CN103913575A - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂s与糖类抗原19-9的联合应用 - Google Patents
半胱氨酸蛋白酶抑制剂s与糖类抗原19-9的联合应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（Cystatin S）与糖类抗原19-9（CA199）的联合应用，具体为Cystatin S与CA199在制备检测大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，本发明还公开了大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，并公开了含有标志物捕获剂的试剂盒，本发明公开的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于大肠癌或胰腺癌的早期诊断，治疗过程中的疗效监控以及治疗后的转移复发监控，可早于临床症状。
Description
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂S与糖类抗原19-9的联合应用。
背景技术
近年来，由于生活水平提高，我国大肠癌发病率急剧上升，达到4.2%。我国大肠癌高发年龄普遍在50岁-60岁，比西方国家平均提早10岁。目前，大肠癌的诊断主要通过大便隐血实验、血液CA199指标、肠镜筛查等，其中大便隐血实验不易被民众接受，其检测筛选检查率低于5%；而肠镜筛查为侵入性，检测痛苦，有出血、穿孔等风险，发现问题进一步进行肠镜检查比例更低，低于3%；血液CA199指标准确度不高。通过早期发现大肠癌，然后进行早期干预大肠癌预后五年生存率高于90%。因此，如何更早期发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，如何对术后患者进行复发监控，是诊断和监控大肠癌亟待解决的问题。
胰腺癌是高致死率肿瘤之一，死亡率与发病率之比为0.99:1。1991-2000年全国疾病监测点系统的资料显示胰腺癌死亡率不断上升，居恶性肿瘤的第7位。65-84岁年龄段者的死亡率是15-54岁年龄段的5倍，城市死亡率为农村的2.42-4.68倍，东北和东部地区死亡率明显高于其它地区。常规的确诊手段为内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)、经皮肝穿刺肝胆管造影（PTC）、超声内窥检查（EUS）、胰管内超声、血管造影等，目前胰腺癌尚无高特异性、灵敏的检测生物标志物，用于胰腺癌的血清蛋白标志物有CA19-9、CEA、CA50、CA242等，但这些标志物常用于晚期胰腺癌辅助诊断、疗效评估、转移复发监控等，用于早期预示胰腺癌普遍灵敏度不够。因此，急需寻找一种高灵敏度的标志物，为早期预示胰腺癌奠定基础。
糖类抗原19-9（CA199）是一种含黏液成分的大分子糖蛋白，可表达于多种细胞包括肿瘤细胞表面。在判断大肠癌患者临床分期方面，CA199是比CEA更为敏感的指标。CA199与肿瘤大小、淋巴结转移及浸润深度相关，并可与其它指标联合应用提示血源性复发。CA199是大肠癌患者独立判断预后的指标，血清中高水平的CA199提示大肠癌患者生存期缩短，但是单独使用CA199指标准确度不高。半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（Cystatin S）是人类Cystatin家族成员，由CST4基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。Cystatin S分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道，CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低，从而提示CST4可能在胃癌的发生有关。但迄今为止，未见CST4与其他癌症相关的报道，也为见Cystatin S与CA199联合应用的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（Cystatin S）和糖类抗原19-9（CA199）在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有前述捕获剂的试剂盒；本发明的目的之四在于提供试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2.大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9的特异性抗体。
3.含有所述捕获剂的试剂盒。
优选的，所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9浓度的试剂盒。
优选的，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
更优选的，所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
更优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
4.利用所述试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法，用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9浓度，利用P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]计算大肠癌阈值P或利用P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]计算胰腺癌阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当P小于0.75时，为阴性；
其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL。
本发明的有益效果：本发明公开了将Cystatin S和CA199联合用于制备预示或诊断大肠癌或胰腺癌的标志物，利用两个标志物共同检测大肠癌和胰腺癌的灵敏度高和特异性高于单独检测一种标志物；本发明还公开了检测大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，将捕获剂于常规试剂制备检测试剂盒，制成试剂盒具有使用方便，重复性好，便于携带等特点，可用于大肠癌或胰腺癌的早期诊断、疗效评估或和移转复发监控等，其特异性好、灵敏度高，其中检测大肠癌的灵敏度为86.4%，特异性为94.4%；检测胰腺癌的灵敏度为85.2%，特异性为87.2%，并且检测结果早于临床症状，为医生提前治疗和干预提供指导。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Cystatin S血清检测试剂盒检测Cystatin S蛋白的标准曲线。
图2为Cystatin S-CA199联合检测试剂盒检测大肠癌ROC曲线。
