ES2532659A1 - Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero - Google Patents
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Abstract
Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo (biofluidos) para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero que comprende las siguientes etapas: a) fraccionamiento y procesado de los biofluidos mediante un tratamiento de selección, purificación, liofilización y su posterior almacenamiento; b) método de capacitación espermática en un medio de cultivo suplementado con biofluidos; c) fecundación in vitro en un medio enriquecido con biofluidos y d) posterior cultivo embrionario con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preimplantacional en medios suplementados con biofluidos.
Description
Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero Objeto de la invención La presente invención contempla un método para aumentar la calidad embrionaria mediante el uso de técnicas de fecundación in vitro (FIV), opcionalmente con preincubación de los ovo citos en fluidos biológicos naturales de fases específicas del ciclo reproductivo, combinado con un método de separación espermática en medio de cultivo suplementado con dichos fluidos y la posterior fecundación y cultivo embrionario (CE) en medios suplementados con fluidos. Sector de la técnica Esta invención pertenece de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Capacitación espermática, Fecundación in vitro y Cultivo embrionario. Antecedentes de la invención y estado de la técnica El procedimiento actualmente conocido para la obtención in vitro de un embrión supone la realización de distintas técnicas de reproducción asistida (ARTs) que difieren entre laboratorios y especies, y comprende los siguientes pasos: 1) la obtención y maduración in vitro (MIV) de los gametos femeninos (ovocitos); 2) la preparación y capacitación de los gametos masculinos (espermatozoides); 3) el proceso de fecundación in vitro en sí mismo ya sea mediante el cocultivo de los gametos o la microinyección asistida de un espermatozoide en el interior del ovocito, y 4) el CE para que los cigotos alcancen el estadio de desarrollo deseado, generalmente el de blastocisto. Una estrategia para incrementar la eficiencia de estas ARTs ha sido imitar en el laboratorio las condiciones que los gametos-cigotos-embriones encuentran in vivo donde, tras la ovulación, el ovo cito maduro es captado por el oviducto (trompas de
Falopio) contactando con su medio natural, el fluido oviductal (FO). Por su parte los espermatozoides "nadan" desde la vagina o el cérvix (según la especie) hasta el lugar de la fecundación (oviducto) contactando durante su paso por el útero con el fluido uterino (FU) y luego, cuando se encuentran ya en las proximidades del ovocito, con el FO. Una vez ambos gametos están en el oviducto se produce la fecundación y el desarrollo embrionario temprano siendo el FO el medio natural en el que ocurren estos eventos reproductivos. Posteriormente el embrión pasa al útero, siendo el FU el medio fisiológico donde se desarrollará hasta que ocurre la implantación y placentación. Por ello, con el objetivo de formular y/o adaptar nuevos medios de cultivo empleados in vitro y mejorar los resultados de fecundación y desarrollo embrionario, numerosos trabajos han estudiado la composición de estos fluidos naturales (/ritani et al. 1974, J Anim Sci 39: 582-588; Leese et al. 2008,Reprod Fertil Dev 20: 1-8). Sin embargo, no se han realizado investigaciones dirigidas a reproducir de una forma combinada y completa el ambiente fisiológico diseñando sistemas de cultivo integrales (desde la FIV hasta el CE) con medios más próximos a la composición de los fluidos biológicos naturales (FO y FU). Incluso a pesar de que, como se ha comprobado en la especie humana, la adición al medio de cultivo de una "simple" proteína oviductal incrementa en más de un 8% los nacimientos (Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789).
Sin duda, las secreciones oviductales y uterinas proporcionan mejores condiciones para la fecundación y el desarrollo embrionario que los sistemas in vitro convencionales ya que la composición de estos medios naturales varía a lo largo de las diferentes fases del ciclo reproductivo de la hembra proporcionando al ovocito, cigoto y/o embrión las condiciones idóneas para su desarrollo en cada momento (Killian et al. 1989, J Reprod Fertil 86: 419-426; Leese et al. 2008, Reprod Fertil Dev
20: 1-8). De forma genérica los biofluidos contienen sales, electrolitos, aminoácidos, componentes energéticos y proteínas. Entre las más de 150 proteínas oviductales que se han conseguido identificar (Avilés el al. 2010, Mol Human Reprod. 16: 896-906), algunas ya se encuentran disponibles comercialmente y se utilizan como suplemento a los medios de cultivo in vitro (Hao et al. 2006, Biol Reprod 75: 726-733; Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789). Sin embargo, se desconoce la composición completa y la concentración exacta de todos los componentes de los biofluidos por lo que la adición directa de los mismos a los medios de cultivo artificiales supone la estrategia más económica, rápida y fiable de suplementarios con todo aquello que los gametos, cigotos y/o embriones precisan en cada una de las etapas.
