JP5425664B2

JP5425664B2 - 金ナノ粒子及びその製造方法

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Publication number: JP5425664B2
Application number: JP2010044792A
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Inventors: 伸夫上原
Original assignee: Utsunomiya University
Current assignee: Utsunomiya University
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2010-03-01
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2030-03-01
Also published as: JP2011179074A

Description

本発明は、金ナノ粒子及びその製造方法に関し、更に詳しくは、金ナノクラスターと熱応答性高分子とを用いた金ナノ粒子の製造方法及びその方法で得られた金ナノ粒子に関する。

非特許文献１では、粒径約１３ｎｍ前後の金ナノ粒子にポリアミノ基を有する熱応答性高分子を被覆して凝集状態とすること、及びその凝集状態に熱刺激を与えることにより再び分散状態に戻ること（再分散現象）が報告されている。同文献１の金ナノ粒子は、金(III)イオンを還元することにより得られるが、金ナノ粒子の粒径の制御は、金(III)イオンの濃度と生成した金ナノ粒子の安定化剤の濃度との比で行っている。そのため、得られる金ナノ粒子の平均粒径の制御、分散性の制御、及び形状の制御を十分に行うことができないという問題があった。また、非特許文献２では、金ナノ粒子を種粒子として金(III)イオンを還元し、粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を作製する方法が提案されている。

なお、特許文献１は、本出願人の関連する技術である。

T.Shimada, K.Ookubo, N.Komuro, T.Shimizu, N.Uehara, Langmuir, 23, 11225-11232(2007)． Liao,H.W; Hafner,J.H., Chem.Mater., 2005, 17, 4636.

特開２００９−２２９１４７号公報

本発明の目的は、新しい金ナノ粒子の製造方法を提供すること、及びその方法で製造された金ナノ粒子を提供することにある。特に、熱応答性高分子を用い、粒径数ナノメートルの金ナノクラスターから粒径数十ナノメートルの金ナノ粒子を製造する方法及びその製造用溶液、並びにその製造方法で得られた金ナノ粒子を提供することにある。

本発明者は、クエン酸還元法による粒径約１３ｎｍの金ナノ粒子を用いて再分散現象について検討してきたが、その後、その再分散現象とは異なるアプローチとして、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）共存下で粒径数ｎｍの金ナノ粒子を合成し、その金ナノ粒子に熱応答性高分子を被覆したのちに熱刺激を加えたところ、溶液の赤みが増し、約５５０ｎｍ付近の吸光度が上昇する現象を発見した。本発明はこうした知見に基づいてなされたものである。

すなわち、上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子の製造方法は、塩化金酸溶液とポリオキシエチレン溶液を混合した後にテトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を添加して得る金ナノクラスターと、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロースとを含む混合溶液を準備する工程と、該混合溶液を４０℃以上９５℃以下で加熱し冷却する工程とを有することを特徴とすることを特徴とする。

この発明によれば、従来のように金(III)イオンを還元して粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を製造するのではなく、粒径１〜５ｎｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得るという新しい方法を提供することができる。また、本発明では熱応答性高分子を用いるが、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子以外であれば本発明の製造方法に適用できる。

本発明に係る金ナノ粒子の製造方法において、前記熱応答性高分子としては、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

特に、前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、Ｐ−ＮＩＰ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−アミン）（以下、ｐＮＩＰ−ＡＣ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−シスタミン）（以下、ｐＮＩＰ−Ｃｙｓ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−アラニン）（以下、ｐＮＩＰ−Ａｌａ）、及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）（以下、ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸）から選ばれる１又は２以上であることが好ましい。

本発明に係る金ナノ粒子の製造方法において、前記金ナノクラスターは、塩化金酸溶液とポリオキシエチレン溶液を混合した後にテトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を添加して得る。

この発明によれば、粒径が１〜５ｎｍの金ナノクラスターを得ることができる。

上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子の製造用溶液は、塩化金酸溶液とポリオキシエチレン溶液を混合した後にテトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を添加して得る金ナノクラスターと、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロースとを含むことを特徴とする。

この発明によれば、加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得ることができる溶液を提供できる。

上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子は、ＴＥＭ像から計測できる粒径が５０〜１００ｎｍの範囲であり、動的光散乱法での測定で粒径１００〜５００ｎｍにピークを示すことを特徴とする。

