WO2016055681A1 - Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero - Google Patents

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero Download PDF

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Raquel Romar Andres
María Pilar COY FUSTER
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Universidad De Murcia
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    • C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer

Definitions

  • the present invention contemplates a method for increasing embryonic quality through the use of in vitro fertilization (IVF) techniques, optionally with pre-incubation of the oocytes in natural biological fluids of specific phases of the reproductive cycle, combined with a method of sperm separation in the middle. of culture supplemented with said fluids and the subsequent fertilization and embryonic culture (EC) in media supplemented with fluids.
  • IVF in vitro fertilization
  • EC fertilization and embryonic culture
  • This invention belongs in general to the field of Assisted Reproduction in mammals, in particular the techniques of sperm training, in vitro fertilization and embryo culture.
  • the currently known procedure for obtaining an embryo in vitro involves the performance of different assisted reproduction techniques (ARTs) that differ between laboratories and species, and includes the following steps: 1) obtaining and in vitro maturation (IVM) of the female gametes (oocytes); 2) the preparation and training of male gametes (sperm); 3) the process of in vitro fertilization itself either by co-cultivating the gametes or assisted microinjection of a sperm inside the oocyte, and 4) the CE so that the zygotes reach the desired stage of development, usually the of blastocyst.
  • IVM in vitro maturation
  • sperm preparation and training of male gametes
  • CE the process of in vitro fertilization itself either by co-cultivating the gametes or assisted microinjection of a sperm inside the oocyte
  • CE so that the zygotes reach the desired stage of development, usually the of blastocyst.
  • FO and / or FU are obtained by different techniques and are generally processed with a single centrifugation and subsequent freezing of the liquid fraction (Carrasco et al. 2008a, Fertile Reprod Dev 20: 808-817; Carrasco et al. 2008b, Reproduction 136: 833-842; Faulkner et al. 2012, Proteomics 12: 2014-223; Lippes and Wagh 1993, Fertile Steril 59: 157-162; Velazquez et al. 2010, Theriogenology 73: 758- 767).
  • biofluids have not been used as additives in human ARTs, which opens a new field of research, especially if we consider that, in most cases, the beneficial effect on gametes and embryos is interspecific, that is, that biofluids of one mammal species can be used for ARTs of another different species (Mondisputed et al. 2013, HumReprod 28: 718-728; Rondeau et al.
  • Patent-1 (ES 2 323 993 A1, Pilar Coy Fuster and Manuel Avilés Sánchez), which describes a method to increase monospermia in IVF.
  • Patent-2 (ES 2 439424 A1, Ignacio Santiago ⁇ lvarez Miguel and Mario Javier Perianes Carrasco) which describes a method to increase the implant potential of mammalian embryos obtained by IVF.
  • Patent-3 (WO2006 / 012177, Randall Prather) "Method to decrease the rate of polyspermy in IVF".
  • Patent-4 (US 2013/0344595 A1, David K. Gardner, Mark G. Larman and Donald Linck) "Culture media for developmental cells containing elevated concentrations of lipoic acid”.
  • Patent-5 (CN 103333855 (A), ZouXiangang and Zhao Yalin) "Sheep embryonic cell culture fluid”.
  • the present invention contemplates a method for increasing the quality of mammalian embryos obtained in vitro by means of a system that includes the addition of natural biological fluids (FO and / or FU) of specific phases of the reproductive cycle in the sperm training, IVF and EC.
  • natural biological fluids FO and / or FU
  • the authors of the present invention have developed, on the one hand, a sperm training system that does not require centrifugations, using the FO and / or FU as a protein additive, which implies great advantages in reducing stress by that the male gametes are subjected during the seminal plasma separation procedure, and thus helps to select those sperm with better DNA quality and integrity. It has been possible to combine both strategies by formulating a new culture medium to select sperm using the Swim-up technique that offers better results than conventional media.
  • this invention proposes the introduction of these natural fluids from the reproductive tract, such as FO and FU, into ARTs to improve the quality of embryos obtained in vitro.
  • the invention describes a method of obtaining embryos in vitro by adding biofluids to the culture media in each of the process phases.
  • Biofluids are obtained from genital devices of mammalian females in specific phases of the reproductive cycle and are previously subjected to a purification and treatment process for their conservation and transport.
  • the invention comprises the following steps: a) a method of classification of FO and FU according to the stage of the reproductive cycle in which they are obtained, followed by their fractionation by double centrifugation and subsequent processing by lyophilization and pasteurization.
  • IVF in a medium enriched with FO and / or FU.
  • the FO is obtained by aspiration by introducing the tip of an automatic pipette through the oviductal ampoule and exerting a manual pressure thus aspirating all the oviductal content.
  • said content is centrifuged (between 4000-1 OOOOg for 1-10 minutes at 4 ° C) and the cell pellet and the mucous phase are discarded.
  • the FO supernatant is recentrifuged under the same conditions, the aqueous phase being in the upper part and the mucous phase (bottom of the tube) in the lower part. Only the aqueous phase of the FO is aspirated.
  • the FU is obtained by aspiration by introducing the tip of an automatic pipette into the uterine horn, exerting an upward manual pressure. Said content is fractionated by double centrifugation under the same conditions as the FO.
  • the biofluids are lyophilized between -50 ° C and -60 ° C, for 20-24h with a pressure of 0.040-0.010 millibars. Once the process is finished, they are kept refrigerated until they are used.