En mamíferos, incluida la especie humana, los FO y/o FU se obtienen mediante distintas técnicas y generalmente se procesan con una única centrifugación y posterior congelación de la fracción líquida (Carrasco et al. 2008a, Reprod Fertil Dev 20: 808817; Carrasco et al. 2008b, Reproduction 136: 833-842; Faulkner et al. 2012, Proteomics 12: 2014-223; Lippes y Wagh 1993, Fertil Steril 59: 157-162;Velazquez et al. 2010, Theriogenology 73: 758-767). Estos biofluidos mejoran las tasas de fecundación y aumentan la calidad embrionaria (Aitken 1977, J Embryol Exp Morphol
41: 295-300;Cebrian-Serrano et al. 2013, ReprodDomestAnim 48: 331-338; Coy et al. 2008a, PNAS 105: 15809-15814; Lloyd et al. 2009, Reproduction 137: 679-687). A
pesar de estos resultados alentadores, hasta la fecha no se han empleado los biofluidos como aditivos en las ARTs humanas lo que abre un campo nuevo de investigación, especialmente si consideramos que, en la mayoría de ocasiones, el efecto beneficioso sobre gametos y embriones es interespecífico, es decir, que los biofluidos de una especie de mamífero pueden utilizarse para las ARTs de otra especie diferente (Mondéjar et al. 2013, HumReprod 28: 718-728; Rondeau et al. 1996, Can J Vet Res 60:14-20). Hasta ahora el procesado de los biofluidos, el almacenamiento y el transporte de las muestras requieren una temperatura controlada para mantener la cadena de frío, condicionando la implementación y extensión de su uso en el campo de la biología reproductiva.
Se ha descrito el efecto beneficioso del contacto de los gametos con los componentes del FO antes de la FIV (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27; Coy et al. 2010, Theriogenology 74: 632-642) y se ha comprobado que los espermatozoides recogidos mediante Swim-up muestran una mayor integridad del AON y un menor porcentaje de morfoanomalías que los obtenidos con centrifugaciones tipo Percoll (Menkveld et al. 1990, Andrologia 22: 152-158; Zini et al. 2000, Urology 56: 1081-1084). Aunque el proceso de capacitación espermática pueda parecer un mero trámite en las ARTs (dura apenas 45-60 minutos), el estrés que sufren los espermatozoides se transmite a la descendencia con alteraciones metabólicas y de comportamiento (Gapp et al. 2014, Nat Neurosci 17: 667-669).
Se han encontrado 5 documentos relacionados con el uso de sustancias específicas en los protocolos de FIV y/o CE pero ninguna describe el uso combinado de FO y FU de fases específicas del ciclo en la generación de embriones. Tampoco se describe en estas patentes ningún método de purificación o fraccionamiento de biofluidos ni su uso en métodos de capacitación espermática.
Para la realización del método de fraccionamiento mediante doble centrifugación y posterior procesado de los biofluidos mediante liofilización, obtenemos los FO y FU de animales sacrificados en matadero (especies porcina, bovina, ovina, caprina, cunícula y equina). Los tractos reproductivos se clasifican en las distintas fases del ciclo estral: folicular temprana (F1), folicular tardía (F2), luteal temprana (L 1) Y luteal tardía (L2) atendiendo al aspecto y la morfología ovárica (Carrasco et al. 2008b, Reproduction
135: 19-27). En la especie humana se pueden obtener de pacientes sometidas a ligadura de trompas, salpingectomías o histerectomías por razones de salud, o bien de donantes.
El FO se obtiene por aspiración introduciendo por la ampolla oviductal la punta de una pipeta automática y ejerciendo una presión manual aspirando así todo el contenido oviductal. Para su fraccionamiento, dicho contenido se centrifuga (entre 4000-10000g durante 1-10 minutos a 4 De) y se descarta el pellet celular y la fase mucosa. El sobrenadante de FO se recentrifuga en las mismas condiciones quedando en la parte superior la fase acuosa y en la inferior la fase mucosa (fondo del tubo). Se aspira únicamente la fase acuosa del FO. Por su parte, el FU se obtiene por aspiración introduciendo en el cuerno uterino la punta de una pipeta automática, ejerciendo una presión manual ascendente. Dicho contenido se fracciona mediante una doble centrifugación en las mismas condiciones que el FO.