この発明によれば、従来にない上記粒径範囲の金ナノ粒子を提供できる。

上記課題を解決するための本発明に係るチオール基の検出方法は、上記本発明に係る金ナノ粒子の製造用溶液を準備し、該溶液に試験試料を添加して加熱、冷却し、該冷却後の溶液を波長５５０ｎｍで吸光度測定することを特徴とする。

この発明によれば、上記本発明に係る金ナノ粒子の製造溶液に試験試料を添加した溶液を加熱冷却した後、波長５５０ｎｍでの吸光度が減少した場合は、その試験試料には、チオール基含有化合物が含まれている可能性が高いということができる。こうしたことから、金ナノ粒子の製造用溶液をチオール基含有化合物の検出溶液として利用できる。なお、そうした吸光度の減少は、チオール基含有化合物が金ナノ粒子に吸着することで、金ナノ粒子同士の接触及び融合が阻害されるものと推察される。

本発明に係る金ナノ粒子の製造溶液によれば、従来のように金(III)イオンを還元して粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を製造するのではなく、粒径１〜５ｎｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得るという新しい方法を提供することができる。また、本発明では熱応答性高分子を用いるが、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子以外であれば本発明の製造方法に適用できる。

本発明に係る金ナノ粒子の製造用溶液によれば、加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得ることができる溶液を提供できる。

本発明に係る金ナノ粒子によれば、従来にない上記粒径範囲の金ナノ粒子を提供できる。

本発明に係るチオール基の検出方法によれば、上記本発明に係る金ナノ粒子の製造溶液に試験試料を添加した溶液を加熱冷却した後、波長５５０ｎｍでの吸光度が減少した場合は、その試験試料には、チオール基含有化合物が含まれている可能性が高いということができる。こうしたことから、金ナノ粒子の製造用溶液をチオール基含有化合物の検出溶液として利用できる。

金ナノ粒子の製造メカニズムを示す模式図、及び、チオール化合物が金ナノ粒子の製造を阻害するメカニズムを示す模式図である。混合溶液Ａ中のＰ−ＮＩＰの濃度を変えたときの波長１９０〜９００ｎｍで吸収スペクトルの測定結果を示すグラフである。混合溶液Ａにおいて加熱温度を変化させたときの金ナノ粒子のＴＥＭ写真である。動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径の測定結果を示すグラフである。

本発明に係る金ナノ粒子の製造方法、その方法に用いる溶液及びその方法で製造された金ナノ粒子について図面を参照して説明する。また、金ナノ粒子の製造用溶液を用いてチオール基の検出を行う方法についても説明する。

［金ナノ粒子の製造方法］
本発明に係る金ナノ粒子の製造方法は、粒径が１〜５ｎｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）とを含む混合溶液を準備する工程と、その混合溶液を加熱し冷却する工程とを有する。以下、本発明の製造方法の各工程について詳しく説明する。

（混合溶液の準備工程）
混合溶液は、金ナノ粒子を製造するための水溶液であって、金ナノクラスターと熱応答性高分子とを少なくとも含んでいる。

金ナノクラスターは、透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ像と略す。）で測定した粒径が１〜５ｎｍの金粒子のことである。金ナノクラスターの形状は、粒形状又は球形状であることが望ましい。金ナノクラスターは各種の方法で製造でき、後述する実験例に記載のように、テトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を用いる方法等で製造することができる。具体的には、塩化金酸溶液にポリオキシエチレン溶液を添加した後に水を加え、ｐＨ調整した後にＮａＢＨ_４（テトラヒドロホウ酸ナトリウム）溶液を添加し、その後反応させて合成することができる。なお、ポリオキシエチレン溶液としては、テトラエチレングリコール等を挙げることができる。こうした合成方法によって、粒径が１〜５ｎｍの金ナノクラスターを得ることができる。

熱応答性高分子としては、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

熱応答性高分子のうち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーの例としては、下記一般式１〜５に記載のものを好ましく挙げることができる。

上記化学式１のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）類である。化学式１において、Ｒ^１とＲ^２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ^３はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。ｎは１０００〜１０００００の整数である。Ｒ^１とＲ^２をメチル基とし、Ｒ^３を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は「Ｐ−ＮＩＰ」で表す。

