JP2021192625A - 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 - Google Patents
凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021192625A JP2021192625A JP2021143853A JP2021143853A JP2021192625A JP 2021192625 A JP2021192625 A JP 2021192625A JP 2021143853 A JP2021143853 A JP 2021143853A JP 2021143853 A JP2021143853 A JP 2021143853A JP 2021192625 A JP2021192625 A JP 2021192625A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antifreeze
- isomaltooligosaccharide
- dextran
- molecular weight
- derivatives
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 91
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims description 133
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 title claims description 89
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 73
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 183
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims abstract description 87
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims abstract description 87
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims abstract description 84
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 35
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 230
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 claims description 205
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 claims description 201
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 145
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 79
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- -1 dextran ester Chemical class 0.000 claims description 28
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 18
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 16
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 abstract description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 173
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 100
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 80
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 42
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 38
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 32
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 30
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 30
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 23
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 16
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 11
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 10
- 229940041984 dextran 1 Drugs 0.000 description 10
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 10
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 10
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 7
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 7
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 7
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 102100029647 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Human genes 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 5
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 5
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl acetate Chemical compound CC(=O)OCC(O)CO KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 4
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 4
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical group CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical group OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 4
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical compound CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- RAGSWDIQBBZLLL-UHFFFAOYSA-N 2-chloroethyl(diethyl)azanium;chloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCCl RAGSWDIQBBZLLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 3
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 3
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 2
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 2
- 102100027670 Islet amyloid polypeptide Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N N-methylacetamide Chemical compound CNC(C)=O OHLUUHNLEMFGTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N N-methylthiourea Natural products CNC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol Chemical compound CCCC(O)O CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 2
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 2
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N methylurea Chemical compound [14CH3]NC(N)=O XGEGHDBEHXKFPX-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- ILVXOBCQQYKLDS-UHFFFAOYSA-N pyridine N-oxide Chemical compound [O-][N+]1=CC=CC=C1 ILVXOBCQQYKLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYWVDGFGRYJLPE-UHFFFAOYSA-N trimethylazanium;acetate Chemical compound CN(C)C.CC(O)=O KYWVDGFGRYJLPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000004398 2-methyl-2-butyl group Chemical group CC(C)(CC)* 0.000 description 1
- 125000004917 3-methyl-2-butyl group Chemical group CC(C(C)*)C 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N Carbon-12 Chemical compound [12C] OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical class OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000956293 Fulda Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241000713321 Intracisternal A-particles Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 206010038669 Respiratory arrest Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N alpha-D-Glcp-(1->4)-alpha-D-Glcp-(1->4)-D-Glcp Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-DZOUCCHMSA-N 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 239000006619 dextran medium Substances 0.000 description 1
- 125000001664 diethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-O diethylammonium Chemical compound CC[NH2+]CC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021255 galacto-oligosaccharides Nutrition 0.000 description 1
- 150000003271 galactooligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000012067 mathematical method Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000003538 pentan-3-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Natural products CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】凍結保存されたサンプルの機能性を保護する効果を有する凍結防止剤の使用、凍結防止剤、および臓器等のサンプルを凍結保存する方法を提供する。【解決手段】ａ）凍結防止剤が、凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖及びその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも１％ｗ／ｗの１種以上の、３００〜１，６５０Ｄａの重量平均分子量を有するイソマルトオリゴ糖及びその誘導体を含む；又はｂ）抗凍結剤が、３００〜９，５００Ｄａの重量平均分子量を有する；又はｃ）凍結防止剤が、凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖及びその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも１％ｗ／ｗの１種以上の、３００〜１，６５０Ｄａの重量平均分子量を有するイソマルトオリゴ糖及びその誘導体を含み、抗凍結剤が、３００〜９，５００Ｄａの重量平均分子量を有する；凍結防止剤の使用である。【選択図】なし
Description
本発明は、抗凍結剤を含む凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法に関する。
ドナー源から採取された細胞、組織または臓器などの生存能力のある生体サンプルの凍結保存は、科学および医学界において大きな重要性および有用性がある。凍結保存は、一般に、たとえば、氷点下、典型的には77 K(= −196℃、液体窒素の沸点)に冷却することによって細胞および組織などのサンプルを保存する処理過程である。これらの低温では、細胞死を引き起こす生化学反応といったような生物活性は、効果的に停止される。凍結保存技術は、植物および動物の細胞および組織などの帯水または含水物質の長期保存に用いられる。これらの物質を凍結させると、氷結晶形態は、「凍結濃縮」と呼ばれる、水分子によって排除される溶質および汚染物質の濃度ムラをもたらすことが知られている。細胞または組織を保存するためには、典型的に、冷却または解凍処理中に凍結防止溶液を用いて損傷を防止する。凍結保存が有用であるために、保存されたサンプルは、その完全性と生存性を、採取の時点での妥当なレベルに保持すべきである。したがって、サンプルを保存する処理過程は、本質的に、たとえば、細胞または組織構造を、ひどくは損傷または破壊しないのが好ましくあるべきである。
従来の凍結保存技術では、サンプルを採取し、保存液に入れ、次いで、凍結させて保存する。サンプルが使用される場合、解凍され、たとえば、ヒトドナー源から採取された細胞は、正常なヒト体温(すなわち、約37℃)に戻され、次いで、細胞培養培地中に置く。凍結保存プロトコルは、細胞採取、凍結および解凍中に、細胞に多大なストレスおよび傷害を与える。これらのストレスおよび傷害は、不可逆的損傷を細胞にもたらしうる。
デキストランは、ヒト、動物および植物細胞用の凍結防止剤として用いられている(Odavic、R. ら、Experientia 36、1122(1980)、Ashwood-Smith、M.J. ら、Cryobiology 9、441(1972)およびEchlin、P. ら、J. Microsc.(Oxford)110、239(1977))。5% メチルスルホキシドと9% デキストラン70の混合物が、ヒト骨髄単分化能幹細胞の最適凍結防止を提供することが見い出された(Dextran、Handbook from Amersham BioSciences、18-1166-12、Edition AA、page 35)。デキストラン、グリセロールおよびジメチルスルホキシド(DMSO)は、単独または組合わせて、ヒト骨髄細胞の凍結防止について研究されている(Odavic、R. ら、Experientia 36、1122(1980))。凍結傷害に対する有意に良好な保護は、1% DMSOと5% グリセロールまたは9% デキストランよりも、3または5% DMSOと併用した9% デキストラン70、および5または10% DMSO単独によって得られた。デキストラン40は、5% (w/v)デキストラン40中の50% DMSOとの併用で、胎盤/臍帯血の凍結保存用であることが知られている(Proc. Nati. Acad. Sci. USA、Vol. 92、pp．10119-10122、October 1995、Medical Sciences)。
Shu Guoweiらは、Advanced Materials Research、Trans Tech Publications Ltd.、Vol. 328(2012)、pp 454-457に、凍結乾燥中のビフィズス菌の生存におけるフラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、イヌリンおよびキシロオリゴ糖の効果を記載している。Kwan Hwa Parkらは、Database CA、XP 002698458に、すり身のためのフラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖またはガラクトオリゴ糖を含む抗凍結剤を記載している。J. Korean Soc. Food Sci. Nutr.、Vol. 30(3)(2001)、pp 565-568には、牛肉タンパク質におけるフラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖の抗凍結剤の効果が記載されている。
従来の抗凍結剤は、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロールなどのグリコール(少なくとも2つのヒドロキシル基を含有するアルコール)である。エチレングリコールは、通例、自動車の凍結防止剤として用いられ、プロピレングリコールは、アイスクリームにおける氷の生成を減少させるために用いられている。ジメチルスルホキシド(DMSO)は、従来の抗凍結剤ともみなされる。グリセロールおよびDMSOは、液体窒素(-196℃)中で保存される精子および胚における氷形成を減少させるために低温生物学者によって数十年間用いられている。これらの既知の凍結防止剤のうち、DMSOは、最も効果的であるとみなされ、頻繁に採用されるが、生理的に毒性であり、予防措置が取られない限り、細胞とともにレシピエントに輸液されるか、または担当者の取扱いにより、高血圧、吐き気および嘔吐を引き起こすことが知られている。Coxら(Cell Tissue Bank (2012)13：203-215)は、発表された文献の遡及的検討によって、ジメチルスルホキシドとともに凍結保存された幹細胞の移植に伴う数百の副作用(たとえば、吐き気、悪寒、心不整脈、神経症状および呼吸停止)を同定した。さらに、DMSOの毒性は、融解された細胞が培養されるか、またはレシピエントの体内に輸液された後のゲノム変化といったような、細胞生存率および／または機能を低下させる傾向がある。したがって、DMSOの毒性は、どのくらいの時間、取扱い中に細胞がDMSOにさらされてもよいかということに影響を及ぼす。
したがって、DMSOなどの他の抗凍結剤の代替物としての、あるいは凍結中の生物サンプルなどのサンプルを保護するため、またはそれに必要な濃度を、好ましくは非毒性濃度へと低下させるための他の抗凍結剤へのサプリメントとしての、必要な保護効果と低毒性を同時に有する凍結防止剤に対する必要性が依然として存在する。
発明の目的
DMSOなどの他の抗凍結剤の代替物としての、あるいはそれに必要な濃度を、好ましくは非毒性濃度へと低下させるための他の抗凍結剤へのサプリメントとしての、凍結保存中に、凍結保存されたサンプルの等しい機能性を保護することに関して必要な保護効果を有する抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様の目的である。抗凍結剤を取り扱う担当者および生体サンプルにとっての低毒性を有し、そのことによってサンプルが損傷されることなく抗凍結剤に接触しうる時間が長くなる、抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的であり、サンプルの洗浄の必要性が低くなり、好ましくは、要すれば、サンプルを抗凍結剤から分離する必要なく、採取された場所あるいはレシピエントへサンプルを戻すことが可能になる。哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織などの臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルのための抗凍結剤として有効である抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。臓器、細胞または組織などの移植されるサンプルのための抗凍結剤として有効である抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。たとえば細胞の抗凍結剤として有効であり、該細胞の許容しうる生存能力をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。たとえば臓器の抗凍結剤として有効であり、該臓器の許容しうる物理的機能性をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。
たとえば組織の抗凍結剤として有効であり、該組織の許容しうる物理的機能性をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。
DMSOなどの他の抗凍結剤の代替物としての、あるいはそれに必要な濃度を、好ましくは非毒性濃度へと低下させるための他の抗凍結剤へのサプリメントとしての、凍結保存中に、凍結保存されたサンプルの等しい機能性を保護することに関して必要な保護効果を有する抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様の目的である。抗凍結剤を取り扱う担当者および生体サンプルにとっての低毒性を有し、そのことによってサンプルが損傷されることなく抗凍結剤に接触しうる時間が長くなる、抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的であり、サンプルの洗浄の必要性が低くなり、好ましくは、要すれば、サンプルを抗凍結剤から分離する必要なく、採取された場所あるいはレシピエントへサンプルを戻すことが可能になる。哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織などの臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルのための抗凍結剤として有効である抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。臓器、細胞または組織などの移植されるサンプルのための抗凍結剤として有効である抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。たとえば細胞の抗凍結剤として有効であり、該細胞の許容しうる生存能力をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。たとえば臓器の抗凍結剤として有効であり、該臓器の許容しうる物理的機能性をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。
