CN115870494B - 一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戊烯酸‑异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料及制备方法。该方法步骤如下：1、戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物的制备；2、戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物修饰的超小粒径金纳米晶材料的制备。本发明采用2‑(十二烷基硫基硫代羰基硫基)‑2‑甲基丙酸作为高分子的端基，后使用硼氢化钠将高分子端基予以还原得到巯基，进而与超小粒径的金核结合，实现了一根高分子链段与金核表面仅有一个结合位点。本发明通过工艺方法的优化控制金纳米团簇的粒径小于2nm。本发明所制备的超小粒径金纳米晶材料在体外实验中体现出了抑制Aβ蛋白错误折叠与纤维化的能力。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料制备与合成技术领域，具体涉及一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料及制备方法。
背景技术
异丙基丙烯酰胺是一种温敏性化合物，在温度较高时，其呈现出疏水性，在温度较低时其呈现出亲水性，利用其这一特点，可将其通过聚合反应制备成温敏性高分子。经过修饰的聚异丙基丙酰胺可以通过自组装的方式与其它高分子在水中一同形成胶束。目前的研究已经表明这一类的胶束能够抑制Aβ蛋白和Amylin蛋白等蛋白质的错误折叠与纤维化（Angew Chem Int Ed Engl. 2014;53(34):8985–90，ACS MacroLett. 2021;10(6):662–70.），而Aβ蛋白和Amylin蛋白等蛋白质的错误折叠与纤维化已经被证明与阿尔兹海默症和二型糖尿病等蛋白质构象病密切相关。
金纳米团簇通常由几个到几百个金原子组成的核以及表面的配体组成，其尺寸大多在1-3 nm左右，其尺寸与电子的费米波长接近，其结构更接近于分子而非金属，故能让体现出许多金纳米粒子所不具有的优点，其在光学、催化、传感、医药等领域表现出了极大的潜力。现有的研究表明，小粒径的金纳米团簇能够有效的抑制Aβ蛋白的错误折叠与纤维化，而较大粒径的金纳米粒子则无法实现上述功能。
目前已有多种制备金纳米团簇的方法，但其制备得到的金纳米团簇表面修饰的配体往往是小分子，以高分子为配体制备粒径小于2 nm的超小粒径金纳米团簇的方法目前尚未有报道。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料及制备方法。
本发明采用2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸作为高分子的端基，后使用硼氢化钠将高分子端基予以还原得到巯基，进而通过巯基将高分子与金结合。本发明中制备的金纳米团簇的高分子配体尽在端基通过金硫键与金核结合，故金核的表面结构较为清洗，同时一根高分子链段与金核表面仅有一个结合位点。有效解决了现有高分子往往没有利用端基与金团簇配位结合，故金核的表面结构往往未知，且存在一根高分子链段与金核表面多个位点结合的可能的技术问题。
本发明在通过硼氢化钠还原高分子端基得到巯基以后，通过稀盐酸除去了硼氢化钠，并在碱性条件下让巯基与氯金酸间相互作用，得到一价金络合物，随后让一价金络合物再次与硼氢化钠反应，避免了三价金与硼氢化钠的直接接触，使得反应产物中尺寸较大的金纳米粒子的量大大减少。进而，有效解决了现有高分子修饰的金纳米团簇的制备过程中通常将氯金酸与高分子混合后，再加入硼氢化钠溶液，这会导致三价金与硼氢化钠间的接触，往往容易导致反应产物中存在尺寸较大的金纳米粒子，且难以去除的问题。
本发明提供的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物的制备
（1）将N-异丙基丙烯酰胺、4-戊烯酸、2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸以及偶氮二异丁腈，溶解于有机溶剂中，得到溶液A；
（2）将溶液A多次循环冷冻-抽气-融化后，充入惰性气体；
（3）搅拌加热反应至完全，滴加碱性溶液得到溶液B；
（4）将溶液B进行透析，再经冻干得到戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物；
步骤二：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物修饰的超小粒径金纳米晶材料的制备
（1）取戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物溶于冰水中，在冰浴的环境下加入还原剂，反应至完全；
（2）在冰浴条件下，向步骤（1）的溶液中滴加酸至没有新的气泡产生，再用碱液将pH调节至10；
（3）在冰浴条件下，向步骤（2）的溶液中加入氯金酸的水溶液，反应至完全；
（4）在冰浴条件下，向步骤（3）的溶液中加入还原剂，反应至完全；
（5）将步骤（4）的溶液进行透析，再经冻干即得。
