ES2323993B1 - Metodo para aumentar la monospermia en la fecundacion in vitro. - Google Patents
Metodo para aumentar la monospermia en la fecundacion in vitro. Download PDFInfo
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Abstract
Método para aumentar la monospermia en la
fecundación in vitro.
La presente invención se refiere a un método
para aumentar la eficacia de la fecundación in vitro de
mamíferos induciendo el endurecimiento de la zona pelúcida de los
ovocitos antes de su cocultivo con espermatozoides.
Description
Método para aumentar la monospermia en la
fecundación in vitro.
Esta invención se refiere a un método para
aumentar la eficacia de la fecundación in vitro de mamíferos
mediante la reducción de los niveles de polispermia.
La polispermia en mamíferos es una anomalía de
la fecundación resultante de la entrada de más de un
espermatozoide en el citoplasma del ovocito (Hunter, 1991, Mol
Reprod Dev. 29:385-391).
Esta patología se ha descrito en todas las
especies de mamíferos en condiciones fisiológicas (coito, monta
natural), pero en porcentajes muy bajos. Sin embargo, es más
frecuente durante la fecundación in vitro (FIV),
fundamentalmente en la especie porcina, aunque también ocurre con
menor incidencia en otras como la bovina o la humana.
En la especie humana, la polispermia suele dar
lugar a abortos espontáneos, aunque se han publicado referencias
de nacimientos de niños triploides o tetraploides (Dean et
al., 1997, J Med Genet 34:246-249; Roberts et
al., 1996, Am J Med Genet 62:243-246; Sherard
et al., 1986, Am J Med Genet 25:307-312;
Shiono et al., 1988, Am J Med Genet
29:543-547; Uchida and Freeman, 1985, Am J Obstet
Gynecol 151:65-69). Estos nacimientos poliploides se
caracterizan por malformaciones severas y múltiples anormalidades
(Doshi et al., 1983, Hum Pathol 14:716-723;
Kjaer et al., 1997, Am J Med Genet
72:216-221; Pitt et al., 1981, J Med Genet
18:246-249).
En la mayoría de los casos en los mamíferos, el
apareamiento tiene lugar antes de la ovulación y tras la
fecundación se establece rápidamente una defensa contra la
polispermia. Este bloqueo es estable y de larga duración (Hunter
et al., 1998, J Exp Zool 280:182-188).
Después de la penetración del espermatozoide, los gránulos
corticales, unas organelas especializadas del ovocito, liberan su
contenido al espacio perivitelino mediante un proceso conocido como
reacción cortical. El contenido de los gránulos corticales altera
las propiedades de la zona pelúcida, lo que se conoce como reacción
de zona, y en consecuencia se bloquea la penetración
polispérmica.
La zona pelúcida (ZP), es una matriz de
glicoproteínas que sintetiza y segrega el ovocito en crecimiento y
que juega un papel fundamental en los primeros momentos de la
fertilización. La zona pelúcida está presente en los ovocitos de
todos los mamíferos en el momento de la fecundación y desempeña
unas funciones básicas en dicho proceso, tales como la unión del
espermatozoide, la inducción de la reacción acrosómica, el bloqueo
de la poliespermia y la protección frente a fecundaciones
interespecíficas, además de desempeñar una función protectora del
ovocito y del embrión temprano. La ZP es una cubierta
glicoprotéica, espesa y elástica, que rodea al ovocito. En la ZP
porcina se han identificado tres familias de glicoproteínas: ZP2,
ZP3 y ZP4, con distintos pesos moleculares y diferente
distribución. Estas glicoproteínas están altamente glicosiladas, lo
que es muy importante para conferirle a la ZP sus funciones
biológicas específicas. La composición y las características de la
ZP parecen ser muy diferentes in vivo e in vitro, lo
cual podría influir en la eficacia de la fecundación in
vitro.
Entre los cambios que se han descrito en la zona
pelúcida tras la fecundación y la reacción cortical, se encuentra
el "endurecimiento" de la misma, medido mediante el aumento de
su resistencia a la digestión con proteasas (Braden et al.,
1954 Aust J Biol Sci 7:391-409; Austin y Braden,
1956 Journal of Experimental Biology 33:358-365;
Barros y Yanagimachi, 1971, Nature 24;
233(5317):268-269; Drobins et al.,
1988, J Exp Zool 245:206-219). Esta afirmación se
basa en numerosos estudios realizados fundamentalmente en el ratón
que demuestran una proteolisis selectiva de la glicoproteína de la
zona pelúcida ZP2 por una proteasa de los gránulos corticales
liberados tras la llegada del espermatozoide (Bleil et al.,
1981, Dev Biol 86:189-197; Moller y Wassarman,
1989, Dev Biol 132:103-112). Este cambio en la zona
pelúcida tendría como consecuencia la formación de puentes
ditirosina o disulfuro, dependiendo de la especie, que en último
término serían los responsables del endurecimiento (Schmell y
Gulyas, 1980, Gamete Research 3:279-290; Zhang
et al., 1991, Mol Reprod Dev 28:292-296) y
por ende, del bloqueo de la polispermia.
