ES2532659B2 - Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero - Google Patents

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero Download PDF

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Abstract

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo (biofluidos) para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero que comprende las siguientes etapas: a) fraccionamiento y procesado de los biofluidos mediante un tratamiento de selección, purificación, liofilización y su posterior almacenamiento; b) método de capacitación espermática en un medio de cultivo suplementado con biofluidos; c) fecundación in vitro en un medio enriquecido con biofluidos y d) posterior cultivo embrionario con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preimplantacional en medios suplementados con biofluidos.

Description

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in 5 vitro de embriones de mamífero
Objeto de la invención
La presente invención contempla un método para aumentar la calidad embrionaria mediante el uso de técnicas de fecundación in vitro (FIV), opcionalmente con
10 preincubaci6n de los ovocitos en fluidos biológicos naturales de fases específicas del ciclo reproductivo, combinado con un método de separación espermática en medio de cultivo suplementado con dichos fluidos y la posterior fecundación y cultivo embrionario (CE) en medios suplementados con fluidos.
Sector de la técnica
15 Esta invención pertenece de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Capacitación espermática, Fecundación in vitro y Cultivo embrionario.
Antecedentes de la invención y estado de la técnica
El procedimiento actualmente conocido para la obtención in vitro de un embrión
20 supone la realización de distintas técnicas de reproducción asistida (ARTs) que difieren entre laboratorios y especies, y comprende los siguientes pasos: 1) la obtención y maduración in vitro (MIV) de los gametos femeninos (ovocitos); 2) la preparación y capacitación de los gametos masculinos (espermatozoides); 3) el proceso de fecundación in vitro en sí mismo ya sea mediante el cocultivo de los
25 gametos o la microinyección asistida de un espermatozoide en el interior del ovocito, y 4) el CE para que los cigotos alcancen el estadio de desarrollo deseado, generalmente el de blastocisto.
Una estrategia para incrementar la eficiencia de estas ARTs ha sido imitar en el laboratorio las condiciones que los gametos-cigotos-embriones encuentran in vivo 30 donde, tras la ovulación, el ovocito maduro es captado por el oviducto (trompas de
Falopio) contactando con su medio natural, el fluido oviductal (FO). Por su parte los espermatozoides -nadan" desde la vagina o el cérvix (según la especie) hasta el lugar de la fecundación (oviducto) contactando durante su paso por el útero con el fluido uterino (FU) y luego, cuando se encuentran ya en las proximidades del ovocito, con el FO. Una vez ambos gametos están en el oviducto se produce la fecundación y el desarrollo embrionario temprano siendo el FO el medio natural en el que ocurren estos eventos reproductivos. Posteriormente el embrión pasa al útero, siendo el FU el medio fisiológico donde se desarrollará hasta que ocurre la implantación y placentación. Por ello, COn el objetivo de formular ylo adaptar nuevos medios de cultivo empleados in vitro y mejorar los resultados de fecundación y desarrollo embrionario, numerosos trabajos han estudiado la composición de estos fluidos naturales (Iritan; et al. 1974, J Anim Sci 39: 582-588; Leese el al. 2008,Reprod Fertil Oev 20: 1-8). Sin embargo, no se han realizado investigaciones dirigidas a reproducir de una forma combinada y completa el ambiente fisiológico diseñando sistemas de cultivo integrales (desde la FIV hasta el CE) con medios más próximos a la composición de los fluidos biológicos naturales (FO y FU). Incluso a pesar de que, como se ha comprobado en la especie humana, la adición al medio de cultivo de una ·simple~ proteína oviductal incrementa en más de un 8% los nacimientos (Meinljes el al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789).