たとえば組織の抗凍結剤として有効であり、該組織の許容しうる物理的機能性をもたらす抗凍結剤を提供することが、本発明の実施態様のさらなる目的である。
発明の概要
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；またはb)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；またはc)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤が、抗凍結剤として非常に有用であることが本発明によって見い出されいる。これまでに用いられたデキストラン40(40,000 Da)およびデキストラン70(70,000 Da)などの高分子量のデキストラン材料と比較して、上述の抗凍結剤を含む凍結防止剤は、分子量が低いために粘度がより小さく、したがって、溶液に予めサンプルを加えて、凍結保存に適した濃度で抗凍結剤とサンプルの両方を含む組成物を得ることを可能にする高濃度で、予め調製することができる。さらに、低分子量の分子は、一般に、高分子量の分子よりも免疫原性が低い。デキストラン1は、デキストランを投与する場合にアナフィラキシー反応のリスクを低下させ、したがって、デキストラン40(40,000 Da)およびデキストラン70(70,000 Da)などの高分子量のデキストランの注射前の予備注射として用いられるハプテンインヒビターとして知られている。デキストラン1は、また、ヒトにおいて非常に低い免疫学的ポテンシャルを有することが、Richterら(Int. Arch. Allergy 43：252-268(1972)およびInt. Arch. Allergy 41：826-844(1971))による研究でも実証されている。さらに、実施例には、本明細書に記載される抗凍結剤を用いる凍結保存が、より高分子量のデキストランを用いるよりも、試験細胞の生存能力として測定される凍結保存後の機能性のよりよい保護を提供することが明らかにされている。
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；またはb)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；またはc)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤が、抗凍結剤として非常に有用であることが本発明によって見い出されいる。これまでに用いられたデキストラン40(40,000 Da)およびデキストラン70(70,000 Da)などの高分子量のデキストラン材料と比較して、上述の抗凍結剤を含む凍結防止剤は、分子量が低いために粘度がより小さく、したがって、溶液に予めサンプルを加えて、凍結保存に適した濃度で抗凍結剤とサンプルの両方を含む組成物を得ることを可能にする高濃度で、予め調製することができる。さらに、低分子量の分子は、一般に、高分子量の分子よりも免疫原性が低い。デキストラン1は、デキストランを投与する場合にアナフィラキシー反応のリスクを低下させ、したがって、デキストラン40(40,000 Da)およびデキストラン70(70,000 Da)などの高分子量のデキストランの注射前の予備注射として用いられるハプテンインヒビターとして知られている。デキストラン1は、また、ヒトにおいて非常に低い免疫学的ポテンシャルを有することが、Richterら(Int. Arch. Allergy 43：252-268(1972)およびInt. Arch. Allergy 41：826-844(1971))による研究でも実証されている。さらに、実施例には、本明細書に記載される抗凍結剤を用いる凍結保存が、より高分子量のデキストランを用いるよりも、試験細胞の生存能力として測定される凍結保存後の機能性のよりよい保護を提供することが明らかにされている。
そこで、第一の態様において、本発明は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤に関する。
a)該凍結防止剤が、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤に関する。
さらなる態様において、本発明は、850〜1,650 Daなどの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤を含む凍結防止剤に関する。
さらなる態様において、本発明は、臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、本明細書に記載される抗凍結剤の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、臓器、細胞および組織から選ばれる凍結保存されるサンプルを含む、本明細書に記載される凍結防止剤を含む凍結保存組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、臓器、細胞および組織から選ばれる凍結保存されたサンプルをさらに含む、本明細書に記載される凍結防止剤を含む凍結保存された組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、臓器、細胞および組織から選ばれる凍結保存されるべきサンプルを、本明細書に記載される凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させるステップを含む、サンプルを凍結保存する方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される凍結保存組成物を凍結保存温度にすることによって、該凍結保存組成物を凍結保存する方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための本明細書に記載される凍結防止剤の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、移植用サンプルを凍結保存するための本明細書に記載される凍結防止剤の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される凍結保存組成物の温度を凍結保存温度に低下させることによって、臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための該凍結保存組成物の使用に関する。
発明の詳細な開示
定義
本明細書で用いる、凍結保存は、冷却速度が従来の凍結保存手順よりも速いガラス化技術などの、サンプルを氷点下の温度に冷却することによって保存する処理過程を意味する。このような低温では、たとえば、細胞死を引き起こす生化学反応といったような生物活性は低下され、たとえば、タンパク質/糖タンパク質またはリポタンパク質の化学構造/機能は保存される。もし抗凍結剤溶液を使用しないならば、保存されるサンプルは、冷却または融解処理過程中の凍結により損傷される可能性がある。
定義
本明細書で用いる、凍結保存は、冷却速度が従来の凍結保存手順よりも速いガラス化技術などの、サンプルを氷点下の温度に冷却することによって保存する処理過程を意味する。このような低温では、たとえば、細胞死を引き起こす生化学反応といったような生物活性は低下され、たとえば、タンパク質/糖タンパク質またはリポタンパク質の化学構造/機能は保存される。もし抗凍結剤溶液を使用しないならば、保存されるサンプルは、冷却または融解処理過程中の凍結により損傷される可能性がある。
１つの好ましい態様において、凍結保存は、一般に、たとえば、氷点下、典型的には77 K(= −196℃、液体窒素の沸点)に冷却することによって細胞および組織などのサンプルを保存する処理過程を意味する。これらの低温では、細胞死を引き起こす生化学反応といったような生物活性は、効果的に停止される。
本明細書で用いる用語「凍結保存温度」は、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃、-55℃未満、-60℃未満、-65℃未満、-70℃未満、-75℃未満、-80℃未満、-85℃未満、-90℃未満、-95℃未満、-100℃未満、-105℃未満、-110℃未満、-115℃未満、-120℃未満、-125℃未満、-130℃未満、-135℃未満、-140℃未満、-145℃未満、-150℃未満、-155℃未満、-160℃未満、-165℃未満、-170℃未満、-175℃未満、-180℃未満、-185℃未満、-190℃未満などの氷点下〜-196℃の温度を示す。
本明細書で用いる用語「サンプル」は、臓器、細胞または組織などの凍結保存される任意の種類の材料を意味する。１つの態様において、サンプルは、臓器、細胞、組織および血液から選ばれる。１つの態様において、サンプルは、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織などの臓器、細胞および組織から選ばれる。１つの態様において、用語「サンプル」は、その形成および発達の様々な段階におけるヒトの身体を含まない。さらなる態様において、本発明は、移植用サンプルを凍結保存するための本明細書に記載される凍結防止剤の使用に関する。１つの態様において、サンプルは、移植用の哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる。
本明細書で用いる用語「細胞」は、組織または臓器中のすべての種類の細胞などの体細胞；全能性幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞および前駆細胞などのすべての型の幹細胞；卵母細胞；精子；および生殖細胞などの任意の型の細胞を含む。細胞は、単離された形態または細胞含有体液、組織または臓器の形態などの単離されない形態であってもよい。
本明細書で用いる用語「細胞含有体液」は、たとえば、下記に定義する血液、羊水、精液、脳脊髄液、骨髄穿刺液および月経液などの任意の細胞含有体液を含む。
本明細書で用いる用語「血液」は、臍帯血、末梢血および運動性血(mobilized blood)などの液体を含有する血液を含む。
本明細書で用いる用語「組織」は、卵巣組織、精巣組織、臍帯組織、胎盤組織、結合組織、心臓組織、筋肉、軟骨および骨からの組織、内分泌組織および神経組織などの任意の種類の細胞型およびその組合せを含む任意の組織型を含む。
用語「組織」はまた、脂肪組織または歯髄組織を含む。
用語「組織」はまた、脂肪組織または歯髄組織を含む。
本明細書で用いる用語「臓器」は、たとえば、肺、肝臓、腎臓、心臓、卵巣および膵臓を含む。用語「臓器」はまた、臍帯を含む。
サンプルに関連して、本明細書で用いる用語「凍結保存後に機能的」は、凍結保存後の臓器、組織または細胞などのサンプルが、凍結保存後に、「許容しうる」および／または「望ましい」機能を保持することを意味する。１つの態様において、凍結保存後のサンプルは、その機能のすべてを保持する。もう１つの態様において、細胞などのサンプルは、所望の機能の少なくとも60%、所望の機能の少なくとも70%、所望の機能の少なくとも80%、所望の機能の少なくとも90%、所望の機能の少なくとも95%、所望の機能の100%などの所望の機能の少なくとも50%を保持する。細胞に関する例として、保存されるべき重要な機能は、細胞の生存能力である。臓器に関するもう１つの例として、保存されるべき重要な機能は、たとえば心臓ではポンプ機能といったような臓器の生理的機能である。組織に関するもう１つの例として、保存されるべき重要な機能は、移植の場合、周囲の組織(皮膚など)と一体化する能力である。
凍結保存後の細胞の生存能力は、実施例に示すように、死細胞からのみ検出可能な測定をもたらす、細胞サンプルをDNA結合色素であるヨウ化プロピジウムとともにインキュベートすることによって死細胞が測定されるヌクレオカウンターシステム(Nucleocounter system)を用いることによって測定されうる。生存能力は、分析される集団における生細胞のパーセンテージとして示される。凍結保存後の細胞サンプルの増殖率は、比色分析であるMTTを用いて分析されうる。
本明細書で用いる用語「バンキング」は、将来的使用のためのサンプルの任意の保管を意味する。
本明細書で用いる用語「臨床的バンキング法」は、ヒトなどの哺乳類の臨床処置に関連するサンプルの任意の保管を意味する。
本明細書で用いる用語「髄バンキング法」は、骨髄穿刺液および関連体液または髄から単離された細胞などの髄サンプルの保管を意味する。
本明細書で用いる用語「歯髄組織バンキング法」は、歯髄組織から単離された細胞などの歯髄組織サンプルの保管を意味する。
本明細書で用いる用語「脂肪組織バンキング法」は、脂肪組織から単離された細胞など脂肪組織サンプルの保管を意味する。本明細書において、用語お「臍帯バンキング法」は、臍帯血、臍帯に関連する組織、または臍帯血もしくは組織から単離された細胞の保管を意味する。
本明細書において、用語「運動性末梢血バンキング法」は、たとえば、血液幹細胞を血液循環内へ放出する作用剤で運動性にされた後の末梢血の保管を意味する。
本明細書で用いる用語「生殖バンキング法」は、精液、卵母細胞、精子、受精卵などの生殖に関連する任意のサンプルの保管を意味する。
原子量単位であるダルトン(記号：Da)は、原子または分子スケールでの質量(原子量)を示すために用いられる標準単位である。その核および電子的基底状態にある炭素12の非結合中性原子の質量の12分の1であると定義される。
本明細書で用いる用語「重量平均分子量」(Mw)は、以下の式：
[式中、giは、分子量Miを有する分子の分率である。Mの可能な値は、pを定義する、個別の値であるラベリングされたMiを有する一組の数を作成する。]
で定義される。
で定義される。
本明細書で用いる用語「数平均分子量」は、以下の式：
[式中、Niは、分子量Miを有する分子の分率であり、giは、分子量Miを有する分子の分率である。Mの可能な値は、pを定義する、個別の値であるラベリングされたMiを有する一組の数を作成する]
で定義される。
で定義される。
本明細書で用いる用語「多分散性(Pd)」は、Mw/Mn＝Pdによって計算される。
「デキストラン1」、「デキストラン40」および「デキストラン70」といったように数字を付けて表される、本明細書で用いる用語「デキストラン」は、デキストランの重量平均分子量が、およそX kDAであることを意味する薬局方の略語であるデキストランXで表される。したがって、デキストラン1は、850〜1,150 Daの重量平均分子量を有するデキストランを意味する。イソマルトオリゴ糖１および水添イソマルトオリゴ糖１は、同様に命名される。したがって、イソマルトオリゴ糖１は、デキストラン1についてのEPおよびUSPの研究論文にしたがって、850〜1,150 Daの重量平均分子量を有するイソマルトオリゴ糖を意味する。イソマルトオリゴ糖１は、本願では、ペンタイソマルトースとも称される。水添イソマルトオリゴ糖１は、水添の混合物を意味し、ここで、水添イソマルトオリゴ糖は、デキストラン1についてのEPおよびUSPの研究論文にしたがう。水添イソマルトオリゴ糖１は、本願では、ペンタイソマルトシドとも称される。
本明細書で用いる用語「デキストランベースのイソマルトオリゴ糖」は、850〜1,650 Daなどの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有し、低分子量デキストランの加水分解などによって得られる加水分解されたデキストランから得られるイソマルトオリゴ糖を意味する。
本明細書で用いる用語「抗凍結剤」は、たとえば、適当な溶液中で、凍害からサンプルを保護するために用いられる物質を意味する。抗凍結剤の例は、たとえば、DMSO、ポリオールなどである。
本明細書で用いる用語「滅菌」は、増殖する能力がある細菌、微生物およびその他の生物が存在しないことを意味する。
本明細書で用いる用語「実質的にDMSOを含まない」は、0.01w/w %未満の量のDMSOを意味する。
本明細書で用いる「C1-10アルキル」は、直鎖または分枝鎖のC1-6アルキルなどの直鎖または分枝鎖のC1-10アルキルである。例は、メチル、エチル、1-プロピル、2-プロピル、イソプロピル、1-ブチル、2-メチル-1-プロピル、2-ブチル、1-ペンチル、3-ペンチル、2-メチル-2-ブチルおよび3-メチル-2-ブチルである。
本明細書で用いる「カルボキシC1-10アルキル」は、-C1-10アルキルCOOHを意味する。例は、カルボキシメチル(CM)(-CH2COOH)である。
本明細書で用いる用語「DEAE」は、ジエチルアミノエチルを意味する。
凍結防止剤
本明細書は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤に関する。
本明細書は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤に関する。
１つの態様において、該抗凍結剤は、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる。
デキストランおよびデキストリン、および／またはその誘導体の分子量は、典型的に、たとえば、ポリエーテルヒドロキシル化ゲルのGPCカラムを用いるゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって決定される。キャリブレーションは、デキストランについての欧州薬局方、第7版の記載に従い、デキストランについての欧州薬局方、第7版、第2巻、1816-1817ページに記載の反復数学的方法を用いて行うことができる。
水添イソマルトオリゴ糖などのソマルトオリゴ糖および／またはその誘導体の分子量は、典型的に、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって決定される。カラムシステムにおける定常期は、高度に架橋した多孔性アガロースビーズに共有結合したデキストランであってもよく、分子量範囲180-3000 Daのオリゴ糖の分解が可能になる。測定は、欧州薬局方、第7版、第1巻、60-61ページに従って行なう。
該抗凍結剤が、電気的に中性である場合、該抗凍結剤の重量平均分子量(Mw)は、GPCによって測定されるのが好ましい。電荷をもつ抗凍結剤の重量平均分子量(Mw)を測定する場合、重量平均分子量(Mw)は、電気的に中性である出発物質、および荷電した抗凍結剤の置換度の分子量に基づいて計算される。非荷電出発物質の各グルコース単位は、1〜3個の置換基で置換されうる。置換基の例としてDEAEを用いて、当業者は、たとえば、ケルダール分析を用いて、たとえば、窒素含量を測定して、最終生成物の分子量を計算することができる。もし、置換基が酸基を含むならば、置換度は、たとえば、滴定により、当業者によって決定されてもよく、その後、最終分子量を計算することができる。
デキストリン、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖はすべて、反復D-グルコース単位を含む。以下にさらに記載するように、デキストランは、主としてα-(1→6)結合D-グルコースからなる中性分枝多糖のファミリーである。デキストリンは、α-(1→4)またはα-(1→6)によって結合したD-グルコース単位のポリマーの混合物である。イソマルトオリゴ糖は、α-D-(1,6)-結合をもつグルコースオリゴマー(典型的には、10 D-グルコース単位よりも少なく、 3-6グルコース単位が適当である)の混合物であり、典型的には、500〜1,650 Da、850〜1,650 Daまたは850 Da〜1150 Daなどの300〜1,650 Daの平均重量分子量を有する。１つの態様において、3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満である。１つの態様において、9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満、10% w/w未満などの20% w/w未満である。さらなる態様において、3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満であり、9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満、10% w/w未満などの20% w/w未満である。重量分率は、たとえば、本明細書の製造例１および２の記載のように、決定されてもよい。
１つの態様において、デキストリン、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖の誘導体は、水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストラン、水添デキストリン、酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストラン、酸化デキストリン、デキストリンのエステル、デキストランのエステル、イソマルトオリゴ糖のエステル、デキストリンのエーテル、デキストランのエーテル、イソマルトオリゴ糖のエーテル、ならびに部分水添/酸化デキストリン、部分水添/酸化デキストランおよび部分水添/酸化イソマルトオリゴ糖、ならびにその誘導体から選ばれる。１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、水添イソマルトオリゴ糖、酸化イソマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖のエステルのエステル、イソマルトオリゴ糖のエーテル、および部分水添/酸化イソマルトオリゴ糖、ならびにその誘導体から選ばれる。
以下は、デキストリン、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖の上述の誘導体のための異なる合成および出発物質の例の概略である(表A)：
表A：
* １つの態様において、合成は、たとえば、US 6,977,249に記載の、部分的に酸化され、水素添加された誘導体を得るための部分的酸化および水素添加であってもよい。
表A：
* １つの態様において、合成は、たとえば、US 6,977,249に記載の、部分的に酸化され、水素添加された誘導体を得るための部分的酸化および水素添加であってもよい。
１つの態様において、デキストリンのエーテル、デキストランのエーテルおよびイソマルトオリゴ糖のエーテルのタイプは、官能基Rを有するエーテルから選ばれる。Rは、メチル(-CH3)およびエチル(-C2H5)などのC1-6アルキルなどのC1-10アルキル、カルボキシメチル(-CH2COOH)などのカルボキシC1-10アルキル、2-ヒドロキシエチル(-2H4OH)、2-ヒドロキシプロピル(-CH2CHOHCH3)、2-ヒドロキシアルキル(-CH2CHOH(CH2)nCH3 (ここで、nは、1-10である)、3-クロロ-2-ヒドロキシプロピル(-CH2CHOHCH2Cl)、2-ジエチルアミノエチル(-C2H4N(C2H5)2)、3-アミノ-2-ヒドロキシプロピル(-CH2CHOHCH2NH2)、3-ジメチルアルキルアンモニウム-2-ヒドロキシプロピル(-CH2CHOHCH2N+(CH3)2R(ここで、Rは、C1-10アルキルである)などのヒドロキシC1-10アルキル、セチルポリエチレングリコール(-CH2CH2O)10C16H33)およびステアリルポリエチレングリコール(-CH2CH2O)10C18H37)から選ばれる。
１つの態様において、該デキストリンのエーテル、デキストランのエーテルおよびイソマルトオリゴ糖のエーテルは、それぞれ、DEAE-デキストリン、DEAE-デキストラン、DEAE-イソマルトオリゴ糖である。１つの態様において、該イソマルトオリゴ糖のエーテルは、DEAE-イソマルトオリゴ糖である。１つの態様において、該デキストリンのエーテル、デキストランのエーテルおよびイソマルトオリゴ糖のエーテルは、それぞれ、カルボキシC1-10アルキル-デキストリン、カルボキシC1-10アルキル-デキストラン、カルボキシC1-10アルキル-イソマルトオリゴ糖である。１つの態様において、該イソマルトオリゴ糖のエーテルは、カルボキシC1-10アルキル-イソマルトオリゴ糖である。
１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストランおよび水添デキストリンから選ばれる。１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、水添イソマルトオリゴ糖である。
