CN115060904B - 一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒 - Google Patents

一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒，属于胶体金制备技术领域，一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法包括以下步骤：（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；（2）加热至第一反应温度后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液；（3）调至第二反应温度，持续反应1min；（4）调至第三反应温度，持续反应3min；（5）调至第四反应温度，持续反应7min；本发明是基于传统的柠檬酸三钠还原法上，通过控制不同反应温度，进而控制胶体金的成核过程与速度，最终制备出粒径大且均一的胶体金溶液，其所呈现出的产品检测灵敏度高、显色强度好、特异性好。

Description

一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试 剂条、试剂盒
技术领域
本发明属于胶体金制备技术领域，具体涉及一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒。
背景技术
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)的外壳，存在于感染者的血液、体液和分泌物中，一般与HBV同时存在，是判断HBV感染的中重要血清学标志物之一。
目前，乙型肝炎病毒表面抗原常用乙肝表面抗原检测试剂盒来进行检查，乙肝表面抗原检测试剂盒的制备过程中需要进行金标垫的制备，而金标垫的制备过程中会使用胶体金，胶体金是氯金酸在还原剂作用下，形成的一定大小金颗粒，通过静电作用维系成稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，称为胶体金。金溶胶分散相粒子直径一般在1-200nm之间，颜色呈橘红色到紫红色，属于多相不均匀体系。
目前胶体金的制备方法一般采用还原法，常用还原剂有白磷、抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠等。白磷还原法可合成粒径3nm左右的金颗粒；抗坏血酸还原法可合成粒径10nm左右的金颗粒；硼氢化钠还原法可合成粒径3-20nm左右的金颗粒；柠檬酸钠还原法可合成粒径5-200nm左右的金颗粒。
粒径的大小与均一程度直接影响产品的显色强度、灵敏度、特异性等性能。同等条件下，胶体金粒径越大，形状越不规则，制备难度越高，批间差越大，但同时显色强度越强，灵敏度越高，特异性越差。因此，制备出形状规则、性能良好的高质量胶体金是金免疫技术的基础与根本。
发明内容
针对上述困难，本发明要解决的技术问题是，提供一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，通过该方法可以制备出粒径大且形状规则的胶体金，同时可以提升产品显色强度和灵敏度，且特异性符合要求；
还提供一种乙肝表面抗原检测试剂条，检测灵敏度高，显色强度好；
还提供一种乙肝表面抗原检测试剂盒，使用便捷，操作简单。
为了解决以上问题，本发明采用的技术方案如下：一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；
（2）加热至130-150℃后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，反应1min；
（3）调至100℃，持续反应1min；
（4）调至130-150℃，持续反应3min；
（5）调至90℃，持续反应7min，结束反应过程；
（6）恢复至室温后，避光置于2-8℃备用。
所述步骤（1）中所述，氯金酸溶液配制方法为：取1g氯金酸溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃避光保存。
所述步骤（2）中，柠檬酸三钠溶液配制方法为：取2g柠檬酸三钠溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃保存。
所述步骤（2）中，加热至140℃。
所述步骤（4）中，调至140℃。
一种乙肝表面抗原检测试剂条，试剂条制备方法包括以下步骤：
（1）划膜
划膜液体配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.1%海藻糖，pH8.5；
将质控线与检测线依次包被于硝酸纤维素膜上。
（2）金标垫的制备
金复溶液配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.5%酪蛋白，质量百分比浓度0.2%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
用上述乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法制备出胶体金溶液，然后进行胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2，用金复溶液离心浓缩后，固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成金标垫的制备。
（3）样品垫的制备
样品垫处理液配方：0.5M Tris，质量百分比浓度0.5% PVP10，质量百分比浓度0.5% BSA，质量百分比浓度0.5%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
将样品垫处理液固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成样品垫的制备。
（4）试剂条的组装
将吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试剂条。
胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2的方法为：每mL胶体金溶液内加入7uL 0.2M锡酸钾溶液，混匀后一次性快速加入7ug抗HBsAg单克隆抗体2，反应15min后，加入50uL质量百分比浓度10% BSA溶液，30min后结束反应。
一种乙肝表面抗原检测试剂盒，试剂盒包括检测卡，检测卡包括相互扣合的卡盖和卡体，卡盖和卡体之间具有上述的试剂条。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明是基于传统的柠檬酸三钠还原法上，通过控制不同反应温度，进而控制胶体金的成核过程与速度，最终制备出粒径大且均一的胶体金溶液，其所呈现出的产品检测灵敏度高、显色强度好、特异性好；本发明一种乙肝表面抗原检测试剂条，检测灵敏度高，显色强度好；一种乙肝表面抗原检测试剂盒，使用便捷，操作简单。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
实施例1：一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；
（2）加热至第一反应温度后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，反应1min；
（3）调至第二反应温度，持续反应1min；
（4）调至第三反应温度，持续反应3min；
（5）调至第四反应温度，持续反应7min，结束反应过程；
（6）恢复至室温后，避光置于2-8℃备用。
上述步骤（1）中，氯金酸溶液配制方法为：取1g氯金酸溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃避光保存；
