KR102009605B1 - Ccl23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물 - Google Patents
Ccl23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CCL23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물 및 식품 조성물, CCL23을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CCL23을 유효성분으로 포함하는 조성물은 내분비 물질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 자궁내막 세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시킴으로써 착상 효율을 크게 증가시킬 수 있는바, 임신 촉진제, 여성 불임증을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 CCL23을 유효성분으로 포함하는 조성물은 내분비 물질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 자궁내막 세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시킴으로써 착상 효율을 크게 증가시킬 수 있는바, 임신 촉진제, 여성 불임증을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CCL23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물 및 식품 조성물, CCL23을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 고령화 사회와 함께, 출산을 하는 산모의 나이가 높아지면서 불임이 증가하고 있다. 또한, 산업화로 인한 환경오염과 여성의 사회진출 등으로 인해 여성이 받는 스트레스가 증가하면서, 임신율이 크게 낮아지고 있는 실정이다. 일반적으로 알려진 여성 불임의 원인으로는 배란장애, 수정란의 이송장애 및 착상 장애 등이 있다. 배란장애와 수정란의 이송장애에 의한 불임 문제는 시험관아기시술법(IVF)을 통해 대부분 해결되고 있으나, 착상 장애에 의한 불임은 아직까지 명확한 해결 방법이 없는 실정이다.
성공적인 임신을 유지시키기 위해서는 배아의 발달, 자궁 내막의 발달, 착상, 태반형성, 호르몬 조절, 모체와 태아 간 영양소 및 가스의 교환이 필요시 된다(Spencer TE et al, Reproduction, 128(6):657-668, 2004).
임신 초기 태아는 자궁내막에 착상하기 위해 구형태의 배반포에서 필라멘트 모양으로 형태학적 변화를 겪으며, 성공적인 비침투성 태반을 형성한다 (Bazer FW and Johnson GA, Differentiation, 2014).
착상 전 기간(peri-implantation period) 중 수태산물로부터 분비되는 에스트로겐은 프로스타글란딘 F 2α의 분비를 막음으로써 황체융해(luteolysis)를 막고 자궁 내막 조직을 리모델링하여 착상을 위한 자궁 환경을 형성한다(Bazer FW and Johnson GA, Differentiation, 87(1-2):52-65, 2014).
착상(implantation)이란, 수정되어 배아로 발달중인 배반포(blastocyst)가 모체의 자궁내막 층에 부착되는 임신 초기의 현상으로, 탈락막화(decidualization)가 유발된 모체의 자궁내막 층과 배아의 세포영양막세포(cytotrophoblast)와의 세포 융합(cell fusion)에 의하여 합포영양막세포(syncytiotrophoblast)를 형성하면서 착상이 이루어지게 된다.
한편, 여성 생식기관 내 소포체 스트레스에 의한 세포사멸은 비정상적인 생식기관의 발달과 임신을 방해하는 요소로 작용하는데, 특히 소포체 스트레스는 마우스 내 비정상적 태반 발달을 야기시키고 여성에서는 태아 성장 지연과 임신중독증, 유산을 야기시키는 것으로 알려져 있다(Mizuuchi et al., J Pathol, 2016; Yung et al., Am J Pathol, 2008; Gao et al., Mol Biol Rep, 2012).
따라서, 성공적인 착상을 위해서는 자공내막 세포가 충분히 증식, 분화, 발달되어야 할 뿐만 아니라 소포체 스트레스를 감소시킬 필요성이 있다.
전술한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 자궁내막 세포의 증식성을 향상시킴과 동시에 소포체 스트레스를 감소시킴으로써, 임신 초기 착상 효율과 임신 유지 능력을 증진시킬 수 있는 물질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 케모카인 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)이 PI3K/AKT와 ERK1/2 MAPK 신호전달경로를 활성화시켜 자궁내막 세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 이용하여 자궁내막 세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 이용하여 자궁내막 세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CCL23을 유효성분으로 포함하는 조성물은 내분비 물질을 원료로 하는바 화학적 합성물에 비해 체내 독성 내지 부작용을 최소화할 수 있으며, PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달경로 내 단백질의 발현 활성화를 통해 자궁내막 세포의 증식을 향상시키고, 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시킴으로써 착상 효율을 크게 증가시킬 수 있는바, 임신 촉진제, 여성 불임증을 예방 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 돼지의 발정주기와 임신 초기 자궁내막 조직 내 CCL23과 CCR1(chemokine (C-C motif) receptor type 1)의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 돼지의 발정주기와 임신 초기 자궁내막 조직 내 CCL23과 CCR1의 발현 위치를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 CCL23이 돼지 자궁내막 상피세포의 증식, 세포증식 인자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CCL23의 시간의존적 투여에 따라 돼지 자궁내막 상피세포 내 신호 전달 기전 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PI3K, MAPK 억제제와 CCL23의 혼합조성물에 의한 신호 전달 조절 인산화효소의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 CCL23이 돼지 자궁내막 상피세포의 세포주기와 소포체 스트레스에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지 자궁내막 상피세포의 증식 및 소포체 스트레스 완화 효과와 관련된 CCL23의 작용 기전을 나타낸 것이다.