上記化学式２のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）類である。化学式２において、Ｒ^１とＲ^２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ^３とＲ^４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。ｘ＋ｙは１００であり、ｎは１〜４である。Ｒ^１とＲ^２をメチル基とし、Ｒ^３とＲ^４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。

化学式２のポリマーの右側の側鎖は、エチレンイミン鎖の繰り返し単位を含むアクリロイルアミン（以下、ＡＣという。）である。より具体的には、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位であるｎ＝０の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））という。］となり、ｎ＝１の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝２の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝３の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））という。］、ｎ＝４の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘキサミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））という。］となる。

上記化学式３のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−シスタミン）類である。化学式３において、Ｒ^１とＲ^２及びＲ^７とＲ^８はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ^３とＲ^４及びＲ^５とＲ^６はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙ／ｚは９５／２．５／２．５〜８０／１０／１０である。なお、ｘ＋ｙ＋ｚは１００である。Ｒ^１とＲ^２及びＲ^７とＲ^８をメチル基とし、Ｒ^３とＲ^４及びＲ^５とＲ^６を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−Ｃｙｓ」で表す。

上記化学式４のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アラニン）類である。化学式４において、Ｒ^１とＲ^２及びＲ^５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ^３とＲ^４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９０／１０〜８０／２０である。なお、ｘ＋ｙは１００である。Ｒ^１とＲ^２及びＲ^５をメチル基とし、Ｒ^３とＲ^４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。

上記化学式５のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）類である。化学式５において、Ｒ^１とＲ^２及びＲ^５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ^３とＲ^４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜８０／２０である。なお、ｘ＋ｙは１００である。Ｒ^１とＲ^２及びＲ^５をメチル基とし、Ｒ^３とＲ^４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸」で表す。

上記化学式１〜５のポリマーの分子量は、重量平均分子量で８０００以上１０００００以下のものを用いることができ、１００００以上２００００以下のものが好ましい。また、各ポリマーは、通常それぞれ単独で用いられるが、２以上を併せて用いてもよい。また、本発明の趣旨の範囲内であれば、上記化学式１〜５のポリマーと同様の効果を奏する他の熱応答性高分子、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル）、ヒドロキシプロピルセルロース等を用いてもよい。

上記化学式１〜５のポリマーは、後述する実験例に示す方法で合成することができる。例えば、化学式１のポリマーは、モノマー成分であるＮ−イソプロピルアクリルアミド類を水に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して得ることができる。また、化学式２〜５のポリマーも、重合させるモノマー成分を溶媒に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して各ポリマーを得ることができる。

なお、同じ熱応答性高分子であっても、金ナノ粒子を製造できないものがある。その代表的な例としては、下記化合物６に示すカボキシル基等のアニオン基を有する熱応答性高分子（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）類（ｐＮＩＰ−ＭＡ））を挙げることができる。また、熱応答性高分子ではないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリアクリルアミドは、金ナノ粒子を製造できない。

（混合溶液）
金ナノ粒子の製造用溶液は、上記した金ナノクラスターと上記した熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）とを含む水溶液である。混合溶液には、金ナノクラスターが０．００１８〜０．００９０質量％の範囲で含まれることが好ましく、熱応答性高分子が０．２５〜２．０質量％の範囲で含まれることが好ましい。また、金ナノクラスターと熱応答性高分子を質量比で表すと、金ナノクラスター／熱応答性高分子の質量比が９／１００００〜３６／１０００の範囲であることが好ましい。

混合溶液に含有させる熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ粒子を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、混合溶液のｐＨは含有させる熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、２．９〜１０．０の範囲であることが好ましい。

（加熱、冷却工程）
調整された金ナノ粒子の製造用溶液（混合溶液）を加熱し、冷却することによって、金ナノ粒子が製造される。加熱は、熱応答性高分子に相転移を起こさせ、金ナノクラスターを融合させる操作である。加熱温度は、４０℃〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃である。温度が高いほど大きな粒径の金ナノ粒子を得ることができる。加熱時間は、３０分〜２時間が好ましい。なお、加熱時間が長くなると大きな粒子の個数が増えて平均粒径が見かけ上大きくなる。しかし、粒子が成長して大きい粒子になるわけではない。また、吸光度の変化は、３０分以上ではあまり変わらない。