  • the biofluids obtained from the different species and phases of the cycle are stored in a biobank and can be used both inter-or intraspecific as well as autologous or heterologous. Before using them as additives in a culture medium, the biofluids are redissolved with purified water to their original volume.
  • biofluids can be transported at room temperature, maintain their biological properties when rehydrated and can be pasteurized at 72-80 ° C for 10-20 seconds before use, which results necessary for the sanitary guarantees of the product.
  • Product activity tests have been performed evaluating the ability of biofluids to harden the pellucid zone (ZP) of the oocyte (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27).
  • ZP pellucid zone
  • mature oocytes underwent digestion with protease. The results show that the biofluids subjected to the fractionation and conservation process described in this patent maintain their biological activity once they are resuspended and pasteurized.
  • the present invention includes the formulation of a new culture medium for sperm selection that we call Swim-up-biofluids.
  • a new culture medium for sperm selection that we call Swim-up-biofluids.
  • NaHCOs NaCI, KCI, MgS0 4 , K 2 HP0, and CaCI 2 . They are responsible for maintaining the osmolarity and pH of the medium, so their concentration was adjusted to levels similar to those described in the FO. The final osmolarity of the medium remained in the range physiological 280-320mOsm. The concentration of inorganic salts was between 90 and 130 mM.
  • concentration of energy substrates within this group are glucose, sodium pyruvate, sodium lactate and sucrose. Concentrations were adjusted to achieve optimum density and viscosity that allowed sperm motility through the medium. The concentration of energy substrates was between 120 and 160 mM.
  • the protein source in the new medium we designed, Swim-up-biofluids, the protein source consisted of the addition of 0.1-5% of FO preferably from fractional and treated phase F2 as described in step a). This treatment was compared with BSA, a protein source usually used in training media.
  • the Swim-up-biofluids training method was performed by mixing 0.5-1.5ml of semen with 0.5-1.5ml of Swim-up-biofluids medium and allowing the sperm to swim towards the top of the tube for a time of 10-50 min at a temperature of 37-38 ° C. After this time 0.5-1 ml of the middle of the upper part was collected containing the sperm that were used to
  • the porcine oocytes are matured in vitro for 42-44h according to the protocols described (Coyetal. 2008b, Reproduction 135: 19-27). After this time, they are mechanically decumulated and 50-55 oocytes are transferred per fertilization well containing only 500 ul of TALP medium (control group) (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141) or TALP supplemented with 0.1 to 5 % of FO, preferably of phase F2 or L1, fractionated and treated as described in step a) (biofluid group).
  • the sperm used for IVF were obtained and processed using the Swim-up-biofluid system described in step b).
  • the decumulated oocytes can be incubated 30-60 minutes with FO preferably of phase F2 or L1.
  • FO preferably of phase F2 or L1.
  • the gametes were cocultivated for 18 hours after which the alleged zygotes were fixed and stained to evaluate the results of fertilization. With this method, the rates of monospermia are improved after fertilization.
  • the embryonic division was evaluated and subsequently the embryos were transferred to NCSU-23 medium supplemented with 0.1-5% FU preferably from phase L1 or L2 to the blastocyst stage.
  • the biofluids were not used in any of the phases of the method, the sperm were trained with the Swim-up-BSA method, the oocytes were fertilized in TALP medium and the zygotes were transferred to NCSU-23 medium for culture. embryonic.
  • the quality of the embryos obtained in both groups was evaluated according to morphology (Bó and Mapletoft 2013, Anim Reprod 10: 344-348) and number of cells per blastocyst.
  • Experimental work has shown that embryos produced in vitro with the biofluid method divide faster than the control and are of better quality (evaluated as number of cells per blastocyst and ability to hatch).
  • Example of embodiment of the invention Method used to obtain embryos by fertilization and in vitro culture using biofluids from different stages of the cycle, checking the improvement in embryonic quality a.- Obtaining, fractioning and controlling the activity of biofluids
  • FO and FU are obtained from genitals from animals slaughtered in slaughterhouse for meat consumption.
  • human species they can be obtained from donors, from patients undergoing tubal ligation or from women undergoing salpingectomies or hysterectomies for health reasons.
  • the biofluids are centrifuged (4000-1 OOOOg for 1-10 minutes at 4 ° C) and the aqueous phase is recentrifuged under the same conditions. This liquid is lyophilized and pasteurized, being ready for use as an additive for culture media after resuspension with purified water.
  • the effectiveness of the treatment was estimated by the ability of the FO to cause hardening of the zona pellucida.
  • the oocytes matured in vitro are mechanically denied and incubated in FO for 30-60 minutes at 38.5 ° C. After this time the oocytes are incubated with a 0.5% protease solution and the time it takes to digest the ZP is counted.
  • Table 1 shows, the treated biofluids maintained their biological activity with respect to untreated biofluids (control):
  • N is the number of oocytes used b.- Sperm training without centrifugation in a new medium enriched with biofluids.
  • the new culture medium was formulated by adjusting osmolarity, pH and energy substrates and replacing bovine serum albumin (BSA) with biofluids.
  • BSA bovine serum albumin
  • the training was carried out with ejaculated sperm from males of proven fertilization (12-24 months of age).
  • semen was deposited on the Swim-up-biofluid medium for 15-30 minutes at 37-38 ° C. After this time the cells were collected from the top and the sperm concentration was adjusted to 25,000 sperm / ml using TALP culture medium (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141).
  • This new method of sperm training was compared with the traditional centrifugation method (Percoll) (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141).
  • the quality of the sperm obtained was assessed by its ability to fertilize porcine oocytes previously matured in vitro for 42-44 hours with conventional protocols (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27).
