(Zhang,Gong et al. 2013)。MCF7在补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的Dulbecco’s ModifiedEagle's Medium中培养，和ZR-75-1在补充有5% FBS和1%青霉素/链霉素的ImprovedMinimum Essential Medium (IMEM)中培养。LCC2和AK-47是分别源自MCF7和ZR-75-1的两个他莫昔芬耐药性的细胞系，由Dr. Robert Clarke (Georgetown University MedicalSchool, Washington, D.C.)友好提供(Wong, Dai et al. 2006)，并且已在我们之前的研究中使用(Zhang, Gong et al. 2013)。LCC2和AK-47均在补充有5%活性炭解吸的FBS和1%青霉素/链霉素的IMEM中培养。本研究中使用的所有细胞系已被传代，和在重新验证或融化后保持少于6个月。
用于产生稳定细胞系的慢病毒转染–对于慢病毒生产，早期传代的293FT细胞以5×105个细胞/孔接种到6-孔板中两天，然后转染。将细胞生长至80-90%汇合，以进行转染。重组体慢病毒通过用慢病毒表达质粒和包装质粒使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)共转染293FT细胞产生。10µl的Lipofectamine 2000试剂在250μl基础培养基(plainmedium)中稀释，和在室温下孵育5分钟。将1µg的慢病毒表达质粒和2.6μl pPACK包装质粒混合物(System Biosciences)加入含稀释的Lipofectamine 2000试剂的培养基。当将其在室温下进一步孵育15分钟时，替换新鲜的完全培养基。20分钟孵育后，将DNA-Lipofectamine复合物加入细胞和孵育过夜。第二天，弃去含复合物的培养基和加入1ml含30% (v/v) FBS的新鲜培养基。在转染后48小时，收获培养基，和在室温下以2000rpm离心5分钟以除去细胞碎片。保留病毒上清液和在-80℃下贮存备用。待转染的目标细胞以3-5×105 /孔接种至6-孔板24-48小时，然后病毒转染。转导当日，除去培养基，和用1ml含终浓度12μg/ml的Polybrene (Sigma)的新鲜完全培养基替换。目标细胞通过加入200μl-800μl制备的病毒上清液感染。24小时后，弃去培养基和用1ml不含Polybrene的完全培养基替换。感染的目标细胞可在感染后通过加入含0.5-1ug/ml嘌呤霉素(Sigma)的完全培养基3-7天进行选择。3–4天后，通过荧光显微术检查GFP表达。
MTT测定法–以密度6x103个细胞/孔接种细胞。在进行MTT测定法当日，用含10%MTT (USB, Affymetrix, 贮液浓度为5 mg/mL)的培养基在37℃孵育细胞4小时。孵育后，弃去培养基，和用100 mL含4 mmol/L HCl和0.1% NP-40的异丙醇替换，以溶解紫色沉淀物。通过Infinite 200微量滴定板阅读器(Tecan)在570 nm测量样品的消光，参考波长为750 nm。从样品减去背景MTT读出。
免疫沉淀法–将细胞在IP裂解缓冲液(0.025M Tris, 0.15M NaCl, 0.001M EDTA,1% NP-40, 5%甘油, pH 7.4)中裂解，和用30µl的Dynabeads蛋白A/G (对于兔抗体为A，对于小鼠抗体为G，Invitrogen, Life Technologies, UK)通过在4℃旋转4小时预澄清。预澄清后，测量蛋白浓度和将裂解物分为相等量的蛋白/管，和用特异性的第一抗体或IgG阴性对照(稀释度1:200)在4℃孵育过夜，同时轻轻转动。第二天，将40μl的珠加入混合物和在4℃孵育另外4 h。孵育后，将珠用冷的PBS洗涤5次，和在100℃煮沸5分钟，以洗脱蛋白。蛋白通过SDS–PAGE凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜和用与蛋白质印迹相同的抗体杂交。
免疫荧光染色–简言之，在-20oC下细胞用50: 50甲醇:丙酮(Millipore,Germany/ Merck, UK)固定10分钟。样品然后用我们已经产生的第一小鼠抗-BQ (克隆D12)孵育过夜。用PBS洗涤后，在37oC恒温箱内将第二山羊抗-小鼠IgG-FITC (1:2000, Lifetechnologies, US)加入样品1小时。用含DAPI (Life technologies, US)的封固剂固定细胞。使用Carl Zeiss LSM 710共焦激光扫描显微镜和软件Windows Vista, ZEN 2011版本5.5 SP1捕获图像和定量。