冷却は、加熱されて熱応答性高分子が析出し濁った溶液を、再度透明にする操作である。冷却温度は、０〜３０℃、好ましくは４〜１０℃である。冷却温度が低くなるほど早く溶液は透明となる。冷却時間は、３０分以上で十分であり、上限は特に限定されない（１時間又は２時間程度）。

こうした加熱冷却手段により、混合溶液から金ナノ粒子を製造することができる。製造された金ナノ粒子は、ＴＥＭ像から計測できる粒径が５０〜１００ｎｍの範囲であり、動的光散乱法での測定で粒径１００〜５００ｎｍにピークを示す。なお、ＴＥＭ像からの計測は、ＴＥＭ写真を撮影し、その写真から計測したものである。一方、動的光散乱法による粒径の測定は、動的光散乱測定装置で測定されたものである。

また、加熱冷却後の溶液は、約５５０ｎｍ付近での吸光度が大きくなり、溶液の赤みが増した。また、こうした吸光度が大きくなるのは、熱応答性高分子の作用により、金ナノ粒子が大きくなっている場合に見られた。

以上説明したように、本発明に係る金ナノ粒子の製造溶液によれば、従来のように金(III)イオンを還元してロッド状の金ナノ粒子を製造するのではなく、粒径１〜５ｎｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得るという新しい方法を提供することができる。また、本発明では熱応答性高分子を用いるが、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子以外であれば本発明の製造方法に適用できる。

［チオール基の検出方法］
次に、チオール基の検出方法について説明する。本発明に係るチオール基の検出方法は、上記した本発明に係る金ナノ粒子の製造用溶液を準備し、その溶液に試験試料を添加して加熱、冷却し、冷却後の溶液を波長５５０ｎｍで吸光度測定する方法である。

金ナノ粒子の製造用溶液にチオール基を有する化合物（チオール化合物という。）を添加すると、チオール基が金ナノ粒子の製造を阻害する。こうした阻害作用は、チオール化合物が図１に示す凝集体を構成する金ナノクラスターに吸着することで、金ナノクラスター同士の接触・融合が阻まれる。その結果、金ナノ粒子の製造が阻害され、吸光度での５５０ｎｍの吸収ピークが小さくなり、赤みが弱くなる。こうしたことは、換言すれば、金ナノ粒子の製造用溶液を、チオール化合物の選択的な検出溶液として応用できる。

チオール化合物としては、Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、システイニルグリシン、還元型グルタチオン、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸エチル等を挙げることができる。これらのチオール化合物は、添加濃度の上昇とともに５５０ｎｍ付近の吸収ピークの減少が見られた。

この検出方法で用いる混合溶液の種類は、上記した本発明に係る金ナノ粒子の製造方法で用いる混合溶液と同じものを用いることができるので、ここではその説明を省略する。

測定できるチオール化合物の濃度は、０〜１．０×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５×１０^−４〜１．０×１０^−４ｍｏｌ／Ｌである。

この発明を利用すれば、金ナノ粒子の製造溶液に試験試料を添加した溶液を加熱冷却した後、波長５５０ｎｍでの吸光度が減少した場合は、その試験試料には、チオール基含有化合物が含まれている可能性が高いということができる。こうしたことから、金ナノ粒子の製造用溶液をチオール基含有化合物の検出溶液として利用できる。

以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明する。

［混合溶液の調製］
（金ナノクラスターの合成）
１００ｍＬメスフラスコに０．１質量％の塩化金酸溶液を１０ｍＬ採り、１質量％のポリオキシエチレン溶液を１０，２５，５０ｍＬそれぞれ添加したのちに水を加えて１００ｍＬとした。溶液のｐＨを１Ｍ塩酸溶液を用いてｐＨ２．５に調整した。この溶液を２５℃水浴中で攪拌しつつ、０．１ＭＮａＢＨ_４（テトラヒドロホウ酸ナトリウム）溶液を１０μＬゆっくりと添加した。その後、２５℃水浴中で６時間反応させて、金ナノクラスターを合成した。