もう１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストランおよび酸化デキストリンから選ばれる。１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、酸化イソマルトオリゴ糖である。もう１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、酸化/水添イソマルトオリゴ糖、酸化/水添デキストランおよび酸化/水添デキストリンから選ばれる。１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、酸化/水添イソマルトオリゴ糖である。
もう１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、DEAE-デキストリン、DEAE-デキストラン、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-デキストリン、カルボキシC1-10アルキル-デキストラン、カルボキシC1-10アルキル-イソマルトオリゴ糖、デキストリンのエステル、デキストランのエステルおよびイソマルトオリゴ糖のエステルから選ばれる。もう１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-イソマルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖のエステルから選ばれる。
もう１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、DEAE-水添デキストリン、DEAE-水添デキストラン、DEAE-水添イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-水添デキストリン、カルボキシC1-10アルキル-水添デキストラン、カルボキシC1-10アルキル-水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストリンのエステル、水添デキストランのエステルおよび水添イソマルトオリゴ糖のエステルなどから選ばれる水添デキストリンの誘導体、水添デキストラン、水添イソマルトオリゴ糖から選ばれる。もう１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、DEAE-水添イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-水添イソマルトオリゴ糖および水添イソマルトオリゴ糖のエステルなどから選ばれる水添イソマルトオリゴ糖の誘導体から選ばれる。もう１つの態様において、デキストリンの誘導体、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖は、DEAE-酸化デキストリン、DEAE-酸化デキストラン、DEAE-酸化イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-酸化デキストリン、カルボキシC1-10アルキル-酸化デキストラン、カルボキシC1-10アルキル-酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストリンのエステル、酸化デキストランのエステルおよび酸化イソマルトオリゴ糖のエステルなどから選ばれる酸化デキストリン、酸化デキストランおよび酸化イソマルトオリゴ糖から選ばれる。もう１つの態様において、イソマルトオリゴ糖の誘導体は、DEAE-酸化イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-酸化イソマルトオリゴ糖および酸化イソマルトオリゴ糖のエステルなどから選ばれる酸化イソマルトオリゴ糖の誘導体から選ばれる。
さらなる態様において、抗凍結剤は、水添イソマルトオリゴ糖、酸化イソマルトオリゴ糖、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル 酸化イソマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖のエステル、イソマルトオリゴ糖のエーテルまたはカルボキシC1-10アルキルイソマルトオリゴ糖である。
さらなる態様において、抗凍結剤は、カルボキシメチルイソマルトオリゴ糖またはカルボキシエチルイソマルトオリゴ糖である。
１つの態様において、抗凍結剤は、イソマルトオリゴ糖１などのイソマルトオリゴ糖である。もう１つの態様において、抗凍結剤は、水添イソマルトオリゴ糖１などの水添イソマルトオリゴ糖である。
誘導体化のバリエーションによって、様々な置換度を達成することができる。置換度が、各グルコース単位当り1〜3置換の範囲にあるのが適当である。たとえば、DEAE-デキストランの場合、3つのグルコース単位当り、およそ１つの荷電基が好ましい。
１つの態様において、凍結防止剤は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体である抗凍結剤の１つ以上を含み、ここで、該凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する少なくとも1% w/w の1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む。
さらなる態様において、凍結防止剤は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体である抗凍結剤の１つ以上を含み、ここで、該抗凍結剤は、500〜7,500 Daなどの300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。１つの態様において、該抗凍結剤は、多くとも9000 Da、多くとも8000 Da、多くとも7000 Da、多くとも6000 Da、多くとも5000 Da、多くとも4000 Da、多くとも3000 Da、多くとも2000 Da、多くとも1900 Da、多くとも1800 Da、多くとも1700または多くとも1,650 Daなどの多くとも9500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
さらなる態様において、凍結防止剤は、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体である抗凍結剤の１つ以上を含み、ここで、該凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する少なくとも1% w/w の1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、ここで、該抗凍結剤は、500〜7,500 Daなどの300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
１つの態様において、電気的に荷電した誘導体は、上述のデキストラン、デキストリンおよびイソマルトオリゴ糖から作成された誘導体などの非荷電出発物質の分子量分布を特徴とする。したがって、１つの態様において、該デキストラン、デキストリンおよび／またはイソマルトオリゴ糖の誘導体は、500〜7,500 Daなどの300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。さらなる態様において、該誘導体は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖の誘導体である。
１つの態様において、デキストラン、デキストリンおよびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、500〜7,500 Daなどの300〜7,500 Daなどの300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
１つの態様において、デキストラン、デキストリンおよびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、1,650〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
１つの態様において、デキストラン、デキストリンおよびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、1,650〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)および≧1および≦5の多分散性を有する。
１つの態様において、デキストラン、デキストリンおよびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、1,650〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
１つの態様において、デキストラン、デキストリンおよびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、1,650〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)および≧1および≦5の多分散性を有する。
１つの態様において、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
１つの態様において、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、≧1および≦3の多分散性を有する。
さらなる態様において、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤は、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
さらなる態様において、3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満である。１つの態様において、9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満、10% w/w未満などの20% w/w未満である。さらなる態様において、3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満であり、9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率は、15% w/w未満、10% w/w未満などの20% w/w未満である。重量分率は、たとえば、本明細書の製造例１および２の記載のように、決定されてもよい。
１つの態様において、凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、20% w/wなどの少なくとも10% w/w の1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む。さらなる態様において、凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上などの少なくとも30% w/wの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む。
デキストランおよびその誘導体
デキストランは、数種の細菌の菌株、主として、たとえば、「Advances in polymer science」、Volume 205、Polysaccharides II、編者 D.Klemm、Springer Verlagに記載のロイコノストックおよびストレプトコッカス株などのグラム陽性、通性嫌気性菌球菌によって形成されうる。医薬用途のためのデキストランは、典型的に、米国および欧州薬局方において規定される特定の細菌株、たとえば、ロイコノストック・メセントロイデス(Leuconostoc Mesenteroides)NCTC 10817またはB512 Fによって製造されている。菌株NCTC 10817およびB512Fは、英国のナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー(中央公衆衛生研究所)から1971年以来公的に入手可能である。
デキストランは、数種の細菌の菌株、主として、たとえば、「Advances in polymer science」、Volume 205、Polysaccharides II、編者 D.Klemm、Springer Verlagに記載のロイコノストックおよびストレプトコッカス株などのグラム陽性、通性嫌気性菌球菌によって形成されうる。医薬用途のためのデキストランは、典型的に、米国および欧州薬局方において規定される特定の細菌株、たとえば、ロイコノストック・メセントロイデス(Leuconostoc Mesenteroides)NCTC 10817またはB512 Fによって製造されている。菌株NCTC 10817およびB512Fは、英国のナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー(中央公衆衛生研究所)から1971年以来公的に入手可能である。
デキストランは、主として、発酵に用いられる細菌に応じて、様々な割合の結合および分枝をもつ主鎖を有するα-(1→6)結合D-グルコースからなる中性分枝多糖である。デキストラン分子は、式(I)には示されない１つの遊離末端アルデヒド基を含む。デキストランにおけるα-(1→6)結合は、総グルコシド結合の50〜97 %で変化しうる。残りのグルコシド結合は、分枝として結合したα-(1→2)、α-(1→3)およびα-(1→4)結合を表す。式(I)は、2-、3-および4-位 に分枝点をもつデキストランのα-(1→6)-結合グルコース主鎖の部分を示す。上述の菌株B512Fを用いる場合、α-(1→6)結合の比率は、95 %またはそれ以上である。
天然のデキストランには、分子量の非常に高い値が見い出される。107〜4x108ダルトンの範囲の値が報告されている。したがって、デキストランを、多くの適用に使用できるようにするために、天然のデキストランを加水分解して低分子量にすることが必要である。当業者に知られており、利用可能である方法はいくつかあるが、加水分解は、塩酸を用い、およそ95℃の温度において、およそpH 1.5にて行われる。加水分解によって、低分子量のデキストランおよびグルコースが生成される。加水分解物は、典型的に、アルコールを用いる沈殿形成、ろ過、および膜ろ過などの他の様々なクロマトグラフィー法などの様々な方法によって精製および分画される。
医薬用途のためのデキストランは、典型的に、米国および欧州薬局方において規定される特定の細菌株、たとえば、ロイコノストック・メセントロイデス(Leuconostoc Mesenteroides)NCTC 10817またはB512 Fによって製造されている。菌株NCTC 10817およびB512Fは、英国のナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー(中央公衆衛生研究所)から1971年以来公的に入手可能である。
デキストランのうち、ヒトの医薬用途には、デキストラン40およびデキストラン70が特に用いられる。たとえば、デキストラン500およびデキストラン5ならびにそれらの間の分子量などの他の分子サイズは、合成用、細胞の分離用の担体として、ワクチン中の賦形剤として、あるいはヒト角膜jの保存などの様々なその他の適用において、凍結保存の領域外で用いられる。さらに、デキストラン1は、ハプテン阻害を示し、ヒトデキストラン抗体を遮断し、そのことによって、ヒトにおける高分子量デキストランの投与後に時々起こることが知られている潜在的アレルギー反応を予防する、デキストラン1の予備注射として、ヒトにおける特別の用途を有する。デキストラン1、デキストラン40およびデキストラン70は、欧州薬局方、第7版、第2巻、1816-1819ページに詳細に記載されている。
デキストランは、また、水溶性ポリマーを合成するために用いられる優れた原料である。
以下は、デキストランの誘導体の例である：
1）たとえば、pH 8-12などのアルカリ条件下、デキストランとホウ化水素などの還元剤を反応させ、アルデヒド末端基をソルビトールに還元することによって合成されうる水添デキストラン。
1）たとえば、pH 8-12などのアルカリ条件下、デキストランとホウ化水素などの還元剤を反応させ、アルデヒド末端基をソルビトールに還元することによって合成されうる水添デキストラン。
2）当業者に公知の方法によって合成されうるデキストランのエーテル。一例は、アルカリ溶液中でのデキストランと(2-クロロエチル)ジエチルアンモニウムクロリドとの反応によって合成されうる2-(ジエチルアミノ)エチルデキストラン(DEAEデキストラン)(反応工程式1に示す)から製造されうる。
反応工程式1：2-(ジエチルアミノ)エチル(A)基および2-[(2-(ジエチルアミノ)エチル]ジエチルアンモニウム]エチル(B)基を含有するDEAEデキストラン
もう１つの例は、反応工程式2に示す、強アルカリ条件下、モノクロロ酢酸(MCA)との反応によって合成されうるカルボキシメチルデキストラン(CMD)などのカルボキシC1-10アルキルデキストランである。
反応工程式2
3）デキストランと酢酸アルデヒドとの反応によって合成されうる酢酸デキストランなどのデキストランのエステル。
反応工程式3
4）酸化デキストランは、たとえば、塩基性水溶液中、次亜塩素酸ナトリウムを用いて合成されうる。
5）部分酸化/水添デキストラン。このタイプの誘導体の製造方法は、たとえば、US 6,977,249に開示され、その開示は、参照することによって本明細書に援用される。一例は、デキストランの分子量を加水分解によって減少させ、その機能性アルデヒド末端基を水素添加によってアルコールに変換する処理過程によって製造されるデキストランから製造されうる；；水素添加は、一部のみであり、炭水化物の総量において計算して多くとも15重量%が還元糖のままであり、該デキストランは、次いで、酸化に付され、該水素添加および酸化が行われて、実質的にすべてのアルコール基およびカルボン酸基に変換されたアルデヒド基を有するデキストランが得られ、該デキストラン生成物は、中間体グリコシル基に機能性アルデヒド基または機能性カルボン酸基を含まない；ここで、水素添加は、水性溶液中、ホウ化水素を用いて行われる；および
ここで、酸化は、塩基性水性溶液中、次亜塩素酸ナトリウムを用いて行われる。
ここで、酸化は、塩基性水性溶液中、次亜塩素酸ナトリウムを用いて行われる。
6）さらなる、上記水添および／または酸化デキストランのDEAE-置換、カルボキシC1-10アルキル-置換、エステルおよびエーテルは、上述と同様に、当業者に公知の方法によって製造されうる。
イソマルトオリゴ糖およびその誘導体
イソマルトオリゴ糖は、α-D-(1,6)-結合主鎖をもつグルコースオリゴマーである。１つの態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、デキストランベースであり、低分子量デキストランの加水分解によって作成される。さらなる態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。１つの態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する加水分解されたデキストランである。
イソマルトオリゴ糖は、α-D-(1,6)-結合主鎖をもつグルコースオリゴマーである。１つの態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、デキストランベースであり、低分子量デキストランの加水分解によって作成される。さらなる態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)などの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。１つの態様において、本明細書に記載されるイソマルトオリゴ糖は、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する加水分解されたデキストランである。
イソマルトオリゴ糖から出発して、グリシトール/ソルビトールへの還元アルデヒド末端基の変化を特徴とするその誘導体を製造することができる。イソマルトオリゴ糖から水添イソマルトオリゴ糖への変換は、下記反応工程式4に記載するように、アルカリ条件下、たとえばホウ化水素などの還元剤でイソマルトオリゴ糖を処理することによって行うことができる：
反応工程式4
デキストランの誘導体を製造するための上述の処理過程を用い、塩化(2-クロロエチル)ジエチルアンモニウムとの反応によって、イソマルトオリゴ糖の誘導体を製造することもでき、2-(ジエチルアミノデキストラン)エチル(DEAE)イソマルトオリゴ糖が作成されうる。もう１つの選択肢は、カルボキシメチルイソマルトオリゴ糖を合成するために、モノクロロ酢酸(MCA)との反応によって、イソマルトオリゴ糖誘導体を製造することである。当業者にとって、上述のデキストランおよびイソマルトオリゴ糖のように、それぞれ塩化(2-クロロエチル)ジエチルアンモニウムおよびモノクロロ酢酸との反応によって、さらなる水添イソマルトオリゴ糖の誘導体を製造することは容易である。
オリゴ-イソマルトース
出発物質としてのデキストランおよび中間体としてのキストラン1(イソマルトオリゴ糖)に関し、デキストラン分子を決定する分枝側鎖α-(1→2)、α-(1→3)およびα-(1→4)の完全欠如を特徴とするオリゴ-イソマルトースを合成することが可能である。これに関連して、オリゴイソマルトースは、イソマルトオリゴ糖のサブセットであるとみなされる。したがって、１つの態様において、オリゴイソマルトースは、850〜1,650 Da、好ましくは850〜1,150 Daなどの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有し、分枝側鎖α-(1→2)、α-(1→3)およびα-(1→4)が完全に欠如する。イソマルトオリゴ糖のために上述した誘導体の同じ合成を、オリゴイソマルトースを用いて行うことができるのは明白である。
出発物質としてのデキストランおよび中間体としてのキストラン1(イソマルトオリゴ糖)に関し、デキストラン分子を決定する分枝側鎖α-(1→2)、α-(1→3)およびα-(1→4)の完全欠如を特徴とするオリゴ-イソマルトースを合成することが可能である。これに関連して、オリゴイソマルトースは、イソマルトオリゴ糖のサブセットであるとみなされる。したがって、１つの態様において、オリゴイソマルトースは、850〜1,650 Da、好ましくは850〜1,150 Daなどの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有し、分枝側鎖α-(1→2)、α-(1→3)およびα-(1→4)が完全に欠如する。イソマルトオリゴ糖のために上述した誘導体の同じ合成を、オリゴイソマルトースを用いて行うことができるのは明白である。
デキストリンおよびその誘導体
デキストリンは、デンプンの加水分解によって製造される低分子量炭水化物の一群である。デキストリンは、様々な長さのグルコース主鎖をもつ分子の混合物からなるデキストランポリマーである。デキストリンを用いる前に、それらは、所望の分子サイズおよび重量分布を得るために、典型的に、たとえば、加水分解または１種以上のアルコール沈殿法を適用することによって、および／または、特定のカットオフ値を有する１種以上の膜を適用する膜処理などの様々なクロマトグラフィー法によって、精製され、分画される。
デキストリンは、デンプンの加水分解によって製造される低分子量炭水化物の一群である。デキストリンは、様々な長さのグルコース主鎖をもつ分子の混合物からなるデキストランポリマーである。デキストリンを用いる前に、それらは、所望の分子サイズおよび重量分布を得るために、典型的に、たとえば、加水分解または１種以上のアルコール沈殿法を適用することによって、および／または、特定のカットオフ値を有する１種以上の膜を適用する膜処理などの様々なクロマトグラフィー法によって、精製され、分画される。
式(II)に示すように、デキストリンは、α-(1→4)またはα-(1→6)グリコシド結合によって結合したD-グルコース単位のポリマーの混合物である。
デキストリンの誘導体は、上述のデキストランおよびイソマルトオリゴ糖と同様に、当業者に公知の方法によって作成されうる。
凍結保存
凍結保存されるサンプルの汚染を回避するために、抗凍結剤が、滅菌されているのが好ましく、凍結保存剤/組成物の他の最適成分もまた滅菌されているのが好ましい。
凍結保存されるサンプルの汚染を回避するために、抗凍結剤が、滅菌されているのが好ましく、凍結保存剤/組成物の他の最適成分もまた滅菌されているのが好ましい。