도 2는 돼지의 발정주기와 임신 초기 자궁내막 조직 내 CCL23과 CCR1의 발현 위치를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 CCL23이 돼지 자궁내막 상피세포의 증식, 세포증식 인자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CCL23의 시간의존적 투여에 따라 돼지 자궁내막 상피세포 내 신호 전달 기전 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PI3K, MAPK 억제제와 CCL23의 혼합조성물에 의한 신호 전달 조절 인산화효소의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 CCL23이 돼지 자궁내막 상피세포의 세포주기와 소포체 스트레스에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지 자궁내막 상피세포의 증식 및 소포체 스트레스 완화 효과와 관련된 CCL23의 작용 기전을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 자궁내막 상피세포의 증식 및 소포체 스트레스 완화 효과와 관련된 CCL23의 작용 기전을 밝혔다(도 7).
본 발명은 CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 모두 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, "임신"은 수정란이 자궁 내벽에 착상하여 모체로부터 영양을 공급받으며 태아로 발육하는 과정으로, 정상적인 임신과정은 수정, 착상 및 태아발달의 순서로 진행된다.
상기 "수정"은 여성의 난소에서 배란된 난자가 수란관의 상부에서 정자와 만나면 수정란이 형성되는 것을 의미한다. 난자는 배란 후 1~2일, 정자는 자궁 내에서 2~3일 동안 살아남아서 수정할 수 있는 능력을 가지며, 정자의 경우 사정된 후 1주일까지 살아 있기도 한다. 정자는 사정된 후 2~3시간이면 수란관을 따라 난소 가까이까지 이르기 때문에, 일반적으로 정자가 먼저 수란관 상부에 도달해 있다가 난소에서 배란된 난자가 이곳에 이르면 여러 정자 중 하나만이 난자와 결합하여 수정란을 형성한다.
상기 "착상"은 수란관 상부에서 정자와 난자가 만나 형성된 수정란이 난할을 거듭하면서 자궁으로 이동하여 포배의 상태로 자궁 내벽에 파묻히는 현상을 의미한다. 수정란이 착상된 이후를 임신이라고 한다. 자궁에 착상한 수정란은 자궁 내벽으로부터 영양을 공급받으면서 약 9개월 동안 자란 후 태어나게 된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 CCL23은 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달기전을 활성화시킴으로써 자궁내막 세포의 증식 능력을 향상시켜 착상 효율을 증가시키는 효과를 가진다.
이때, 상기 자궁내막 세포는 포유동물 유래의 세포일 수 있으며, 상기 포유동물은 설치목(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 우제목(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소, 사슴, 기린 및 영양), 기제목(예를 들어, 말, 당나귀, 코뿔소 및 맥), 식육목(예를 들어, 개, 고양이, 호랑이, 늑대, 여우, 사자, 치타, 표범, 너구리, 오소리, 퓨마, 재규어 및 삵쾡이), 토끼목(토끼 및 우는 토끼), 식충목(예를 들어, 고슴도치, 두더지 및 솔레노돈) 및 영장목(예를 들어, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 보노보노, 일본원숭이, 붉은털원숭이)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 CCL23은 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시킴으로써 착상 효율을 증가시키는 효과를 가진다.
이때, 상기 소포체 스트레스 유도 단백질은 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, IRE1α, ATF6α, p-PERK, p-eIF2α, GRP78 및 GADD153로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 조성물은 CCL23을 단독으로 포함하거나, 임신 촉진에 효과가 있는 물질을 가 있는 물질을 유효성분으로 더 포함할 수 있고, 상기 유효성분 외에도 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분, 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 CCL23을 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 통상의 것을 모두 사용 가능하고, 일 예로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 성분들은 유효성분 즉,CCL23에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 임신 촉진용으로서 단독으로 사용될 수 있고, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제등과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 CCL23의 일일 투여량은 001 내지 10000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 1 내지 20㎎/㎏이고, 하루 1회 내지 3회에 나눠 투여하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 CCL23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 임신 촉진을 목적으로 하는 건강기능식품에 포함될 수 있으며, 본 발명의 유효성분을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 합성 또는 추출물로부터 분리된 것을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 또한 상기 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적절하게 조절하여 사용 될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 또는 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL23을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
상기 불임증은 여성 불임증(Female infertility)일 수 있다.