Desde que se obtuvieron los primeros lechones
nacidos por fecundación in vitro (Cheng et al., 1986,
Theriogenology 25:146) se hizo evidente el problema de la
polispermia en el cerdo. Por este motivo han sido numerosas las
publicaciones orientadas a la búsqueda de las condiciones ideales
durante la FIV para evitar la entrada masiva de espermatozoides en
el ovocito de esta especie. Los esfuerzos investigadores se han
centrado en el estudio de los medios de cultivo empleados
(Dobrinsky et al., 1996, Biol Reprod
55:1069-1074; Abeydeera et al., 1998, Mol
Reprod Dev 51:395-401; Coy et al., 2002,
Reproduction 124:279-288), la estandarización de las
condiciones de trabajo (Coy et al., 1993a, Theriogenology 39:
1201-1208; Coy et al., 1993b, Theriogenology
40: 539-546; Coy et al., 1993c, Zygote 1:
209-213), el empleo de espermatozoides
crioconservados, y a ser posible de origen epididimario (Rath y
Niemann 1997 Theriogenology 547:785-793; Romar
et al., 2003a, Theriogenology 59:975-986), la
comparación de los resultados entre los distintos sistemas de
capacitación (Jeong y Yang, 2001, Mol Reprod Dev
59:330-335; Matás et al., 2003 Reproduction
125: 133-141), o el empleo de la inyección
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) como técnica
alternativa a la FIV (Probst et al., 2002, Theriogenology
57:752; García-Roselló et al., 2005, J
Androl 27:268-275). Sin embargo, como señalan
diversas revisiones sobre el tema (Abeydeera 2002, Theriogenology
57:257-273; Coy y Romar, 2002, Reprod Fert Dev
14:275-286; Wheeler et al., 2004, Reprod Fert
Dev 16:15-25), el problema persiste y las
soluciones pasan por intentar imitar, en condiciones in
vitro, el mecanismo fisiológico de bloqueo de la polispermia
que tiene lugar en el oviducto.
Se ha demostrado que en la especie porcina los
ovocitos madurados in vitro poseen la misma capacidad para
liberar los gránulos corticales (GC) tras la fecundación que los
madurados in vivo (Wang et al., 1998, Mol Reprod Dev
49:308-316). Sin embargo, tanto en el cerdo como en
la vaca se ha observado una ausencia de endurecimiento o
"hardening" tras la reacción cortical en ovocitos madurados y
fecundados in vitro (Coy et al., 2002, Reproduction
124:279-288; Romar et al., 2003b, Anim Reprod
Sci 85:287-300, Coy et al., 2005,
Reproduction 129: 19-26). Una hipótesis posible
sería que la anormalmente alta incidencia de polispermia en la
especie porcina tras la penetración in vitro no fuera debida
a una incompleta reacción cortical (exocitosis de los gránulos
corticales), sino a la necesidad prioritaria del endurecimiento de
la zona pelúcida como mecanismo de bloqueo de la polispermia
frente a otros mecanismos como la proteolisis o remoción de
receptores para el espermatozoide mediada por glicosidasas o
proteasas de los gránulos corticales.
El DTSP o agente de Lomant (ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester) cuya
estructura química es:
es un reactivo químico usado para
conjugar moléculas por medio de un enlace covalente. Para ello el
grupo químico N-hidroxisuccinimidil (NHS) reacciona
con los grupos aminos presentes en los aminoácidos lisina de las
proteínas (Lomant y Fairbanks 1976, J Mol Biol 104: 243; Jarausch y
Kadenbach 1985, Eur J Biochem 146: 211). Este compuesto químico se
encuentra disponible
comercialmente.
Otros compuestos que actúan de forma similar,
conjugando moléculas por medio de un enlace covalente, son el EGS
(Etilen glicol bis [succinimidilsuccinato]), el
Sulfo-EGS (Etilen glicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato]), el BSOCOES (Bis[2
succinimidooxicarboniloxi) etil] sulfone), el DSP
(Ditiobis[succinimidilpropionato]), el DTSSP
(3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate]), el
DSS (Disuccinimidil suberato), el BS^{3}
(Bis[sulfosuccinimidil] suberate), el DSG (Disuccinimidil
glutarato), el DST (Disuccinimidil tartarato), el DFDNB
(1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno),
el DPDPB
(1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]
butano), el
BM[PEO]_{3}(1,11-bis
Maleimidotriethyleneglycol), el BMH
(Bis-Maleimidohexano), el BM [PEO]_{2} (1,
8-bis-Maleimidodietilenglicol), el
HBVS
(1,6-Hexano-bis-vinilsulfona),el
DTME (Ditio-bis-maleimidoetano), el
BMB (1,4-bis-Maleimidobutano), el
BMDB (1,4
bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano),
o el BMOE (Bis-Maleimidoetano).
Entre las sustancias antipolispérmicas
descubiertas figuran principalmente las denominadas oviductinas
(Kouba et al., Biol Reprod 2000, 63: 242-250;
McCauley et al., 2003, Biol Reprod
69:828-834) que son proteínas específicas
secretadas por las células oviductales. Antes de descubrir su
efecto beneficioso sobre la reducción de la polispermia, se
realizaron numerosos trabajos utilizando medios condicionados con
secreciones oviductales o con diferentes proporciones de fluido
oviductal, así como cocultivos con células epiteliales del oviducto
(Nagai y Moor 1990, Mol Reprod Dev 26:377-382;
Funahashi y Day, 1993, J Reprod Fertil 99:97-1038;
Kano et al. 1994, Theriogenology:
42:1061-1068; Dubuc y Sirard, 1995, Mol Reprod Dev
41:360-367; Kim et al. 1997, Zygote 5:
61-65; Vatzias y Hagen 1999, Biol Reprod 60:
42-48; Romar et al. 2001, Anim Rep Sci
68:85-98). Finalmente, se ha observado el efecto
beneficioso de la osteopontina, una proteína de la matriz
extracelular también presente en el oviducto, sobre la polispermia
(Prather, WO2006/012177).
De acuerdo con un aspecto de la invención, ésta
proporciona un método para fecundación in vitro mediante el
aumento de la resistencia de la zona pelúcida de los ovocitos de
mamífero a la digestión con proteasas y, como consecuencia, la
indución de uno de los mecanismos fisiológicos de bloqueo de la
polispermia.