幾つかの適用において、追加の抗凍結剤とともに、このような追加の抗凍結剤の濃度を、好ましくは非毒性濃度まで減少させるために、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤を補足するのが有用である。このことは、肝細胞または多機能性幹細胞などの特定の細胞型にとって特に有用である。したがって、さらなる態様において、凍結防止剤は、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、1-アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、硫酸コンドロイチン、クロロホルム、コリン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エリスリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α-グリセロリン酸、グリセロールモノアセテート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンN-オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミン酢酸塩、尿素、バリンおよびキシロースから選ばれる、少なくとも１つの追加の抗凍結剤をさらに含む。１つの態様において、該追加の抗凍結剤は、DMSOである。低下された量においてDMSOを追加することの利点は、非常に壊れやすい細胞にとって、追加の保護が得られることである。好ましい態様において、凍結防止剤はDMSOを含まないか、または実質的に含まない。したがって、さらに好ましい態様において、該デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖またはその誘導体は、凍結防止剤中の唯一の抗凍結剤である。DMS0を含まないか、または実質的に含まない凍結防止剤は、サンプルの融解後の洗浄を必要としない。次いで、サンプルを洗浄することなく培養プロセスを迅速に開始するために、融解したサンプルを、培養培地に直接懸濁させてもよく、あるいは、潜在的に実質的な細胞喪失をもたらす洗浄ステップなしで患者に直接用いてもよい。DMS0を含まないか、または実質的に含まない凍結防止剤を用いるう１つの利点は、サンプルを損傷することなく、より長期間抗凍結剤に曝露さることができ、その結果、より効率的な作業工程が可能になることである。
もう１つの態様において、凍結防止剤は、さらに、0.01〜1 mg/mLの量の凍結防止剤などの、少なくとも１つの不凍化タンパク質および／または不凍化タンパク質を含む。不凍化糖タンパク質の例は、単一の長い両親媒性のαヘリックスである、ロングホーンスカルピンに由来するI型AFPである。
凍結防止剤または凍結防止組成物は、サンプルの生存能力を改善するためのさらなる物質を含んでもよい。このような物質の例として、IAP(アポトーシスのインヒビター)；rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路のインヒビター；EGF、FGF、PDGF、IGF、EPO、BDNF、TGF、TNF、VEGFなどの増殖因子に言及することができる。さらなる態様において、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ由来の任意の血清成分に言及することができる。凍結防止剤または凍結防止組成物は、増殖培地を含んでもよい。１つの態様において、をβ-カテニン/P300アンタゴニスト、および、たとえばアクチビンとTGFβを連結するID-8などのアクチビン/TGFβリガンド含む増殖培地を用いることができる。たとえばWO 2013/054112に記載のように、このタイプの培地は、多能性幹細胞、特に胚性幹細胞の培養のために特に有用である。もう１つの例は、KnockOut Serum Replacement、GlutaMAX(商標)サプリメントを含むDMEM/F12、FGF、NEAAおよびBMEを含む標準的ノックアウト培地である。もう１つの例は、mTSERTM系である。凍結保存されるサンプルに応じて変わる増殖培地の他の例は、当業者には公知である。
本明細書に開示される凍結防止剤は、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末などの粉末の形態であってもよい。
さらなる態様において、該凍結防止剤は、溶液の形態である。したがって、凍結防止剤は、たとえば滅菌水などの溶媒をさらに含んでもよい。１つの態様において、該凍結防止剤は、40%〜65% w/wまたは50%〜60% w/wの該抗凍結剤などの30%〜70% w/w該抗凍結剤を含む。
凍結保存されるべき細胞、組織または臓器などのサンプルはまた、非常に典型的には、冷凍適合性pH緩衝液とともに、少なくとも塩基性塩溶液、エネルギー源(たとえばグルコースなど)および低温にて中性pHを維持することができる緩衝液に含まれうる。高知の材料として、たとえば、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)が挙げられる。この材料はまた、凍結保存組成物および／または凍結保存剤の一部として包含されてもよい。
本明細書に開示される１つの態様は、本明細書に記載される凍結防止剤を含む凍結保存組成物であり、該凍結保存組成物は、凍結保存されるべきサンプルをさらに含む。
本明細書に開示されるさらなる態様は、凍結保存されているか、または凍結保存される過程にある凍結防止剤およびサンプルを含む凍結保存された組成物である。本明細書で記載される用語「凍結保存された組成物」は、凍結保存される過程にあるか、またはすでに凍結保存された「凍結保存組成物」のいずれかを意味する。
本明細書に開示されるさらなる態様は、凍結保存されるべきサンプルのための増殖培地または基質を含む凍結保存された組成物である。
１つの態様において、サンプルは、哺乳類などの臓器、細胞および組織から選ばれる 。さらなる態様において、サンプルは、臓器、細胞、血液または組織である。このような凍結保存されるべき細胞の例は、初代細胞、細胞株などのインビトロ培養細胞、ヒト血液細胞などのインビトロ分別細胞、および動物およびヒト由来の受精卵である。さらなる例は、精子細胞、胚性幹細胞、IPS細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、臍帯血幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および血液細胞である。さらなる態様において、サンプルは、間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、IPS細胞、ケラチン生成細胞、好ましくはCD34陽性血液幹細胞などの造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞およびIPS細胞から選ばれる。さらなる態様において、サンプルは、間葉系幹細胞および造血幹細胞から選ばれる。１つの態様において、細胞は、動物またはヒト由来である。臓器の例は、肺、肝臓、腎臓、心臓、卵巣および膵臓である。組織の例は、骨髄、皮膚、卵巣、精巣、血管、結合組織の組織、好ましくは卵巣および結合組織の組織である。さらなる態様において、 血液は、臍帯血および運動性末梢血液、好ましくは臍帯血から選ばれる。さらなる態様において、サンプルは、血液、月経液または羊水などの細胞含有体液である。
凍結防止されるべき特定のサンプルに応じて、抗凍結剤は、典型的に、2〜50 % w/w、4〜45 % w/wまたは6〜20 % w/w、または6〜12 % w/w、あるいは好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの1〜50 % w/wの量で、凍結保存されるべき組成物中に存在する。１つの態様において、抗凍結剤は、多くとも55% w/w、多くとも50% w/w、多くとも45% w/w、多くとも40% w/w、多くとも35% w/wなどの多くとも60% w/wの量で凍結保存されるべき組成物中に存在する。もう１つの態様において、抗凍結剤は、典型的に、少なくとも4% w/w、少なくとも6% w/w、少なくとも6% w/w、少なくとも7% w/wなどの少なくとも2% w/wの量で存在する、
もし凍結防止されるべき組成物が、DMSOなどの追加の抗凍結剤を含むならば、追加の抗凍結剤は、典型的に、1-8% w/wなどの8 % w/w未満、たとえば、5% w/w未満など、1-4% w/w未満などの4 % w/w未満などの量で存在する。
従来の凍結保存技術において、サンプルは、採取され、保存溶液中に懸濁され、次いで冷凍することによって保存される。細胞などのサンプルが使用される場合、それらは解凍され、たとえば、ヒトドナーから採取された細胞は、正常なヒトの体温(すなわち、およそ37℃)に戻され、次いで、細胞培養培地に置かれる。
本発明の凍結保存方法において、凍結保存中、凍結保存温度に低下させる前に本明細書に記載される凍結防止剤と接触させることによって、サンプルは保護される。凍結防止剤と接触させることは、凍結保存温度への降温中に、凍結保存組成物中の抗凍結剤によってサンプルが保護されるように、サンプルを何らかの方法で抗凍結剤と接触させることを意味する。たとえば、細胞は、保護されるべき細胞が加えられるプレートの適当なウエルを充填することによって；または凍結防止剤の溶液に細胞を懸濁させることによるか、もしくはたとえば凍結乾燥形態の凍結防止剤を、すでに緩衝液などの溶液中にある細胞、血液または臓器に加えることによって；または遠心分離後の細胞ペレットを凍結防止剤に再懸濁させて細胞を溶液にすることによって、凍結防止剤と接触させることができる。
１つの態様において、本明細書は、凍結保存されるべきサンプルを、本明細書に定義される凍結防止剤と接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度に低下させるステップを含む、サンプルを凍結保存する方法を開示する。
さらなる態様において、該組成物の温度を凍結保存温度に低下させることによって本明細書に定義される組成物を凍結保存する方法が開示される。
室温から溶液の氷点の下1-2℃への変化速度は、細胞が温度ショック感受性であるならば、最大生存能力における主な効果を有する。
3.5℃〜-5℃の間で、サンプルは、通常、氷の結晶の導入、冷たい探針で培地の表面に接触すること、機械的振動、または氷核形成が起こるまで温度を急速に低下させること、のいずれかによって、凍結するように誘導される。凍結は、発熱過程なので、熱を凍結溶液から追い出さなければならない。これは、低氷点の液体にサンプルを浸漬したままにするか、または実質的なヒートシンクを提供するかのいずれかによって行うことができる。細胞外の培地に氷が形成されるので、より多くの自由水が氷相に結合するようになる。疎水性である細胞膜は、細胞内氷の核形成に対するバリヤーとして働き、したがって、凍結しない細胞は、次第に高張となる溶液に曝露される。細胞外塩濃度は、氷に対する水の隔離の結果として増加する。凍結しない細胞は、細胞内および細胞外液相の浸透圧の不均衡に応答する細胞からの水の輸送により収縮する。次いで、サンプルは、各細胞型に対して最適化されなければならない限定された速度で冷却される。
冷却の最適速度は、水に対する細胞膜の浸透性、細胞の表面：体積比、本明細書に記載される凍結防止剤中の凍結防止添加物のタイプおよび濃度によって決定される。グリセロールまたはDMSO中で凍結された大部分核形成された哺乳類細胞については、最適冷却速度は、通常、約0.3〜10℃/分である。約4℃〜-80℃の間の継続的な冷却が、最も一般的に用いられる。一旦、サンプルがおよそ-80℃に到達すれば、保管のために、液体窒素(-196℃)または液体窒素の蒸気相内にサンプルを直接移動させることができる。凍結保存に用いるためのもう１つの方法は、1000℃〜2000℃/分という非常に速い冷却速度を得ることができるガラス化技術である。この技術を用いると、サンプルを含む凍結保存組成物を含む特殊なガラス化デバイスが、液体窒素に直接置かれる。１つの態様において、凍結保存温度は、0.1-10、0.2-8、0.3-6、0.4-4、0.5-2℃/分などの0.05-15℃/分の速度にて達成される。もう１つの態様において、凍結保存温度は、800-2500、1000-2000、1200-1800℃/分など500-3000の℃/分の速度にて達成される。
液体窒素中での生存細胞保管の期間は、主として、宇宙線バックグラウンドによって引き起こされる遊離ラジカルの生成率に応じてさまざまである。
たとえば、液体窒素に保管された哺乳類胚の半減期は、およそ30,000年であると推定されている。凍結細胞を、短期間であっても、それらの保管温度以上に暖めないようにすることが重要である。断続的な加温は、細胞構造を損ない、全生存能力を低下させうる急速な移動性際結晶(migratory recrystallization)を促進する。
さらなる態様において、サンプルは、凍結保存後に融解される。サンプルの融解の最適速度は、使用した凍結条件および保存されるべき特定のサンプルに応じて変わる。一般に、懸濁液中で凍結される単一細胞ならびに心臓弁などの組織にとっては、急速な加温が望ましい。このような急速加温は、凍結サンプル中の氷結晶の成長を制限し、高生存のための絶対要件であることが多い。多くの組織に関し、この加温は、37-42℃の水浴にてサンプルを振とうすることによって達成されうる。急速加温の理論的根拠は、それが、冷却中に形成された氷結晶の成長を制限することである。
いくつかの組織は、急速加温に対して敏感でありうる。細胞は、氷融解液としての細胞外高張液に曝露され、その浸透圧平衡を維持するために再水和せざるをえないので、このことは、一過性浸透圧ショックによるものである。他のより敏感なサンプルについては、代謝過程は、融解培地中での血清またはその他の高分子量ポリマーを用いる連続的希釈によって、再活性化されうるか、または正常レベルにされうる。
融解手順が完了した後も、細胞は、依然として、段細胞を等張培地に戻すように階的に希釈されなければならないマルチモル(multimolar)濃度の凍結防止剤に曝露される。哺乳類細胞のためには、段階的希釈プロトコルが、典型的に用いられる。サンプルの希釈は、浸透圧ショックおよび抗凍結剤毒性の両方の効果を減少させるように、通常、好ましくは37℃にて行われる。さらなる態様において、該抗凍結剤の濃度は、4〜20 % w/w、5〜15 % w/wまたは6〜12 % w/w、または好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの4〜45 % w/wである。
さらなる態様において、凍結保存組成物中のサンプルの温度は、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃などの-50℃未満の凍結保存温度に降温される。
１つの態様において、凍結防止剤は、バンキング法において用いられる。１つの態様において、凍結防止剤は、臨床的バンキング法において用いられる。１つの態様において、凍結防止剤は、運動性末梢血バンキング法において用いられる。
１つの態様において、凍結防止剤は、悪性疾患のための幹細胞移植または臓器移植などの臨床的バンキング法において用いられる。１つの態様において、凍結防止剤は、運動性末梢血バンキング法、髄バンキング法または臍帯バンキング法において用いられる。
１つの態様において、凍結防止剤は、髄バンキング法または臍帯バンキング法において用いられる。１つの態様において、凍結防止剤は、脂肪組織バンキング法または歯髄組織バンキング法において用いられる。さらなる態様において、凍結防止剤は、生殖バンキング法において用いられる。
以下にさらなる実施態様を開示する：
１．1種以上のデキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体などの1種以上のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体である抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/wの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；および／または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤。
２．デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれるなどのデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤。
１．1種以上のデキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体などの1種以上のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体である抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/wの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；および／または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤。
２．デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれるなどのデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤。
３．該抗凍結剤が、300〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-2のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４．該抗凍結剤が、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上である、実施態様1-3のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
５．該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-4のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
６．該イソマルトオリゴ糖およびその誘導体が、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-5のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
７．該サンプルが、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織などの臓器、細胞および組織から選ばれる、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-6のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
８．該サンプルが、移植用である、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-7のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
９．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-8のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１０．該サンプルが臓器であり、該臓器が、凍結保存後の該臓器の生理的機能の測定により機能的であると判断され、および／または該サンプルが組織であり、該組織が、このような組織の周囲組織と一体化する能力により機能的であると判断され、および／または該サンプルが細胞であり、細胞が、該凍結保存後の細胞の生存能力により機能的であると判断される、実施態様1-9のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４．該抗凍結剤が、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上である、実施態様1-3のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
５．該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-4のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
６．該イソマルトオリゴ糖およびその誘導体が、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-5のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
７．該サンプルが、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織などの臓器、細胞および組織から選ばれる、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-6のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
８．該サンプルが、移植用である、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-7のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
９．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、サンプルを凍結保存するための、実施態様1-8のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１０．該サンプルが臓器であり、該臓器が、凍結保存後の該臓器の生理的機能の測定により機能的であると判断され、および／または該サンプルが組織であり、該組織が、このような組織の周囲組織と一体化する能力により機能的であると判断され、および／または該サンプルが細胞であり、細胞が、該凍結保存後の細胞の生存能力により機能的であると判断される、実施態様1-9のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１１．該抗凍結剤が、1,650〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-10のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１２．該抗凍結剤が、500〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-11のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１３．該抗凍結剤が、1,650〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-12のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１４．該抗凍結剤が、多分散性Pdを有し、Pdが≧1および≦5である、実施態様1-13のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１５．該抗凍結剤が、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-14のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１６．該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-15のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１７．該抗凍結剤が、多分散性Pdを有し、Pdが≧1および≦3である、実施態様1-16のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１８．該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも10% w/wの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-17のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１９．3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率が、15% w/w未満である、実施態様1-18のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２０．9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率が、20 % w/w未満である、実施態様1-19のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１２．該抗凍結剤が、500〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-11のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１３．該抗凍結剤が、1,650〜3,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-12のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１４．該抗凍結剤が、多分散性Pdを有し、Pdが≧1および≦5である、実施態様1-13のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１５．該抗凍結剤が、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-14のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１６．該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様1-15のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１７．該抗凍結剤が、多分散性Pdを有し、Pdが≧1および≦3である、実施態様1-16のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１８．該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも10% w/wの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-17のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