图3为Cystatin S-CA199联合检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明使用的试剂如下：Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司（货号为：MAB1296）；兔抗人Cystatin S多克隆抗体（货号为：11542-RP02）、Cystatin S蛋白标准品（货号11542-H08H）购自北京义翘神州生物技术有限公司，CA199-ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司（货号为：F5905）。
实施例1建立Cystatin S血清检测反应体系及其优化
用浓度为5μg/mL鼠抗人Cystatin S单克隆抗体包被ELISA板，于4℃条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时，洗板；将浓度分别为0pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，200pg/mL，400pg/mL，800pg/mL，1600pg/mL的Cystatin S蛋白标准品（编码CystatinS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1）和样品加入封闭板中，于37℃反应1小时，洗板；然后用浓度为0.5μg/mL HRP标记的兔抗人Cystatin S多克隆抗体，在37℃条件下反应1小时，洗板；再与四甲基联苯胺（TMB）反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值（图1），由图1可知，Cystatin S酶联免疫检测试剂盒线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990，回收率在90%～110%范围内。
检测体系优化，比对分别由美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS BIOLOGICALS3个不同公司生产的Cystatin S单克隆抗体、美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S蛋白标准品和R&D公司，英国Abcam和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S多克隆抗体。结果表明，Cystatin S单抗优选R&D公司提供的产品，最佳工作浓度为5μg/mL；Cystatin S蛋白标准品和Cystatin S多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0.5μg/mL，在最佳条件下，可实现背景OD值＜0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
固相载体的确定：对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较，结果显示，美国corning公司（货号为：9018）和thermo（货号为：468667）公司的酶标板符合背景OD值＜0.1，且信噪比较高。
包被液的选择：根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液（pH7.5）和碳酸盐缓冲液（pH9.6）检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液（pH9.6）可满足空白组OD值＜0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
稀释剂的选择：通过实验对比了2种商品化稀释剂（分别购自天津博美科生物技术有限公司（货号BMKF017-1）；上海西唐生物科技有限公司（货号C0901））和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的终浓度如下：3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1×PBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞（pH6.0）。
稳定剂的选择：使用3种稳定剂（具体如下：稳定剂Ⅰ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl；稳定剂Ⅱ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂Ⅲ：体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞）分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL，使用时按体积比为1：100稀释。并于第0天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示，稳定剂Ⅲ效果最佳，具体组分为：体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%胎牛血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
通过以上研究确定了检测体系的主要组分，建立Cystatin S血清检测体系。
实施例2Cystatin S酶联免疫检测试剂盒
根据实施例1中建立Cystatin S血清检测体系构建Cystatin S酶联免疫检测试剂盒，具体组分如表1所示：
表1.Cystatin S酶联免疫检测试剂盒组分
评价Cystatin S酶联免疫检测试剂盒：使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S阳性质控品，分别在Cystatin S蛋白浓度为160pg/mL和80pg/mL2个水平重复检测10次，检测结果显示变异系数CV≤10%；用3个批号试剂盒检测同一样本，3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15%。对试剂盒稳定性进行研究显示，在4℃条件下保存8个月、开封后在4℃条件下保存2个月，在0-4℃运输7天均能保持稳定。
实施例3建立CA199血清检测试剂盒
CA199血清检测试剂盒使用CA199-ELISA试剂盒，购自上海西唐生物科技有限公司。
将CA199-ELISA试剂盒与实施例2中构建的Cystatin S血清检测试剂盒组成CystatinS-CA199联合检测试剂盒，用于检测肿瘤标志物CA199和Cystatin S，其中编码CA199蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
实施例4Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断和预示大肠癌
（1）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断大肠癌
从上海肿瘤医院收集200例大肠癌患者治疗前血清，同时从血站收集200例献血人员血清，每例血清1mL。使用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒分别检测大肠癌患者和献血人员血清中Cystatin S与CA199浓度，并根据检测结果绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）（图2）。然后根据ROC曲线统计单独或联合检测Cystatin S与CA199的曲线下面积，结果如表2所示。