Hasta ahora se pensaba que el endurecimiento de
la zona pelúcida era una consecuencia de la fecundación (Moller y
Wassarman, 1989, Dev Biol 132:103-112), es decir,
que se debía a una respuesta del ovocito a la entrada del
espermatozoide. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención,
se ha podido constatar que esto no es siempre así y que es posible
inducir el endurecimiento de la zona pelúcida y así aumentar muy
significativamente la monospermia. Por lo tanto, de acuerdo con un
aspecto de la invención, ésta proporciona un método para aumentar
la monospermia en la fecundación in vitro que comprende la
inducción del endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos
previo a la fecundación.
De acuerdo con una realización de la invención,
dicho endurecimiento previo a la fecundación de la zona pelúcida
de los ovocitos se lleva a cabo empleando medios químicos, físicos
y/o biológicos.
En el contexto de la invención, el término
"medios químicos" hace referencia al uso de al menos un
compuesto químico, capaz de provocar el endurecimiento de la zona
pelúcida de los ovocitos. De acuerdo con la invención, el término
"medios físicos" hace referencia a la aplicación de agentes
físicos (cambios de temperatura, presión, humedad, densidad, etc)
que pudieran endurecer la zona pelúcida. De acuerdo con la
invención, el término "medios biológicos" hace referencia a la
utilización de fluidos o sólidos corporales (humanos o animales) o
de sus componentes (como puede ser el fluido oviductal, alguna de
las proteínas que contiene o proteínas recombinantes), a la
utilización de medios de cultivo condicionados u obtenidos a partir
de secreciones de células oviductales o endometriales, que provoquen
un endurecimiento de la zona pelúcida.
De modo preferente, dicho endurecimiento se
lleva a cabo empleando compuestos químicos o biológicos,
inductores de dicho endurecimiento. En el caso de emplearse
compuestos biológicos, se utilizan de manera preferentemente
componentes oviductales.
De modo preferido, dicho endurecimiento de la
zona pelúcida de los ovocitos se lleva a cabo mediante la
incubación de éstos con al menos un compuesto químico o biológico
capaz de formar uniones entre los diferentes componentes de dicha
zona pelúcida. Dichos compuestos químicos son compuestos capaces de
formar enlaces covalentes entre proteínas y más preferiblemente
compuestos que forman enlaces covalentes entre los aminoácidos
lisina de las glicoproteínas de la zona pelúcida. Dichos compuestos
biológicos son compuestos capaces de unirse a la zona pelúcida por
fuerzas electrostáticas o de Van der Waals y restringir el paso de
espermatozoides a través de la misma, aumentando su resistencia a
la digestión con proteasas (endurecimiento).
Así, de acuerdo con una realización preferida de
la invención, ésta proporciona un método para aumentar la
monospermia en la fecundación in vitro que comprende la
inducción del endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos
con al menos un compuesto químico que forman enlaces covalentes
entre proteínas o un compuesto biológico que se une a la zona
pelúcida, y el posterior cocultivo de los ovocitos tratados con
dicho agente con espermatozoides. De acuerdo con una realización
preferida, dicho compuesto forma enlaces covalentes entre los
aminoácidos lisina de las glicoproteínas de la zona pelúcida de los
ovocitos.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, tras el tratamiento de los ovocitos con el compuesto
inductor del endurecimiento de la zona pelúcida de éstos, se lleva
a cabo un lavado del medio para la eliminación de dichos compuestos
del medio antes de iniciar el cocultivo de los ovocitos con los
espermatozoides.
De acuerdo con una realización preferida, el
agente inductor del endurecimiento de la zona pelúcida del ovocito
se selecciona entre el grupo formado por ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen
glicol bis [succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato](Sulfo-EGS),
Bis[2 succinimidooxicarboniloxi) etil] sulfone (BSOCOES),
Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP),
3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP),
Disuccinimidil suberato (DSS), Bis[sulfosuccinimidil]
suberate (BS^{3}), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil
tartarato (DST),
1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno
(DFDNB),
1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]
butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol
(BM[PEO]_{3}), Bis-Maleimidohexano
(BMH),
1,8-bis-Maleimidodietilenglicol
(BM[PEO]_{2}),
1,6-Hexano-bis-vinilsulfona
(HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano
(DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano
(BMB), 1,4
bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano
(BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE), y mezcla de los
mismos. En una realización más preferida el agente es el ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).
El método resulta beneficioso para la
fecundación in vitro, ya que incrementa su rendimiento al
reducir el número de fecundaciones anómalas (polispérmicas). El
método es especialmente adecuado para la especie porcina pero
también mejora los resultados en la especie bovina y podría
utilizarse en otros mamíferos, incluyendo la especie humana.
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
ésta proporciona el uso de agentes que forman enlaces covalentes
entre proteínas como inductores del endurecimiento de la zona
pelúcida de los ovocitos de mamífero in vitro. De acuerdo
con una realización preferida de la invención, dichos agentes son
responsables de la formación de enlaces covalentes entre los
aminoácidos lisina de las glicoproteínas de la zona pelúcida.
En una realización preferida, dichos agentes se
seleccionan entre el grupo formado por ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen
glicol bis[succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato](Sulfo-EGS),
Bis[2 succinimidooxicarboniloxi) etil] sulfone (BSOCOES),
Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP),
3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP),
Disuccinimidil suberato (DSS), Bis[sulfosucci-
nimidil] suberate (BS^{3}), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST), 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido] butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol (BM[PEO]_{3}), Bis-Maleimidohexano (BMH), 1,8-bis-Maleimidodietilenglicol (BM[PEO]_{2}), 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano (BMB), 1,4 bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los mismos. En una realización más preferida el agente es el ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).
nimidil] suberate (BS^{3}), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST), 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido] butano (DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol (BM[PEO]_{3}), Bis-Maleimidohexano (BMH), 1,8-bis-Maleimidodietilenglicol (BM[PEO]_{2}), 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano (BMB), 1,4 bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los mismos. En una realización más preferida el agente es el ácido 3,3'-Ditiodipropiónico di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).