上述步骤（2）中，柠檬酸三钠溶液配制方法为：取2g柠檬酸三钠溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃保存；
上述步骤（2）中，第一反应温度为130℃；
上述步骤（3）中，第二反应温度为100℃；
上述步骤（4）中，第三反应温度为130℃；
上述步骤（5）中，第四反应温度为90℃。
实施例2：一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；
（2）加热至第一反应温度后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，反应1min；
（3）调至第二反应温度，持续反应1min；
（4）调至第三反应温度，持续反应3min；
（5）调至第四反应温度，持续反应7min，结束反应过程；
（6）恢复至室温后，避光置于2-8℃备用。
上述步骤（1）中，氯金酸溶液配制方法为：取1g氯金酸溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃避光保存；
上述步骤（2）中，柠檬酸三钠溶液配制方法为：取2g柠檬酸三钠溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃保存；
上述步骤（2）中，第一反应温度为140℃；
上述步骤（3）中，第二反应温度为100℃；
上述步骤（4）中，第三反应温度为140℃；
上述步骤（5）中，第四反应温度为90℃。
实施例3：一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；
（2）加热至第一反应温度后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，反应1min；
（3）调至第二反应温度，持续反应1min；
（4）调至第三反应温度，持续反应3min；
（5）调至第四反应温度，持续反应7min，结束反应过程；
（6）恢复至室温后，避光置于2-8℃备用。
上述步骤（1）中，氯金酸溶液配制方法为：取1g氯金酸溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃避光保存；
上述步骤（2）中，柠檬酸三钠溶液配制方法为：取2g柠檬酸三钠溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃保存；
上述步骤（2）中，第一反应温度为150℃；
上述步骤（3）中，第二反应温度为100℃；
上述步骤（4）中，第三反应温度为150℃；
上述步骤（5）中，第四反应温度为90℃。
实施例4：一种胶体金法乙肝表面抗原检测试剂条，试剂条制备方法包括以下步骤：
（1）划膜
划膜液体配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.1%海藻糖，pH8.5；
将质控线与检测线从上至下依次包被于硝酸纤维素膜上。
（2）金标垫的制备
金复溶液配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.5%酪蛋白，质量百分比浓度0.2%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
用实施例1-3其中之一的乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法制备出胶体金溶液，然后进行胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2，用金复溶液离心浓缩后，固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成金标垫的制备。
（3）样品垫的制备
样品垫处理液配方：0.5M Tris，质量百分比浓度0.5% PVP10；质量百分比浓度0.5% BSA；质量百分比浓度0.5%吐温20；质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
将样品垫处理液固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成样品垫的制备。
（4）试剂条组装
将吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试剂条。
实施例5：一种胶体金法乙肝表面抗原检测试剂盒，试剂盒包括检测卡，检测卡包括相互扣合的卡盖和卡体，卡盖和卡体之间具有实施例4描述的试剂条。
乙肝表面抗原检测实验数据如下：
为了更好地体现本专利的技术优势，按照实施例1-3和常规柠檬酸三钠法分别制备胶体金溶液，然后制得乙肝表面抗原检测试剂条进行对比、阐述和说明。
（1）划膜
划膜液体配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.1%海藻糖，pH8.5；
质控线用原料：羊抗鼠IgG多克隆体，划膜浓度1.5mg/mL；
检测线用原料：抗HBsAg单克隆抗体1，划膜浓度1.0mg/mL；
将质控线用原料与检测线用原料从上至下依次包被于硝酸纤维素膜上。
（2）金标垫的制备
金复溶液配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.5%酪蛋白，质量百分比浓度0.2%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
按照实施例1-3和常规柠檬酸三钠法分别制备胶体金溶液，然后按常规方法进行胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2，用金复溶液离心浓缩后，固相化于玻璃纤维上，放置于烘房烘干6h后，即完成金标垫的制备。
常规柠檬酸三钠制备胶体金溶液方法：将质量百分比浓度1%氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，置于三口烧瓶中；采用恒温电热套加热至沸腾后，一次性快速加入质量百分比2%柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，待烧瓶内液体颜色变化为深紫色，持续加热10min后，结束反应；
胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2方法：每mL胶体金溶液内加入7uL 0.2M锡酸钾溶液，混匀后一次性快速加入7ug抗HBsAg单克隆抗体2，反应15min后，加入50uL质量百分比浓度10% BSA溶液，30min后结束反应。
（3）样品垫的制备
样品垫处理液配方：0.5M Tris，质量百分比浓度0.5% PVP10，质量百分比浓度0.5% BSA，质量百分比浓度0.5%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
将样品垫处理液固相化于玻璃纤维上，放置于烘房烘干6h后，即完成样品垫的制备。
（4）组装试剂条
将吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试剂条。
通过实验对比不同胶体金制备方法对乙肝表面抗原检测产品所产生的显色强度、灵敏度和特异性方面的差异。
实验数据如下：
“-”表示阴性，“+”表示阳性，“+”越多表示阳性显色越强。
显色强度结果：
Figure 847475DEST_PATH_IMAGE001
灵敏度结果：
Figure 395131DEST_PATH_IMAGE002
特异性结果：
Figure 361950DEST_PATH_IMAGE003
通过以上结果可知，将本发明实施例中的胶体金制备方法用于乙肝表面抗原检测试剂盒中，其产品显色强度、灵敏度和特异性均有显著提高。