（化学式１／Ｐ−ＮＩＰの合成）
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）３０ｇを採り、水１００ｍＬで溶解した。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温し、攪拌しながら、重合開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム１．０ｇ及び重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１．５ｍＬを添加し、４時間重合した。合成したＰ−ＮＩＰの構造式は、上記化学式１のＲ^１とＲ^２をメチル基としＲ^３を水素原子としたものである。重合終了後、メタノール１００ｍＬを加えて沈殿したポリマーを取り出し、メタノール１００ｍＬに溶解した。この溶液に、水１００ｍＬを加え、沈殿したポリマー取り出して水１００ｍＬに溶解した。この操作を二回繰り返し行い、精製したＰ−ＮＩＰを水に溶解し、凍結乾燥を行った。さらに、得られたポリマーを水に溶解して凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３３．２℃であった。

（化学式２／ｐＮＩＰ−ＡＣの合成）
ＤＥＴＡを含む１，４−ジオキサンの混合溶液（２０．６３ｇ／２００ｍＬ）に、ＡＣと１，４−ジオキサンの混合溶液（１．６２５ｍＬ／５０ｍＬ）を一滴ずつ滴下して反応させた（ＤＥＴＡの物質量：ＡＣの物質量＝１０：１）。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、少量（約４０ｍＬ）のメタノールに溶解した。これにＫＯＨ−メタノール溶液を加えて攪拌、濾別し、得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＤＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）とＡＣ−ＤＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。これに重合促進剤と重合開始剤を添加し、油浴中でフラスコ内の溶液を攪拌しながら窒素雰囲気下で脱酸素を行った。その後、窒素を通気しながら、油浴で６０℃とし、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。

また、エチレンイミン鎖長の異なるエチレンジアミン（ＥＤＡ）１２．０２ｇ（０．２ｍｏｌ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）２０．６３ｇ（０．２ｍｏｌ）、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）３７．８６ｇ（０．２ｍｏｌ）、ペンタエチレンヘプタミン（ＰＥＨＡ）４６．４９ｇ（０．２ｍｏｌ）をそれぞれ用いて、ＮＩＰＡＡｍの物質量とＤＥＴＡの物質量がモル比で９０：１０ｍｏｌ％としたｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））の合成と同様の操作を行い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘプタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））］を合成した。合成した各熱応答性高分子の構造式は、上記化学式２のＲ^１とＲ^２をメチル基としＲ^３とＲ^４を水素原子としたものである。

重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を室温まで冷却する。メタノール１００ｍＬに対して２Ｌの冷ジエチルエーテルを用い、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌する。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解する。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解し、溶液を凍結させた。溶液が完全に凍結した後、凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。こうしてポリマーを合成した。この熱応答性高分子（ＮＩＰ−ＴＥＴＡ）の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３５．５℃であった。

（化学式３／ｐＮＩＰ−Ｃｙｓの合成）
まず合成の中原料であるアクリロイルシスタミン［以下ＡＣ−Ｃｙｓ］溶液を以下の手順で合成した。５０ｍＬ遠心沈殿管に水５ｍＬ、シスタミン硫酸塩を０．２５０ｇ添加し、溶解させた。その後、１０Ｍ水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを約１０に調整した。この溶液にアセトニトリル５ｍＬ及び塩化ナトリウムを添加して水相とアセトニトリル相に分離させた。このとき塩化ナトリウムは０．１ｇずつを２相に分かれるまで添加した。２相のうちアセトニトリル相だけを分取して３００ｍＬ三角フラスコに移した。水相にはアセトニトリル５ｍＬを添加して攪拌し、再び２相に分離させ、アセトニトリル相を分取して先ほどの３００ｍＬ三角フラスコに加え、攪拌しつつ冷却した。ここに１．４−ジオキサン５０ｍＬ及び塩化アクリロイル１．６２５ｍＬの混合溶液を滴下して攪拌を続けた。滴下終了後に生じた白色沈殿を濾別して、沈殿に水１００ｍＬを添加して溶解したのちに１Ｍ水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを５に調整した。この溶液に含まれるＡＣ−Ｃｙｓはそれ以上生成せずに重合に用いた。