  • the oocytes were cocultured with the sperm trained in the different methods for 18 hours. After this time the alleged zygotes were fixed and stained to evaluate the fertilization results (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27).
  • PEN percentage of oocytes penetrated
  • MONO percentage of monospermia
  • SPZ / OO average number of sperm per penetrated oocyte
  • SPZ / ZP average number of sperm attached to the zona pellucida
  • REN yield, percentage of viable zygotes over the total of the oocytes. Data are expressed as mean ⁇ SEM. Different letters indicate significant differences with P ⁇ 0.05.
  • N is the number of oocytes inseminated c- Obtaining embryos by IVF in biofluid supplemented media.
  • IVF is performed in a culture medium (TALP) with or without biofluids.
  • the oocytes mature under the usual protocols described above and are transferred to the fertilization medium.
  • the results of this invention have shown that when the oocytes are inseminated in a culture medium supplemented with FO, the penetration rates are increased while maintaining high levels of monospermia (Table 3). This makes the yield (REN) of the IVF method with biofluids significantly greater, obtaining a greater number of possible embryos.
  • N is the number of oocytes inseminated d.- Embryonic culture with biofluids and assessment of the quality of the embryos obtained.
  • the zygotes were transferred to culture medium (NCSU-23) supplemented or not with early luteal phase FO for 48 hours where they were grown to 2-4 cell stage. After this time the embryos were transferred to NCSU-23 medium supplemented or not with early luteal phase FU where they were cultured to the blastocyst stage.
  • NCSU-23 medium supplemented or not with early luteal phase FU where they were cultured to the blastocyst stage.
  • the parameters of division, number of blastocysts in each of the stages of development from early blastocyst to hatched blastocyst
  • average number of cells per blastocyst and their functionality were assessed. , evaluated as their ability to hatch (contract and expand rhythmically until they get out of the zona pellucida).
  • N is the number of zygotes used
  • Control 903 31.7 ⁇ 6.1 to 28.3 ⁇ 5.9 40.0 ⁇ 6.4 0a 0a
  • N is the number of zygotes used

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Abstract

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo (biofluidos) para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero que comprende las siguientes etapas: a) fraccionamiento y procesado de los biofluidos mediante un tratamiento de selección, purificación, liofilización y su posterior almacenamiento; b) método de capacitación espermática en un medio de cultivo suplementado con biofluidos;c) fecundación in vitro en un medio enriquecido con biofluidos y d) posterior cultivo embrionario con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preimplantacional en medios suplementados con biofluidos.

Description

PROCESADO Y USO DE FLUIDOS DEL TRACTO REPRODUCTIVO PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES DE MAMÍFERO
DESCRIPCIÓN
Objeto de la invención
La presente invención contempla un método para aumentar la calidad embrionaria mediante el uso de técnicas de fecundación in vitro (FIV), opcionalmente con preincubación de los ovocitos en fluidos biológicos naturales de fases específicas del ciclo reproductivo, combinado con un método de separación espermática en medio de cultivo suplementado con dichos fluidos y la posterior fecundación y cultivo embrionario (CE) en medios suplementados con fluidos.
Sector de la técnica
Esta invención pertenece de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Capacitación espermática, Fecundación in vitro y Cultivo embrionario.
Antecedentes de la invención y estado de la técnica
El procedimiento actualmente conocido para la obtención in vitro de un embrión supone la realización de distintas técnicas de reproducción asistida (ARTs) que difieren entre laboratorios y especies, y comprende los siguientes pasos: 1) la obtención y maduración in vitro (MIV) de los gametos femeninos (ovocitos); 2) la preparación y capacitación de los gametos masculinos (espermatozoides); 3) el proceso de fecundación in vitro en sí mismo ya sea mediante el cocultivo de los gametos o la microinyección asistida de un espermatozoide en el interior del ovocito, y 4) el CE para que los cigotos alcancen el estadio de desarrollo deseado, generalmente el de blastocisto.
Una estrategia para incrementar la eficiencia de estas ARTs ha sido imitar en el laboratorio las condiciones que los gametos-cigotos-embriones encuentran in vivo donde, tras la ovulación, el ovocito maduro es captado por el oviducto (trompas de Falopio) contactando con su medio natural, el fluido oviductal (FO). Por su parte los espermatozoides "nadan" desde la vagina o el cérvix (según la especie) hasta el lugar de la fecundación (oviducto) contactando durante su paso por el útero con el fluido uterino (FU) y luego, cuando se encuentran ya en las proximidades del ovocito, con el FO. Una vez ambos gametos están en el oviducto se produce la fecundación y el desarrollo embrionario temprano siendo el FO el medio natural en el que ocurren estos eventos reproductivos. Posteriormente el embrión pasa al útero, siendo el FU el medio fisiológico donde se desarrollará hasta que ocurre la implantación y placentación. Por ello, con el objetivo de formular y/o adaptar nuevos medios de cultivo empleados in vitro y mejorar los resultados de fecundación y desarrollo embrionario, numerosos trabajos han estudiado la composición de estos fluidos naturales (Iritani et al. 1974, J Anim Sci 39: 582-588; Léese et al. 2008, Reprod Fértil Dev 20: 1-8). Sin embargo, no se han realizado investigaciones dirigidas a reproducir de una forma combinada y completa el ambiente fisiológico diseñando sistemas de cultivo integrales (desde la FIV hasta el CE) con medios más próximos a la composición de los fluidos biológicos naturales (FO y FU). Incluso a pesar de que, como se ha comprobado en la especie humana, la adición al medio de cultivo de una "simple" proteína oviductal incrementa en más de un 8% los nacimientos (Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789).