Sin duda, las secreciones oviductales y uterinas proporcionan mejores condiciones para la fecundación y el desarrollo embrionario que los sistemas in vitro convencionales ya que la composición de estos medios naturales varía a lo largo de las diferentes fases del ciclo reproductivo de la hembra proporcionando al ovocito, cigoto y/o embrión las condiciones idóneas para su desarrollo en cada momento (Kiffian el al. 1989, J Reprod Fertil 86: 419-426; Leese el al. 2008, Reprod Fertil Oev
20: 1-8). De forma genérica los biofluidos contienen sales, electrolitos, aminoácidos, componentes energéticos y proteínas. Entre las más de 150 proteínas oviductales que se han conseguido identificar (Avilés el al. 2010, Mol Human Reprod. 16: 89&-906), algunas ya se encuentran disponibles comercialmente y se utilizan como suplemento a los medios de cultivo in vitro (Hao el al. 2006, Biol Reprod 75: 726-733; Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789). Sin embargo, se desconoce la composición completa y la concentración exacta de todos los componentes de los biofluidos por lo que la adición directa de los mismos a los medios de cultivo artificiales supone la estrategia más económica, rápida y fiable de suplementarios Can todo aquello que los gametos, cigotos y/o embriones precisan en cada una de las etapas.
En mamíferos, incluida la especie humana, los FO y/o FU se obtienen mediante distintas técnicas y generalmente se procesan con una unica centrifugación y posterior congelaci6n de la fracci6n líquida (Carrasco el al. 2oo8a, Reprod Fertil Oev 20: 80881 7; Carrasco el al. 2008b, Reproduction 136: 833-842; Faulkner el al. 2012, 5 Proteomics 12: 2014-223; Lippes y Wagh 1993, Fertil Sleril59: 157-162;Velazquez el al. 2010. Theriogenology 73: 758-767). Estos biofluidos mejoran las tasas de fecundación y aumentan la calidad embrionaria (Aitken 1977, J Embryol Exp Morphol
41: 295-3OO;Cebrian-Serrano el al. 2013, ReprodOomeslAnim 48: 331-338; Coy el al. 2oo8a, PNAS 105: 15809-15814; L10yd el al. 2009, Reproduction 137: 679-687). A 10 pesar de estos resultados alentadores, hasta la fecha no se han empleado los biofluidos como aditivos en las ARTs humanas lo que abre un campo nuevo de investigación, especialmente si consideramos que, en la mayoría de ocasiones, el efecto beneficioso sobre gametos y embriones es interespecifico, es decir, que los biofluidos de una especie de mamífero pueden utilizarse para las ARTs de otra
15 especie diferente (Mondéjar el al. 2013, HumReprod 28: 718-728; Rondeau el al. 1996, Can J Vel Res 60:14-20). Hasta ahora el procesado de los biofluidos, el almacenamiento y el transporte de las muestras requieren una temperatura controlada para mantener la cadena de fria, condicionando la implementación y extensión de su uso en el campo de la biología reproductiva.
Se ha descrito el efecto beneficioso del contacto de los gametos con los componentes del FO antes de la FIV (Coy el al. 2008b, Reproduction 135: 19-27; Coy el al. 2010, Theriogenology 74: 632-642) y se ha comprobado que los espermatozoides recogidos mediante Swim-up muestran una mayor integridad del ADN y un menor porcentaje de 25 morfoanomalias que los obtenidos con centrifugaciones tipo Percoll (Menkveld el al. 1990, Andrologia 22: 152-158; Zini el al. 2000, Urology 56: 1081-1084). Aunque el proceso de capacitación espermática pueda parecer un mero trámite en las ARTs (dura apenas 45-60 minutos), el estrés que sufren los espermatozoides se transmite a la descendencia con alteraciones metabólicas y de comportamiento (Gapp el al. 2014,
30 Nal Neurosci 17; 667-669).
Se han encontrado 5 documentos relacionados con el uso de sustancias específicas en los protocolos de FIV y/o CE pero ninguna describe el uso combinado de FO y FU de fases especificas del ciclo en la generación de embriones. Tampoco se describe en
35 estas patentes ningún método de purificación o fraccionamiento de biofluidos ni su uso en métodos de capacitación espermática.
Patente-1 (ES 2 323 993 A1 , Pilar Coy Fuster y Manuel Avilés Sánchez), donde se describe un Método para aumentar la monospermia en la FIV.
Patente-2 (ES 2 439424 A1 , Ignacio Santiago Álvarez Miguel y Mario Javier Perianes Carrasco) donde se describe un Método para aumentar el potencial implantatorio de 5 embriones de mamíferos obtenidos por FIV.