상기 여성 불임증은 난자의 비착상(Nonimplantation of ovum), 무배란과 관련된 여성 불임증(Female infertility associated with anovulation), 자궁관에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of tubal origin), 자궁관의 선천 이상과 관련된 경우(Associated with congenital anomaly of tube), 자궁관의 폐쇄(Tubal block), 자궁관의 폐색(Tubal occlusion), 자궁관의 협착(Tubal stenosis), 자궁에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of uterine origin), 자궁의 선천 이상과 관련된 경우(Associated with congenital anomaly of uterus), 자궁목에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of cervical origin), 남성 요인과 관련된 여성 불임증(Female infertility associated with male factors), 기타 요인에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of other origin) 및 상세불명의 여성 불임증(Female infertility, unspecified)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 "난자 비착상(Nonimplantation of ovum)"은 여성 불임증의 대표적인 원인이다. 착상시, 수정란이 세포분열을 하면서 이동하여 자궁속에 들어와 배반포 단게에 이르면 자궁내막에 파뭍혀 자리를 잡게 된다 그러나, 배아가 착상할 자궁내막의 두께가 충분치 않거나 손상으로 인해 경직될 경우 착상이 되기가 어려우며 자궁벽의 유착등으로 공간이 부족할 경우 유산되는 경우가 많다. 자연유산, 계류유산, 임신중절수술, 자궁내막염, 골반결핵 및 자궁내 장치등으로 유발된 자궁내 염증에 의해 자궁내막이 유착되거나, 자궁근종 폴립 등으로 자궁형태변형이나 자궁내막에 면역학적 과민반응이 생기거나, 선천적 자궁기형 호르몬 분비이상으로 자궁내막형성이 불완전할 경우 착상에 장애가 발생한다. 난자 비착상은 인공수정, 시험관 시술 실패의 가장 큰 원인으로 지목되고 있다.
상기 약학적 조성물 또는 식품 조성물은 상술한 CCL23을 유효성분으로 포함하는 약학적 제제 또는 식품 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 상기 CCL23을 포함하는 조성물을 이용하여 자궁내막 세포의 증식 능력을 향상시키는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예
<실험 방법>
실험동물 및 세포배양
수정 이후 12일째 되는 임신한 암퇘지로부터 수태산물을 분리하였으며 이로부터 자궁내막 상피 세포주를 레트로바이러스 (SV40) vector를 이용하여 불멸화 동정한뒤, DME/F12 1:1 배지에 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)과 항생제인 ZellShield를 함께 혼합하여 일차배양하였으며, 형태학적 분석과 상피세포 특이 항체인 시토케라틴에 염색되는 것을 확인하였다. 이후, 실험을 위해 25~30 계대 배양된 돼지 자궁내막 상피세포를 100-mm 세포배양용기에 단층배양하였으며, 80%정도까지 배양한뒤 24h 동안 FBS 결핍으로 만들어 준 뒤 CCL23을 처리하였다.
실험 재료
CCL23은 R&D systems로부터 구매하여 사용하였으며, CCL23에 의한 신호전달메커니즘을 확인하기 위하여 phospho-AKT, ERK1/2, P70S6K, JNK, S6, P38 단백질 및 total-AKT, ERK1/2, P70S6K, JNK, S6, P38 단백질을 Cell Signaling Techonology사로부터 구매하였다. 또한 타겟 신호전달과정을 억제함에 따른 효과를 규명하기 위하여 PI3K 억제제인 wortmannin을 Cell Signaling Technology사로부터, ERK1/2 억제제인 U0126, p-JNK 억제제인 SP600125, p-P38 억제제인 SB203580을 Enzo Life Science사로부터 구매하여 사용하였다.