表2、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断大肠癌结果
| 标志物 | 曲线下面积 | 灵敏度 | 特异性 |
| Cystatin S | 0.899 | 83.4% | 90.5% |
| CA199 | 0.786 | 60.8% | 82.7% |
| Cystatin S+CA199 | 0.949 | 86.4% | 94.4% |
由表2可知，单独检测Cystatin S和CA199的曲线下面积分别为0.899和0.786，灵敏度分别为83.4%和60.8%，特异性分别为90.5%和82.7%，Cystatin S与CA199联合检测的曲线下面积为0.949，灵敏度为86.4%，特异性为94.4%。因此，使用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒特异性更高，检测结果更可靠。
然后根据检测结果，在特异性达到75%的情况下，应用Logistic回归统计方法得出CystatinS和CA199联合检测的判断公式，具体为P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL），P大于或等于0.75，阳性；P小于0.75，阴性。
应用：利用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒对100例疑似大肠癌患者进行检测，然后根据P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算P值。结果显示，100例被检样本中，41例P值大于0.75，为大肠癌患者；59例P值小于0.5，为非大肠癌患者，与临床诊断结果一致。
（2）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒评估大肠癌疗效
从上海肿瘤医院取10例大肠癌患者治疗前血清，检测血清中Cystatin S和CA199浓度，治疗结束后再取患者血清检测血清中Cystatin S和CA199浓度。根据Cystatin S和CA199联合检测判断公式P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算P值，然后根据P值评估疗效。评估标准为：P值与治疗前相比下降小于30%，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于30%，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于70%，判断为治疗效果显著，其结果如表3所示。同时，医生根据临床症状评估大肠癌的疗效，结果如表3所示。
表3、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒评估大肠癌疗效结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
| 1 | 下降36% | 改善 |
| 2 | 下降41.3% | 无效 |
| 3 | 上升11% | 无效 |
| 4 | 上升12.7% | 无效 |
| 5 | 下降74% | 有效 |
| 6 | 上升16.9% | 无效 |
| 7 | 上升42% | 无效 |
| 8 | 下降39% | 改善 |
| 9 | 上升16% | 无效 |
| 10 | 下降43% | 改善 |
由表3可知，试剂盒检测结果是10例患者中，其中1例患者治疗有效，4例患者治疗后病情得到改善，其余5例患者无治疗效果，与临床判断结果相比符合率达90%。
（3）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控大肠癌转移复发
对6例疗程结束后的大肠癌患者进行跟踪随访，治疗后6周首次采集血清，并检测血清中Cystatin S和CA199浓度，以后每隔三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用公式P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，为无进展生存，结果如表4所示。9个月时，医生根据临床症状判断大肠癌患者是否发生转移复发，结果如表4所示。
表4、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控大肠癌转移复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 1 | 0.45 | 0.56 | 0.67 | 0.78 | 转移复发 |
| 2 | 0.52 | 0.53 | 0.44 | 0.35 | 无进展生存 |
| 3 | 0.62 | 0.66 | 0.72 | 0.78 | 转移复发 |
| 4 | 0.49 | 0.48 | 0.69 | 0.86 | 转移复发 |
| 5 | 0.53 | 0.54 | 0.65 | 0.56 | 无进展生存 |
| 6 | 0.47 | 0.48 | 0.49 | 0.30 | 无进展生存 |
由表4可知，试剂盒检测结果是6例大肠癌患者中有3例出现转移复发，3例无进展生存，并且使用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控大肠癌转移复发早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
由此可知，为了提高诊断和预示大肠癌的准确度、特异性或灵敏度，可以将Cystatin S和CA199联合作为大肠癌的标志物。
实施例4Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断和预示胰腺癌
（1）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断胰腺癌
从上海肿瘤医院收集200例胰腺癌患者治疗前血清，同时从血站收集245例健康献血人员血清，每例血1mL。使用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒分别检测胰腺癌患者和健康人血清中Cystatin S与CA199浓度，然后根据检测结果绘制ROC曲线（图3）。再根据ROC曲线统计单独或联合检测Cystatin S与CA199标志物的曲线下面积、灵敏度和特异性，结果如表5所示。
表5、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒诊断结果
| 标志物 | 曲线下面积 | 灵敏度 | 特异性 |
| Cystatin S | 0.827 | 76.3% | 83.4% |
| CA199 | 0.732 | 62.4% | 74.6% |
| Cystatin S+CA199 | 0.866 | 85.2% | 87.2% |
由表5可知，检测Cystatin S标志物的曲线下面积为0.827，灵敏度为76.3%，特异性为83.4%；检测CA199标志物的曲线下面积为0.723，灵敏度为62.4%，特异性为74.6%；而CystatinS和CA199联合检测的曲线下面积为0.866，灵敏度为85.2%，特异性为87.2%。因此，使用Cystatin S和CA199联合检测试剂盒诊断胰腺癌的灵敏度和特异性均更高，其准确性更好。