Sin duda, las secreciones oviductales y uterinas proporcionan mejores condiciones para la fecundación y el desarrollo embrionario que los sistemas in vitro convencionales ya que la composición de estos medios naturales varía a lo largo de las diferentes fases del ciclo reproductivo de la hembra proporcionando al ovocito, cigoto y/o embrión las condiciones idóneas para su desarrollo en cada momento (Killian et al. 1989, J Reprod Fértil 86: 419-426; Léese et al. 2008, Reprod Fértil Dev 20: 1-8). De forma genérica los biofluidos contienen sales, electrolitos, aminoácidos, componentes energéticos y proteínas. Entre las más de 150 proteínas oviductales que se han conseguido identificar (Avilés et al. 2010, Mol Human Reprod. 16: 896-
906), algunas ya se encuentran disponibles comercialmente y se utilizan como suplemento a los medios de cultivo in vitro (Hao et al. 2006, Biol Reprod 75: 726-733; Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789). Sin embargo, se desconoce la composición completa y la concentración exacta de todos los componentes de los biofluidos por lo que la adición directa de los mismos a los medios de cultivo artificiales supone la estrategia más económica, rápida y fiable de suplementarios con todo aquello que los gametos, cigotos y/o embriones precisan en cada una de las etapas.
En mamíferos, incluida la especie humana, los FO y/o FU se obtienen mediante distintas técnicas y generalmente se procesan con una única centrifugación y posterior congelación de la fracción líquida (Carrasco et al. 2008a, Reprod Fértil Dev 20: 808-817; Carrasco et al. 2008b, Reproduction 136: 833-842; Faulkner et al. 2012, Proteomics 12: 2014-223; Lippes y Wagh 1993, Fértil Steril 59: 157-162; Velazquez et al. 2010, Theriogenology 73: 758-767). Estos biofluidos mejoran las tasas de fecundación y aumentan la calidad embrionaria (Aitken 1977, J Embryol Exp Morphol 41: 295-300;Cebrian-Serrano et al. 2013, ReprodDomestAnim 48: 331-338; Coy et al. 2008a, PNAS 105: 15809-15814; Lloyd et al. 2009, Reproduction 137: 679-687). A pesar de estos resultados alentadores, hasta la fecha no se han empleado los biofluidos como aditivos en las ARTs humanas lo que abre un campo nuevo de investigación, especialmente si consideramos que, en la mayoría de ocasiones, el efecto beneficioso sobre gametos y embriones es interespecífico, es decir, que los biofluidos de una especie de mamífero pueden utilizarse para las ARTs de otra especie diferente (Mondéjar et al. 2013, HumReprod 28: 718-728; Rondeau et al.
1996, Can J Vet Res 60:14-20). Hasta ahora el procesado de los biofluidos, el almacenamiento y el transporte de las muestras requieren una temperatura controlada para mantener la cadena de frío, condicionando la implementación y extensión de su uso en el campo de la biología reproductiva.
Se ha descrito el efecto beneficioso del contacto de los gametos con los componentes del FO antes de la FIV (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27; Coy et al. 2010, Theriogenology 74: 632-642) y se ha comprobado que los espermatozoides recogidos mediante Swim-up muestran una mayor integridad del ADN y un menor porcentaje de morfoanomalías que los obtenidos con centrifugaciones tipo Percoll
(Menkveld et al. 1990, Andrologia 22: 152-158; Zini et al. 2000, Urology 56: 1081- 1084). Aunque el proceso de capacitación espermática pueda parecer un mero trámite en las ARTs (dura apenas 45-60 minutos), el estrés que sufren los espermatozoides se transmite a la descendencia con alteraciones metabólicas y de comportamiento (Gapp et al. 2014, Nat Neurosci 17: 667-669).
Se han encontrado 5 documentos relacionados con el uso de sustancias específicas en los protocolos de FIV y/o CE pero ninguna describe el uso combinado de FO y FU de fases específicas del ciclo en la generación de embriones. Tampoco se describe en estas patentes ningún método de purificación o fraccionamiento de biofluidos ni su uso en métodos de capacitación espermática.
Patente- 1 (ES 2 323 993 A1 , Pilar Coy Fuster y Manuel Avilés Sánchez), donde se describe un Método para aumentar la monospermia en la FIV.
Patente-2 (ES 2 439424 A1 , Ignacio Santiago Álvarez Miguel y Mario Javier Perianes Carrasco) donde se describe un Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por FIV.
Patente-3 (WO2006/012177, Randall Prather) "Method to decrease the rate of polyspermy in IVF".
Patente-4 (US 2013/0344595 A1 , David K. Gardner, Mark G. Larman y Donald Linck) "Culture media for developmental cells containing elevated concentrations of lipoic acid".
Patente-5 (CN 103333855 (A), ZouXiangang y Zhao Yalin) "Sheep embryonic cell culture fluid".
Descripción detallada de la invención
La presente invención contempla un método para aumentar la calidad de los embriones mamíferos obtenidos in vitro mediante un sistema que incluye la adición de fluidos biológicos naturales (FO y/o FU) de fases específicas del ciclo reproductivo en las fases de capacitación espermática, FIV y CE.