同位小鼠模型–将以比率1:1与Matrigel (BD Biosciences)混合的细胞系接种至5-6周龄雌性裸小鼠的腹部乳房脂肪垫。当肿瘤可触摸到时，将小鼠随机分至治疗组和对照组，其中治疗组接受每日皮下注射溶于花生油(Sigma)的他莫昔芬(Sigma)和对照组仅接受皮下注射溶剂。肿瘤大小通过卡尺测量，和肿瘤体积计算为(长度*宽度*宽度)/2。肿瘤生长速率表示为肿瘤体积变化的%，其按在指定时间点测量的肿瘤体积(针对第0天的肿瘤体积标准化)*100%计算。该方案已被Committee on the Use of Live Animals in Teachingand Research (CULATR), the University of Hong Kong (CULATR No.:3259-14 )审核和批准。
组织微阵列–在1992-2001年诊断的具有临床随访数据的236个乳腺癌病例从香港玛丽医院病理学系(Department of Pathology, Queen Mary Hospital of Hong Kong)的记录中追溯，其获得了香港大学机构审查委员会(Institutional Review Board of TheUniversity of Hong Kong) (UW 06-379 T/1404)的批准。所有病例的组织学切片由病理学家检查，选择代表性的石蜡肿瘤块作为各病例的供体块，和为构建组织微阵列(TMA)块标记选择的区域。总共206个病例可被评价和对于BQ323636.1染色进行评分。其中93个接受他莫昔芬治疗并且是ER阳性的。
我们进一步募集由来自Nottingham University Hospital的我们的合作者提供的TMA切片用于分析。这由一大组患者组成，其包含来自招募至Nottingham TenovusPrimary Breast Carcinoma Series的患者(年龄≤70岁)的充分表征的连续系列的早期阶段(TNM阶段I-III，不包括T3和T4肿瘤)散发原发性手术侵入性乳腺癌，其在1989和1998之间在Nottingham City Hospital提供和按照统一方案管理。该研究由NottinghamResearch Ethics Committee 2在题目‘Development of a molecular geneticclassification of breast cancer(乳腺癌的分子遗传分类的开发)’下批准。使用的TMA切片包括具有超过20年的病理学和临床随访数据的1129个乳腺癌患者。总共679个病例可被评价和对于BQ323636.1染色进行评分。其中262个已接受他莫昔芬治疗并且是ER阳性的。
因此，来自香港和UK的总共355个他莫昔芬治疗的ER阳性乳腺癌病例用于统计学分析。
免疫组织化学–TMA切片通过用二甲苯和递降浓度的乙醇孵育而脱石蜡和再水合。柠檬酸盐缓冲液(0.01M, pH 6.0)用于抗原恢复。在室温下将玻片浸入3% H2O2/甲醇10分钟以淬灭内源性过氧化物酶。在0.05% Tween/PBS (PBST)中漂洗两次后，将以1:50稀释的BQ323636.1特异性抗体加入至各切片，和在4°C孵育过夜。然后将玻片在PBST中洗涤，和用DAKO EnVision+System-HRP-标记的聚合物抗-兔在室温下在暗处孵育30分钟。洗涤后，将色原体DAB/底物试剂加入玻片上，和将玻片孵育另外6分钟。最后，将玻片脱水和固定。Aperio ScanScope ®系统(Aperio technology, USA)用于可视化和评价BQ323636.1表达。TMA玻片通过ScanScope扫描仪扫描，和各个染色的TMA斑点在计算机屏幕上使用Aperio的图像阅读器ImageScope评价。为了避免评价的主观性，染色的强度和百分比通过两个独立的个体以半定量的方式评分，如之前所述，和采取平均值。BQ323636.1表达水平根据H-评分系统评分，其考虑了染色强度和各强度的百分比(Detre, Saclani Jotti et al.1995)。H评分= (1 × 在强度类型1染色的细胞的%) + (2 × 在强度类型2染色的细胞的%) + (3 × 在强度类型3染色的细胞的%)。截止值设定为评分的中值，其为130。
统计学分析–统计学分析使用SPSS (IBM, 版本17)进行。来自MTT测定法和小鼠模型的结果通过students’ t-检验比较。剪接变体BQ323636.1的表达水平和患者的他莫昔芬反应性之间的相关性通过卡方检验分析。BQ323636.1的表达水平在不同组之间使用Mann-Whiney U秩检验比较。存活分析通过Kaplan–Meier评估和Cox回归模型进行。小于0.05的P值被视为统计学显著的。
实施例1：对BQ323636.1特异性的单克隆抗体的产生
本发明涉及小鼠单克隆抗体的产生，将其表位(QRTWRSRCASWP) (SEQ ID NO: 2)作图至BQ323636.1蛋白的最后11个氨基酸(图1A)，这是区别BQ323636.1与其野生型NCOR2/SMRT的序列。下文描述了详细方案。