Dicho endurecimiento de la zona pelúcida de los
ovocitos tiene como consecuencia un efecto sobre el bloqueo de la
polispermia. Por lo tanto, de acuerdo con éste aspecto de la
invención, éste puede ser también referido como el uso de agentes
formadores de enlaces covalentes entre proteínas como agentes
antipolispérmicos.
Así, de acuerdo con la invención, el DTSP (al
igual que el resto de agentes formadores de enlaces covalentes
entre proteínas) produce un endurecimiento de la zona pelúcida de
los ovocitos semejante al que se produce en condiciones
fisiológicas y permite que el ovocito establezca un mecanismo
eficaz de defensa contra la entrada masiva de espermatozoides en su
citoplasma (polispermia) en ensayos de fecundación in
vitro.
Del mismo modo, de acuerdo con la invención, el
agente formador de enlaces covalentes entre proteínas, que de modo
preferido es el DTSP, produce un incremento en la resistencia de la
zona pelúcida de los ovocitos a la digestión con proteasas. Este
endurecimiento, que también ocurre en condiciones fisiológicas, se
puede inducir en el laboratorio con el DTSP y de este modo
potenciar el mecanismo de defensa del ovocito contra la entrada
masiva de espermatozoides (polispermia), que es frecuente en la
fecundación in vitro.
El uso de agentes formadores de enlaces
covalentes entre proteínas, como agente antipolispérmico, dada su
capacidad de producir un endurecimiento de la zona pelúcida de los
ovocitos puede ser utilizado con grandes ventajas en la especie
porcina pero también en otras como la humana, bovina, equina,
ovina, caprina, felina, canina o en roedores y lagomorfos.
De acuerdo con la invención, el método para
aumentar la resistencia de la zona pelúcida de los ovocitos de
mamífero a la digestión con proteasas comprende las etapas
siguientes:
- i)
- inducir el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos por medios químicos, físicos y/o biológicos;
- ii)
- opcionalmente, lavar los ovocitos tratados en la etapa i);
- iii)
- cocultivo de los ovocitos con espermatozoides.
Según una realización preferida, el
endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos se lleva a cabo
mediante el tratamiento con un agente formador de enlaces
covalentes entre proteínas. De modo más preferido, el método
comprende:
- i)
- introducir los ovocitos en una solución que contiene al menos un agente formador de enlaces covalentes entre proteínas y opcionalmente un tampón;
- ii)
- opcionalmente, lavar dicha solución para eliminar la presencia de dicho agente; y
- iii)
- transferir los ovocitos tratados previamente a otra solución a la que se añaden los espermatozoides para permitirles fecundar los ovocitos.
De modo que en el medio de maduración (solución
de la etapa i) del método descrito en la presente invención, se
introducen los ovocitos, el compuesto formador de enlaces
covalentes entre proteínas y opcionalmente un tampón.
Los protocolos de maduración in vitro de
los ovocitos, preparación de los espermatozoides, fecundación in
vitro, cultivo y transferencia de embriones son conocidos y se
han descrito en numerosas publicaciones (por ejemplo, Rath, 1992,
Theriogenology 37:885-896; Abeydeera et al.,
Biol Reprod 1998, 58:1316-1320; Coy et al.,
2005, Reproduction 129:747-755).
De acuerdo con una realización preferida, la
concentración del compuesto formador de enlaces covalentes entre
proteínas, por ejemplo DTSP, en el medio con el tampón y los
ovocitos puede oscilar desde 0'03 hasta 1'2 mg/ml de DTSP y el
tiempo de incubación de los ovocitos con dicho compuesto puede
variar desde 1 minuto hasta 2 horas.
Sin la presencia de dicho compuesto formador de
enlaces covalentes entre proteínas, el tiempo de digestión de la
zona pelúcida con una solución de proteasa al 0'5% oscila entre uno
y dos minutos, los porcentajes de polispermia (con concentraciones
de espermatozoides que permitan penetraciones superiores al 90%)
pueden superar el 90% en el cerdo y el 50% en la vaca (ver
ejemplos, Tablas 1, 2, 3 y 4), y el número medio de espermatozoides
que penetra por ovocito puede alcanzar valores de 12 en el caso del
cerdo o de 1'7 en el caso de la vaca. Sin embargo, la adición de
dicho compuesto aumenta el tiempo de resistencia de la zona
pelúcida a la digestión con pronasa hasta 3700 segundos en el caso
del cerdo y 1700 segundos en el caso de la vaca, la polispermia (en
condiciones de saturación de espermatozoides en el medio) disminuye
al 64% en el cerdo y al 36% en la vaca, y el número medio de
espermatozoides por ovocito se sitúa en 2'8 en el cerdo y 1'6 en la
vaca (Tablas 1, 2, 3 y 4).
En otro ejemplo (Tabla 5), la polispermia
disminuye hasta el 54% cuando la penetración es del 94% y hasta el
30% cuando la penetración es del 63%.