Los autores de la presente invención han desarrollado por un lado, un sistema de capacitación espermática que no requiere centrifugaciones, empleando como aditivo proteico los FO y/o FU, que supone grandes ventajas a la hora de reducir el estrés al que se ven sometidos los gametos masculinos durante el procedimiento de separación del plasma seminal, y que ayuda así a seleccionar aquellos espermatozoides con mejor calidad e integridad de ADN. Se ha conseguido aunar ambas estrategias formulando un nuevo medio de cultivo para seleccionar espermatozoides mediante la técnica de Swim-up que ofrece mejores resultados que los medios convencionales. Por otro lado, se ha llevado a cabo un nuevo proceso que permite obtener muestras purificadas y liofilizadas (deshidratadas) de ambos biofluidos sin que pierdan su actividad biológica beneficiosa, pudiendo ser almacenadas muestras en seco y transportadas a temperatura ambiente, lo que supone una ventaja al método convencional utilizado hasta ahora (muestras líquidas).
Todo ello aumenta las posibilidades de que el uso de este sistema integrado de obtención de embriones in vitro pueda ser implementado y desarrollado en laboratorios de todo el mundo.
En la actualidad, tanto el número como la calidad de los embriones mamíferos obtenidos mediante técnicas in vitro son menores al obtenido in vivo. En el procedimiento in vivo los gametos entran en contacto con los biofluidos de manera aislada antes de producirse la fecundación y el desarrollo embrionario, por lo que un protocolo integral de obtención de embriones de alta calidad debería incluir este contacto de los gametos, de manera individual, con los biofluidos, sustituyendo los sistemas de selección espermática tipo Percoll (que implican centrifugaciones) por modelos tipo Swim-up donde los espermatozoides nadan libremente.
El uso de los propios fluidos naturales con los que los gametos y embriones van encontrándose específicamente en el tracto reproductivo a lo largo de su desarrollo puede incrementar la calidad de los embriones obtenidos in vitro. Así pues, esta invención propone la introducción de estos fluidos naturales del tracto reproductivo, como son el FO y el FU, en las ARTs para mejorar la calidad de los embriones obtenidos in vitro.
La invención describe un método de obtención de embriones in vitro mediante la adición de biofluidos a los medios de cultivo en cada una de las fases del proceso. Los biofluidos son obtenidos de aparatos genitales de hembras de mamífero en fases concretas del ciclo reproductivo y son sometidos previamente a un proceso de purificación y tratamiento para su conservación y transporte. La invención comprende las siguientes etapas: a) un método de clasificación de los FO y FU en función del etapa del ciclo reproductivo en la que se obtienen, seguido de su fraccionamiento mediante doble centrifugación y posterior procesado mediante liofilización y pasteurización.
b) un método de capacitación espermática sin centrifugaciones en un medio de cultivo específico suplementado con FO y/o FU.
c) FIV en un medio enriquecido con FO y/o FU.
d) cultivo con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo en medios suplementados con FO y/o FU.
Para la realización del método de fraccionamiento mediante doble centrifugación y posterior procesado de los biofluidos mediante liofilización, obtenemos los FO y FU de animales sacrificados en matadero (especies porcina, bovina, ovina, caprina, cunícula y equina). Los tractos reproductivos se clasifican en las distintas fases del ciclo estral: folicular temprana (F1), folicular tardía (F2), luteal temprana (L1) y luteal tardía (L2) atendiendo al aspecto y la morfología ovárica (Carrasco et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). En la especie humana se pueden obtener de pacientes sometidas a ligadura de trompas, salpingectomías o histerectomías por razones de salud, o bien de donantes.
El FO se obtiene por aspiración introduciendo por la ampolla oviductal la punta de una pipeta automática y ejerciendo una presión manual aspirando así todo el contenido oviductal. Para su fraccionamiento, dicho contenido se centrifuga (entre 4000-1 OOOOg durante 1-10 minutos a 4 °C) y se descarta el pellet celular y la fase mucosa. El sobrenadante de FO se recentrifuga en las mismas condiciones quedando en la parte superior la fase acuosa y en la inferior la fase mucosa (fondo del tubo). Se aspira únicamente la fase acuosa del FO. Por su parte, el FU se obtiene por aspiración introduciendo en el cuerno uterino la punta de una pipeta automática, ejerciendo una presión manual ascendente. Dicho contenido se fracciona mediante una doble centrifugación en las mismas condiciones que el FO.
Una vez fraccionados, los biofluidos se liofilizan entre -50°C y -60°C, durante 20-24h con una presión de 0.040-0.010 milibares. Una vez finalizado el proceso se conservan refrigerados hasta su uso. Los biofluidos obtenidos de las distintas especies y fases del ciclo se almacenan en un biobanco y pueden utilizarse tanto de forma ínter o intraespecífica así como de manera autóloga o heterologa. Antes de usarlos como aditivos en un medio de cultivo, los biofluidos se redisuelven con agua purificada hasta su volumen original. Una de las ventajas que presenta este nuevo método de fraccionamiento es que los biofluidos se pueden transportar a temperatura ambiente, mantienen sus propiedades biológicas al rehidratarse y pueden pasteurizarse a 72-80°C durante 10-20 segundos antes de su uso, lo que resulta necesario para las garantías sanitarias del producto. Las pruebas de actividad del producto se han realizado evaluando la capacidad de los biofluidos para endurecer la zona pelúcida (ZP) del ovocito (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Para ello ovocitos maduros denudados se sometieron a una digestión con proteasa. Los resultados demuestran que los biofluidos sometidos al proceso de fraccionamiento y conservación descrito en esta patente mantienen su actividad biológica una vez son resuspendidos y pasteurizados.