免疫原：肽3781.1 Biosyntan GmbH QRTWRSRCASWP-OH
肽-BSA-缀合物(BSA: Fraction V, Pierce; Cross-Linker: Sulfo-MBS, Pierce)
宿主：8周龄雌性BALB/c小鼠
免疫程序：
在最后的加强剂量之前使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，用未偶联的肽3781作为固定抗原，在受体的血清中检测所需抗体的存在。对于融合实验，使用小鼠42。
融合日期：04.10.2013 融合号：577
亲本细胞融合系：SP2/0 (非分泌小鼠骨髓瘤)
融合方法：融合前两天，制备小鼠(Balb/c)腹膜巨噬细胞用作饲养细胞，和接种至4个96-孔细胞培养板的孔中。对于融合程序，将来自免疫的小鼠的6 x 107个脾细胞和来自小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的2 x 107个细胞与1.2ml的聚乙二醇1450 (50% / 10% DMSO;Sigma)在37°C一起孵育30秒。洗涤后，将细胞接种至所述4个96-孔细胞培养板。通过在补充有20%胎牛血清(PAN)和HATSupplement (50x; PAN)]的HAT培养基[RPMI 1640培养基(Biochrom)中生长选择杂合克隆。两周后，HAT培养基被替换为HT培养基，持续三次传代，接着回到正常细胞培养基。
筛选/克隆/再克隆：融合后两周，初步筛选细胞培养上清液中的抗原特异性IgG抗体。在培养上清液中抗原特异性抗体的存在通过其与直接连接至96-孔微量滴定板的孔(100ng/孔)的未偶联的肽3781的结合来测量。抗体结合通过以下来定量：加入与酶结合的相关的抗-物种免疫球蛋白，接着加入该酶的发色底物。新鲜培养基和多克隆小鼠抗血清的稀释液用作阴性对照或阳性对照。发现12个产生特异性抗体的杂交瘤集落是高度阳性的。将选择的12个细胞群转移至24-孔板用于细胞增殖，然后再次测试。选择具有最高抗体效价的4个细胞群用于使用有限稀释技术进行克隆和再克隆。产生特异性单克隆抗体的4个细胞系被表征和冷冻。对于同种型表征，使用小鼠单克隆抗体同种分型试剂盒(MouseMonoclonal Antibody Isotyping Kit, Roche)。
细胞培养基：RPMI 1640培养基[(1x), w 2.0 g/l NaHCO3, 含稳定的谷氨酰胺(Biochrom AG; Catalog No.: FG 1415)]，含20% FCS (PAN Biotech GmbH; Cat.-No.:1302-P283004; Lot No.: P283004; Origin: Australia)；庆大霉素(PAA LaboratoriesGmbH; Best.-Nr. P11-004; 50μg/ml)
最佳生长：在37°C温度和5% CO2
细胞贮存/冷冻：大约3 x 106个细胞/750μl新鲜细胞培养基被吸取到冷冻管中。加入750μl的冷冻培养基(80% FCS和20% DMSO (PAN))。使用Nalgene Cryo FreezingContainer，将冷冻管立即置于-80°C冰箱中和在24小时内转移至液氮中用于长期贮存。
细胞贮存/解冻：在37°C水浴中将冷冻管尽可能快速地融化。用10ml冷的培养基稀释细胞和以1000 rpm离心10分钟。然后，将沉淀重悬于细胞培养基中并转移至25ml细胞培养瓶。
支原体测试：使用ELISA试剂盒(Mycoplasma detection Kit (支原体检测试剂 盒); Roche Diagnostics GmbH)测试细胞培养上清液中的支原体
实施例2：4个最终克隆的分泌的抗体的反应性：ELISA
将细胞培养上清液与已通过直接吸附结合未偶联的肽3781的固相一起孵育。在测定期间，任何特异性抗体将自身结合至固相上的抗原，然后在第二次孵育中用标记的抗-物种抗体检测。
包被：100ng/孔(孔=50μl)的肽3781 (在PBS中稀释)在4°C过夜；用洗涤缓冲液(PBS/0.05% Tween20)洗涤板两次。封闭：100μl/孔封闭溶液(PBS/0.05% Tween20/10%NCS)在RT下1h；
用洗涤缓冲液洗涤板两次。孵育：在孵育缓冲液(PBS/0.05%; Tween20/10%NCS)中连续稀释的50μl/孔的细胞培养上清液，在RT下2h；用洗涤缓冲液洗涤板三次。缀合：50μl/孔HRP-兔抗小鼠IgG；(Fc特异性；Pierce; 在孵育缓冲液中稀释)在RT下1h；用洗涤缓冲液洗涤板三次。底物：50μl/孔酶底物(OPD/柠檬酸盐-磷酸氢盐缓冲液)在RT下15分钟。终止：50μl/孔终止溶液。测量：测量490nm的吸光度。