Claims (7)

1.一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液和超纯水按体积比1:99混匀，加入锥形瓶中进行油浴加热；
（2）加热至130-150℃后，一次性快速加入柠檬酸三钠溶液，其与上述加入的氯金酸溶液体积比为1：3.8，反应1min；
（3）调至100℃，持续反应1min；
（4）调至130-150℃，持续反应3min；
（5）调至90℃，持续反应7min，结束反应过程；
（6）恢复至室温后，避光置于2-8℃备用；
所述步骤（1）中，氯金酸溶液配制方法为：取1g氯金酸溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃避光保存。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，柠檬酸三钠溶液配制方法为：取2g柠檬酸三钠溶于超纯水中，定容至100mL，混匀后置于2-8℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，加热至140℃。
4.根据权利要求3所述的一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，调至140℃。
5.一种乙肝表面抗原检测试剂条，其特征在于：试剂条制备方法包括以下步骤：
（1）划膜
划膜液体配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.1%海藻糖，pH8.5；
将质控线与检测线依次包被于硝酸纤维素膜上；
（2）金标垫的制备
金复溶液配方：0.1M Tris，质量百分比浓度0.5%酪蛋白，质量百分比浓度0.2%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
用权利要求1的乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法制备出胶体金溶液，然后进行胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2，用金复溶液离心浓缩后，固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成金标垫的制备；
（3）样品垫的制备
样品垫处理液配方：0.5M Tris，质量百分比浓度0.5% PVP10，质量百分比浓度0.5%BSA，质量百分比浓度0.5%吐温20，质量百分比浓度0.2% Proclin 300，质量百分比浓度0.5%蔗糖，pH8.0；
将样品垫处理液固相化于玻璃纤维上，烘干6h后，即完成样品垫的制备；
（4）试剂条的组装
将吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试剂条。
6.根据权利要求5所述的一种乙肝表面抗原检测试剂条，其特征在于：胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体2的方法为：每mL胶体金溶液内加入7uL 0.2M锡酸钾溶液，混匀后一次性快速加入7ug抗HBsAg单克隆抗体2，反应15min后，加入50uL质量百分比浓度10% BSA溶液，30min后结束反应。
7.一种乙肝表面抗原检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括检测卡，检测卡包括相互扣合的卡盖和卡体，卡盖和卡体之间具有权利要求5的试剂条。
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