５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：シスタミンの物質量）がモル比で９９：１（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）２２．４１ｇ（０．１９８ｍｏｌ）とＡＣ−Ｃｙｓ溶液を加えた。攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温した。重合開始剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．５ｍＬ及び重合促進剤としてペルオキソ二硫酸カリウム０．５４０６ｇを添加して、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿法によりポリマーの精製を２回行った。その後、得られたポリマーを水に溶解して凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成した熱応答性高分子の構造式は、上記化学式３のＲ^１とＲ^２及びＲ^７とＲ^８をメチル基としＲ^３とＲ^４及びＲ^５とＲ^６を水素原子としたものである。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３２．９℃であった。

（化学式４／ｐＮＩＰ−Ａｌａの合成）
１００ｍＬビーカーにアラニンを２．１３８ｇ及び塩化アクリロイルを１．８４８ｇ添加して攪拌したのちに、一晩放置した。その後、水５０ｍＬを添加して溶解したのちに１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを５．０に調整した。この溶液を５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコに移し、水５０ｍＬ及びＮＩＰＡＡｍ２０．３７ｇを加えた。攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温した。重合開始剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．５ｍＬ及び重合促進剤としてペルオキソ二硫酸カリウム０．５４０６ｇを添加して、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿法によりポリマーの精製を２回行った。その後、得られたポリマーを水に溶解して凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成した熱応答性高分子の構造式は、上記化学式４のＲ^１とＲ^２及びＲ^５をメチル基としＲ^３とＲ^４を水素原子としたものである。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３３．２℃であった。

（化学式５／ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸の合成）
まず、ｐＮＩＰ−ＧＭＡを合成した。５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにＮＩＰＡＡｍを２１．５０ｇ、酸化アルミニウムで重合禁止剤を除去したグリシジルメタクリル酸（ＧＭＡ）を１．４２ｇ、１，４−ジオキサンを１００ｍＬ、重合促進剤として３−ＭＰＡを０．１ｍＬ及び重合開始剤としてＡＩＢＮを１．６ｇ加えた。攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、オイルバスを用いてフラスコを５５℃まで加温した。その後、加温を止めて室温まで放冷して２時間放置した。ｐＮＩＰ−ＧＭＡ溶液を５００ｍＬビーカーに移して乳酸７２ｇを添加したのちに密閉して室温で一晩放置した。攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、オイルバスを用いてフラスコを８０℃まで加温して８時間重合した。その後、密閉状態のまま室温で一晩放置し、精製した。合成した熱応答性高分子の構造式は、上記化学式５のＲ^１とＲ^２及びＲ^５をメチル基としＲ^３とＲ^４を水素原子としたものである。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３４．３℃であった。

（化学式６／ｐＮＩＰ−ＭＡの合成）
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコに、モノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＭＡの物質量）をモル比で（９０：１０）（ｍｏｌ％）となるようにＮＩＰＡＡｍ２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）とメタクリル酸（ＭＡ）１．７２ｇ（０．０２ｍｏｌ）を入れた。ＮＩＰＡＡｍとＭＡの含量が両者の和として３０質量％となるようにメタノール６５．２ｍＬを添加してモノマーを溶解した。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温し、攪拌しながら、重合促進剤として３−ＭＰＡ（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）を、重合開始剤としてＡＩＢＮ０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加して、脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を室温まで冷却する。メタノール１００ｍＬに対して２Ｌの冷ジエチルエーテルを用い、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌する。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解する。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解し、溶液を凍結させた。溶液が完全に凍結した後、凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。合成したｐＮＩＰ−ＭＡの構造式は上記化学式６のＲ^１とＲ^２をメチル基としＲ^３とＲ^４を水素原子としたものである。

（混合溶液の調製）
１０ｍＬメスフラスコに金ナノクラスター溶液を３ｍＬ採り、２質量％の熱応答性高分子溶液を５．０ｍＬ加えて１０ｍＬ定容とした。さらに、この実験で用いた基本的な条件は、水浴を用いた加熱条件を９０℃、３０分とし、放冷後の冷却条件は冷暗所で４℃、１時間とした。

Ｐ−ＮＩＰを熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ａ」、ｐＮＩＰ−ＡＣを熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ｂ」、ｐＮＩＰ−Ｃｙｓを熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ｃ」、ｐＮＩＰ−Ａｌａを熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ｄ」、ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸を熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ｅ」、ｐＮＩＰ−ＭＡを熱応答性高分子として用いたものを「混合溶液Ｆ」とした。