Para el desarrollo del método de capacitación espermática sin centrifugaciones y en medios suplementados con biofluidos la presente invención incluye la formulación de un nuevo medio de cultivo para la selección espermática que denominamos Swim- up-biofluidos. Para ello nos basamos en los medios descritos en la literatura (Alvarez et al. 1993, Hum Reprod 8: 1087-1092; García-López et al. 1996, J Chromatogr B Biomed Appl 680: 137-143) pero realizando los siguientes cambios sobre la composición: - Ajuste de la concentración de sales: dentro de este grupo podemos englobar
NaHCOs, NaCI, KCI, MgS04, K2HP0 , y CaCI2. Son los responsables de mantener la osmolaridad y pH del medio por lo que su concentración se ajustó a niveles similares a los descritos en el FO. La osmolaridad final del medio se mantuvo en el rango fisiológico de 280-320mOsm. La concentración de sales inorgánicas estuvo comprendida entre 90 y 130 mM.
- Ajuste de pH: se ajustó en torno a 7.2-7.8 utilizando HEPES como agente tamponador para evitar las oscilaciones de pH en el medio durante el tiempo que los espermatozoides están en contacto con él.
- Ajuste de la concentración de sustratos energéticos: dentro de este grupo se encuentran glucosa, piruvato sódico, lactato sódico y sacarosa. Se ajustaron las concentraciones para conseguir una densidad y viscosidad óptimas que permitieran la movilidad de los espermatozoides a través del medio. La concentración de sustratos energéticos estuvo comprendida entre 120 y 160 mM.
- Proteínas: en el nuevo medio que diseñamos, Swim-up-biofluidos, la fuente de proteínas consistió en la adición de 0.1-5% de FO preferentemente de fase F2 fraccionado y tratado como se ha descrito en la etapa a). Este tratamiento se comparó con BSA, fuente proteica habitualmente empleada en los medios de capacitación.
El método de capacitación Swim-up-biofluidos se realizó mezclando 0.5-1.5ml de semen con 0.5-1.5ml de medio Swim-up-biofluidos y permitiendo a los espermatozoides nadar hacia la parte superior del tubo durante un tiempo de 10-50 min a una temperatura de 37-38°C. Pasado este tiempo se recogieron 0.5-1 mi del medio de la parte superior conteniendo los espermatozoides que se utilizaron para
FIV. El nuevo método de capacitación espermática se comparó con el método de centrifugaciones tradicional (Percoll; Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141). Gracias a su trabajo de experimentación, los autores de la invención han demostrado que cuando los espermatozoides son capacitados en el sistema Swim-up-biofluidos con un medio suplementado con FO se mejora significativamente la monospermia y por tanto el número de cigotos capaces de desarrollarse hasta embrión.
En la realización del método FIV que incluye la adición de biofluidos al medio de fecundación, los ovocitos porcinos se maduran in vitro durante 42-44h según los protocolos descritos (Coyetal. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Pasado este tiempo se decumulan mecánicamente y se transfieren 50-55 ovocitos por cada pocilio de fecundación conteniendo sólo 500 ul de medio TALP (grupo control) (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141) o TALP suplementado con 0.1 al 5 % de FO, preferentemente de fase F2 ó L1 , fraccionado y tratado como se describe en la etapa a) (grupo biofluidos). Los espermatozoides utilizados para la FIV se obtuvieron y procesaron mediante el sistema Swim-up-biofluidos descrito en la etapa b). Opcionalmente, antes de ser inseminados los ovocitos decumulados pueden incubarse 30-60 minutos con FO preferentemente de fase F2 ó L1. Los gametos se cocultivaron durante 18 horas pasadas las cuales los presuntos cigotos se fijaron y tiñeron para evaluar los resultados de fecundación. Con este método se mejoran las tasas de monospermia tras la fecundación.
En el desarrollo del CE en medios suplementados con biofluidos, los ovocitos se maduraron según los protocolos descritos (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-
27). Se compararon dos métodos de CE, el método control y el método biofluidos con líquidos fraccionados y tratados como se describe en la etapa a). Para el grupo biofluidos los espermatozoides empleados para la FIV se capacitaron mediante el método Swim-up-biofluidos descrito en la etapa b) y los ovocitos se fecundaron en medio suplementado con 0.1-5 % de FO, como se describe en la etapa c). Una vez obtenidos los cigotos éstos se transfirieron a medio de cultivo embrionario NCSU-23 (Petters y Wells 1993, J Reprod Fertility Suppl 48: 61-73) suplementado los dos-tres primeros días con 0.1-5 % de FO, preferentemente de fase L1 ó L2. Tras las primeras 48 horas de cultivo se evaluó la división embrionaria y posteriormente los embriones se transfirieron a medio NCSU-23 suplementado con 0.1-5% de FU preferentemente de fase L1 ó L2 hasta el estadio de blastocisto. En el grupo control no se emplearon los biofluidos en ninguna de las fases del método, los espermatozoides se capacitaron con el método Swim-up-BSA, los ovocitos se fecundaron en medio TALP y los cigotos se transfirieron a medio NCSU-23 para su cultivo embrionario. Una vez terminado el cultivo se evaluó la calidad de los embriones obtenidos en ambos grupos atendiendo a la morfología (Bó y Mapletoft 2013, Anim Reprod 10: 344-348) y número de células por blastocisto. Con el trabajo de experimentación se ha demostrado que los embriones producidos in vitro con el método biofluidos se dividen más rápidamente que el control y son de mejor calidad (evaluada como número de células por blastocisto y capacidad para eclosionar).