Los ovocitos pueden ser obtenidos del oviducto
mediante una intervención quirúrgica o bien de ovarios obtenidos
en matadero, en el caso de animales de abasto. En la especie
humana, se pueden obtener mediante punción de los folículos
ováricos por vía transvaginal. Suele resultar más fácil obtener
ovocitos de folículos ováricos y, en el caso de los animales,
someterlos a un proceso de maduración in vitro que
obtenerlos en el oviducto por vía quirúrgica. Para la maduración
in vitro existen numerosos protocolos y sistemas descritos
(ver por ejemplo, Funahashi et al., 1997, Biol Reprod
57:49-53; Coy et al., 1999, Theriogenology
51: 799-812). Todos ellos utilizan un medio de
cultivo más o menos complejo que contiene diferentes sales,
sustratos energéticos, antibióticos, hormonas, etc. Los ovocitos
en este medio de cultivo se mantienen durante un periodo de tiempo
variable (por ejemplo, 24 horas en la vaca, 44 horas en el cerdo),
en condiciones adecuadas de temperatura (entre
37-39ºC, normalmente) y humedad. El volumen de
medio de cultivo puede variar. Por ejemplo, pueden emplearse
microgotas de 50 o 100 \mul cubiertas con aceite mineral
conteniendo 25-50 ovocitos, o pueden emplearse
pocillos con 500 \mul de medio y un número variable de ovocitos
(20-70, por ejemplo).
El DTSP y otros compuestos que incrementan la
resistencia de la zona pelúcida a la digestión con proteasa pueden
introducirse en el medio de maduración de los ovocitos a una
concentración de 0'03 a 1'2 mg/ml desde el inicio del proceso de
maduración o al final del mismo. De esta manera el DTSP puede estar
en contacto con los ovocitos desde 1 minuto hasta 48 horas en el
caso del cerdo o desde 1 minuto hasta 28 horas en el caso de la
vaca.
Los espermatozoides que se van a utilizar en la
fecundación in vitro pueden ser obtenidos a partir de
muestras de eyaculados de las que se emplean para inseminación
artificial, o a partir de testículos obtenidos en matadero en el
caso de los animales de abasto, mediante la extracción de los
mismos desde el epidídimo. Estos espermatozoides, a su vez, pueden
ser o no crioconservados, seleccionados en función de que porten
el cromosoma X o el Y (sexados), pueden también ser portadores de
ADN exógeno que luego introducirán en el ovocito (Lavitrano et
al., 2003, Mol Reprod Dev 64:284-297), etc.
Los tratamientos a los que se somete a los
espermatozoides para inducir la capacitación pueden variar. Por
ejemplo, se han usado sistemas que incluían un proceso con tres
lavados en solución salina y una preincubación de 40 minutos en
medio TCM-199 a un pH de 7.8, habiendo sometido
previamente a los espermatozoides a un periodo de conservación de
16 horas a 20ºC. Posteriormente, Mattioli et al. (1989,
Theriogenology 31:1201-1207) refirieron también el
nacimiento de lechones por FIV sometiendo a los espermatozoides a
un proceso de selección a través de un gradiente de Percoll®,
sistema semejante al empleado en la especie humana. Este método
permite aislar de manera rápida y eficiente a los espermatozoides
mótiles, que son liberados de contaminación por otros
constituyentes seminales (Ng FLH, Human Reproduction 1992, 7:
261-266,). También Yoshida sometió a los
espermatozoides a tres lavados por centrifugación, aunque sin
preincubación, antes de introducirlos en las placas de cultivo para
la FIV, obteniendo éxito en cuanto a la producción de descendencia
viva (Theriogenology 1993, 39:1303-1311). Estudios
posteriores demostraron que no eran necesarios ni los lavados ni las
preincubaciones previas a la introducción de los espermatozoides en
las placas de cultivo para conseguir penetraciones (Martínez et
al., 1996, Biol Reprod 55:134-140; Matás et
al., 2003, Reproduction 125: 133-141).
Los espermatozoides, pues, de diferentes
orígenes y sometidos a distintos tratamientos son transferidos a
un medio de fecundación (solución de la etapa ii) del método de la
invención) al que también son transferidos los ovocitos previamente
tratados con el compuesto formador de enlaces covalentes entre
proteínas. El tiempo de fecundación puede variar desde 5 minutos
hasta 18-20 horas.
De acuerdo con el método de la invención, la
fecundación in vitro puede realizarse de modo convencional,
es decir, introduciendo los ovocitos y los espermatozoides en un
medio de cultivo (TCM-199, TBM, TALP, etc). El
número de ovocitos por pocillo o por microgota de medio puede
variar, pero un ejemplo puede consistir en depositar 50 ovocitos
pretratados con DTSP en 250 \mul de medio TALP y añadir 250
\mul de espermatozoides pretratados con Percoll® como describen
Matás et al (Matás et al., 2003, Reproduction 125:
133-141). El tiempo de cocultivo de los ovocitos con
los espermatozoides puede oscilar desde 5 minutos (Funahashi y
Romar 2004, Reproduction 128:789-800) hasta
20-24 horas.
En los ejemplos descritos, el tiempo de
coincubación es de 4 horas. Después de este tiempo, los ovocitos se
lavan muy bien mediante sucesivos pases a través de una pipeta
Pasteur adelgazada para eliminar el exceso de espermatozoides
adheridos a la zona pelúcida y se introducen en un medio de cultivo
de embriones, o se mantienen en el medio de fecundación hasta el
día siguiente.
Para evaluar los resultados, entre las 12 y las
24 horas después del inicio del cocultivo, los ovocitos se fijan y
se tiñen para observar el número de espermatozoides que han
penetrado y el estadio de desarrollo en el que se encuentran. Se
puede emplear glutaraldehido como fijador y Hoechst para teñir el
ADN, o etanol acético como fijador y orceína o lacmoid para teñir
el núcleo. El porcentaje de ovocitos penetrados, el estadio nuclear
del ovocito (vesícula germinal, metafase, anafase, telofase,
pronúcleo femenino) y el estadio nuclear del espermatozoide
(cabezas compactas, descondensadas o pronúcleo masculino) se pueden
valorar en microscopio de contraste de fases o de fluores-
cencia.
cencia.