なお、上記の熱応答性高分子合成において、合成した熱応答性高分子の限外濾過には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の限外ろ過膜（排除限界分子量：１００００）を装備したプラスチック製ウルトラフィルター用限外濾過器（アドバンテック株式会社製、ＭＯＤＥＬ−ＵＨＰ−Ｋ）を使用した。合成した熱応答性高分子の凍結乾燥には、オイルミストトラップ（アルバック機工製株式会社、ＯＭＴ−０５０Ａ型）を備え付けた直結型油回転真空ポンプ（アルバック機工株式会社製）、ユニトラップ（東京理科器械株式会社製、ＵＴ−１０００型）、及び水分トラップ（東京理科器械株式会社製、ＣＭＷ−１型）を装備した凍結乾燥機（東京理科器械株式会社製、ＦＤ−５Ｎ型）を使用した。

［評価方法］
得られた各混合溶液について、濃度、加熱時間、加熱温度等を変化させたとき、金ナノ粒子の平均粒径と混合溶液の吸光度を測定した。金ナノ粒子の平均粒径は、ＤＬＳ（動的光散乱）測定装置（Malvern Instruments株式会社製、Zetasizer nano ZS）で測定した。また、ＴＥＭ写真から計測した粒径も必要に応じて評価した。吸光度は、光路長１ｃｍのプラスチックセルを装備した紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製、Ｖ−５６０型）を使用し、波長１９０〜９００ｎｍで吸収スペクトルを測定した。また、ｐＨの測定には、ｐＨメーター（株式会社堀場製作所製、Ｆ−１３）を使用した。熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は、熱応答性高分子の透過率曲線から求め、透過率が５０％での温度をそれぞれの熱応答性高分子のＬＣＳＴとした。なお、透過率の測定には、光路長１ｃｍプラスチックセルを装備したダブルビーム分光光度計（日立製作所製、Ｕ−２０００Ａ型）を使用した。

なお、下記の結果において、ＴＥＭ写真から計測した粒径と、ＤＬＳで計測した粒径との相違は、ＴＥＭ写真では実際の金ナノ粒子の塊の範囲を示しているが、ＤＬＳでは、流体力学的な直径としての大きさ、すなわち熱応答性高分子と水和物とを含む流体粒子の大きさを示していることによる相違である。

［結果］
（混合溶液Ａからの金ナノ粒子の製造）
表１は混合溶液Ａでの結果である。図２は混合溶液中のＰ−ＮＩＰの濃度を変えたときの波長１９０〜９００ｎｍで吸収スペクトルの測定結果である。図３は加熱温度を変化させたときの金ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図４は動的光散乱（ＤＬＳ）による粒径の測定結果である。混合溶液Ａを加熱冷却すると５５０ｎｍ付近に吸収ピークが生じた。この吸収ピークはＰ−ＮＩＰの濃度の増加によって増加した。この吸収ピークの増加は、目視でほぼ透明な溶液が加熱により赤みを帯びることでも確認できた。このとき、粒径が６０〜９０ｎｍ程度の大きな金ナノ粒子の存在がＴＥＭ像により確認できた。Ｐ−ＮＩＰを添加していない条件では、混合溶液Ａを加熱冷却してもこうした挙動は見られなかった。

また、加熱温度の上昇及び加熱時間の増加にともない、吸光度は増加した。また、ＤＬＳでの粒径測定結果では、濃度とともに粒径が大きくなった。平均粒径の増加と最大吸光度の増加との間に相関が見られた。これらの結果から、混合溶液Ａを加熱冷却することにより、Ｐ−ＮＩＰ鎖の収縮によって所定の大きさの金ナノ粒子を製造することができ、金ナノ粒子の大きさを制御できることがわかった。なお、ＴＥＭ像での粒径計測は温度変化の実験時に行ったが、濃度変化の実験及び時間変化の実験でも同様の吸光度の結果が得られているので、同程度の粒径の金ナノ粒子が製造されていると推察できる。

（混合溶液Ｂ〜Ｅからの金ナノ粒子の製造）
表２は混合溶液Ｂ〜Ｅの加熱前後の結果である。加熱条件としては、熱応答性高分子の濃度１．０質量％、加熱温度９０℃、加熱時間３０分とした。混合溶液Ｂ〜Ｅにおいても、上記混合溶液Ａの場合と同様の吸光度結果が得られた。この結果は、表１の結果と同様の結果を示すものであり、同程度の粒径の金ナノ粒子が製造されていると推察できる。また、加熱冷却により目視でほぼ透明な溶液が加熱により赤みを帯びたことからも、同程度の粒径の金ナノ粒子が製造されていると推察できる。