Quantitative RT-
PCR
임신 초기와 비임신기의 자궁내막 조직으로부터 trizole (ambion)을 이용하여 total RNA를 추출하였으며, total RNA를 사용하여 reverse transcriptase, oligodT, random hexamer를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Nanodrop으로 농도와 순도를 측정하였으며 이후 진행될 quantitative RT-PCR 또는 cloning PCR을 위해 60ng/㎕로 희석하여 -20℃에 보관하였다. 합성한 cDNA를 대상으로 quantitative RT-PCR을 수행하였다. 프라이머는 Primer 3 프로그램을 이용하여 디자인하였으며, 돼지 CCL23 (GenBank accession no. XM_003131712.6: forward: 5‘-TTA CAC CCC ACG AAA AAT CC-3’; reverse: 5‘-TGA ACT TGC TCG TCA TCA GG-3’)와 돼지 CCR1 (GenBank accession no. NM_001001621.1: forward: 5‘-CCC TAT CAT CTA CGC CTT CG-30; reverse: 50-TTG TTT GCA GAG GTG TTT GG-3‘) primer를 사용하였으며, SYBR green (Sigma-Aldrich)을 이용한 real-time PCR 검출 시스템 (Applied Biosystems)을 실시하였다. 각 유전자 및 GAPDH 유전자의 분석은 세 번에 걸쳐서 반복 수행되었으며 발현량을 확인하기 위해 표준 곡선 및 Ct 값을 GAPDH 유전자의 발현량으로 표준화시켜 분석하였다. PCR 조건: 94℃, 3분 (변성 단계) 및 40 사이클 (94℃, 20초-변성; 60℃, 40초-어닐링; 72℃, 1분-연장하는 것으로 구성된 사이클)을 실시하는 단계. 온도를 10초 당 0.5℃의 속도로 55℃에서 95℃까지 증가시켜 연속적인 형광 측정을 획득함으로써 융해곡선 프로그램 (QuantStudio3) 분석을 실시하였다. Ct 값에 의해 얻어진 융해곡선에 따라 quantitative RT-PCR 산물을 동정하였고 상대적인 유전자 발현양상을 2-ΔΔCt 방법에 따라 분석하였다.
In situ
hybridization
자궁 내막 조직상에서 각 유전자의 mRNA 발현 위치를 검증하기 위하여 in situ hybridization 분석을 진행하였다. 산차별 자궁 내막 조직 내 선발 유전자의 mRNA 발현 위치를 검출하기 위하여 cRNA hybridization probe를 제작하였다. 모돈의 자궁 내막 조직으로부터 얻은 cDNA를 각 유전자들의 상보적인 방향의 돼지 CCL23 (GenBank accession no. XM_003131712.5: forward, 5‘-CCA CCG AGA AGA TGA AGA CC-3’; reverse, 5‘-TAA TTC AGG CCA AGG CTT CC-3’)과 돼지 CCR1 (GenBank accession no.NM_001001621.1: forward, 5‘-AGA GGC TCA GAA GCA TGA CC-3‘; reverse, 5’-CAT TTT CAG AGC CTG GAA CC-3‘) 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 단편들을 1% agarose gel에 로딩 후 100V로 30분간 전기영동을 실시하여 분리하였다. 각 유전자들의 DNA를 Wizard SV gel 및 PCR Clean-up 시스템 (Promega)으로 분리 정제하였다. TOPO TA cloning dual vector (Invitrogen)에 유전자 삽입 후 plasmid DNA를 추출하여 sequencing (Bioneer sequencing 의뢰) 진행하였으며, 각 서열에 대한 재조합 플라스미드를 BamHI과 XhoI 제한효소를 이용해 선형화 (linearization) 하여 T7, SP6 polymerase에 의해 딕옥시게닌(DIG)이 labeling 된 anti-sense, sense cRNA 프로브를 합성(Roche kit 사용)하였다. 파라핀에 포매된 산차별 모돈의 자궁 내막 조직을 5 ㎛로 박절하여 슬라이드를 형성하였으며, Xylene으로 슬라이드 위 조직 주위의 파라핀을 제거하고 100, 95, 70% 알코올로 수화시켰다. 1X PBS로 잔여 알코올을 제거하고 10 mM의 glycine이 포함된 1X PBS에 10분간 인큐베이션 하였따. 1% Triton X-100과 20분 동안 반응시킨 후, 1×PBS로 두 번에 걸쳐서 세척한 이후, proteinase K가 첨가된 TE buffer를 처리하고 4% paraformaldehyde를 녹인 1×PBS로 조직을 고정하였다. 고정 된 조직을 50% 포름아마이드 및 4×SSC (standard saline citrate)를 포함하는 전-혼성화 (prehybridization) 혼합물과 상온에서 15분 이상 반응시켰으며, 전-혼성화 후, 절편들을 40% 포름아마이드 및 4×SSC, 10% dextran sodium sulfate salt, 100㎍/ml fish sperm DNA, 100 ㎍/ml yeast tRNA 및 타겟 유전자에 대해 DIG-labeled RNA probe를 포함하는 혼성화 (hybridization) 혼합물과 42℃에서 18시간 동안 습도 유지 챔버에서 반응시켰다. 혼성화 이후, 슬라이드를 포름아마이드 및 SSC를 포함하는 일련의 용액들로 엄격 조건 (stringency) 하에서 세척하였고, 조직을 Alkaline phosphatase conjugated sheep-anti-DIG 항체 (Roche)와 하룻밤 동안 반응 시킨 후, 시그널을 0.4 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (Sigma), 0.4 mM nitrobluetetrazolium (Sigma) 및 2 mM levamisole (Sigma)을 포함하는 시각화 용액으로 검출하였다.