Una vez fraccionados, los biofluidos se liofilizan entre -50De y -60De, durante 20-24h con una presión de 0.040-0.010 milibares. Una vez finalizado el proceso se conservan refrigerados hasta su uso. Los biofluidos obtenidos de las distintas especies y fases del ciclo se almacenan en un biobanco y pueden utilizarse tanto de forma inter o intraespecífica así como de manera autóloga o heteróloga. Antes de usarlos como aditivos en un medio de cultivo, los biofluidos se redisuelven con agua purificada hasta su volumen original. Una de las ventajas que presenta este nuevo método de fraccionamiento es que los biofluidos se pueden transportar a temperatura ambiente, mantienen sus propiedades biológicas al rehidratarse y pueden pasteurizarse a 7280De durante 10-20 segundos antes de su uso, lo que resulta necesario para las garantías sanitarias del producto.
Las pruebas de actividad del producto se han realizado evaluando la capacidad de los biofluidos para endurecer la zona pelúcida (ZP) del ovocito (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Para ello ovocitos maduros denudados se sometieron a una
digestión con proteasa. Los resultados demuestran que los biofluidos sometidos al proceso de fraccionamiento y conservación descrito en esta patente mantienen su actividad biológica una vez son resuspendidos y pasteurizados.
Para el desarrollo del método de capacitación espermática sin centrifugaciones y en medios suplementados con biofluidos la presente invención incluye la formulación de un nuevo medio de cultivo para la selección espermática que denominamos Swim-upbiofluidos. Para ello nos basamos en los medios descritos en la literatura (Alvarez et al. 1993, Hum Reprod 8: 1087-1092; García-López et al. 1996, J Chromatogr B Biomed Appl 680: 137-143) pero realizando los siguientes cambios sobre la composición:
- -
- Ajuste de la concentración de sales: dentro de este grupo podemos englobar NaHC03, NaCI, KCI, MgS04, K2HP04, y CaCI2. Son los responsables de mantener la osmolaridad y pH del medio por lo que su concentración se ajustó a niveles similares a los descritos en el FO. La osmolaridad final del medio se mantuvo en el rango fisiológico de 280-320mOsm. La concentración de sales inorgánicas estuvo comprendida entre 90 y 130 mM. -Ajuste de pH: se ajustó en torno a 7.2-7.8 utilizando HEPES como agente tamponador para evitar las oscilaciones de pH en el medio durante el tiempo que los espermatozoides están en contacto con él. -Ajuste de la concentración de sustratos energéticos: dentro de este grupo se encuentran glucosa, piruvato sódico, lactato sódico y sacarosa. Se ajustaron las concentraciones para conseguir una densidad y viscosidad óptimas que permitieran la movilidad de los espermatozoides a través del medio. La concentración de sustratos energéticos estuvo comprendida entre 120 y 160 mM. -Proteínas: en el nuevo medio que diseñamos, Swim-up-biofluidos, la fuente de proteínas consistió en la adición de 0.1-5% de FO preferentemente de fase F2 fraccionado y tratado como se ha descrito en la etapa a). Este tratamiento se comparó con BSA, fuente proteica habitualmente empleada en los medios de capacitación.
El método de capacitación Swim-up-biofluidos se realizó mezclando 0.5-1.5ml de semen con 0.5-1.5ml de medio Swim-up-biofluidos y permitiendo a los espermatozoides nadar hacia la parte superior del tubo durante un tiempo de 10-50 min a una temperatura de 37-38°C. Pasado este tiempo se recogieron 0.5-1ml del medio de la parte superior conteniendo los espermatozoides que se utilizaron para
con el método Swim-up-BSA, los ovo citos se fecundaron en medio TALP y los cigotos se transfirieron a medio NCSU-23 para su cultivo embrionario. Una vez terminado el cultivo se evaluó la calidad de los embriones obtenidos en ambos grupos atendiendo a la morfología (Bó y Mapletoft 2013, Anim Reprod 10: 344-348) y número de células por blastocisto. Con el trabajo de experimentación se ha demostrado que los embriones producidos in vitro con el método biofluidos se dividen más rápidamente que el control y son de mejor calidad (evaluada como número de células por blastocisto y capacidad para eclosionar).