Palenle-3 (W02006/012177 , Randall Pralher) "Melhod lo decrease Ihe rale 01 polyspenny in IVF".
Palenle-4 (US 2013/0344595 A1 , David K. Gardner, Mark G. Larman y Donald Linck) "Culture media ter developmental cells containing elevated concentrations af lipaie 10 acid".
Palenle-5 (CN103333855 (A), ZouXiangang y Zhao Yatin) "Sheep embryonic cell culture f1uid~.
Descripción detallada de la invención
15 La presente invención contempla un método para aumentar la calidad de los embriones mamíferos obtenidos in vitro mediante un sistema que incluye la adición de fluidos biológicos naturales (FO y/o FU) de fases específicas del ciclo reproductivo en las fases de capacitación espermática, FIV y CE.
20 Los autores de la presente invención han desarrollado por un lado, un sistema de capacitación espermática que no requiere centrifugaciones, empleando como aditivo proteico los FO y/o FU, que supone grandes ventajas a la hora de reducir el estrés al que se ven sometidos los gametos masculinos durante el procedimiento de separación del plasma seminal, y que ayuda así a seleccionar aquellos espermatozoides con
25 mejor calidad e integridad de AON. Se ha conseguido aunar ambas estrategias formulando un nuevo medio de cultivo para seleccionar espermatozoides mediante la técnica de Swim-up que ofrece mejores resultados que los medios convencionales. Por otro lado, se ha llevado a cabo un nuevo proceso que permite obtener muestras purificadas y liofilizadas (deshidratadas) de ambos biofluidos sin que pierdan su
30 actividad biológica beneficiosa, pudiendo ser almacenadas muestras en seco y transportadas a temperatura ambiente, lo que supone una ventaja al método convencional utilizado hasta ahora (muestras líquidas).
Todo ello aumenta las posibilidades de que el uso de este sistema integrado de obtención de embriones in vitro pueda ser implementado y desarrollado en laboratorios de lodo el mundo.
En la actualidad, tanto el número como la calidad de los embriones mamíferos obtenidos mediante técnicas in vitro son menores al obtenido in vivo. En el procedimiento in vivo los gametos entran en contacto con los biofluidos de manera aislada antes de producirse la fecundación y el desarrollo embrionario, por lo que un protocolo integral de obtención de embriones de alta calidad debería incluir este contacto de los gametos, de manera individual, con los biofluidos, sustituyendo los sistemas de selección espermatica tipo Percoll (que implican centrifugaciones) por modelos tipo Swim-up donde los espermatozoides nadan libremente. El uso de los propios fluidos naturales con los que los gametos y embriones van encontrándose específicamente en el trado reproductivo a lo largo de su desarrollo puede incrementar la calidad de los embriones obtenidos in vitro. Así pues, esta invención propone la introducción de estos fluidos naturales del tracto reproductivo, como son el FO y el FU, en las ARTs para mejorar la calidad de los embriones obtenidos in vitro.
La invención describe un método de obtención de embriones in vitro mediante la adición de biofluidos a los medios de cultivo en cada una de las fases del proceso. Los biofluidos son obtenidos de aparatos genitales de hembras de mamífero en fases concretas del ciclo reproductivo y son sometidos previamente a un proceso de purificación y tratamiento para su conservación y transporte.
La invención comprende las siguientes etapas:
a) un método de clasificación de los FO y FU en función del etapa del ciclo reproductivo en la que se obtienen, seguido de su fraccionamiento mediante doble centrifugación y posterior procesado mediante liofilización y pasteurización.
b) un método de capacitación espermática sin centrifugaciones en un medio de cultivo específico suplementado con FO y/o FU.
c) FIV en un medio enriquecido con FO y/o FU.
d) cultivo con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo en medios suplementadOS con FO y/o FU.