Se consideran ovocitos monospérmicos aquellos
que solo presentan un espermatozoide en su interior. El
tratamiento con al menos un compuesto formador de enlaces
covalentes entre proteínas, y especialmente el DTSP, incrementa la
eficacia total del sistema (porcentaje de ovocitos penetrados
monospérmicos) hasta un 40%, y los porcentajes de monospermia
pueden pasar de un 4% en el grupo control a un 70% en el grupo
tratado con 0'60 mg/ml de DTSP (Tabla 5).
Otra posibilidad es evaluar los resultados a las
48 horas de la fecundación. En este caso, lo que valoraremos es el
porcentaje de ovocitos que han alcanzado el estadio de
"embrión" de dos células, es decir que han sido fecundados y
han progresado en su desarrollo hasta este estadio.
Además del tratamiento con DTSP se pueden
introducir en el sistema otras variaciones que ayudan a mejorar los
porcentajes de monospermia como pueden ser la adición de
glicoproteínas oviductales (McCauley et al., 2003, Biol
Reprod 69:828-834), el pretratamiento de los
espermatozoides con adenosina y posterior coincubación de los
gametos con cafeína (Funahashi y Romar 2004, Reproduction
128:789-800), la adición de osteopontina (Prather,
WO2006/012177 A2), etc.
Tras el periodo de tiempo de cocultivo con los
espermatozoides, los ovocitos fecundados pueden transferirse a un
medio de cultivo de embriones. En el caso del cerdo, por ejemplo,
el más utilizado es el NCSU (Petters y Wells, 1993, J. Reprod.
Fertil. 48, 61-73) en diferentes versiones, como el
NCSU-23, que contiene taurina e hipotaurina
(Abeydeera et al 1998, Theriogenology 50:
747-56; Machaty et al., 1998, Biol. Reprod.
59: 451-55), o el NCSU-37, que
contiene sorbitol (Hajdu et al., 1994, J Anim Sci
72:1299-1305; Kikuchi et al., 1999, Biol.
Reprod. 60:336-340). En la vaca se emplean, por
ejemplo, el medio KSOM (Lawrence et al., 2004, J Dairy Sci
87:2449-2454; Coy et al., 2005, Reproduction
129:19-26) o el SOF (Carolan et al., 1995,
Theriogenology 43:1115-1128; Lonergan et al.,
1997, J Reprod Fert 109:355365), entre otros. Los medios de cultivo
de embriones pueden llevar numerosos aditivos como el factor de
crecimiento epidérmico (EGF), células oviductales (Katska et
al., 1995, Theriogenology 43:859-70; Katska
et al., 1998, J Anim Feed Sc 7:353-362) o
endometriales (Katsuragawa et al., 1995, Hum. Reprod.
10:3028-3034; Conway-Myers 1998,
Semin Reprod Endocrinol 16:175-182), pueden o no
contener proteínas o suero (Dobrinsky et al., 1996, Koo
et al., 1997), etc.
Independientemente del medio de cultivo
utilizado, los embriones se mantienen en el incubador entre 1 y 9
días, alcanzando en este último caso el estadio de blastocisto. Los
embriones pueden ser transferidos a hembras receptoras por métodos
quirúrgicos o no quirúrgicos, pueden ser congelados o vitrificados,
pueden ser clonados o modificados genéticamente por diferentes
métodos antes de ser transferidos, etc. Las variaciones en el
método descrito pueden ser numerosas, pero en general, el
rendimiento final de las diferentes técnicas puede ser mejorado con
el empleo de DTSP u otra molécula de mecanismo de acción similar
para aumentar la resistencia de la zona pelúcida del ovocito a la
digestión proteolítica.
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
ésta proporciona una solución para inducir el endurecimiento de la
zona pelúcida de ovocitos in vitro, caracterizada porque
incluye ovocitos y al menos un agente químico capaz de formar
enlaces covalentes entre proteínas. Entre los agentes químicos
capaces de formar enlaces covalentes entre proteínas se encuentran
aquellos citados anteriormente en la presente invención. De modo
preferido se emplea el DTSP.
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
ésta proporciona el uso de un compuesto que forma enlaces
covalentes entre proteínas en la indución del endurecimiento de la
zona pelúcida de ovocitos in vitro.
Del mismo modo, la invención se refiere de modo
preferido al uso del ácido 3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP) como
agente anti-polispérmico in vitro.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos.
Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ovocitos se obtuvieron de cerdas prepúberes
sacrificadas en matadero. Los complejos células
cúmulus-ovocito se recogieron de folículos no
atrésicos (3 a 6 mm diámetro) y se maduraron en grupos de
50-55 en 500 \mul de medio de maduración
NCSU-37 durante 22 h a 38'5ºC y 5% CO_{2} en
aire. El medio NCSU-37 (Petters & Wells, 1993)
se suplementó con cisteína 0.57 mmol, dibutiril AMP 1 mmol, 5
\mug/ml de insulina, \beta-mercaptoethanol 50
\mumol, 10 UI de eCG/ml (Foligon, Intervet International B.V.,
Boxmeer, Holland), 10 UI de hCG/ml (Chorulon, Intervet
International B.V., Boxmeer, Holland), y 10% de fluido folicular
porcino (v/v). Tras este tiempo, los ovocitos se lavaron y
transfirieron a medio sin hormonas durante 22 h (Funahashi y Day,
1993).