Ejemplo de realización de la invención
Método utilizado para obtener embriones por fecundación y cultivo in vitro utilizando biofluidos de distintas etapas del ciclo comprobando la mejora en la calidad embrionaria
a.-Obtención, fraccionamiento y control de actividad de los biofluidos
En animales de abasto los FO y FU se obtienen de genitales procedentes de animales sacrificados en matadero para consumo cárnico. En la especie humana se pueden obtener de donantes, de pacientes sometidas a ligadura de trompas o de mujeres sometidas a salpingectomías o histerectomías por razones de salud. Los biofluidos se centrifugan (4000-10000g durante 1-10 minutos a 4°C) y la fase acuosa se recentrifuga con las mismas condiciones. Este líquido se liofiliza y pasteuriza quedando listo para su uso como aditivo de medios de cultivo previa resuspensión con agua purificada. La eficacia del tratamiento se estimó por la capacidad del FO para provocar el endurecimiento de la zona pelúcida. Para ello los ovo citos madurados in vitro se denudan mecánicamente y se incuban en FO durante 30-60 minutos a 38.5°C. Pasado este tiempo los ovocitos se incuban con una solución de proteasa al 0.5% y se contabiliza el tiempo que tarda en digerirse la ZP. Como muestra la tabla 1 los biofluidos tratados mantuvieron su actividad biológica con respecto a biofluidos no tratados (control):
Tabla 1. Tiempo de digestión de la zona pelúcida (tdZP) de ovo citos madurados in vitro tras ser incubados 30-60 minutos en FO de fase F2 fraccionado, liofilizado y pasteurizado. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.001.
nuevo medio de cultivo en el que se ha empleado como fuente proteica la albúmina (Swim-up-BSA) o los biofluidos (Swim-up-biofluidos). PEN (porcentaje de ovocitos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZIOO (número medio de espermatozoides por ovocito penetrado), SPZIZP (número medio de espermatozoides
5 unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de cigotos viables sobre el total de los ovocitos).Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05.
Método capacitación Percoll Swim-up-BSA Swim-upbiofluidos N PEN (%) MONO(%) SPZlOO SPZlZP REN (%)
105 84.3±3.6a 17.4±4.1a 8.4±0.7a 17.3±2.3a 14.6±0.1a 180 69.6±3.5b 42.7±4.6ab 2.1 ±0.1 b 7.2±0.5b 29.7±0.2b 183 71.1±3.4b 49.6±4.5b 2.7±0.1b 8.6±0.5b 35.2±0.2c
N es el número de ovo CitOS Inseminados
c.-Obtención de embriones por FIV en medios suplementados con biofluidos
Una vez capacitados los espermatozoides en el sistema Swim-up-biofluidos la FIV se realiza en un medio de cultivo (TALP) con o sin biofluidos. Los ovo citos se maduran bajo los protocolos habituales descritos con anterioridad y se transfieren al medio de
15 fecundación. Los resultados de esta invención han demostrado que cuando los ovocitos se inseminan en un medio de cultivo suplementado con FO se aumentan los porcentajes de penetración manteniéndose niveles elevados de monospermia (Tabla 3). Esto hace que el rendimiento (REN) del método de FIV con biofluidos sea significativamente mayor obteniéndose un mayor número de posibles embriones.
20 Tabla 3. Resultados de FIV suplementando el medio de FIV con biofluidos. PEN (porcentaje de ovo citos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZlOO (número medio de espermatozoides por ovo cito penetrado), SPZlZP (número medio de espermatozoides unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de
25 cigotos viables sobre el total de los penetrados). Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con
P<0.05.
Método N PEN(%) MONO (%) SPZlOO SPZlZP REN (%)
capacitación
Control 32 43.7±0.1a 78.6±0.1 1.2±0.1 13.4±2.1 34.4±0.1a
Biofluidos 33 66.6±0.1b 72.7±0.1 1.3±0.1 19.3±3.2 48.5±0.1b N es el número de ovocitos inseminados
d.-Cultivo embrionario con biofluidos y valoración de la calidad de los embriones obtenidos
5 Tras el periodo de fecundación, los cigotos fueron trasladados a medio de cultivo (NCSU-23) suplementado o no con FO de fase luteal temprana durante 48 horas donde fueron cultivados hasta estadio de 2-4 células. Pasado este tiempo los embriones se transfirieron a medio NCSU-23 suplementado o no con FU de fase luteal temprana donde fueron cultivados hasta el estadio de blastocisto. Para comprobar los
10 efectos del sistema con biofluidos sobre la calidad embrionaria se valoraron los parámetros de división, número de blastocistos en cada una de las etapas de desarrollo (desde blastocisto temprano a blastocisto eclosionado), número medio de células por blastocisto y funcionalidad de los mismos, evaluada como su capacidad para eclosionar (contraerse y expandirse rítmicamente hasta conseguir salir de la zona
15 pelúcida). Se comprobó que los embriones obtenidos mediante el sistema biofluidos eran significativamente de mejor calidad que los embriones que no habían estado en contacto con estos fluidos naturales, como lo demuestra el mayor número de células por blastocisto (Tabla 4) y el mayor porcentaje de blastocistos que comienzan y completan el proceso de eclosión(Tabla 5).