Para la realización del método de fraccionamiento mediante doble centrtfugación y posterior procesado de los biofluidos mediante liofilización, obtenemos los FO y FU de animales sacrificados en matadero (especies porcina, bovina, ovina, caprina, cunícula y equina). Los tractos reproductivos se clasifican en las distintas fases del ciclo estral: 5 folicular lemprana (F1), folicular tardia (F2), luteal temprana (L1) y luteal lardia (L2) atendiendo al aspecto y la morfología ovárica (Carrasco el al. 2008b, Reproduction
135: 19-27). En la especie humana se pueden obtener de pacientes sometidas a ligadura de trompas, salpingectomías o histerectomias por razones de salud, o bien de donantes.
10 El FO se obtiene por aspiración introduciendo por la ampona oviductalla punta de una pipeta automática y ejerciendo una presión manual aspirando así todo el contenido oviductal. Para su fraccionamiento, dicho contenido se centrifuga (entre 4000-10000g durante 1-10 minutos a 4 OC) Y se descarta el pellet celular y la fase mucosa. El sobrenadante de FO se recentrifuga en las mismas condiciones quedando en la parte
15 superior la fase acuosa y en la inferior la fase mucosa (fondo del tubo). Se aspira únicamente la fase acuosa del FO. Por su parte, el FU se obtiene por aspiración introduciendo en el cuerno uterino la punta de una pipeta automática, ejerciendo una presión manual ascendente. Dicho contenido se fracciona mediante una doble centrifugación en las mismas condiciones que el FO.
20 Una vez fraccionados, los biofluidos se liofilizan entre -500C y -60DC, durante 2Q-24h con una presión de 0.040-0.010 milibares. Una vez finalizado el proceso se conservan refrigerados hasta su uso. Los biofluidos obtenidos de las distintas especies y fases del ciclo se almacenan en un biobanco y pueden utilizarse tanto de fonna ínter O
25 intraespecífica as! como de manera aut610ga o heteróloga. Antes de usarlos como aditivos en un medio de cultivo, los biofluidos se redisuelven con agua purificada hasta su volumen original. Una de las ventajas que presenta este nuevo método de fraccionamiento es que los biofluidos se pueden transportar a temperatura ambiente, mantienen sus propiedades biológicas al rehidratarse y pueden pasteurizarse a 72
30 BODe durante 10-20 segundos antes de su uso, lo que resulta necesario para las garantias sanitarias del producto.
Las pruebas de actividad del producto se han realizado evaluando la capacidad de los biofluidos para endurecer la zona pelúeida (ZP) del ovoeilo (Coy el al. 2008b, 35 Reproduction 135: 19-27). Para ello ovocitos maduros denudados se sometieron a una
digestión con proteasa. Los resu ltados demuestran que los biofluidos sometidos al
proceso de fraccionamiento y conservación descrito en esta patente mantienen su
actividad biológica una vez son resuspendidos y pasteurizados.
S
Para el desarrollo del método de capacitación espermática sin centrifugaciones y en
medios suplementados con biofluidos la presente invención incluye la formulación de
un nuevo medio de cultivo para la selección espermática que denominamos Swim-up
biofluidos. Para ello nos basamos en los medios descritos en la literatura (Alvarez et
al. 1993, Hum Reprod 8: 1087-1092; Garcia-Lopez el al. 1996, J Chromalogr B
10
Biomed Appl 680: 137-143) pero realizando los siguientes cambios sobre la
composición:
-Ajuste de la concentración de sales: dentro de este grupo podemos englobar
NaHCO" NaCI, KCI, MgSO" K,HPO" y CaCI,. Son los responsables de mantener la
15
osmolaridad y pH del medio por lo que su concentración se ajustó a niveles similares a
los descritos en el FO. La osmolaridad final del medio se mantuvo en el rango
fisiológico de 280-320mOsm. La concentración de sales inorgánicas estuvo
comprendida entre 90 y , 30 mM.
-Ajuste de pH: se ajustó en torno a 7.2-7.8 utilizando HEPES como agente
20
tamponador para evitar las oscilaciones de pH en el medio durante el tiempo que los
espermatozoides están en contacto con él.
-Ajuste de la concentración de sustratos energéticos: dentro de este grupo se
encuentran glucosa, piruvato sódico, lactato sódico y sacarosa. Se ajustaron las
concentraciones para conseguir una densidad y viscosidad óptimas que permitieran la
25
movilidad de los espermatozoides a través del medio. la concentración de sustratos
energéticos estuvo comprendida entre 120 y 160 mM.