세포증식 분석
96-well plate에 자궁내막세포를 3×103cells/well로 분주하여 배양한 다음 serum-free DME/F12 1:1 medium으로 24시간 동안 배양하여 starvation을 진행한 다음 유용물질을 처리하고 48시간을 배양하여 10 μM BrdU를 첨가해 2시간 배양한 뒤 cell Proliferation ELISA, BrdU kit (Cat No. 11647229001, Roche)를 사용하여 세포 증식 정도를 확인하였다.
면역형광법
3×104 개의 자궁내막 상피세포를 10% FBS가 포함된 DME/F12 1:1 배지 300 μl와 함께 confocal dish (catalog number: 100350, SPL Life Science, Republic of Korea)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 CCL23 20ng을 30분 동안 처리한 뒤 메탄올로 10분간 세포를 고정하고, 1:200으로 희석된 PCNA, p-Cyclin D1 항체를 처리하였으며 대조군에는 rabbit IgG를 처리하여 4℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% BSA (bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 2번의 워싱과정을 거쳐 2차 항체로는 goat anti-rabbit IgG Alexa 488 (catalog number: A-11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 antibody dilution buffer에 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간동안 배양하였다. 자궁내막 상피세포를 0.1% BSA-PBS로 워싱한 다음 DAPI 염색을 추가적으로 시행하여 세포 내 타겟 단백질뿐만 아니라 핵을 동시에 관찰할 수 있도록 하였다. 실험 종료 후 LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
단백질 발현 분석 (
웨스턴블롯
)
돼지 자궁내막 상피세포에 CCL23 또는 세포신호전달 억제제와의 혼합물을 처리한 다음 세포로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동 수행한 뒤, nitrocellulose membrane으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 chemiluminescence detection (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약을 사용하여 ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
세포주기 분석
자궁내막 세포를 6-well plate에 배양하여 serum-free DME/F12 1:1 medium으로 24시간동안 starvation을 진행하고 농도 의존적으로 CCL23을 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 세포를 원심분리 하여 모아주고 0.1% BSA-PBS로 세포를 두 차례 씻어주고 70% 에탄올로 4℃에서 24시간동안 세포 고정을 해준 다음 세포를 원심분리 하여 모아주고 0.1% BSA-PBS로 세포를 두 차례 씻어주고 RNase A (Sigma-Aldrich)가 100 μg/mL 포함된 propidium iodide (PI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)으로 빛이 들어오지 않는 조건에서 30분 동안 염색한 뒤 Cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 형광을 측정하였다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
<결과 및 고찰>
발정주기와 임신 초기의 돼지 자궁내막 조직에서
CCL23과
CCR1의
발현 변화 양상 분석
발정주기와 임신 초기 돼지 자궁내막 조직을 대상으로 CCL23와 CCR1의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행하였으며, 측정 결과 CCL23과 CCR1의 발현이 임신 초기에 증가한다는 것을 확인하였다 (도 1). 또한 in situ hybridization 실험결과에서도 임신기에 CCL23과 CCR1의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 자궁내막 상피세포와 샘상피 세포에서 주로 발현되는 것을 확인하였다(도 2).