Los ovocitos se obtuvieron de vacas sacrificadas
en matadero. Los complejos células cúmulus-ovocito
se recogieron por aspiración de folículos no atrésicos y se
cultivaron en medio TCM-199 con glutamina, sales de
Earle's y bicarbonato a pH 7'4. Seis horas antes de su utilización
al medio se le adicionó suero fetal bovino (10% v/v), 10 UI de
hCG/ml (Chorulon, Intervet Internacional B.V., Boxmeer, Holanda),
10 UI de eCG/ml (Foligon, Intervet Internacional B.V., Boxmeer,
Holanda), piruvato de sodio 0'2 mM, y L-glutamina 2
mM, y se equilibró en cámara de cultivo con atmósfera humidificada
a 38'5ºC y 5% de CO_{2}. Se maduraron en grupos de
50-55 en 500 \mul de medio durante
22-24 h a 38.5ºC y 5% CO_{2} en aire.
\vskip1.000000\baselineskip
Al final del periodo de maduración, los ovocitos
se transfirieron a un medio de lavado (PBS) y se pipetearon
repetidamente o se sometieron a vortex para eliminar las células
del cumulus que tengan adheridas a la zona pelúcida. Posteriormente
se transfirieron a medio de maduración fresco con 0 (grupo control)
ó 0'60 mg/ml de DTSP y se mantuvieron 30 minutos en el incubador
en atmósfera humidificada a 38'5ºC y 5% de CO_{2}. A
continuación, se introdujeron en grupos de 5 en gotas de 50 \mul
de pronasa (0.5% (w/v) en PBS). Las zonas pelúcidas se observaron
ininterrumpidamente en el estereomicroscopio a 200 x con una placa
calefactora a 37ºC hasta su disolución, anotando el tiempo que
tarda ésta en producirse (ver Tablas 1 y 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los ovocitos maduros tratados con DTSP o no
tratados (grupo control) se transfirieron en grupos de 50 a
pocillos con 250 \mul de medio TALP. La fecundación se realizó
mediante un periodo de cocultivo entre gametos de 4 horas. La
fracción rica del eyaculado de verracos de fertilidad probada se
transportó al laboratorio inmediatamente después de la recogida
diluida en BTS 1:8. Una muestra alícuota de semen de 0'5 ml se
depositó cuidadosamente sobre un gradiente discontinuo de Percoll®
de 45 y 90% (v/v) y se centrifugó a 700 g durante 30 min. Las
células recogidas en el fondo de la fracción 90% se lavaron en
medio de fecundación mediante centrifugación a 100 g durante 10
min. El precipitado de espermatozoides se resuspendió de nuevo en
medio de fecundación hasta alcanzar una concentración de 10^{5}
células/ml. El medio de fecundación in vitro es básicamente
el descrito por Rath et al. 1999 (Rath et al., en
1999, J Anim Sci 77: 3346-3352).
Tras el periodo de maduración in vitro,
los ovocitos tratados con DTSP o no tratados (grupo control) se
transfirieron en grupos de 50 a pocillos con 500 \mul de medio
TALP. La fecundación se realizó con 1x10^{6} espermatozoides/ml
con un periodo de cocultivo entre gametos de 18 horas. Los
espermatozoides procedían de pajuelas
congeladas-descongeladas de toros de fertilidad
probada. Las muestras de semen se centrifugaron en un gradiente
discontinuo de Percoll® de 45 y 90% (v/v) durante 15 minutos a 600
g. El precipitado se resuspendió en Sperm-TALP
(Parrish et al., 1988, Biol Reprod
38:1171-1180) y se lavó de nuevo durante 8 minutos a
300 g. Finalmente, los espermatozoides se resuspendieron en medio
FIV-TALP (Parrish et al., 1988) y se
añadieron al pocillo que contiene los ovocitos a una concentración
final de 10^{5} células/ml.
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18-20 horas después de la
fecundación, los ovocitos se lavaron por pipeteo o mediante vortex
para eliminar el exceso de espermatozoides adheridos a la zona
pelúcida y se fijaron en glutaraldehido (2% en PBS) durante 30
minutos. A continuación se tiñeron durante 15 min (1% Hoechst 33342
in PBS), se lavaron en PBS con 1 mg/ml polivinilpirrolidona y se
montaron en portaobjetos. Los ovocitos se consideran penetrados
(PEN) cuando se observa al menos un espermatozoide en el interior
del citoplasma, esté descondensado o en estadio pronuclear. El
número total de espermatozoides en el interior de cada ovocito
también se evaluó (E/O). Los ovocitos con un pronúcleo masculino y
otro femenino en su interior se consideraron monospérmicos (MON),
mientras que todos aquellos con dos o más espermatozoides en
cualquier estadio se consideraron polispérmicos.