底物：3,7mM o-苯二胺/柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液，0,012% H2O2柠檬酸盐/磷酸氢盐缓冲液：35mM柠檬酸一水合物、85mM Na2HPO4 x 2H2O, pH 5,0 终止溶液：4N 硫酸(Schwefelsäure)。洗涤缓冲液：PBS/0.05% Tween20。
选择具有最高效价的抗原特异性抗体产生的4个克隆(C1, D12, G4, H8)，和应用ELISA以评价抗原-抗体特异性结合(图1B)。
实施例3：用常用的生物医学研究方法测试抗-BQ323636.1抗体
抗-BQ323636.1的四个克隆在蛋白质印迹(图2A)、免疫沉淀(图2B)、免疫荧光染色(图2C)和免疫组织化学染色(图2D)的应用中测试。在蛋白质印迹中，该BQ323636.1在略微低于50kDa的分子量处检出特异性条带(预测分子量为42.65kDa，抗体稀释度1:1000)。通过克隆G4和D12的免疫沉淀表明略微低于50kDa的分子量的蛋白的富集。免疫荧光染色(抗体稀释度1:50)表明BQ323636.1在细胞质和细胞核中表达，与使用乳腺癌患者样品的免疫组织化学染色一致(抗体稀释度1:50)。
实施例4：BQ323636.1过表达在体外和体内造成他莫昔芬耐药性
使用抗-BQ323636.1抗体的蛋白质印迹表明，在蛋白水平上，分别与它们的亲本他莫昔芬敏感性细胞系MCF7和ZR75相比，在衍生的他莫昔芬耐药性细胞系LCC2和AK47中BQ323636.1以更高水平表达(图3A)。使用基于慢病毒的系统，我们产生了稳定过表达BQ323636.1 (ZR75-BQ323636.1和MCF7-BQ323636.1)的细胞系(图10)和用空载体转染的细胞系用作对照(ZR75-载体和MCF7-载体)。MTT测定表明BQ323636.1过表达诱导他莫昔芬耐药性，如图3B所示。
使用裸小鼠模型，我们进一步验证了BQ323636.1过表达在产生他莫昔芬耐药性中的影响。将以比率1:1与Matrigel (BD Biosciences)混合的细胞系接种至5-6周龄雌性裸小鼠的腹部乳房脂肪垫。当肿瘤可触摸时，将小鼠随机分至治疗组和对照组，其中治疗组接受每日皮下注射溶于花生油(Sigma)的他莫昔芬(Sigma)和对照组仅接受等量的溶剂。通过卡尺测量肿瘤大小和肿瘤体积计算为(长度*宽度*宽度)/2。肿瘤生长速率表示为肿瘤体积变化的%，其按在指定时间点测量的肿瘤体积(针对在第0天的肿瘤体积标准化)*100%计算。如图4A所示，对照细胞系ZR75-载体和MCF7-载体，其初始是他莫昔芬敏感的，对他莫昔芬治疗响应良好，如当与仅接受溶剂处理的对照组相比，通过显著减少的肿瘤生长指示的。相比之下，BQ323636.1过表达的细胞系ZR75-BQ32363.61和MCF7-BQ323636.1二者(图4B)抵抗他莫昔芬治疗，因为在治疗组和对照组之间比较没有肿瘤生长变化。体外和体内结果证实，BQ323636.1过表达产生他莫昔芬耐药性，这为使用BQ323636.1作为他莫昔芬耐药性的预测标志物提供了可靠的实验证据。
实施例5：在IHC中使用单克隆抗体抗-BQ323636.1来预测乳腺癌患者的他莫昔芬 耐药性
作为在人组织样品中BQ323636.1作为他莫昔芬耐药性的预测标志物的有用性的体内证实，使用对BQ323636.1特异性的单克隆抗体的功效在组织微阵列上对已接受他莫昔芬治疗的总共355个患者通过IHC染色进行评价。这些他莫昔芬治疗的患者来自香港(93个病例)和来自英国(262个病例)。两组患者当单独分析时，各自得到统计学显著的结果。因此，提供合并的结果。他莫昔芬耐药性定义为接受他莫昔芬治疗并随后发生疾病复发或转移的患者。
通过卡方检验，核BQ323636.1过表达与他莫昔芬耐药性显著相关(p= 3.90 x 10-6, 图5A)，并且BQ32363.1核表达在随后发现他莫昔芬耐药性的患者中显著更高(Mann-Whitney U秩检验, p= 4.02 x 10-6, 图5B)。核BQ323636.1过表达还与疾病复发显著相关(卡方检验, p=3.47 x 10-4, 图6A)，并且核BQ323636.1在随后发生疾病复发的患者中显著更高(Mann-Whitney U秩检验, p=3.54 x 10-4, 图6B)。此外，核BQ323636.1过表达与癌症转移显著相关(卡方检验, p=1.72 x 10-6, 图7A)，并且核BQ323636.1在随后发生转移的患者中显著更高(Mann-Whitney U秩检验, p=1.78 x 10-6, 图7B)。
与其在预测他莫昔芬耐药性中的作用一致，通过Kaplan-Meier评估，核BQ323636.1过表达与较差的存活显著相关(时序检验, 分别对于总体存活和疾病特异性存活，p=6.28 x 10-5和p=1.31 x 10-4 , 图8)。通过cox回归单变量分析(图9)，还发现核BQ323636.1过表达与较差的总体存活(风险比率= 1.842, p=0.000)以及与较差的疾病特异性存活(风险比率=2.10, p=0.000)显著相关。显著性在多变量分析上得到保持，与较差的总体存活(风险比率= 2.41, p=0.000)以及与较差的疾病特异性存活(风险比率=3.20,p=0.000)相关。