（混合溶液Ｆからの金ナノ粒子の製造）
熱応答性高分子であるにもかかわらず、ｐＮＩＰ−ＭＡでは金ナノ粒子を製造できなかった。これは、カルボキシル基が分散安定剤として作用し、ｐＮＩＰ−ＭＡ中のカルボキシル基が粒径５０ｎｍ以上の大きな粒子の製造を阻害したことが考えられる。

（安定性）
製造した各金ナノ粒子は、凝集や沈殿を生じることなく長期間安定であり、簡易診断キット等、医療用途や診断薬分野への適用が期待される。

［ポリ（メチルビニルエーテル）とヒドロキシプロピルセルロースの実験例］
次に、熱応答性高分子であるポリ（メチルビニルエーテル）とヒドロキシプロピルセルロースについても、上記したＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーの場合と同様にして確認実験を行った。条件としては、金ナノクラスター０．０４３ｇ−Ａｕ／Ｌと熱応答性高分子１．０質量％とを含む金ナノ粒子の製造用溶液を調製し、加熱条件としては９０℃３０分で行った。冷却条件は前記と同様にした。その結果、ポリ（メチルビニルエーテル）を熱応答性高分子として用いた金ナノ粒子の製造用溶液、及びヒドロキシプロピルセルロースを熱応答性高分子として用いた金ナノ粒子の製造用溶液のいずれも、加熱、冷却により、ＴＥＭ像からの計測で、粒径約８０ｎｍ前後の金ナノ粒子の形成を確認した。また、表３に示すように、上記混合溶液Ａの場合と同様の吸光度結果が得られた。

［チオール基の検出方法］
金ナノ粒子の製造用溶液を加熱冷却して金ナノ粒子を製造する過程で、チオール基を含むチオール化合物を添加したときに、吸光度に変化が見られたので検討した。

表４は、混合溶液Ａを用い、その溶液に各種の添加物質を加えたときの吸光度を測定した結果である。なお、加熱温度は９０℃、加熱時間は３０分である。添加物質としては、グリシン（Ｇｌｙ）、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）を用いた。表４の結果より、グリシン（Ｇｌｙ）吸収スペクトルに変化は見られなかった。一方、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）、３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）では添加濃度の上昇とともに５５０ｎｍ付近の吸光度が減少した。このことから、図１に示すように、チオール基が金ナノ粒子の製造に対して阻害作用を有していると考えられる。こうした阻害作用は、チオール化合物が金ナノ粒子に吸着することで、金ナノ粒子同士の接触・融合が阻んでいるためであると考えられる。

この実験では、金ナノ粒子の製造溶液に試験試料を添加した溶液を加熱冷却した後、波長５５０ｎｍでの吸光度が減少した場合は、その試験試料には、チオール基含有化合物が含まれている可能性が高いということができ、金ナノ粒子の製造用溶液をチオール基含有化合物の検出溶液として利用できる。

Claims

塩化金酸溶液とポリオキシエチレン溶液を混合した後にテトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を添加して金ナノクラスターを得る工程と、
該金ナノクラスターと、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロースとを含む混合溶液を準備する工程と、
該混合溶液を４０℃以上９５℃以下で加熱し冷却し、ＴＥＭ像から計測できる粒径が５０〜１００ｎｍの範囲であり、動的光散乱法での測定で粒径１００〜５００ｎｍにピークを示す金ナノ粒子を得る工程と、
を有することを特徴とする金ナノ粒子の製造方法。
前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−アミン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−シスタミン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ＡＣ−アラニン）、及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）から選ばれる１又は２以上である、請求項１に記載の金ナノ粒子の製造方法。
塩化金酸溶液とポリオキシエチレン溶液を混合した後にテトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を添加して得る金ナノクラスターと、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロースとを含む溶液を準備し、該溶液に試験試料を添加して４０℃以上９５℃以下で加熱、冷却し、該冷却後の溶液を波長５５０ｎｍで吸光度測定することを特徴とするチオール基の検出方法。