然后根据Cystatin S和CA199浓度，应用Logistic回归统计方法，在特异性达到75%的情况下得出联合检测Cystatin S和CA199的判断公式，具体为P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）。当P值大于或等于0.5时，为阳性；当P值小于0.5时，为阴性。
应用：利用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测，然后根据P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]（其中a代表CystatinS浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算P值。结果显示，100例被检样本中，19例P值大于0.5，为胰腺癌患者；81例P值小于0.5，为非胰腺癌患者，与临床诊断结果一致。
（2）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒评估胰腺癌治疗效果
从上海肿瘤医院取10例胰腺癌患者治疗前血清，检测血清中Cystatin S和CA199浓度，疗程结束后再检测Cystatin S和CA199浓度。根据Cystatin S和CA199浓度，应用公式P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算P值，根据治疗前和治疗后的P值变化进行疗效评估。评估标准为：P值与治疗前相比下降小于50%，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于50%，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降小于90%，判断为有效，P值小于0.5，判断为治疗效果显著，结果如表6所示。同时，医生根据临床症状评价胰腺癌的疗效，结果如表6所示。
表6、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒评估胰腺癌疗效结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度变化百分比 | 临床评价 |
| 1 | 降低62% | 改善 |
| 2 | 升高2.5% | 无效 |
| 3 | 降低63% | 改善 |
| 4 | 降低43% | 无效 |
| 5 | 升高4% | 有效 |
| 6 | 降低59% | 改善 |
| 7 | 降低42% | 无效 |
| 8 | 降低90% | 有效 |
| 9 | 降低17% | 无效 |
| 10 | 降低49% | 无效 |
由表6可知，试剂盒评估结果是10例胰腺癌患者中，其中1例患者治疗有效，3例患者治疗后病情得到改善，其余6例患者治疗后无效，与临床判断相比符合率达90%。
（3）Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控胰腺癌移转复发
对上海肿瘤医院的6例疗程结束的早期胰腺癌患跟踪随访，治疗后六周首次采集患者血清，检测血清中Cystatin S和CA199浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用公式为P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]（其中a代表Cystatin S浓度，单位为pg/mL，b代表CA199浓度，单位为ng/mL）计算其P值，当P大于或等于0.5时，表明发生了转移复发；当P小于0.5时，表明未发生转移复发，为无进展生存，结果如表7所示。9个月时，医生根据临床症状评价胰腺癌是否发生转移复发，结果如表7所示。
表7、Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控胰腺癌移转复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 1 | 0.227 | 0.198 | 0.321 | 0.582 | 转移复发 |
| 2 | 0.13 | 0.141 | 0.15 | 0.16 | 无进展生存 |
| 3 | 0.343 | 0.237 | 0.213 | 0.336 | 无进展生存 |
| 4 | 0.13 | 0.129 | 0.147 | 0.137 | 无进展生存 |
| 5 | 0.132 | 0.122 | 0.134 | 0.143 | 无进展生存 |
| 6 | 0.333 | 0.338 | 0.471 | 0.681 | 转移复发 |
由表7所示，6例胰腺癌患者中有2例发生了转移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存。并且使用Cystatin S-CA199联合检测试剂盒监控胰腺癌，可早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
由此可知，为了提高诊断和预示胰腺癌的准确度、特异性或灵敏度，可以将Cystatin S和CA199联合作为胰腺癌的标志物。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9在制备诊断和预示大肠癌或胰腺癌标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.大肠癌或胰腺癌标志物的捕获剂，其特征在于：所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述糖类抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的捕获剂，其特征在于：所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9的特异性抗体。
5.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9浓度的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
10.利用权利要求5-9任一项所述试剂盒建立计算诊断和预示大肠癌或胰腺癌阈值的方法，其特征在于：用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和糖类抗原19-9浓度，利用P=exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)/[1+exp(-8.268-0.0919*a+0.312*b)]计算大肠癌阈值P或利用P=[exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）/[1+exp（-5.248+0.063*a+0.598*b）]计算胰腺癌阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当P小于0.75时，为阴性；
其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制剂S浓度，单位为pg/mL，b代表糖类抗原19-9浓度，单位为ng/mL。
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| GR01 | Patent grant |