１９．3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率が、15% w/w未満である、実施態様1-18のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２０．9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率が、20 % w/w未満である、実施態様1-19のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２１．3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率が、15% w/w未満であり、9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率が、15% w/w未満、10% w/w未満などの20 % w/w未満である、実施態様1-20のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２２．該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも30% w/w、少なくとも40% w/w、少なくとも50% w/w、少なくとも60% w/w、少なくとも70% w/w、少なくとも80% w/w、少なくとも90% w/w、少なくとも95% w/wまたはそれ以上などの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-21のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２３．該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖などのイソマルトオリゴ糖である、実施態様1-22のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２４．該イソマルトオリゴ糖およびその誘導体がデキストランベースである、実施態様1-23のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２２．該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも30% w/w、少なくとも40% w/w、少なくとも50% w/w、少なくとも60% w/w、少なくとも70% w/w、少なくとも80% w/w、少なくとも90% w/w、少なくとも95% w/wまたはそれ以上などの1種以上のイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む、実施態様1-21のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２３．該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖などのイソマルトオリゴ糖である、実施態様1-22のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２４．該イソマルトオリゴ糖およびその誘導体がデキストランベースである、実施態様1-23のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２５．該誘導体が、水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストラン、水添デキストリン、酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストラン、酸化デキストリン、デキストリンのエステル、デキストランのエステル、イソマルトオリゴ糖のエステル、デキストリンのエーテル、デキストランのエーテル、イソマルトオリゴ糖のエーテル；水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストラン、水添デキストリン、酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストラン、酸化デキストリンなどから選ばれる部分水添/酸化デキストリン、部分水添/酸化デキストランおよび部分水添/酸化イソマルトオリゴ糖およびその誘導体；DEAE-デキストリン、DEAE-デキストラン、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル-デキストリン、カルボキシC1-10アルキル-デキストラン、カルボキシC1-10アルキル-イソマルトオリゴ糖、デキストリンのエステル、デキストランのエステルおよびイソマルトオリゴ糖のエステルおよびその誘導体から選ばれるデキストリン、デキストランおよびイソマルトオリゴ糖の誘導体である、実施態様1-24のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２６．該誘導体が、水添イソマルトオリゴ糖、酸化イソマルトオリゴ糖、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル、酸化イソマルトオリゴ糖またはカルボキシC1-10アルキルイソマルトオリゴ糖である、実施態様1-25のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２７．該誘導体が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する水添イソマルトオリゴ糖などの水添イソマルトオリゴ糖である、実施態様1-26のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２８．該カルボキシC1-10アルキルイソマルトオリゴ糖が、カルボキシメチルイソマルトオリゴ糖またはカルボキシエチルイソマルトオリゴ糖である、実施態様25-27のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２６．該誘導体が、水添イソマルトオリゴ糖、酸化イソマルトオリゴ糖、DEAE-イソマルトオリゴ糖、カルボキシC1-10アルキル、酸化イソマルトオリゴ糖またはカルボキシC1-10アルキルイソマルトオリゴ糖である、実施態様1-25のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２７．該誘導体が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する水添イソマルトオリゴ糖などの水添イソマルトオリゴ糖である、実施態様1-26のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２８．該カルボキシC1-10アルキルイソマルトオリゴ糖が、カルボキシメチルイソマルトオリゴ糖またはカルボキシエチルイソマルトオリゴ糖である、実施態様25-27のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
２９．アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、1-アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、硫酸コンドロイチン、クロロホルム、コリン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エリスリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α-グリセロリン酸、グリセロールモノアセテート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンN-オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミン酢酸塩、尿素、バリンおよびキシロースから選ばれる、少なくとも１つの追加の抗凍結剤をさらに含む、実施態様1-28のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３０．該追加の抗凍結剤が、DMSOである、実施態様1-29のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３１．実質的にDMSOを含まない、実施態様1-30のいずれか１つに記載の凍結防止剤。 ３２．The agent according to embodiment 31 which is free of DMSO。
３３．唯一の抗凍結剤として実施態様1に定義される抗凍結剤を含む、実施態様1-32のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３４．該凍結防止剤が、粉末の形態である、実施態様1-33のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３５．該凍結防止剤が、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末の形態である、実施態様1-34のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３６．該凍結防止剤が、溶液の形態である、実施態様1-35のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３７．該凍結防止剤が、40%〜65% w/wまたは50%〜60% w/wの該抗凍結剤などの30%〜70% w/wの該抗凍結剤を含む、実施態様1-36のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３０．該追加の抗凍結剤が、DMSOである、実施態様1-29のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３１．実質的にDMSOを含まない、実施態様1-30のいずれか１つに記載の凍結防止剤。 ３２．The agent according to embodiment 31 which is free of DMSO。
３３．唯一の抗凍結剤として実施態様1に定義される抗凍結剤を含む、実施態様1-32のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３４．該凍結防止剤が、粉末の形態である、実施態様1-33のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３５．該凍結防止剤が、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末の形態である、実施態様1-34のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３６．該凍結防止剤が、溶液の形態である、実施態様1-35のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３７．該凍結防止剤が、40%〜65% w/wまたは50%〜60% w/wの該抗凍結剤などの30%〜70% w/wの該抗凍結剤を含む、実施態様1-36のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３８．該凍結防止剤が、40%〜65% w/wまたは50%〜60% w/wの該追加の抗凍結剤などの30%〜70% w/wの該追加の抗凍結剤を含む、実施態様1-37のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
３９．凍結保存されるべきサンプルのための増殖培地または基質をさらに含む、実施態様1-38のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４０．IAP(アポトーシスのインヒビター)；rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路のインヒビター；および／またはEGF、FGF、PDGF、IGF、EPO、BDNF、TGF、TNF、VEGFなどの任意の増殖因子に属する任意のタンパク質をさらに含む、実施態様1-39のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４１．ヒト、ウシ、ウマまたはイヌ由来の任意の血清成分をさらに含む、実施態様1-40のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４２．該抗凍結剤が、滅菌されている、実施態様1-41のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４３．実施態様1-42に定義される凍結防止剤を含み、凍結保存されるべきサンプルをさらに含む、凍結保存組成物。
４４．サンプルが、臓器、単離された細胞などの細胞、またはたとえば血液などの細胞含有体液および組織から選ばれる、実施態様43に記載の凍結保存組成物。
４５．サンプルが、移植用の哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれるサンプルなどの哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる、実施態様44に記載の凍結保存組成物。
３９．凍結保存されるべきサンプルのための増殖培地または基質をさらに含む、実施態様1-38のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４０．IAP(アポトーシスのインヒビター)；rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)シグナル伝達経路のインヒビター；および／またはEGF、FGF、PDGF、IGF、EPO、BDNF、TGF、TNF、VEGFなどの任意の増殖因子に属する任意のタンパク質をさらに含む、実施態様1-39のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４１．ヒト、ウシ、ウマまたはイヌ由来の任意の血清成分をさらに含む、実施態様1-40のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４２．該抗凍結剤が、滅菌されている、実施態様1-41のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
４３．実施態様1-42に定義される凍結防止剤を含み、凍結保存されるべきサンプルをさらに含む、凍結保存組成物。
４４．サンプルが、臓器、単離された細胞などの細胞、またはたとえば血液などの細胞含有体液および組織から選ばれる、実施態様43に記載の凍結保存組成物。
４５．サンプルが、移植用の哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれるサンプルなどの哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる、実施態様44に記載の凍結保存組成物。
４６．該サンプルが、間葉系幹細胞、組織特異的前駆細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞または心筋細胞などの組織または臓器中のすべての種類の組織由来細胞；造血幹細胞、マクロファージ、血小板、赤血球などの血液由来細胞；またはすべてのタイプの多能性細胞、全能性細胞および単能性細胞などの幹細胞；ならびに胚葉細胞などの体細胞から選ばれる細胞である、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４７．該サンプルが、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、マクロファージ、およびCD34陽性血液幹細胞などの造血幹細胞から選ばれる細胞である、実施態様43-46のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４８．該サンプルが、卵巣組織、精巣組織、臍帯組織、胎盤組織、結合組織、心臓組織、筋肉、骨および軟骨組織からの組織、内分泌組織および神経組織から選ばれる組織である、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４９．該サンプルが、臍帯血、末梢血および運動性末梢血などの血液、羊水、精液、脳脊髄液、月経液および骨髄穿刺液から選ばれる細胞含有体液である
、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５０．該サンプルが、肺、心臓、腎臓、肝臓、臍帯および卵巣から選ばれる臓器である、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５１．2〜50 % w/wまたは4〜45 % w/wまたは6〜12 % w/w、あるいは好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの1〜50 % w/wの量の該抗凍結剤を含む、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４７．該サンプルが、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、マクロファージ、およびCD34陽性血液幹細胞などの造血幹細胞から選ばれる細胞である、実施態様43-46のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４８．該サンプルが、卵巣組織、精巣組織、臍帯組織、胎盤組織、結合組織、心臓組織、筋肉、骨および軟骨組織からの組織、内分泌組織および神経組織から選ばれる組織である、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
４９．該サンプルが、臍帯血、末梢血および運動性末梢血などの血液、羊水、精液、脳脊髄液、月経液および骨髄穿刺液から選ばれる細胞含有体液である
、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５０．該サンプルが、肺、心臓、腎臓、肝臓、臍帯および卵巣から選ばれる臓器である、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５１．2〜50 % w/wまたは4〜45 % w/wまたは6〜12 % w/w、あるいは好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの1〜50 % w/wの量の該抗凍結剤を含む、実施態様43-45のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５２．該組成物が、1-8%などの8 % w/w未満の量のDMSOを含む、実施態様43-51のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５３．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様43-52のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５４．該組成物が、8 % w/w未満、1-4%などの4 % w/w未満の量のDMSOを含む、実施態様43-53のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５５．凍結保存されるべきサンプルを、実施態様1-42のいずれか１つに定義される凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることを含む、サンプルを凍結保存する方法。
５６．凍結保存組成物が、実施態様43-54のいずれか１つに定義される、実施態様55に記載の方法。
５３．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様43-52のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５４．該組成物が、8 % w/w未満、1-4%などの4 % w/w未満の量のDMSOを含む、実施態様43-53のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
５５．凍結保存されるべきサンプルを、実施態様1-42のいずれか１つに定義される凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることを含む、サンプルを凍結保存する方法。
５６．凍結保存組成物が、実施態様43-54のいずれか１つに定義される、実施態様55に記載の方法。
５７．凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることによる、実施態様43-56のいずれか１つに定義される該組成物を凍結保存する方法。
５８．凍結保存温度が、0.1-10、0.2-8、0.3-6、0.4-4、0.5-2℃/分などの0.05-15℃/分の速度にて達成される、実施態様55-57のいずれか１つに記載の方法。
５９．該抗凍結剤の濃度が、5〜15 % w/wまたは6〜12 % w/w、または好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの4〜20 % w/wである、実施態様55-58のいずれか１つに記載の方法。
６０．凍結保存組成物中のサンプルの温度が、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃などの-50℃未満の温度に降温される、実施態様55-59のいずれか１つに記載の方法。
６１．サンプルが、凍結保存後に融解される、実施態様55-60のいずれか１つに記載の方法。
６２．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様55-61のいずれか１つに記載の方法。
６３．凍結保存されるべきサンプルが、臓器、細胞および組織から選ばれる、実施態様55-62のいずれか１つに記載の方法。
６４．臨床的バンキング法における、実施態様55-63のいずれか１つに記載の方法。
６５．運動性末梢血バンキング法、髄バンキング法、脂肪組織バンキング法、歯髄組織バンキング法、生殖バンキング法または臍帯バンキング法などのバンキング法における、実施態様55-64のいずれか１つに記載の方法。
５８．凍結保存温度が、0.1-10、0.2-8、0.3-6、0.4-4、0.5-2℃/分などの0.05-15℃/分の速度にて達成される、実施態様55-57のいずれか１つに記載の方法。
５９．該抗凍結剤の濃度が、5〜15 % w/wまたは6〜12 % w/w、または好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの4〜20 % w/wである、実施態様55-58のいずれか１つに記載の方法。