实施例6：单克隆抗体的V H 和V L 链的测序
从杂交瘤细胞沉淀提取mRNA。使用Fusion Antibodies Ltd内部RNA提取方案从沉淀提取总RNA。
RT-PCR：通过逆转录用寡聚(dT)引物从RNA产生cDNA。PCR反应使用可变结构域引物设置，以扩增单克隆抗体DNA的VH和VL区二者，得到图11所示的条带。将VH和VL产物克隆至Invitrogen测序载体pCR2.1和转化至TOP10细胞，和通过PCR筛选阳性转化子。挑出选择的集落和在ABI3130xl Genetic Analyzer上通过DNA测序分析。在图12中对于重链和在图13中对于轻链显示了氨基酸序列比对。
VH共有氨基酸序列：
MYLGLSCVFIVFLLKGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYW (hCDR1)MNWVRQSPEKGLEWVAEIRLRSSYYAT(hCDR2)HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTMITTGYFDV(hCDR3)WGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLA (SEQ ID NO: 3)
可变结构域以粗体突出显示。互补决定区(CDRs)用下划线表示，如通过IMGT编号系统确定的(Lefranc, M.P. et al., Nucleic AcidsResearch, 27, 209-212 (1999))。
重链的CDR环的图示在图14中显示。
图12中比对的氨基酸序列包括VH2.1 (SEQ ID NO: 4), VH2.2 (SEQ ID NO: 5),VH2.3 (SEQ ID NO: 6), VH2.5 (SEQ ID NO: 7)和VH2.6 (SEQ ID NO: 8)，分别具有SEQID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的相应核酸序列。
VL共有氨基酸序列：
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIHSNGNTY(lCDR1)LHWYLQKPGQSPKLLIYKVS(lCDR2)NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQITHIPRT (lCDR3)FGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLN NFYPK (SEQ ID NO: 26)
可变结构域以粗体突出显示。互补决定区(CDRs)用下划线表示，如通过IMGT编号系统确定的(Lefranc, M.P. et al., Nucleic AcidsResearch, 27, 209-212 (1999))。
轻链的CDR环的图示在图15下显示。
图13中比对的氨基酸序列包括VK2.1 (SEQ ID NO: 14), VK2.2 (SEQ ID NO:15), VK2(2).2 (SEQ ID NO: 16), VK2(2).3 (SEQ ID NO: 17)和VK2(2).5 (SEQ ID NO:18)和VK2(2).6. (SEQ ID NO: 19)，分别具有SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ IDNO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25的相应核酸序列。
讨论
乳腺癌患者的第一线治疗通常是手术切除。超过70%的乳腺癌表达雌激素受体(ER)。ER阳性患者通常用他莫昔芬，一种选择性雌激素受体调节剂治疗，作为第一线辅助疗法来预防癌症复发和降低死亡率。然而，随着长期他莫昔芬治疗，几乎一半的患者最终发展耐药性和出现疾病复发或转移。这些患者然后需要用化学疗法治疗，通常治疗很差。
因为约一半的具有雌激素受体阳性癌症的乳腺癌患者对他莫昔芬无效，鉴定可用于监测他莫昔芬功效的有效和可靠的生物标志物和逆转他莫昔芬耐药性的新靶标是重要的。为了改善乳腺癌患者的疾病结果，对于耐受他莫昔芬治疗的患者需要建立更灵敏的预测生物标志物和新的治疗靶标。本发明提供了对BQ323636.1特异性的单克隆抗体和其在测定法、例如免疫组织化学(IHC)中用于预测乳腺癌患者的他莫昔芬耐药性的用途。BQ323636.1，NCOR2/SMRT的剪接变体，经鉴定与他莫昔芬耐药性有关，和产生对该剪接变体特异性的小鼠单克隆抗体以研究使用BQ323636.1作为他莫昔芬耐药性的预测标志物的功效。在体外使用细胞系和在体内使用裸小鼠模型，使用该抗体，均发现BQ323636.1的过表达产生对他莫昔芬的耐药性。在自存档乳腺癌患者的石蜡块的355个病例构建的组织微阵列(TMA)上在IHC中使用该抗体成功表明，BQ323636.1过表达可预测他莫昔芬耐药性(p=3.90x 10-6) (他莫昔芬耐药性被定义为接受他莫昔芬并随后发生复发或转移的患者)和与差的患者存活有关(对于总体存活p= 6.28 x 10-5，对于疾病特异性存活p=1.31 x 10-4)。