-Protelnas: en el nuevo medio que diseñamos, Swim-up-biofluidos, la fuente de
prote[nas consistió en la adición de 0.1-5% de FO preferentemente de fase F2
fraccionado y tratado como se ha descrito en la etapa a). Este tratamiento se comparó
30
con BSA, fuente proteica habitualmente empleada en los medios de capacitación.
El método de capacitación Swim-up-biofluidos se realizó mezclando 0.5-1 .5ml de
semen con O.5-1 .5ml de medio Swim-up-biofluidos y permitiendo a los
espermatozoides nadar hacia la parte superior del tubo durante un tiempo de 10-50
35
min a una temperatura de 37-38°C. Pasado este tiempo se recogieron 0.5-1ml del
medio de la parte superior conteniendo los espermatozoides que se utilizaron para
•
FIV. El nuevo método de capacitación espermática se comparó con el método de centrifugaciones tradicional (Percal!; Malas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141). Gracias a su trabajo de experimentación, los autores de la invención han demostrado que cuando los espermatozoides son capacitados en el sistema Swim-up-biofluidos con un medio suplementado con FO se mejora significativamente la monospermia y por tanto el número de cigotos capaces de desarrollarse hasta embrión.
En la realización del mélodo FIV que incluye la adición de biofluidos al medio de fecundación, los ovocitos porcinos se maduran in vitro durante 42-44h según los protocolos descritos (Coy el al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Pasado este tiempo se decumulan mecánicamente y se transfieren 50-55 ovocitos por cada pocillo de fecundación conteniendo sólo 500 ul de medio TALP (grupo control) (Malas et al. 2003, Reproduetion 125: 133-1141) o TALP suplementado con 0.1 al 5 % de FO, preferentemente de fase F2 ó L 1, fraccionado y tratado como se describe en la etapa a) (grupo biofluidos). Los espennatozoides utilizados para la FIV se obtuvieron y procesaron mediante el sistema Swim-up-biofluidos descrito en la etapa b). Opcionalmente, antes de ser inseminados los ovocitos decumulados pueden incubarse 30-60 minutos con FO preferentemente de fase F2 ó L 1. Los gametos se cocultivaron durante 18 horas pasadas las cuales los presuntos cigotos se fijaron y tiñeron para evaluar los resultados de fecundación. Con este método se mejoran las tasas de monospermia tras la fecundación.
En el desarrollo del CE en medios suplementados con biofluidos, los ovocitos se maduraron según los protocolos descritos (Coy el al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Se compararon dos métodos de CE, el método control y el método biofluidos con liquidos fraccionados y tratados como se describe en la etapa a). Para el grupo biofluidos los espermatozoides empleados para la FIV se capacitaron mediante el método Swim-up-biofluidos descrito en la etapa b) y los ovocitos se fecundaron en medio suplementado con 0.1-5 % de FO, como se describe en la etapa c). Una vez obtenidos los cigotos éstos se transfirieron a medio de cultivo embrionario NCSU-23 (Petters y Wells 1993, J Reprod Fertility Suppl 48: 61-73) suplementado los dos-tres primeros días con 0.1-5 % de FO, preferentemente de fase L 1 ó L2. Tras las primeras 48 horas de cultivo se evaluó la división embrionaria y posterionnente los embriones se transfirieron a medio NCSU-23 suplementado con 0.1-5% de FU preferentemente de fase L 1 ó L2 hasta el estadio de blastocisto. En el grupo control no se emplearon los biofluidos en ninguna de las fases del método, los espermatozoides se capacitaron con el método Swim-up-BSA, los ovacitos se fecundaron en medio TALP y los cigotos se transfirieron a medio NCSU-23 para su cultivo embrionario. Una vez terminado el cultivo se evaluó la calidad de los embriones obtenidos en ambos grupos atendiendo a la morfologia (Bó y Mapletoff 2013, Anim Reprod 10: 344-348) y número de células por
5 blastocisto. Con el trabajo de experimentación se ha demostrado que los embriones producidos in vitro con el método biofluidos se dividen mas rápidamente que el control y son de mejor calidad (evaluada como número de células por blastocislo y capacidad para eclosionar).