CCL23이
돼지 자궁내막 상피세포의 증식, 세포증식 인자의 발현에 미치는 영향
돼지 자궁내막 상피세포를 대상으로 CCL23를 처리하여 세포증식 분석을 진행한 결과, 돼지 자궁내막 세포의 증식은 CCL23의 처리량에 비례하여 함께 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 CCL23의 농도가 20ng/ml일 경우 130% 이상 세포 증식이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 자궁내막 상피세포를 대상으로 0~50ng의 CCL23을 처리하여 세포주기를 분석한 결과, 0ng에서 24.69%이였던 G2/M phase가 50ng에서 42.21%까지 처리량에 비례하여 증가하였으며, 세포 증식이 가속화됨을 확인하였다. 또한, 세포 증식 인자인 PCNA와 Cyclin D1을 면역형광기법으로 돼지 자궁내막 상피세포를 염색하여 확인한 결과 상기 세포 증식 인자의 발현이 CCL23에 의해 유도됨을 확인하였다(도 3).
CCL23의
시간의존적 투여에 따른 자궁내막 상피세포 내 신호전달기전 변화 분석
용량의존적 투여에 따른 세포 증식 양상 분석결과에 따라 20ng 농도의 CCL23을 0, 5, 15, 30, 60, 120분에 맞춰 시간의존적으로 투여한 후 세포로부터 단백질을 추출하여 PI3K 및 MAPK 신호전달 과정의 주요 신호전달매개 단백질인 AKT, P70S6K, S6, Cyclin D1, ERK1/2, JNK, P38 단백질의 인산화 양상을 확인한 결과, 상기 7가지 단백질 모두 CCL23을 15분 인큐베이션 하였을 때 대조군에 비해 증가하는 양상을 보임을 확인하였다(도 4).
자궁내막 상피세포 내
PI3K
/
AKT
,
MAPK
기전 불활성화에 의한 단백질 인산화 양상 분석
돼지 자궁내막 상피세포 내 CCL23에 의한 PI3K, MAPK 신호전달경로 조절양상을 확인하기 위하여 PI3K 억제제 wortmannin과 ERK1/2 억제제 U0126, JNK 억제제 SP600125, P38 억제제인 SB203580을 먼저 처리하여 타겟 신호전달기전을 억제한 후 CCL23을 추가적으로 처리한 결과, CCL23에 의해 활성화되었던 AKT, P70S6K, S6, Cyclin D1, ERK1/2, JNK, P38 단백질의 인산화가 감소됨을 확인하였다(도 5).
CCL23이
자궁내막 상피세포의 세포주기와 소포체 스트레스에 미치는 영향 분석
자궁내막 상피세포를 대상으로 소포체 스트레스 유도물질인 튜니카마이신(tunicamycin)을 처리한 결과, 소포체 스트레스 유발 시에 발현되는 IRE1α, ATF6α, p-PERK, p-eIF2α, GRP78, GADD153 단백질이 증가한 반면, 반면, 튜니카마이신과 CCL23을 혼합(+CCL23)한 경우 상기 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현이 모두 감소하는 양상을 보임을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 CCL23이 돼지 자궁내막 상피세포에서 내/외부 환경요인에 따라 발생한 소포체 스트레스를 완화시킨다는 것을 확인하였다(도 6).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 CCL23은 PI3K/AKT 및 ERK1/2 MAPK 신호전달기전을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 임신촉진용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 CCL23은 소포체 스트레스 유도 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 임신촉진용 약학적 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 소포체 스트레스 유도 단백질은 IRE1α, ATF6α, p-PERK, p-eIF2α, GRP78 및 GADD153로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 임신촉진용 약학적 조성물. - CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 식품 조성물.
- CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 불임증은 난자의 비착상(Nonimplantation of ovum), 무배란과 관련된 여성 불임증(Female infertility associated with anovulation), 자궁관에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of tubal origin), 자궁에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of uterine origin), 자궁목에서 기원한 여성 불임증(Female infertility of cervical origin) 및 남성 요인과 관련된 여성 불임증(Female infertility associated with male factors)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 불임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - CCL23(C-C motif chemokine ligand 23)을 유효성분으로 포함하는 불임증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 자궁내막 세포의 증식 능력을 향상시키는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180077594A KR102009605B1 (ko) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Ccl23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물 |
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| KR1020180077594A KR102009605B1 (ko) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Ccl23을 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물 |
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Citations (1)
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| WO2016154335A1 (en) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | University Of South Florida | Use of ccl2 to inhibit abnormal uterine bleeding |
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2018
- 2018-07-04 KR KR1020180077594A patent/KR102009605B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2016154335A1 (en) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | University Of South Florida | Use of ccl2 to inhibit abnormal uterine bleeding |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOLOGY OF REPRODUCTION 74, 896-904 (2006) * |
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