20 Tabla 4. Resultados del cultivo embrionario con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05. REN (rendimiento del método; porcentaje de blastocistos con respecto a los embriones divididos).
Grupo N División Blastocistos REN (%) Célulasl
embrionaria (%) (%)* blastocisto Control 903 47.5±1.6a 41.4±2.4 19.6±1.3 49.9±3.7a Biofluidos 961 42.1±1.6b 44.5±2.5 18.7±1.2 81.8±7.2b
*Con respecto a los embriones divididos. N es el número de cigotos empleados
Tabla 5. Estadio de desarrollo de los blastocistos (Blasto) obtenidos in vitro con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05.
temprano expandido eclosionando eclosionado Control 903 31.7±6.1a 28.3±5.9 40.0±6.4 Oa Oa Biofluidos 961 12.8±5.4b 30.8±7.5 35.9±7.8 15.4±5.9b 5.1±3.6b
5 N es el número de cigotos empleados
Cuando se compara el número medio de células de los blastocistos obtenidos in vitro con blastocistos obtenidos in vivo, se observa que el número de células de los embriones obtenidos con el método biofluidos es similar a los embriones in vivo,
10 mientras que los del método control tienen aproximadamente la mitad de células (Tabla 6). Este resultado refleja que la calidad embrionaria que se obtiene con el método biofluidos es similar a la obtenida de forma natural, al menos en lo referente a este parámetro de calidad.
15 Tabla 6. Número medio de células por blastocisto obtenidos in vivo o in vitro mediante el método control y el biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.001
Control 49.9±3.6a
Biofluidos 81.8±7.2b
In vivo 87.0±7.2b
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1.-Método para aumentar la calidad biológica y la supervivencia de los embriones de mamífero producidos in vitro mediante la incorporación de biofluidos de fases específicas del ciclo a los medios de cultivo caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- i)
- Fraccionamiento y procesado de los fluidos oviductal y uterino de cada una
- de
- las fases del ciclo mediante un proceso de selección, doble
- centrifugación
- con posterior liofilización, opcionalmente pasteurización y
- refrigeración
- para su uso en técnicas de reproducción asistida o para
- biotecnología en general.
- ii)
- Procesado de los espermatozoides en un medio de cultivo suplementado
- con los biofluidos obtenidos en i) caracterizado porque la selección de los
- espermatozoides
- para fecundación in vitro se basa en su capacidad
- fisiológica de nadar libremente atravesando dicho medio de cultivo que
- contiene agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, antibióticos y
- fluido
- oviductal fraccionado y tratado, obtenido durante la fase folicular
- tardía del ciclo.
- iii)
- Fecundación in vitro utilizando los espermatozoides obtenidos en ii) en un
- medio enriquecido con fluido oviductal.
- iv)
- Cultivo de los embriones obtenidos en iii) hasta cualquier fase del desarrollo
- preimplantacional
- en medios suplementados con fluido oviductal en una
- primera fase (variable desde 24 hasta 72 horas) y con fluido uterino en una
- segunda fase (variable desde 48 hasta el estadio de mórula o blastocito).
- 2.-Método según la reivindicación 1 ii), caracterizado porque en el medio de cultivo la concentración de sales inorgánicas está comprendida entre 90 y 130 mM, la concentración de sustratos energéticos está comprendida entre 120 y 160 mM y la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado está comprendida entre 0.1 y 5%.
- 3.-Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado de fase folicular tardía o luteal temprana del ciclo reproductor en el medio de fecundación in vitro está comprendida entre 0.1 y 5%.
- 4.-Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones durante las primeras 24-72 horas desde la fecundación en medio de cultivo suplementado con fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal temprana del ciclo a una concentración entre
- 0.1 y 5%.
- 5.-Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones hasta estadio de mórula o blastocisto en medio de cultivo suplementado con fluido uterino fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.
- 6.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los biofluidos se obtienen de mamíferos.
- 7.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los gametos, cigotos o embriones se obtienen de mamíferos.
- 8.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los biofluidos utilizados son de la misma o de distintas especies.
- 9.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los biofluidos utilizados pueden ser de un mismo sujeto o de un sujeto diferente (donante).
- 10.-El uso de biofluidos fraccionados y tratados en la elaboración de medios de cultivo, suplementos o medicamentos para mejorar la funcionalidad espermática, la fecundación in vitro, el cultivo embrionario, la criopreservación de gametos o embriones o la transferencia embrionaria a una hembra receptora según las reivindicaciones anteriores.
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