10 Ejemplo de realización de la invención
Método utilizado para obtener embriones por fecundación y cultivo in vitro utilizando biofluidos de distintas etapas del ciclo comprobando la mejora en la calidad embrionaria
a.-Obtención, fraccionamiento y control de actividad de los biofluidos
15 En animales de abasto los FO y FU se obtienen de genitales procedentes de animales sacrificados en matadero para consumo camico. En la especie humana se pueden obtener de donantes, de pacientes sometidas a ligadura de trompas o de mujeres sometidas a salpingectomías o histerectomias por razones de salud. Los biofluidos se centrifugan (4000-10000g durante 1-10 minutos a 4'C) y la fase acuosa se
20 recentrifuga con las mismas condiciones. Este liquido se liofiliza y pasteuriza quedando listo para su uso como aditivo de medios de cultivo previa resuspensión con agua purificada. La eficacia del tratamiento se estimó por la capacidad del FO para provocar el endurecimiento de la zona pelúdda. Para ello los ovodtos madurados in vitro se denudan mecánicamente y se incuban en FO durante 30-60 minutos a 38.5°C.
25 Pasado este tiempo los ovocitos se incuban con una solución de proteasa al 0.5% y se contabiliza el tiempo que tarda en digerirse la ZP. Como muestra la tabla 1 los biofluidos tratados mantuvieron su actividad biológica con respecto a biofluidos no tratados (control):
30 Tabla 1. Tiempo de digestión de la zona pelúcida (tdZP) de ovocitos madurados in vitro tras ser incubados 30-60 minutos en FO de fase F2 fraccionado, liofilizado y pasteurizado. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.001 .
Tratamiento del fluido oviductal
N tdZP (segundos)
Control (no fraccionado)
14 3750.0±665.2a
Fraccionado
14 7995.0HO.8b
Fraccionado y liofilizado
14 9432.8±534.2b
Fraccionado, liofilizado y pasteurizado
10 8874.0±445.6b
N es el numero de OVOCltos empleado
b.-Capacitación espermática sin centrifugaciones en un nuevo medio enriquecido con biofluidos
5 El nuevo medio de cultivo se formuló ajustando la osmolaridad, pH y sustratos energéticos y sustituyendo la albúmina sérica bovina (BSA) por biofluidos. La capacitación se realizó con espermatozoides eyaculados procedentes de machos de fertilizad probada (12-24 meses de edad). Para el método de capacitación Swim-upbiofluidos se depositó el semen sobre el medio SWim-up-biofluidos durante 15-30 10 minutos a 37-38°C. Pasado este tiempo se recogieron las células de la parte superior y se ajustó la concentración espermática a 25.000 espermatozoides/mi utilizando para ello medio de cultivo TALP (Malas el al. 2003, Reproduction 125: 133-1141). Este nuevo método de capacitación espermática se comparó con el método de centrifugaciones tradicional (Percoll) (Matás et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141). 15 La calidad de los espermatozoides obtenidos se valoró por su capacidad para fecundar ovocitos porcinos previamente madurados in vitro durante 42-44 horas con los protocolos convencionales (Coy el al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Los ovocitos se cocultivaron con los espermatozoides capacitados en los distintos métodos durante 18 horas. Pasado este tiempo los presuntos cigotos se fijaron y tiñeron para 20 evaluar los resultados de fecundación (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Los resultados mostraron que los espermatozoides capacitados en el sistema Swimup-biofluidos con un medio suplementado con FO mejoran significativamente la monospermia, gracias a la reducción del número de espermatozoides que se unen a la zona pelúcida del ovocito (SPZlZP) y del número de espermatozoides que penetra al 25 interior del ovocito (SPZlOO), obteniéndose asl un mayor rendimiento de la técnica (REN) que con el sistema convencional de centrifugaciones tal y como se muestra en
la tabla 2.