Ejemplo de realización de la invención Método utilizado para obtener embriones por fecundación y cultivo in vitro utilizando biofluidos de distintas etapas del ciclo comprobando la mejora en la calidad embrionaria a.- Obtención, fraccionamiento y control de actividad de los biofluidos
En animales de abasto los FO y FU se obtienen de genitales procedentes de animales sacrificados en matadero para consumo cárnico. En la especie humana se pueden obtener de donantes, de pacientes sometidas a ligadura de trompas o de mujeres sometidas a salpingectomías o histerectomías por razones de salud. Los biofluidos se centrifugan (4000-1 OOOOg durante 1-10 minutos a 4°C) y la fase acuosa se recentrifuga con las mismas condiciones. Este líquido se liofiliza y pasteuriza quedando listo para su uso como aditivo de medios de cultivo previa resuspensión con agua purificada. La eficacia del tratamiento se estimó por la capacidad del FO para provocar el endurecimiento de la zona pelúcida. Para ello los ovocitos madurados in vitro se denudan mecánicamente y se incuban en FO durante 30-60 minutos a 38.5°C. Pasado este tiempo los ovocitos se incuban con una solución de proteasa al 0.5% y se contabiliza el tiempo que tarda en digerirse la ZP. Como muestra la tabla 1 los biofluidos tratados mantuvieron su actividad biológica con respecto a biofluidos no tratados (control):
Tabla 1. Tiempo de digestión de la zona pelúcida (tdZP) de ovocitos madurados in vitro tras ser incubados 30-60 minutos en FO de fase F2 fraccionado, liofilizado y pasteurizado. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.001.
Figure imgf000011_0001
N es el número de ovocitos empleado b.- Capacitación espermática sin centrifugaciones en un nuevo medio enriquecido con biofluidos.
El nuevo medio de cultivo se formuló ajusfando la osmolaridad, pH y sustratos energéticos y sustituyendo la albúmina sérica bovina (BSA) por biofluidos. La capacitación se realizó con espermatozoides eyaculados procedentes de machos de fertilizad probada (12-24 meses de edad). Para el método de capacitación Swim-up- biofluidos se depositó el semen sobre el medio Swim-up-biofluidos durante 15-30 minutos a 37-38°C. Pasado este tiempo se recogieron las células de la parte superior y se ajustó la concentración espermática a 25.000 espermatozoides/ml utilizando para ello medio de cultivo TALP (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133-1141). Este nuevo método de capacitación espermática se comparó con el método de centrifugaciones tradicional (Percoll) (Matas et al. 2003, Reproduction 125: 133- 1141). La calidad de los espermatozoides obtenidos se valoró por su capacidad para fecundar ovocitos porcinos previamente madurados in vitro durante 42-44 horas con los protocolos convencionales (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Los ovocitos se cocultivaron con los espermatozoides capacitados en los distintos métodos durante 18 horas. Pasado este tiempo los presuntos cigotos se fijaron y tiñeron para evaluar los resultados de fecundación (Coy et al. 2008b, Reproduction 135: 19-27). Los resultados mostraron que los espermatozoides capacitados en el sistema Swim-up-biofluidos con un medio suplementado con FO mejoran significativamente la monospermia, gracias a la reducción del número de espermatozoides que se unen a la zona pelúcida del ovocito (SPZ/ZP) y del número de espermatozoides que penetra al interior del ovocito (SPZ/OO), obteniéndose así un mayor rendimiento de la técnica (REN) que con el sistema convencional de centrifugaciones tal y como se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Resultados de la FIV tras capacitar los espermatozoides en un método tradicional con centrifugaciones (Percoll) o un método sin centrifugaciones con un nuevo medio de cultivo en el que se ha empleado como fuente proteica la albúmina
(Swim-up-BSA) o los biofluidos (Swim-up-biofluidos). PEN (porcentaje de ovocitos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZ/OO (número medio de espermatozoides por ovocito penetrado), SPZ/ZP (número medio de espermatozoides unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de cigotos viables sobre el total de los ovocitos). Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05.
Figure imgf000013_0001
N es el número de ovocitos inseminados c- Obtención de embriones por FIV en medios suplementados con biofluidos.
Una vez capacitados los espermatozoides en el sistema Swim-up-biofluidos la FIV se realiza en un medio de cultivo (TALP) con o sin biofluidos. Los ovocitos se maduran bajo los protocolos habituales descritos con anterioridad y se transfieren al medio de fecundación. Los resultados de esta invención han demostrado que cuando los ovocitos se inseminan en un medio de cultivo suplementado con FO se aumentan los porcentajes de penetración manteniéndose niveles elevados de monospermia (Tabla 3). Esto hace que el rendimiento (REN) del método de FIV con biofluidos sea significativamente mayor obteniéndose un mayor número de posibles embriones.
Tabla 3. Resultados de FIV suplementando el medio de FIV con biofluidos. PEN (porcentaje de ovocitos penetrados), MONO (porcentaje de monospermia), SPZ/OO (número medio de espermatozoides por ovocito penetrado), SPZ/ZP (número medio de espermatozoides unidos a la zona pelúcida) y REN (rendimiento, porcentaje de cigotos viables sobre el total de los penetrados). Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05. Método N PEN (%) 10N< SPZ/OO SPZ/ZP REN (%) capacitación (%)
Control 32 43.7±0.1 a 78.6±0.1 1.2±0.1 13.4±2.1 34.4±0.1 a
Biofluidos 33 66.6±0.1 b 72.7±0.1 1.3±0.1 19.3±3.2 48.5±0.1 b
N es el número de ovocitos inseminados d.- Cultivo embrionario con biofluidos y valoración de la calidad de los embriones obtenidos.