进一步，所述步骤一（1）中，N-异丙基丙烯酰胺、4-戊烯酸、2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸和偶氮二异丁腈的摩尔比250-350:60-100:16-24:3-5。
进一步，所述步骤一（2）中，循环次数为3-5次。
进一步，所述步骤一（3）中，加热反应温度为60-80℃，搅拌速度为1200-1800 r/min。
进一步，所述步骤一（4）中，透析的截留分子量为不超过1000 Da。
进一步，所述步骤二中，还原剂为硼氢化钠的水溶液，浓度为0.08-0.12 mol/L。
进一步，所述步骤二（1）中，戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物：还原剂为1g：1-1.5mmol。
进一步，所述步骤二（3）中，氯金酸溶液的质量分数为1.5-2.5%；所述步骤二（3）、（4）中，氯金酸溶液：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物：还原剂为1ml：0.1-0.3g：0.1-0.3ml。
进一步，所述步骤二（5）中，透析的截留分子量为30000-40000Da。
反应路径如下：
第二方面，本发明提供利用第一方面所述方法制备的戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明采用2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸作为高分子的端基，后使用硼氢化钠将高分子端基予以还原得到巯基，进而与超小粒径的金核结合，实现了一根高分子链段与金核表面仅有一个结合位点；
（2）制备的戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物具有酰胺基和羧基支链结构，可以有效提高分子间的分散性，利于控制粒径；
（3）所述方法先在碱性环境下让巯基与氯金酸间相互作用，得到一价金络合物，随后让一价金络合物再次与硼氢化钠反应，避免了三价金与硼氢化钠的直接接触，使得反应产物中尺寸较大的金纳米粒子的量大大减少，进而控制金纳米团簇的粒径小于2 nm；
（4）本发明所制备的超小粒径金纳米晶材料在体外实验中体现出了抑制Aβ蛋白错误折叠与纤维化的能力。
附图说明
图1由上至下分别为戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）、4-戊烯酸（4-PA）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（DDMAT）的傅立叶变换红外光谱图；
图2为由上至下依次为戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）、4-戊烯酸（4-PA）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（DDMAT）的核磁共振氢谱图；
图3为戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）的Zeta电位分布图；
图4为（a）不同温度下戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）在水溶液中的粒径分布；（b）5℃下戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物水溶液的照片；（c）37℃下戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物水溶液的照片；
图5为戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）与金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的紫外-可见吸收光谱图；
图6为2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（DDMAT）、戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）与金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的傅立叶变换红外光谱图；
图7为金纳米晶材料的X-射线光电子能谱图；
图8为金纳米晶材料的X-射线光电子能谱中Au的细分谱图；
图9为金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的Zeta电位分布图；
图10为金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的水合粒径的分布图；
图11为金纳米晶材料在高分辨透射电镜下的形貌图，其中标尺为5nm；
图12为金纳米晶材料的粒径统计分布图；
图13为不同浓度的金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）与20μmol·L-1的Aβ40共同孵育的ThT荧光动力学曲线图；
图14为不同浓度的金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）与20μmol·L-1的Aβ40共同孵育的tlag/ t0统计图，其中对照组成核所需时间为t0，各实验组成核所需时间为tlag；