６０．凍結保存組成物中のサンプルの温度が、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃などの-50℃未満の温度に降温される、実施態様55-59のいずれか１つに記載の方法。
６１．サンプルが、凍結保存後に融解される、実施態様55-60のいずれか１つに記載の方法。
６２．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様55-61のいずれか１つに記載の方法。
６３．凍結保存されるべきサンプルが、臓器、細胞および組織から選ばれる、実施態様55-62のいずれか１つに記載の方法。
６４．臨床的バンキング法における、実施態様55-63のいずれか１つに記載の方法。
６５．運動性末梢血バンキング法、髄バンキング法、脂肪組織バンキング法、歯髄組織バンキング法、生殖バンキング法または臍帯バンキング法などのバンキング法における、実施態様55-64のいずれか１つに記載の方法。
６６．臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれるなどの、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤の使用であって、ここで、a)該凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；またはb)該抗凍結剤は、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；またはc)該凍結防止剤は、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する。
６７．該抗凍結剤が、300〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様66に記載の凍結防止剤の使用。
６７．該抗凍結剤が、300〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、実施態様66に記載の凍結防止剤の使用。
６８．臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、850〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するなどの300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる凍結防止剤の使用。
６９．臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、実施態様1-42のいずれか１つに定義される凍結防止剤の使用。
７０．凍結保存されるべきサンプルを、該凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることを含む、実施態様66-69のいずれか１つに記載の使用。
６９．臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、実施態様1-42のいずれか１つに定義される凍結防止剤の使用。
７０．凍結保存されるべきサンプルを、該凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることを含む、実施態様66-69のいずれか１つに記載の使用。
７１．該凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることによってサンプルを凍結保存するための、実施態様43-54のいずれか１つに記載の凍結保存組成物の使用。
７２．凍結保存温度が、0.1-10、0.2-8、0.3-6、0.4-4、0.5-2℃/分などの0.05-15℃/分の速度にて達成される、実施態様66-71のいずれか１つに記載の使用。
７３．該抗凍結剤の濃度が、5〜15 % w/wまたは6〜12 % w/w、または好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの4〜20 % w/wである、実施態様66-72のいずれか１つに記載の使用。
７４．凍結保存組成物中のサンプルの温度が、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃などの-50℃未満の温度に降温される、実施態様66-73のいずれか１つに記載の使用。
７５．サンプルが、凍結保存後に融解される、実施態様66-74のいずれか１つに記載の使用。
７６．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様66-75のいずれか１つに記載の使用。
７７．凍結保存されるべきサンプルが、移植用の臓器、細胞および組織から選ばれる、実施態様66-76のいずれか１つに記載の使用。
７８．運動性末梢血バンキング法、髄バンキング法、脂肪組織バンキング法、歯髄組織バンキング法、生殖バンキング法または臍帯バンキング法などのバンキング法における、実施態様66-77のいずれか１つに記載の使用。
７９．臨床的バンキング法における、実施態様66-78のいずれか１つに記載の使用。
７２．凍結保存温度が、0.1-10、0.2-8、0.3-6、0.4-4、0.5-2℃/分などの0.05-15℃/分の速度にて達成される、実施態様66-71のいずれか１つに記載の使用。
７３．該抗凍結剤の濃度が、5〜15 % w/wまたは6〜12 % w/w、または好ましくは6〜10% w/w、またはより好ましくは7〜9% w/wなどの4〜20 % w/wである、実施態様66-72のいずれか１つに記載の使用。
７４．凍結保存組成物中のサンプルの温度が、-50℃〜-196℃、-80℃〜-196℃などの-50℃未満の温度に降温される、実施態様66-73のいずれか１つに記載の使用。
７５．サンプルが、凍結保存後に融解される、実施態様66-74のいずれか１つに記載の使用。
７６．該サンプルが、凍結保存後に機能的である、実施態様66-75のいずれか１つに記載の使用。
７７．凍結保存されるべきサンプルが、移植用の臓器、細胞および組織から選ばれる、実施態様66-76のいずれか１つに記載の使用。
７８．運動性末梢血バンキング法、髄バンキング法、脂肪組織バンキング法、歯髄組織バンキング法、生殖バンキング法または臍帯バンキング法などのバンキング法における、実施態様66-77のいずれか１つに記載の使用。
７９．臨床的バンキング法における、実施態様66-78のいずれか１つに記載の使用。
本明細書において言及されるすべての刊行物は、参照することによって本明細書に援用される。本発明の所望の組成物、方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施態様に関連して記載されているが、請求の範囲に記載の本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。
製造例１
イソマルトオリゴ糖１の製造
低分子量デキストランの加水分解
カットオフ値＜5,000ダルトンを有する膜からの浸透物として採取された3345 kgの加水分解デキストランは、温度95℃、pH 1.5において加水分解される。
イソマルトオリゴ糖１の製造
低分子量デキストランの加水分解
カットオフ値＜5,000ダルトンを有する膜からの浸透物として採取された3345 kgの加水分解デキストランは、温度95℃、pH 1.5において加水分解される。
加水分解は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いてモニターされ、加水分解されている材料の分子量が、所望の値、すなわち、850〜1,150ダルトンの重量平均分子量に到達したと評価される時に、冷却によって終結される。
加水分解によって、低分子量のイソマルトオリゴ糖が製造されるが、グルコースもまた形成される。冷却および中和後、グルコースおよび非常に低い分子量のオリゴマーの量は、カットオフ値340〜800ダルトンを有する膜処理によって減少する。この処理の後、イソマルトオリゴ糖の含量は、旋光度(αD20〜200)によって、915 kgであると決定され、還元糖の量は、ソモギー試薬の使用によって、22.5%であると決定される。
表1：GPC分析の結果
AUPW：ピーク下面積(Mw)
AUPN：ピーク下面積(Mn)
AUPW：ピーク下面積(Mw)
AUPN：ピーク下面積(Mn)
上記表1から明らかなように、イソマルトオリゴ糖は、1020 DaのMWを有し、Mnは827 Daに等しく、多分散性Pd＝1.23である。還元糖は、22.5 %であると測定される。このイソマルトオリゴ糖は、本明細書において、ペンタイソマルトースとも称される。
製造例２
水添イソマルトオリゴ糖１の製造
加水分解および分画後、418 kgのイソマルトオリゴ糖が残った。還元糖は、30.8 %であると測定された。この量を、10 kgの水素化ホウ素ナトリウムで処理し、その結果、最終的イオン交換前に、362 kgの水添イソマルトオリゴ糖を得た。その後、溶液をpH＜7.0に中和し、続いて、脱イオン化し、最後に、噴霧乾燥した。最終生成物の還元糖は、0.09 %であると測定された。
水添イソマルトオリゴ糖１の製造
加水分解および分画後、418 kgのイソマルトオリゴ糖が残った。還元糖は、30.8 %であると測定された。この量を、10 kgの水素化ホウ素ナトリウムで処理し、その結果、最終的イオン交換前に、362 kgの水添イソマルトオリゴ糖を得た。その後、溶液をpH＜7.0に中和し、続いて、脱イオン化し、最後に、噴霧乾燥した。最終生成物の還元糖は、0.09 %であると測定された。
表2：GPC分析の結果
AUPW：ピーク下面積(Mw)
AUPN：ピーク下面積(Mn)
AUPW：ピーク下面積(Mw)
AUPN：ピーク下面積(Mn)
上記表2から明らかなように、水添イソマルトオリゴ糖は、968 DaのMWを有し、Mnは780 Daに等しく、多分散性Pd＝1.24である。還元糖は、22.5 %であると測定される。この水添イソマルトオリゴ糖は、本明細書において、ペンタイソマルトシドとも称される。
凍結保存剤の製造
以下の実施例において用いた凍結保存剤は、増殖培地(DMEM/F12＋10% FBS＋ペニシリン/ストレプトマイシン)中の抗凍結剤(DMSO、製造例１で製造されたペンタイソマルトース(イソマルトオリゴ糖１)または製造例２で製造されたペンタイソマルトシド(水添イソマルトオリゴ糖１)など)を無菌で可溶化して、所望の最終濃度n(たとえば、8% イソマルトオリゴ糖１凍結保存組成物について、8 グラム/100 mlの増殖培地)にし、個々の凍結保存組成物をフィルター滅菌することによって製造される。
以下の実施例において用いた凍結保存剤は、増殖培地(DMEM/F12＋10% FBS＋ペニシリン/ストレプトマイシン)中の抗凍結剤(DMSO、製造例１で製造されたペンタイソマルトース(イソマルトオリゴ糖１)または製造例２で製造されたペンタイソマルトシド(水添イソマルトオリゴ糖１)など)を無菌で可溶化して、所望の最終濃度n(たとえば、8% イソマルトオリゴ糖１凍結保存組成物について、8 グラム/100 mlの増殖培地)にし、個々の凍結保存組成物をフィルター滅菌することによって製造される。
正常ヒト皮膚線維芽細胞の凍結保存
標準条件下(37℃、5% CO2および標準増殖培地 [DMEM/F12＋10% FBS＋ペニシリン/ストレプトマイシン])、NHDF(第2継代)を、従来のT-フラスコで培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を6つの異なる凍結保存剤(1 ml)に再懸濁させた：1)増殖培地＋10% DMSO、2)増殖培地＋2% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、3)増殖培地＋2% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、4)増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１、5)増殖培地＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、および6)添加剤を含まない増殖培地(FBSを含まないDMEM/F12)。次いで、イソプロパノールベースの方法を用い、1℃/分の定速で液体N2の温度まで温度を下げて凍結させ、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で凍結保存した。1週間後、標準的融解プロトコル(37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な37℃ 増殖培地に細胞溶液を滴下する)を用いて細胞を融解した。融解後、次の分析を行った：1)生存能力、ヌクレオカウンター装置(NC200)を使用、および2)初代継代における生存能力、ヌクレオカウンター装置(NC200)を使用。結果を図１および２に示し、表3〜5にまとめる。
唯一の凍結保存剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いる場合、10% DMSOを用いる標準的条件と比較して、融解後の生存能力は、わずかに低下する。2% DMSOを、イソマルトオリゴ糖１とともに用いる場合、生存能力に関する差異は、観察されない。初代継代においてイソマルトオリゴ糖単独とともに凍結保存された細胞の生存能力は、10% DMSOを用いる標準的条件と類似する。この実験は、唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いる、凍結保存溶液中でNHDFを凍結保存することは、標準的凍結保存条件からの培養物と同程度まで用いることができる培養物をもたらすことを実証する。
標準条件下(37℃、5% CO2および標準増殖培地 [DMEM/F12＋10% FBS＋ペニシリン/ストレプトマイシン])、NHDF(第2継代)を、従来のT-フラスコで培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を6つの異なる凍結保存剤(1 ml)に再懸濁させた：1)増殖培地＋10% DMSO、2)増殖培地＋2% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、3)増殖培地＋2% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、4)増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１、5)増殖培地＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、および6)添加剤を含まない増殖培地(FBSを含まないDMEM/F12)。次いで、イソプロパノールベースの方法を用い、1℃/分の定速で液体N2の温度まで温度を下げて凍結させ、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で凍結保存した。1週間後、標準的融解プロトコル(37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な37℃ 増殖培地に細胞溶液を滴下する)を用いて細胞を融解した。融解後、次の分析を行った：1)生存能力、ヌクレオカウンター装置(NC200)を使用、および2)初代継代における生存能力、ヌクレオカウンター装置(NC200)を使用。結果を図１および２に示し、表3〜5にまとめる。
唯一の凍結保存剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いる場合、10% DMSOを用いる標準的条件と比較して、融解後の生存能力は、わずかに低下する。2% DMSOを、イソマルトオリゴ糖１とともに用いる場合、生存能力に関する差異は、観察されない。初代継代においてイソマルトオリゴ糖単独とともに凍結保存された細胞の生存能力は、10% DMSOを用いる標準的条件と類似する。この実験は、唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いる、凍結保存溶液中でNHDFを凍結保存することは、標準的凍結保存条件からの培養物と同程度まで用いることができる培養物をもたらすことを実証する。
正常なヒトケラチン生成細胞(NHEK)の凍結保存
実施例２に記載したものと同じプロトコルを用いて、NHEKを凍結保存した。同じ実験グループで行った。結果を図３および４に示し、表3〜5にまとめる。
実施例２に記載したものと同じプロトコルを用いて、NHEKを凍結保存した。同じ実験グループで行った。結果を図３および４に示し、表3〜5にまとめる。
NHDFについても明らかなように、結果は、唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いて、NHEKが、凍結保存溶液中で凍結保存されうることを明確に実証する。培養物の初代継代における生存能力は、10% DMSOを用いる標準的条件下で凍結保存されたNHEKのレベルと同じである。
正常なヒト間葉系幹細胞(hMSC)の凍結保存
さらに2つの実験グループ（増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１+ 2% トレハロース；および増殖培地＋2% トレハロース）を含めて、実施例２に記載したものと同じプロトコルを用いて、hMSCを凍結保存した。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析をおこなった。結果を図５に示し、表3〜5にまとめる。
さらに2つの実験グループ（増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１+ 2% トレハロース；および増殖培地＋2% トレハロース）を含めて、実施例２に記載したものと同じプロトコルを用いて、hMSCを凍結保存した。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析をおこなった。結果を図５に示し、表3〜5にまとめる。
結果は、唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いて、hMSCが、凍結保存溶液中で凍結保存されうることを明確に実証する。融解後の生存能力が、10% DMSOを含有する標準的配合物と同じレベルであることが明らかにされる。
表3〜5
T1：融解後の生存
T2：初代継代後の生存
T1：融解後の生存
T2：初代継代後の生存
表3
表4
表5
イソマルトオリゴ糖１へのhMSCの曝露
hMSCを、従来のT-フラスコ中、集密まで増殖させた。細胞を放出し、2つの異なる配合物に差異懸濁させた：1)増殖培地＋10% DMSO；および2)8% イソマルトオリゴ糖１。各配合物中の細胞の採集濃度は、1x106個/mlであった。実施例２に記載したものと同じ基本プロトコルを用いた。各バイアルからの1 mlを凍結バイアルに加え、3つの異なる時点[1)0分(T0)、10分(T10)および30分(T30)]でヌクレオカウンターを用いて生存能力を分析した。結果を表6にまとめる。
表6
hMSCを、従来のT-フラスコ中、集密まで増殖させた。細胞を放出し、2つの異なる配合物に差異懸濁させた：1)増殖培地＋10% DMSO；および2)8% イソマルトオリゴ糖１。各配合物中の細胞の採集濃度は、1x106個/mlであった。実施例２に記載したものと同じ基本プロトコルを用いた。各バイアルからの1 mlを凍結バイアルに加え、3つの異なる時点[1)0分(T0)、10分(T10)および30分(T30)]でヌクレオカウンターを用いて生存能力を分析した。結果を表6にまとめる。
表6
標準的凍結保存条件への曝露が、hMSCの生存能力に著しく影響を及ぼすことが明らかに実証される。唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を含む凍結製剤(cryoformulation)への曝露は、60分間の曝露後、生存能力に有意に影響を及ぼす。これは、イソマルトオリゴ糖１を含む凍結保存組成物中で濃縮凍結保存用の細胞培養物を取り扱うことができ、より柔軟な作業手順を可能にすることを実証する。
hMSCの凍結保存用のイソマルトオリゴ糖560 Da
実施例に記載したものと同じ基本プロトコルを用いて、hMSCを凍結保存し、同じ実験グループを行った。結果は、イソマルトオリゴ糖560 Da中でhMSCを凍結保存することは可能であるが、水添イソマルトオリゴ糖560 Daは、この実験ではイソマルトオリゴ糖560 Daほど有効ではないことを示す。結果を表7にまとめる。
表7
実施例に記載したものと同じ基本プロトコルを用いて、hMSCを凍結保存し、同じ実験グループを行った。結果は、イソマルトオリゴ糖560 Da中でhMSCを凍結保存することは可能であるが、水添イソマルトオリゴ糖560 Daは、この実験ではイソマルトオリゴ糖560 Daほど有効ではないことを示す。結果を表7にまとめる。
表7
PluriPro増殖培地中のヒトiPS細胞
製造例１に記載したように、この実験に用いるイソマルトオリゴ糖１を製造する。ヒト人工多能性幹細胞、iPSC(12代継代)を、標準的条件下(37度、5% CO2およびPluriPro 増殖培地、Cell Guidance System)、単一細胞として従来のT-フラスコ中で培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を12個の異なる凍結保存溶液(1 ml)に再懸濁させた：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋5% DMSO、増殖培地＋10% DMSO＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１、および抗凍結剤なしの増殖培地。次いで、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で液体N2の温度まで温度を下げて凍結保存した(イソプロパノールベースの方法を用いる)。一週間後、標準的融解プロトコルを用いて細胞を融解した((37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な増殖培地に細胞溶液を滴下して移した)。最初の播種を行い、ROCKインヒビターを加えた。融解後、ヌクレオカウンター技術を用い、生存能力分析を行った。結果を図６に示す。
製造例１に記載したように、この実験に用いるイソマルトオリゴ糖１を製造する。ヒト人工多能性幹細胞、iPSC(12代継代)を、標準的条件下(37度、5% CO2およびPluriPro 増殖培地、Cell Guidance System)、単一細胞として従来のT-フラスコ中で培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を12個の異なる凍結保存溶液(1 ml)に再懸濁させた：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋5% DMSO、増殖培地＋10% DMSO＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋8% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋2% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋4% イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋8% イソマルトオリゴ糖１、および抗凍結剤なしの増殖培地。次いで、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で液体N2の温度まで温度を下げて凍結保存した(イソプロパノールベースの方法を用いる)。一週間後、標準的融解プロトコルを用いて細胞を融解した((37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な増殖培地に細胞溶液を滴下して移した)。最初の播種を行い、ROCKインヒビターを加えた。融解後、ヌクレオカウンター技術を用い、生存能力分析を行った。結果を図６に示す。
結果は、凍結保存された細胞の生存能力は、DMSOを加える場合よりも有意に低いが、ヒトiPS細胞が、唯一の抗凍結剤としてイソマルトオリゴ糖１を用いて凍結保存されうることを実証する。
PluriPro増殖培地中のヒトiPS細胞