Tabla 2. Resultados de la FIV tras capacitar los espermatozoides en un método 30 tradicional con centrifugaciones (Percoll) o un método sin centrifugaciones con un
nuevo medio de cultivo en el que se ha empleado como fuente proteica la albúmina (Swim-up-BSA) o los biofluidos (Swim-up-biofluidos). PEN (porcentaje de ovocitos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZlOO (número medio de espermatozoides por ovocito penetrado), SPZlZP (número medio de espermatozoides unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de cigotos viables sobre el total de los ovocitos).Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<O.05.
REN (%)
PEN(%)
MONO(%)
SPZlOO
SPZlZPMétodo
N
capacitación Percoll
8.4±0.7a
17.3±2.3a
14.6±0.1a Swim-up-BSA
105 84.3±3.6a
17.4±4.1a
42 .7±4.6ab
2.1±0.1b
7.2±0.5b
29.7±0.2b Swim-up
180 69.6±3.5b
49 .6±4.5b
2.7±0.1b
8.6±0.5b
35.2±0.2c biofluidos
183 71 .1±3.4b
N es el numero de OVOCltoS Inseminados
C.-Obtención de embriones por FIV en medios suplementados con biofluidos
Una vez capacitados los espermatozoides en el sistema Swim-up-biofluidos la FIV se realiza en un medio de cultivo (TALP) con o sin biofluidos. Los ovocitos se maduran bajo los protocolos habituales descritos con anterioridad y se transfieren al medio de
15 fecundación. Los resultados de esta invención han demostrado que cuando los ovocitos se inseminan en un medio de cultivo suplementado con FO se aumentan los porcentajes de penetración manteniéndose niveles elevados de monospermia (Tabla 3). Esto hace que el rendimiento (REN) del método de FIV con biofluidos sea significativamente mayor obteniéndose un mayor número de posibles embriones.
Tabla 3. Resultados de FIV suplementando el medio de FIV con biofluidos. PEN (porcentaje de ovocitos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZfOO (número medio de espermatozoides por ovocito penetrada), SPZflP (número medio de espermatozoides unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de
25 cigotos viables sobre el total de los penetrados). Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05.
Mélodo
N PEN(%} MONO(%} SPZlOO SPZlZP REN(%}
capacitación
Control
32 43.7±0.1 a 78.6±0.1 1.2±0.1 13.4±2.1 34.4±0.1a
Biofluidos
33 66.6±0.1b 72.7±0.1 1.3±0.1 19.3±3.2 48.5±0.1b
N es el numero de OVOCltOS Inseminados
d.-Cultivo embrionario con biofluidos y valoración de la calidad de los embriones obtenidos
5 Tras el periodo de fecundación, los cigotos fueron trasladados a medio de cultivo (NCSU-23) suplementado o no con FO de fase luteal temprana durante 48 horas donde fueron cultivados hasta estadio de 2-4 células. Pasado este tiempo los embriones se transfirieron a medio NCSU-23 suplementado o no con FU de fase luteal temprana donde fueron cultivados hasta el estadio de blastocisto. Para comprobar los
10 efectos del sistema con biofluidos sobre la calidad embrionaria 59 valoraron los parámetros de división, número de blastocistos en cada una de las etapas de desarrollo (desde blastocisto temprano a blastocisto eclosionado), número medio de células por blastocisto y funcionalidad de los mismos, evaluada como su capacidad para eclosionar (contraerse y expandirse rítmicamente hasta conseguir salir de la zona
15 pelúcida). Se comprobó que los embriones obtenidos mediante el sistema biofluidos eran significativamente de mejor calidad que los embriones que no habían estado en contacto con estos fluidos naturales, como lo demuestra el mayor número de células por blastocisto (Tabla 4) y el mayor porcentaje de blastocistos que comienzan y completan el proceso de eclosión(Tabla 5).
20 Tabla 4. Resultados del cultivo embrionario con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<O.05. REN (rendimiento del método; porcentaje de blastocistos con respecto alas embriones divididos).
Grupo
N División embrionaria (%) BI••locioloo (%)* REN ('lo) Célul.", bl.oloclolo
Control
903 47.5±1 .6a 41.4±2.4 19.6±1.3 49.9±3.7a
Biofluidos
961 42.1±1.6b 44.5±2.5 18.7±1.2 81 .8±7.2b
...