图15为不同浓度的金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）与20μmol·L-1的Aβ40共同孵育的平台期荧光强度统计图；
图16为20μmol·L-1的Aβ40与不同浓度的金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）共孵育后的AFM形貌图；
图17为金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的圆二色光谱图；
图18为Aβ40在单独孵育24小时前后的圆二色光谱图；
图19为Aβ40在与50μg/mL的金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）共孵育24小时前后的圆二色光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明，本发明的内容完全不限于此。
实施例1
制备戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料的方法，步骤如下：
步骤一：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物的制备
①取N-异丙基丙烯酰胺10mmol、4-戊烯酸2.5 mmol、2-（十二烷基硫基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸0.625 mmol以及偶氮二异丁腈0.125 mmol，溶解于10 ml的二甲亚砜中，最后将溶液转移至Schlenk瓶中。
②通过液氮将Schlenk瓶中的液体冷却至完全凝固后，通过机械式真空泵将Schlenk瓶中气体抽出，随后将Schlenk瓶密封，并置于35 ℃的温水中将液体解冻，液体解冻后，重复上述操作。上述的液氮冷冻-抽气-融化循环需进行3次。最后一次循环完成后在Schlenk瓶中充满氮气或氩气。
③将Schlenk瓶置于70 ℃的油浴锅中，在1500 r/min的磁力搅拌下，反应8小时。
④反应结束后，取0.1 mol/L的氢氧化钠溶液20mL，在冰浴和磁力搅拌下，将Schlenk瓶中的液体缓缓滴入上述的氢氧化钠溶液中。
⑤将上一步中得到的混合溶剂放入截留分子量为500 Da的透析袋中，进行透析，每4小时换一次水，持续两天。
⑥将透析袋中的液体冷冻干燥即可获得戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物。
步骤二：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物修饰的超小粒径金纳米晶材料的制备
①取戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物0.4 g溶于20 mL冰水，在冰浴的环境下加入0.1 mol/L的硼氢化钠溶液5 mL，反应15分钟。
②在冰浴条件下，向上述溶液缓慢滴加稀盐酸至没有新的气泡产生，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调节至10。
③在冰浴条件下，向上述溶液中加入质量分数为2%的氯金酸的水溶液2 mL，反应30分钟。
④在冰浴条件下，向上述溶液中加入0.1 mol/L的硼氢化钠溶液0.4 mL，反应30分钟。
⑤将上述溶液置于截留分子量为35000 Da的透析袋中，进行透析，每4小时换一次水，持续2天。
⑥将透析袋中的液体冷冻干燥即可获得戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物修饰的超小粒径金纳米晶材料。
实施例2
图1至图4为戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物（PNPA）的基本表征，其中：
图1和图2表明成功得到了一种异丙基丙烯酰胺与4-戊烯酸的共聚物，即PNPA；
图3表明PNPA在水溶液中带有较强的负电荷，这进一步证明了PNPA的成功合成，同时为PNPA通过静电相互作用抑制Aβ蛋白的错误折叠与纤维化提供了前提条件；
图4表明PNPA具有明显的温敏性，在低温下呈现亲水性，在体温（37℃）下疏水性，同时为PNPA通过亲水-疏水相互作用抑制Aβ蛋白的错误折叠与纤维化提供了前提条件。
图5至图12为金纳米晶材料（PNPA@AuNCs）的基本表征，其中：
图5和图6证明了PNPA已经成功的作为配体接到了金纳米晶的表面，即金纳米晶材料已被成功合成；
图7和图8证明了PNPA@AuNCs具有传统金纳米晶材料所共有的价键特点，即同时存在1价金和0价金；
图9表明PNPA@AuNCs具有较低的表面电位，在水中较为稳定，不易聚集，同时为PNPA@AuNCs通过静电相互作用抑制Aβ蛋白的错误折叠与纤维化提供了前提条件；
图10是通过动态光散射技术得到的PNPA@AuNCs的粒径分布图。
图11和图12是透射电子显微镜技术得到的PNPA@AuNCs的金核粒径分布图。
应用实施例1
PNPA@AuNCs抑制蛋白纤维化程度以及抑制Aβ蛋白的错误折叠
PNPA@AuNCs与Aβ40共同孵育的方法：