Tras el periodo de fecundación, los cigotos fueron trasladados a medio de cultivo (NCSU-23) suplementado o no con FO de fase luteal temprana durante 48 horas donde fueron cultivados hasta estadio de 2-4 células. Pasado este tiempo los embriones se transfirieron a medio NCSU-23 suplementado o no con FU de fase luteal temprana donde fueron cultivados hasta el estadio de blastocisto. Para comprobar los efectos del sistema con biofluidos sobre la calidad embrionaria se valoraron los parámetros de división, número de blastocistos en cada una de las etapas de desarrollo (desde blastocisto temprano a blastocisto eclosionado), número medio de células por blastocisto y funcionalidad de los mismos, evaluada como su capacidad para eclosionar (contraerse y expandirse rítmicamente hasta conseguir salir de la zona pelúcida). Se comprobó que los embriones obtenidos mediante el sistema biofluidos eran significativamente de mejor calidad que los embriones que no habían estado en contacto con estos fluidos naturales, como lo demuestra el mayor número de células por blastocisto (Tabla 4) y el mayor porcentaje de blastocistos que comienzan y completan el proceso de eclosión(Tabla 5).
Tabla 4. Resultados del cultivo embrionario con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05. REN (rendimiento del método; porcentaje de blastocistos con respecto a los embriones divididos).
Figure imgf000015_0001
*Con respecto a los embriones divididos. N es el número de cigotos empleados
Tabla 5. Estadio de desarrollo de los blastocistos (Blasto) obtenidos in vitro con el método biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.05.
Grupo Blasto Blasto Blasto Blasto Blasto temprano Expan eclosio eclosio dido nando -nado
Control 903 31.7±6.1 a 28.3±5.9 40.0±6.4 0a 0a
Biofluidos 961 12.8±5.4b 30.8±7.5 35.9±7.8 15.4±5.9b 5.1 ±3.6b
N es el número de cigotos empleados
Cuando se compara el número medio de células de los blastocistos obtenidos in vitro con blastocistos obtenidos in vivo, se observa que el número de células de los embriones obtenidos con el método biofluidos es similar a los embriones in vivo, mientras que los del método control tienen aproximadamente la mitad de células (Tabla 6). Este resultado refleja que la calidad embrionaria que se obtiene con el método biofluidos es similar a la obtenida de forma natural, al menos en lo referente a este parámetro de calidad.
Tabla 6. Número medio de células por blastocisto obtenidos in vivo o in vitro mediante el método control y el biofluidos. Los datos se expresan como media ± SEM. Distintas letras indican diferencias significativas con P<0.001
Método Células/blastocisto
Control 49.9±3.6a
Biofluidos 81.8±7.2b
In vivo 87.0±7.2b

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Método para aumentar la calidad biológica y la supervivencia de los embriones de mamífero producidos in vitro mediante la incorporación de biofluidos de fases específicas del ciclo a los medios de cultivo caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) Fraccionamiento y procesado de los fluidos oviductal y uterino de cada una de las fases del ciclo mediante un proceso de selección, doble centrifugación con posterior liofilización, opcionalmente pasteurización y refrigeración para su uso en técnicas de reproducción asistida o para biotecnología en general.
ii) Procesado de los espermatozoides en un medio de cultivo suplementado con los biofluidos obtenidos en i) caracterizado porque la selección de los espermatozoides para fecundación in vitro se basa en su capacidad fisiológica de nadar libremente atravesando dicho medio de cultivo que contiene agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, antibióticos y fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido durante la fase folicular tardía del ciclo.
iii) Fecundación in vitro utilizando los espermatozoides obtenidos en ii) en un medio enriquecido con fluido oviductal.
iv) Cultivo de los embriones obtenidos en iii) hasta cualquier fase del desarrollo preimplantacional en medios suplementados con fluido oviductal en una primera fase (variable desde 24 hasta 72 horas) y con fluido uterino en una segunda fase (variable desde 48 hasta el estadio de mórula o blastocito).
2. - Método según la reivindicación 1 ii), caracterizado porque en el medio de cultivo la concentración de sales inorgánicas está comprendida entre 90 y 130 mM, la concentración de sustratos energéticos está comprendida entre 120 y 160 mM y la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado está comprendida entre 0.1 y 5%.
3. - Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado de fase folicular tardía o luteal temprana del ciclo reproductor en el medio de fecundación in vitro está comprendida entre 0.1 y 5%.
4. - Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones durante las primeras 24-72 horas desde la fecundación en medio de cultivo suplementado con fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal temprana del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.
5. - Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones hasta estadio de mórula o blastocisto en medio de cultivo suplementado con fluido uterino fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.
6. - Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los biofluidos se obtienen de mamíferos.
7. - Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los gametos, cigotos o embriones se obtienen de mamíferos.
8. - Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los biofluidos utilizados son de la misma o de distintas especies.
9. - Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los biofluidos utilizados pueden ser de un mismo sujeto o de un sujeto diferente (donante).
10. - El uso de biofluidos fraccionados y tratados en la elaboración de medios de cultivo, suplementos o medicamentos para mejorar la funcionalidad espermática, la fecundación in vitro, el cultivo embrionario, la criopreservación de gametos o embriones o la transferencia embrionaria a una hembra receptora según las reivindicaciones anteriores.
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