製造例１に記載したように、この実験に用いる水添イソマルトオリゴ糖１を製造する。ヒト人工多能性幹細胞、iPSC(12代継代)を、標準的条件下(37度、5% CO2およびPluriPro 増殖培地、Cell Guidance System)、単一細胞として従来のT-フラスコ中で培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を12個の異なる凍結保存溶液(1 ml)に再懸濁させた：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋5% DMSO、増殖培地＋10% DMSO＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、および抗凍結剤なしの増殖培地。次いで、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で液体N2の温度まで温度を下げて凍結保存した(イソプロパノールベースの方法を用いる)。一週間後、標準的融解プロトコルを用いて細胞を融解した((37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な増殖培地に細胞溶液を滴下して移した)。最初の播種を行い、ROCKインヒビターを加えた。融解後、ヌクレオカウンター技術を用い、生存能力分析を行った。結果を図７に示す。
製造例１に記載したように、この実験に用いる水添イソマルトオリゴ糖１を製造する。ヒト人工多能性幹細胞、iPSC(12代継代)を、標準的条件下(37度、5% CO2およびPluriPro 増殖培地、Cell Guidance System)、単一細胞として従来のT-フラスコ中で培養した。集密(70-80%)に達した時点で、細胞集団をフラスコから放出し、遠心分離した(1000 rpm、10分)。0,5x106個の細胞を12個の異なる凍結保存溶液(1 ml)に再懸濁させた：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋5% DMSO、増殖培地＋10% DMSO＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋10% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋5% DMSO＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋2% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋4% 水添イソマルトオリゴ糖１、増殖培地＋8% 水添イソマルトオリゴ糖１、および抗凍結剤なしの増殖培地。次いで、細胞を、標準的制御凍結保存条件下で液体N2の温度まで温度を下げて凍結保存した(イソプロパノールベースの方法を用いる)。一週間後、標準的融解プロトコルを用いて細胞を融解した((37度の水浴にバイアルを直接浸漬させ、新鮮な増殖培地に細胞溶液を滴下して移した)。最初の播種を行い、ROCKインヒビターを加えた。融解後、ヌクレオカウンター技術を用い、生存能力分析を行った。結果を図７に示す。
結果は、凍結保存された細胞の生存能力は、DMSOを加える場合よりも有意に低いが、ヒトiPS細胞が、唯一の抗凍結剤として水添イソマルトオリゴ糖１を用いて凍結保存されうることを実証する。DMSOなしで凍結保存されたサンプルにおいて、使用したイソマルトオリゴ糖１の濃度の関数として、生存能力を改善する傾向が観察された。
異なる分子量をもつ抗凍結剤中での正常なヒト間葉系幹細胞(hMSC)の凍結保存
実施例２と同じプロトコルを用いて、以下の実験グループにおいて、hMSCを凍結保存した：増殖培地＋10% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw 10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストラン＋5% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストラン＋1% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストランおよび増殖培地。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析を行った。融解後、標準的条件下で3日間、MSCを培養し、インビトロ分析における比色分である、細胞集団中のミトコンドリア活性を測定するMTTアッセイを用いることによって、増殖速度を分析した。
結果を図８に示す。
実施例２と同じプロトコルを用いて、以下の実験グループにおいて、hMSCを凍結保存した：増殖培地＋10% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw 10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストラン＋5% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストラン＋1% DMSO、8% イソマルトオリゴ糖１、平均Mw10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストランおよび増殖培地。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析を行った。融解後、標準的条件下で3日間、MSCを培養し、インビトロ分析における比色分である、細胞集団中のミトコンドリア活性を測定するMTTアッセイを用いることによって、増殖速度を分析した。
結果を図８に示す。
結果は、hMSCを、唯一の抗凍結剤として、イソマルトオリゴ糖１、平均Mw 10.000のデキストランまたは平均Mw 40.000のデキストランを用いる凍結保存溶液中で凍結保存することができること明確に実証する。融解後の直接生存能力分析におけるMnの間に、有意な差異は観察されなかった。しかしながら、3日後の増殖速度の分析は、8% イソマルトオリゴ糖１(平均Mw 1000)中で凍結保存されたhMSCは、8% 平均Mw 10.000および平均Mw 40.000のデキストランと比較してより活発に増殖することを実証した。
平均Mw 1500 Mwを有するイソマルトオリゴ糖中での正常なヒト間葉系幹細胞(hMSC)の凍結保存
実施例２と同じプロトコルを用いて、以下の実験グループにおいて、hMSCを凍結保存した：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋2% DMSO、平均Mw 1500 Mwを有する8% イソマルトオリゴ糖＋2% DMSO、平均Mw 1500 Mwを有する8% イソマルトオリゴ糖および増殖培地。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析を行った。融解後、標準的条件下で3日間、MSCを培養し、インビトロ分析における比色分である、細胞集団中のミトコンドリア活性を測定するMTTアッセイを用いることによって、増殖速度を分析した。結果を図９に示す。
実施例２と同じプロトコルを用いて、以下の実験グループにおいて、hMSCを凍結保存した：増殖培地＋10% DMSO、増殖培地＋2% DMSO、平均Mw 1500 Mwを有する8% イソマルトオリゴ糖＋2% DMSO、平均Mw 1500 Mwを有する8% イソマルトオリゴ糖および増殖培地。上述のヌクレオカウンター技術を用いて、生存能力分析を行った。融解後、標準的条件下で3日間、MSCを培養し、インビトロ分析における比色分である、細胞集団中のミトコンドリア活性を測定するMTTアッセイを用いることによって、増殖速度を分析した。結果を図９に示す。
結果は、hMSCを、唯一の抗凍結剤として、平均Mw 1500を有するイソマルトオリゴ糖を用いる凍結保存溶液中で凍結保存することができること明確に実証する。
DMSO、イソマルトオリゴ糖１または水添イソマルトオリゴ糖１とともに凍結保存した後の CD34+ 造血幹細胞の生存能力
運動性末梢血細胞を、白血球除去輸血によって採取し、10% DMSOまたは異なる濃度のイソマルトオリゴ糖１(isom)または水添イソマルトオリゴ糖１(h-isom)を含む凍結防止培地中で凍結させた。速度制御フリーザー(Kryo 560-16、Planer； 開始温度4℃、-1℃/分で0℃まで低下、-2℃/分で-45℃まで低下、および-5℃/分で-100℃まで低下)を用いてサンプルを凍結させ、-150℃にした。37℃の水浴中でサンプルを融解させた。フローサイトメトリーを適用して、CD45+、CD34+ 造血幹細胞の生存能力を評価した。蛍光DNA結合化合物である7-アミノアクチノマイシン D(7-AAD)を、生/死マーカーとして用いた。7AADを排除できる細胞を、生存可能であると仮定した。結果を、図１０に示す：イソマルトオリゴ糖１(薄いグレーのバー)、水添イソマルトオリゴ糖１(濃いグレーのバー)およびDMSO(黒いバー)。それぞれ二回ずつ測定された、3つの別々の実験からのデータを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
運動性末梢血細胞を、白血球除去輸血によって採取し、10% DMSOまたは異なる濃度のイソマルトオリゴ糖１(isom)または水添イソマルトオリゴ糖１(h-isom)を含む凍結防止培地中で凍結させた。速度制御フリーザー(Kryo 560-16、Planer； 開始温度4℃、-1℃/分で0℃まで低下、-2℃/分で-45℃まで低下、および-5℃/分で-100℃まで低下)を用いてサンプルを凍結させ、-150℃にした。37℃の水浴中でサンプルを融解させた。フローサイトメトリーを適用して、CD45+、CD34+ 造血幹細胞の生存能力を評価した。蛍光DNA結合化合物である7-アミノアクチノマイシン D(7-AAD)を、生/死マーカーとして用いた。7AADを排除できる細胞を、生存可能であると仮定した。結果を、図１０に示す：イソマルトオリゴ糖１(薄いグレーのバー)、水添イソマルトオリゴ糖１(濃いグレーのバー)およびDMSO(黒いバー)。それぞれ二回ずつ測定された、3つの別々の実験からのデータを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
h-isomおよびisomの両方が、標準的10% DMSOと同程度まで、凍結保存後のCD34+ 造血細胞の生存能力をサポートする。h-isomおよびisomの両方において、より高い濃度でより高い防止効果が得られるという傾向が、実証される。4%の濃度は、6%、8%、10%および12%の濃度よりも、より低い有意な防止効果（60%未満）を与える。10%および12%の濃度は、10% DMSOと同様の防止効果を有する。この研究では、h-isomおよびisomの凍結防止効果の間には、有意な差異は観察されなかった。
DMSO、イソマルトオリゴ糖１または水添イソマルトオリゴ糖１とともに凍結保存した後の脂肪由来間質/幹細胞(ASC)の生存能力
Vibrasat装置(Moeller Medical GmbH & Co。KG、Fulda、Germany)を用いて腹部や太腿の内側の美容脂肪吸引によって得られた脂肪組織から、ASCを採取した。間質血管画分からのASCを、ダルベッコ変法イーグル培地、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、1% GlutaMAXおよび10%のプールされたヒト血小板溶解物からなる培養培地にエクスビボで増殖させた。10% DMSOまたは様々な濃度のイソマルトオリゴ糖１(isom)もしくは水添イソマルトオリゴ糖１(h-isom)を含有する凍結保護培地中で細胞を凍結させた。速度制御フリーザーを用いて、(Kryo 560-16、Planer； 開始温度4℃、-1℃/分で0℃まで低下、-2℃/分で-45℃まで低下、および-5℃/分で-100℃まで低下)を用いてサンプルを凍結させ、-150℃にした。37℃の水浴中でサンプルを融解させた。表現型（CD73、CD90、CD105に対して陽性ならびにCD14、CD20、CD45およびCD34に対して陰性）の特性評価のためにフローサイトメトリーを適用して、ASCの生存能力を評価した。蛍光DNA結合化合物である7-アミノアクチノマイシン D(7-AAD)を、生/死マーカーとして用いた。7AADを排除できる細胞を、生存可能であると仮定した。結果を、図１１に示す：イソマルトオリゴ糖１(薄いグレーのバー)、水添イソマルトオリゴ糖１(濃いグレーのバー)およびDMSO(黒いバー)。二回ずつ測定された、１つの実験からのデータを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。DMSOの結果は予測よりも低い。
Vibrasat装置(Moeller Medical GmbH & Co。KG、Fulda、Germany)を用いて腹部や太腿の内側の美容脂肪吸引によって得られた脂肪組織から、ASCを採取した。間質血管画分からのASCを、ダルベッコ変法イーグル培地、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、1% GlutaMAXおよび10%のプールされたヒト血小板溶解物からなる培養培地にエクスビボで増殖させた。10% DMSOまたは様々な濃度のイソマルトオリゴ糖１(isom)もしくは水添イソマルトオリゴ糖１(h-isom)を含有する凍結保護培地中で細胞を凍結させた。速度制御フリーザーを用いて、(Kryo 560-16、Planer； 開始温度4℃、-1℃/分で0℃まで低下、-2℃/分で-45℃まで低下、および-5℃/分で-100℃まで低下)を用いてサンプルを凍結させ、-150℃にした。37℃の水浴中でサンプルを融解させた。表現型（CD73、CD90、CD105に対して陽性ならびにCD14、CD20、CD45およびCD34に対して陰性）の特性評価のためにフローサイトメトリーを適用して、ASCの生存能力を評価した。蛍光DNA結合化合物である7-アミノアクチノマイシン D(7-AAD)を、生/死マーカーとして用いた。7AADを排除できる細胞を、生存可能であると仮定した。結果を、図１１に示す：イソマルトオリゴ糖１(薄いグレーのバー)、水添イソマルトオリゴ糖１(濃いグレーのバー)およびDMSO(黒いバー)。二回ずつ測定された、１つの実験からのデータを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。DMSOの結果は予測よりも低い。
抗凍結剤としてのh-isomおよびisomの両方が、10% DMSOと同程度まで、ASCの生存能力をサポートする。低濃度である4%を除いて、高濃度が、約70%を超える生存能力をもたらす。12%の濃度は、より低い濃度と比較して、有意に高い生存能力(80%〜90% )をもたらす。この研究では、h-isomおよびisomの凍結防止効果の間には、4%グループを除いて、有意な差異は観察されなかった。
マウスの卵巣を除去した後、以下の凍結保存溶液に卵巣を移すまで、10 mg/ml HSA、ペニシリン/ストレプトマイシンを補足し、37℃に維持したマッコイ培地に卵巣を移す：1)標準条件（ヒト卵巣組織の凍結保存と同様に、PBS、1.5 mol/L エチレングリコール、0.1 mol/L スクロース、10 mg/ml HSA）または2) PBS、10 % (w/v)イソマルトオリゴ糖１。
卵巣を氷上で30分間平衡化し、次いで、プログラム可能な凍結フリーザー(cryofreezer)(Planner Cryo 10 プログラム可能フリーザー、UK)に移し、次の勾配でサンプルを-140℃に冷却する（開始温度：-1℃；-9℃まで-2℃/分；5分間維持；播種；-40℃まで-0.3℃/分、-140℃まで-10℃/分；次いで、液体窒素に直接入れる)。融解：37℃の湯中、室温；イソマルトオリゴ糖１(20 % (w/v))を含む培地中で10分間 、次いで、固定培地へ直接。組織プレパラートにおいて、両方の卵巣は、発生の異なる段階にある生存卵胞を示す。
上記実施例１３に記載したとおり、ただし以下の凍結保存溶液中で、マウスの卵巣を処理する：1)標準的条件（ヒト卵巣組織の凍結保存と同様に、PBS、1.5 mol/L エチレングリコール、0.1 mol/L スクロース、10 mg/ml HSA）；または2)PBS、1,5 mol/L エチレングリコール、10 mg/ml HSA、10 % (w/v)水添イソマルトオリゴ糖１；または3)PBS、10 mg/ml HSA、10 % (w/v)水添イソマルトオリゴ糖１。組織プレパラートにおいて、すべての卵巣は、発生の異なる段階にある生存卵胞を示す。
Claims (27)
- デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤の使用であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤の使用。 - 該抗凍結剤が、300〜7,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、請求項１に記載の凍結防止剤の使用。
- 臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存するための、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる凍結防止剤の使用。
- 該抗凍結剤が、デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれ、800〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
- 該抗凍結剤が、≧1および≦5の多分散性Pdを有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
- 該誘導体が、水添イソマルトオリゴ糖、水添デキストラン、水添デキストリン、酸化イソマルトオリゴ糖、酸化デキストラン、酸化デキストリン、デキストリンのエステル、デキストランのエステル、イソマルトオリゴ糖のエステル、デキストリンのエーテル、デキストランのエーテル、イソマルトオリゴ糖のエーテル、部分水添/酸化デキストリン、部分水添/酸化デキストランおよび部分水添/酸化イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。
- 該イソマルトオリゴ糖湯が、水添イソマルトオリゴ糖、酸化イソマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖のエステル、イソマルトオリゴ糖のエーテルおよび部分水添/酸化イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる、請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
- 該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
- 該抗凍結剤が、850〜1,150 Daの重量平均分子量(Mw)を有する水添イソマルトオリゴ糖である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
- 3グルコース単位未満のイソマルトオリゴ糖の重量分率が、15% w/w未満である、請求項８〜９のいずれか１つに記載の使用。
- 9グルコース単位を超えるイソマルトオリゴ糖の重量分率が、20% w/w未満である、請求項８〜９のいずれか１つに記載の使用。
- 該イソマルトオリゴ糖およびその誘導体が、デキストランベースである、請求項１〜１１ののいずれか１つに記載の使用。
- サンプルが、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる、請求項１〜１２ののいずれか１つに記載の使用。
- 該サンプルが、移植用である、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用。
- 該凍結防止剤が、粉末の形態または溶液の形態である、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の使用。
- 該凍結防止剤が、30%〜70% w/wの該抗凍結剤を含む、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の使用。
- デキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる1種以上の抗凍結剤を含む凍結防止剤であって、
a)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含む；または
b)該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；または
c)該凍結防止剤が、該凍結防止剤中のデキストリン、デキストラン、イソマルトオリゴ糖およびその誘導体の総重量に基づいて、少なくとも1% w/w の1種以上の、300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体を含み、該抗凍結剤が、300〜9,500 Daの重量平均分子量(Mw)を有する；
凍結防止剤。 - 300〜1,650 Daの重量平均分子量(Mw)を有するイソマルトオリゴ糖およびその誘導体から選ばれる抗凍結剤を含む凍結防止剤。
- 抗凍結剤が、請求項１〜１２のいずれか１つにおいてさらに定義される、請求項１７〜１８のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
- 請求項１〜１２および１５〜１６のいずれか１つにおいてさらに定義される、請求項１７〜１８のいずれか１つに記載の凍結防止剤。
- 請求項１〜２０のいずれか１つに定義される凍結防止剤を含み、臓器、細胞および組織から選ばれる凍結保存されるべきサンプルをさらに含む、凍結保存組成物。
- サンプルが、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる、請求項２１に記載の凍結保存組成物。
- 1〜50 % w/wの量の該抗凍結剤を含む、請求項２１〜２２のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
- 5% w/w未満、4% w/w未満などの8% w/w未満などの量のDMSOをさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１つに記載の凍結保存組成物。
- 凍結保存されるべきサンプルを、請求項１〜２０のいずれか１つに定義される凍結防止剤に接触させて、凍結保存組成物を得、次いで、凍結保存組成物の温度を凍結保存温度まで低下させることを含む、臓器、細胞および組織から選ばれるサンプルを凍結保存する方法。
- 該サンプルが、哺乳類臓器、哺乳類細胞および哺乳類組織から選ばれる請求項２５に記載の方法。
- 該サンプルが、移植用である、請求項２６に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023086708A JP2023109957A (ja) | 2012-11-30 | 2023-05-26 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261731849P | 2012-11-30 | 2012-11-30 | |
| US61/731,849 | 2012-11-30 | ||
| EP12195033 | 2012-11-30 | ||
| EP12195033.1 | 2012-11-30 | ||
| US201261740211P | 2012-12-20 | 2012-12-20 | |
| EP12198598 | 2012-12-20 | ||
| US61/740,211 | 2012-12-20 | ||
| EP12198598.0 | 2012-12-20 | ||
| EP13180869 | 2013-08-19 | ||
| EP13180869.3 | 2013-08-19 | ||
| JP2018167835A JP6978644B2 (ja) | 2012-11-30 | 2018-09-07 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018167835A Division JP6978644B2 (ja) | 2012-11-30 | 2018-09-07 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023086708A Division JP2023109957A (ja) | 2012-11-30 | 2023-05-26 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021192625A true JP2021192625A (ja) | 2021-12-23 |
Family
ID=50827210