①在96孔板中每孔加入100μL 不同浓度的PNPA@AuNCs溶液或100μLPBS溶液（使PNPA@AuNCs的终浓度为50μg·mL-1、20 μg·mL-1、10μg·mL-1、5 μg·mL-1、1μg·mL-1和0 μg·mL-1）
②加入100μL Aβ40蛋白溶液（Aβ40终浓度为20μmol·L-1）
③加入50μLThT溶液（ThT终浓度为20μmol·L-1）。
④在37℃下孵育，定期检测荧光强度。
ThT会和Aβ蛋白纤维化的部分相结合，并在特定波长的光的照射下发射出荧光，故荧光强度越高，Aβ蛋白纤维化程度越高。
图13、图14和图15说明了PNPA@AuNCs能够剂量依赖性的延缓Aβ蛋白纤维化的速度（图14），同时抑制Aβ蛋白纤维化的程度（图15）。
PNPA@AuNCs与Aβ40共同孵育后，通过原子力显微镜观察了Aβ40的形貌，见图16，其中：
在未添加PNPA@AuNCs时Aβ40纤维化程度较高，添加10μg·mL-1的PNPA@AuNCs后纤维化程度明显降低，添加50μg·mL-1的PNPA@AuNCs后已经观察不到Aβ40纤维。
通过圆二色光谱观察PNPA@AuNCs抑制Aβ40错误折叠的方法：
配制适量含与不含50μg·mL-1的PNPA@AuNCs的溶液各一份，其中加入Aβ40蛋白使其终浓度为20μmol·L-1。在恒温水浴摇床上孵育24小时后，监测其圆二色光谱的变化。
图17表明PNPA@AuNCs不存在圆二色光谱信号，不会对测定产生干扰。
图18表明在24小时内Aβ40蛋白的圆二色光谱信号已经由200nm转移到218nm，错误折叠已经发生。
图19表明在24小时内与PNPA@AuNCs共孵育的Aβ40蛋白的圆二色光谱信号未发生明显变化，即PNPA@AuNCs能够有效抑制的Aβ40错误折叠。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物的制备
(1)将N-异丙基丙烯酰胺、4-戊烯酸、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸以及偶氮二异丁腈，溶解于有机溶剂中，得到溶液A；
(2)将溶液A多次循环冷冻-抽气-融化后，充入惰性气体；
(3)搅拌加热反应至完全，滴加碱性溶液得到溶液B；
(4)将溶液B进行透析，再经冻干得到戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物；
步骤二：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物修饰的超小粒径金纳米晶材料的制备
(1)取戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物溶于冰水中，在冰浴的环境下加入还原剂，反应至完全；
(2)在冰浴条件下，向步骤(1)的溶液中滴加酸至没有新的气泡产生，再用碱液将pH调节至10；
(3)在冰浴条件下，向步骤(2)的溶液中加入氯金酸的水溶液，反应至完全；
(4)在冰浴条件下，向步骤(3)的溶液中加入还原剂，反应至完全；
(5)将步骤(4)的溶液进行透析，再经冻干即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一(1)中，N-异丙基丙烯酰胺、4-戊烯酸、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸和偶氮二异丁腈的摩尔比为250-350:60-100:16-24:3-5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一(2)中，循环次数为3-5次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一(3)中，加热反应温度为60-80℃，搅拌速度为1200-1800r/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一(4)中，透析的截留分子量为不超过1000Da。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中，还原剂为硼氢化钠的水溶液，浓度为0.08-0.12mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二(1)中，戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物：还原剂为1g：1-1.5mmol。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二(3)中，氯金酸溶液的质量分数为1.5-2.5％；所述步骤二(3)、(4)中，氯金酸溶液：戊烯酸与异丙基丙烯酰胺共聚物：还原剂为1ml：0.1-0.3g：0.1-0.3ml。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二(5)中，透析的截留分子量为30000-40000Da。
10.一种戊烯酸-异丙基丙烯酰胺共聚物修饰超小金纳米材料，其特征在于：采用权利要求1-9任一项所述的方法制备。
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