25 •Con respecto a 105 embriones divididos. N es el numero de cigotos empleados
Tabla 5. Estadio de desarrollo de los blastocistos (8Ias1o) obtenidos in vitro con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<O.05.
BI.Olo
Blasto
Blasto
Blasto
BI••1o
Grupo
N
eclosionand( expandido eclosionado temprano
31 .7±6.1a
28.3±5.9
40.0±6.4
Oa
Da
Control
15.4±5.9b
5.1±3.6b
Biofluidos
12.8±5.4b
30.8±7.5
35.9±7.8
S
N es el numero de cigotos empleados
10
Cuando se compara el número medio de células de los blastocistos obtenidos in vitro con blastocislos obtenidos in vivo, se observa que el número de células de los embriones obtenidos con el método biofluidos es similar a los embriones in vivo, mientras que los del método control tienen aproximadamente la mitad de células (Tabla 6). Este resultado refleja que la calidad embrionaria que se obtiene con el método biofluidos es similar a la obtenida de forma natural, al menos en lo referente a este parámetro de calidad.
15
Tabla 6. Número medio de células por blastocisto obtenidos in vivo o in vitro mediante el método control y el biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<O.001

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Método para aumentar la calidad biológica y la supelVivencia de los embriones de mamífero producidos in vitro mediante la incorporación de biofluidos de fases específicas del ciclo a los medios de cultivo caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
    i)
    Fraccionamiento y procesado de los fluidos oviductal y uterino de cada una
    de
    las fases del ciclo mediante un proceso de selección, doble
    centrifugación
    con posterior liofilización, opcionalmente pasteurización y
    refrigeración
    para su uso en técnicas de reproducción asistida o para
    biotecnología en general.
    ii)
    Procesado de los espermatozoides en un medio de cultivo suplementado
    con los biofluidos obtenidos en i) caracterizado porque la selección de los
    espermatozoides
    para fecundación in vitro se basa en su capacidad
    fisiológica de nadar libremente atravesando dicho medio de cultivo que
    contiene agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, antibióticos y
    fluido
    oviductal fraccionado y tratado, obtenido durante la fase folicular
    tardla del ciclo.
    iii)
    Fecundación in vitro utilizando los espermatozoides obtenidos en ii) en un
    medio enriquecido con fluido oviductal.
    iv)
    Cultivo de los embriones obtenidos en ¡ii) hasta cualquier fase del desarrollo
    preimplantacional
    en medios suplementados con fluido oviductal en una
    primera fase (variable desde 24 hasta 72 horas) y con fluido uterino en una
    segunda fase (variable desde 48 hasta el estadio de mórula o blastocito).
  2. 2.-Método según la reivindicación 1 ii), caracterizado porque en el medio de cultivo la concentración de sales inorgánicas está comprendida entre 90 y 130 mM, la concentración de sustratos energéticos está comprendida entre 120 y 160 mM y la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado está comprendida entre 0.1 y 5%.
  3. 3.-Mélodo según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado de fase folicular tardia o luteal temprana del ciclo reproductor en el medio de fecundación in vitro está comprendida entre 0.1 y 5%.
  4. 4.-Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones durante las primeras 24-72 horas desde la fecundación en medio de cultivo suplementado con fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal temprana del ciclo a una concentración entre
  5. 0.1 y 5%.
  6. 5.-Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones hasta estadio de mórula o blastocisto en medio de cultivo suplementado con fluido uterino fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.
  7. 6.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los biofluidos se obtienen de mamíferos.
  8. 7.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los gametos, cigotos o embriones se obtienen de mamíferos.
  9. 8.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los biofluidos utilizados son de la misma o de distintas especies.
  10. 9.-Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los biofluidos utilizados pueden ser de un mismo sujeto o de un sujeto diferente (donante).
  11. 10.-El uso de biofluidos fraccionados y tratados en la elaboración de medios de cultivo, suplementos o medicamentos para mejorar la funciona lidad espermática, la fecundación in vitro, el cultivo embrionario, la criopreservación de gametos o embriones o la transferencia embrionaria a una hembra receptora según las reivindicaciones anteriores.
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