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Claims (19)
1. Un método para fecundación in vitro
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- i)
- inducir el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos;
- ii)
- opcionalmente, lavar los ovocitos tratados en la etapa i);
- iii)
- cocultivo de los ovocitos con espermatozoides.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el proceso de endurecimiento de la etapa
i) se lleva a cabo utilizando medios químicos, físicos, biológicos o
mezcla de estos.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la
etapa i) se lleva a cabo mediante la incubación de los ovocitos con
al menos un compuesto químico o biológico capaz de formar uniones
entre los diferentes componentes de la zona pelúcida.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque la
etapa i) se lleva a cabo mediante la introducción de los ovocitos en
una solución que contiene al menos un agente químico capaz de formar
enlaces covalentes entre proteínas y, opcionalmente un tampón.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
caracterizado porque dicho agente formador de enlaces
covalentes entre proteínas es un agente químico capaz de formar
enlaces covalentes entre los aminoácidos lisina de las
glicoproteínas de la zona pelúcida de los ovocitos.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el agente
químico capaz de formar enlaces covalentes entre proteínas se
selecciona entre el grupo formado por ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen
glicol bis [succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS),
Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone
(BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP),
3,3'-Ditiobis[sulfosuccinimidilpropionate]
(DTSSP), Disuccinimidil suberato (DSS),
Bis[sulfosuccinimidil]suberate (BS3), Disuccinimidil
glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST),
1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno
(DFDNB),
1,4-Di-[3'-(2,-piridilditio)-propionamido]butano
(DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol
(BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH),
1,8-bis-Maleimidodietilenglicol
(BM[PEO]2),
1,6-Hexano-bis-vinilsulfona
(HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano
(DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano
(BMB), 1,4
bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano
(BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los
mismos.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 3 a 6, caracterizado porque el
compuesto formador enlaces covalentes entre proteínas es el ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 3 a 7, caracterizado porque la
etapa i) comprende la incubación de los ovocitos en presencia de
0'03 hasta 1'2 mg/ml de al menos un compuesto formador de enlaces
covalentes entre proteínas.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 3 a 8, caracterizado porque
comprende la incubación de los ovocitos en presencia de al menos un
compuesto formador de enlaces covalentes entre proteínas bien desde
el inicio del proceso de maduración o bien al final del mismo.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque
además incluye el paso de cultivar los ovocitos de origen animal
no-humano fecundados con espermatozoides de origen
animal no-humano hasta producir un embrión.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, caracterizado porque incluye el paso de clonar el embrión
animal no-humano por transferencia nuclear.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los ovocitos se
seleccionan entre ovocitos porcinos, bovinos, caninos, equinos,
ovinos, aviares o de roedores.
13. Una solución para inducir el endurecimiento
de la zona pelúcida de ovocitos in vitro,
caracterizada porque incluye ovocitos y al menos un agente
químico capaz de formar enlaces covalentes entre proteínas.
14. La solución de acuerdo con la reivindicación
13, caracterizado porque el agente químico se selecciona
entre el grupo formado por ácido
3,3-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen
glicol bis[succinimidilsuccinato] (EGS), Etilenglicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS),
Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone
(BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato] (DSP),
3,3'-Ditiobis [sulfosuccinimidilpropionate] (DTSSP),
Disuccinimidil suberato (DSS),
Bis[sulfosuccinimidil]suberate (BS3), Disuccinimidil
glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST),
1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno
(DFDNB),
1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano
(DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol
(BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH),
1,8-bis-Maleimidodietilenglicol
(BM[PEO]2),
1,6-Hexano-bis-vinilsulfona
(HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano
(DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano
(BMB), 1,4
bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano
(BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los
mismos.
15. La solución de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 14, caracterizado porque el compuesto
formador de enlaces covalentes entre proteínas es el ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP).
16. El uso de un compuesto que forma enlaces
covalentes entre proteínas en la indución del endurecimiento de la
zona pelúcida de ovocitos in vitro.
17. El uso del ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP), Etilen
glicol bis [succinimidilsuccinato] (EGS), Etilen glicol
bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (Sulfo-EGS),
Bis[2 succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfone
(BSOCOES), Ditiobis[succinimidilpropionato](DSP),
3,3'-Ditiobis[sulfosuccinimidilpropionate]
(DTSSP), Disuccinimidil suberato (DSS),
Bis[sulfosuccinimidil] suberate (BS3), Disuccinimidil
glutarato (DSG), Disuccinimidil tartarato (DST),
1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenceno
(DFDNB),
1,4-Di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]butano
(DPDPB), 1,11-bis Maleimidotriethyleneglycol
(BM[PEO]3), Bis-Maleimidohexano (BMH),
1,8-bis-Maleimidodietilenglicol
(BM[PEO]2),
1,6-Hexano-bis-vinilsulfona
(HBVS), Ditio-bis-maleimidoetano
(DTME), 1,4-bis-Maleimidobutano
(BMB), 1,4
bis-Maleimidil-2,3-dihidroxibutano
(BMDB), Bis-Maleimidoetano (BMOE) y mezcla de los
mismos en la indución del endurecimiento de la zona pelúcida de
ovocitos in vitro.
18. El uso del ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP) como
agente inductor del endurecimiento de la zona pelúcida de ovocitos
in vitro.
19. El uso del ácido
3,3'-Ditiodipropiónico
di(N-hidroxisuccinimida ester (DTSP) como
agente anti-polispérmico in vitro.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602334A ES2323993B1 (es) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | Metodo para aumentar la monospermia en la fecundacion in vitro. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602334A ES2323993B1 (es) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | Metodo para aumentar la monospermia en la fecundacion in vitro. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323993A1 ES2323993A1 (es) | 2009-07-28 |
| ES2323993B1 true ES2323993B1 (es) | 2010-05-31 |
Family
ID=40852633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200602334A Active ES2323993B1 (es) | 2006-09-14 | 2006-09-14 | Metodo para aumentar la monospermia en la fecundacion in vitro. |
Country Status (1)
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|---|---|
| ES (1) | ES2323993B1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2532659B2 (es) | 2014-10-08 | 2015-09-08 | Universidad De Murcia | Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2570491A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-02-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Method to decrease the rate of polyspermy in ivf |
-
2006
- 2006-09-14 ES ES200602334A patent/ES2323993B1/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| IWAMOTO K. et al. "{}Disulfide formation in bovine zona pellucida glycoproteins during fertilization: evidence for the involvement of cysteine cross-linkages in hardening of the zona pellucida"{} Journal of Reproduction and Fertility. Nov. 1999 vol. 117 pag. 395-402, todo el documento. * |
| RATH D. et al. "{}Zona pellucida characteristics and sperm-binding patterns of in vivo and in vitro produced porcine oocytes inseminated with differently prepared spermatozoa"{} Theriogenology. Enero 2005 vol 63. pag. 352-362, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2323993A1 (es) | 2009-07-28 |
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Legal Events
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