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Claims (21)

1.结合NCOR2的剪接变体的抗体，其中所述剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物。
2. 权利要求1的抗体，其中所述抗体结合具有SEQ ID NO: 1的序列的NCOR2的表位。
3.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
4. 前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是选自Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段或包含多个不同的抗体片段的多特异性抗体的抗体片段。
5.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体与可检测部分缀合或共价结合。
6.通过嵌合或人源化权利要求1的抗体得到的抗体。
7.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
8. 前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO: 3的VH氨基酸序列。
9. 前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO: 26的VL氨基酸序列。
10. 前述权利要求中任一项的抗体，其中VH序列包含三个CDR，即hCDR1 (GFTFSNYW)、hCDR2 (IRLRSSYYAT)和hCDR3 (TMITTGYFDV)，和VL序列包含三个CDR，即lCDR1(QSLIHSNGNTY)、lCDR2 (KVS)和lCDR3 (SQITHIPRT)。
11.试剂盒，其包含前述权利要求中任一项的抗体，任选地进一步包含特异性识别前述权利要求中任一项的抗体的标记的第二抗体。
12.产生权利要求1的抗体的杂交瘤或重组宿主细胞。
13.测定癌症受试者的他莫昔芬耐药性的方法，包括：
(a) 从受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中NCOR2的剪接变体的表达水平，其中所述剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照中的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明所述癌症是他莫昔芬耐药性的。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者是人。
15.权利要求13-14中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述比较步骤包括：
使所述样品与特异性识别具有SEQ ID NO: 1的序列的NCOR2的表位的抗体接触；和检测所述抗体和NCOR2的剪接变体之间的复合物。
17.权利要求16的方法，其中在免疫测定法中NCOR2的剪接变体与特异性识别NCOR2的剪接变体的抗体接触，所述免疫测定法选自放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀法、化学发光测定法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定法和狭线印迹测定法。
18.测定他莫昔芬-治疗的受试者是否处于癌症复发的风险中或处于转移的风险中的方法，包括：
(a) 自受试者获得肿瘤样品；
(b) 测定样品中NCOR2的剪接变体的表达水平，其中所述剪接变体的特征为在mRNA剪接期间外显子11缺失，产生早期翻译终止密码子和截短的蛋白产物；
(c) 比较(b)中的表达水平与正常对照中的表达水平，
其中相对于对照，NCOR2的剪接变体的过表达表明受试者处于癌症复发的风险中，或处于转移的风险中。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者是人。
20.权利要求18-19中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
21. 保藏号577/D12 –DSM ACC3272的克隆D12。
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