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015544485A Active JP6438887B2 (ja) | 2012-11-30 | 2013-11-29 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2018167835A Active JP6978644B2 (ja) | 2012-11-30 | 2018-09-07 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2021143853A Pending JP2021192625A (ja) | 2012-11-30 | 2021-09-03 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2023086708A Pending JP2023109957A (ja) | 2012-11-30 | 2023-05-26 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015544485A Active JP6438887B2 (ja) | 2012-11-30 | 2013-11-29 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
| JP2018167835A Active JP6978644B2 (ja) | 2012-11-30 | 2018-09-07 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023086708A Pending JP2023109957A (ja) | 2012-11-30 | 2023-05-26 | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11484025B2 (ja) |
| EP (2) | EP3925443A1 (ja) |
| JP (4) | JP6438887B2 (ja) |
| KR (1) | KR102196974B1 (ja) |
| CN (2) | CN108112575B (ja) |
| AR (1) | AR093662A1 (ja) |
| AU (1) | AU2013351058B2 (ja) |
| BR (1) | BR112015012161B1 (ja) |
| CA (1) | CA2891198A1 (ja) |
| EA (1) | EA028147B1 (ja) |
| IL (1) | IL239027B (ja) |
| MX (1) | MX370136B (ja) |
| PL (1) | PL2934109T3 (ja) |
| SG (1) | SG11201504116SA (ja) |
| WO (1) | WO2014083169A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA201503397B (ja) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007081744A2 (en) | 2006-01-06 | 2007-07-19 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for administration of iron |
| PT2411053T (pt) | 2009-03-25 | 2017-02-15 | Pharmacosmos Holding As | Composto oligossacarídico de ferro estável |
| US9458424B2 (en) * | 2013-12-19 | 2016-10-04 | FertiPro N.V. | Methods for cryopreservation of stem cells via slow-freezing |
| WO2015150394A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
| CN106999518A (zh) * | 2014-11-14 | 2017-08-01 | 日本赤十字社 | 脐带血以及末梢血的冻结保存方法以及冻结保存用溶液 |
| WO2016077735A1 (en) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Yale University | Novel methods and devices for high-throughput quantification, detection and temporal profiling of cellular secretions, and compositions identified using same |
| TWI548748B (zh) * | 2015-04-16 | 2016-09-11 | 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司 | 造血幹／先驅細胞之體外放大培養方法及其立即可使用之組成物 |
| JP6948261B2 (ja) * | 2015-07-15 | 2021-10-13 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法 |
| CN108934158B (zh) * | 2016-02-01 | 2022-11-15 | Gc细胞治疗 | 细胞冻存用培养基组合物及其应用 |
| CA3016629A1 (en) * | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Livestock Improvement Association Of Japan, Inc. | Diluent for sperm and method for preserving sperm using same |
| CN106085996A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-09 | 上海理工大学 | 复合稳定剂及添加该复合稳定剂的nmn转移酶的酶活测定方法 |
| US20190183910A1 (en) * | 2016-06-23 | 2019-06-20 | Kutluk Oktay | Enhancing dna repair and preventing aging and its consequences in reproductive and other cells |
| CN106177918A (zh) * | 2016-09-30 | 2016-12-07 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
| EP3556849A4 (en) * | 2016-12-14 | 2020-08-19 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Mammalian Cryopreservation Fluid |
| KR102635317B1 (ko) | 2017-01-26 | 2024-02-08 | 중앙대학교 산학협력단 | 네크로스타틴-1을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 |
| KR102701970B1 (ko) | 2017-01-26 | 2024-09-03 | 중앙대학교 산학협력단 | 멜라토닌을 포함하는 정원줄기세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 |
| CN106821938B (zh) * | 2017-03-21 | 2020-03-24 | 北京海康殷氏生物科技有限责任公司 | 一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法 |
| CN106908294A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-30 | 漯河医学高等专科学校 | 一种病理标本的处理方法 |
| US20220125042A1 (en) * | 2017-05-17 | 2022-04-28 | Universidade Nova De Lisboa | Cryoprotectant and/or cryopreservant composition, methods and uses thereof |
| JP2019110799A (ja) * | 2017-12-22 | 2019-07-11 | 三菱製紙株式会社 | 動物細胞のガラス化凍結保存方法 |
| CN108018210B (zh) * | 2017-12-30 | 2020-11-06 | 华中农业大学 | 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂 |
| CN108371207A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-08-07 | 浙江海洋大学 | 一种冷冻对虾前处理试剂及使用方法 |
| CN109362708A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-02-22 | 广州南医大生物工程有限公司 | 一种干细胞冷冻剂及其应用 |
| KR102150120B1 (ko) * | 2018-11-26 | 2020-09-01 | 대한민국 | 미생물 동결건조 보호용 조성물 |
| KR20210100662A (ko) * | 2018-12-05 | 2021-08-17 | 세레스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 박테리아를 안정화시키는 조성물 그리고 이의 용도 |
| US11968975B2 (en) * | 2019-04-30 | 2024-04-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Compositions and methods for storing liquid biospecimens |
| US11547656B2 (en) * | 2019-05-31 | 2023-01-10 | Luz Sarmiento Biscotti | Cryogenic natural skin care compositions and corresponding methods |
| CN110241027B (zh) * | 2019-07-17 | 2021-07-13 | 厦门昶科生物工程有限公司 | 一种球等鞭金藻的保存方法 |
| WO2021016575A1 (en) * | 2019-07-24 | 2021-01-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cryoprotectant polymers and methods of making and using thereof |
| KR102058338B1 (ko) | 2019-08-05 | 2019-12-23 | 충남대학교 산학협력단 | 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물 |
| RU2731065C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2020-08-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
| RU2744614C1 (ru) * | 2020-02-25 | 2021-03-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Способ снижения токсичности криоконсервирующего раствора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток |
| CN111345282A (zh) * | 2020-03-17 | 2020-06-30 | 广东万海细胞生物科技有限公司 | 一种细胞冻存液及冻存方法 |
| CN111280166A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-06-16 | 广州裕康生物科技有限公司 | 囊胚的玻璃化冷冻液及冷冻方法 |
| US20230389540A1 (en) * | 2020-10-29 | 2023-12-07 | Osaka University | Method for freezing cell structure |
| KR102559904B1 (ko) * | 2020-12-18 | 2023-07-25 | 대상 주식회사 | 항산화 활성을 가지는 산화당류 조성물의 제조방법 |
| AU2021415097A1 (en) | 2021-01-04 | 2023-08-17 | Sanglife Solutions Ab | Lipid layer preservation |
| CN113287599B (zh) * | 2021-04-30 | 2022-04-19 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法 |
| EP4346400A1 (en) * | 2021-06-04 | 2024-04-10 | The Secant Group, LLC | Cryopreservation compositions and methods including glycerol ester components |
| CN114540283B (zh) * | 2022-01-27 | 2023-10-20 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 用于牛体外胚胎生产的高效玻璃化冷冻方法 |
| WO2024110457A1 (en) * | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E. V. | Identification of cryoprotectants for cryopreservation of cells and cell aggregates |
| CN116650425A (zh) * | 2023-07-13 | 2023-08-29 | 晟迪生物医药(苏州)有限公司 | 糖酯化合物或其盐在冷冻保护、冷冻干燥保护中的应用 |
| CN117136833B (zh) * | 2023-08-18 | 2024-05-24 | 生态环境部华南环境科学研究所(生态环境部生态环境应急研究所) | 一种围氏马尾藻种质保存方法 |
| CN117205162B (zh) * | 2023-09-12 | 2024-06-25 | 上海腾瑞制药股份有限公司 | 一种重组人酸性成纤维细胞生长因子冻干制剂的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5982301A (ja) * | 1982-11-01 | 1984-05-12 | Taiyo Sanso Kk | 生体細胞或は組織の凍結保存方法 |
| JPS60129102A (ja) * | 1983-12-15 | 1985-07-10 | Fujirebio Inc | 凍結乾燥物の製造方法 |
| JPH0799965A (ja) * | 1993-10-07 | 1995-04-18 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
| JP2012500021A (ja) * | 2008-08-20 | 2012-01-05 | アンスロジェネシス コーポレーション | 改良型細胞組成物およびその作製方法 |
| WO2015150394A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2128527A1 (en) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Raymond P. Goodrich, Jr. | Method of freezing cells and cell-like materials |
| US5629145A (en) * | 1995-03-24 | 1997-05-13 | Organ, Inc. | Cryopreservation of cell suspensions |
| JPH09110601A (ja) * | 1996-09-05 | 1997-04-28 | Biosurface Technol Inc | 培養上皮細胞シートの凍結保存 |
| DK173138B1 (da) | 1998-11-20 | 2000-02-07 | Pharmacosmos Holding As | Fremgangsmåde til fremstilling af en jerndextranforbindelse, jerndextranforbindelse fremstillet efter fremgangsmåden, farma |
| KR100324351B1 (ko) * | 1998-11-25 | 2002-11-18 | 박관화 | 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 또는 갈락토올리고당을 유효성분으로 하는 단백질 냉동변성방지제 |
| JP2000201672A (ja) * | 1999-01-11 | 2000-07-25 | Asahi Medical Co Ltd | 有核細胞の凍結保存用組成物 |
| CA2438153C (en) * | 2001-02-14 | 2015-06-02 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom |
| EP1475434A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-11-10 | Oncoscience AG | Method for storing tumor cells |
| KR100534215B1 (ko) * | 2003-11-11 | 2005-12-08 | (주)히스토스템 | 냉동 보관된 제대혈로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법 |
| WO2005056763A2 (en) | 2003-12-04 | 2005-06-23 | University Of Utah Research Foundation | Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue |
| JP2007075540A (ja) | 2005-09-16 | 2007-03-29 | Terumo Corp | 生体組織置換性表面を持つ医療用材料 |
| CN101215338B (zh) * | 2007-01-05 | 2010-09-15 | 庄茅 | 异麦芽低聚糖铁及其制备方法 |
| CA2688504A1 (en) * | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Method of isolating stem and progenitor cells from placenta |
| WO2009157209A1 (ja) | 2008-06-27 | 2009-12-30 | 株式会社バイオベルデ | 細胞および組織の凍結保存用組成物 |
| DK2424972T3 (da) | 2009-04-30 | 2013-10-14 | Actogenix Nv | Kryobeskyttende midler til frysetørring af mælkesyrebakterier |
| JP5604072B2 (ja) | 2009-09-28 | 2014-10-08 | テルモ株式会社 | 活性エステル化多糖およびその製造方法 |
| RU2416197C1 (ru) | 2009-12-11 | 2011-04-20 | Александр Борисович Смолянинов | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови |
| CN102132697B (zh) * | 2010-01-21 | 2013-08-21 | 周海华 | 一种羊膜长期保存液及其制备方法 |
| WO2011143741A1 (en) * | 2010-05-15 | 2011-11-24 | Hopital Maisonneuve-Rosemont | Extenders for mammalian sperm processing and preservation |
| CN102337245B (zh) | 2011-08-02 | 2012-10-10 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种脐带血分离二联袋分离造血干细胞的方法 |
| GB201117469D0 (en) | 2011-10-10 | 2011-11-23 | Cell Guidance Systems Ltd | Culture media for pluripotent stem cells |
| WO2013107797A1 (en) | 2012-01-17 | 2013-07-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cryopreservation of cells, tissues and organs |
| EP2721930A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-23 | Serumwerk Bernburg AG | Solution for cryopreservation, method of manufacturing the same, and its use |
-
2013
- 2013-11-29 AU AU2013351058A patent/AU2013351058B2/en active Active
- 2013-11-29 PL PL13796107T patent/PL2934109T3/pl unknown
- 2013-11-29 CN CN201711133145.9A patent/CN108112575B/zh active Active
- 2013-11-29 US US14/647,745 patent/US11484025B2/en active Active
- 2013-11-29 BR BR112015012161A patent/BR112015012161B1/pt active IP Right Grant
- 2013-11-29 CA CA2891198A patent/CA2891198A1/en not_active Abandoned
- 2013-11-29 MX MX2015006617A patent/MX370136B/es active IP Right Grant
- 2013-11-29 AR ARP130104408A patent/AR093662A1/es unknown
- 2013-11-29 JP JP2015544485A patent/JP6438887B2/ja active Active
- 2013-11-29 EP EP21160316.2A patent/EP3925443A1/en active Pending
- 2013-11-29 CN CN201380062361.2A patent/CN104918486B/zh active Active
- 2013-11-29 KR KR1020157017571A patent/KR102196974B1/ko active IP Right Grant
- 2013-11-29 WO PCT/EP2013/075128 patent/WO2014083169A1/en active Application Filing
- 2013-11-29 EA EA201591052A patent/EA028147B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-11-29 EP EP13796107.4A patent/EP2934109B1/en active Active
- 2013-11-29 SG SG11201504116SA patent/SG11201504116SA/en unknown
-
2015
- 2015-05-15 ZA ZA2015/03397A patent/ZA201503397B/en unknown
- 2015-05-27 IL IL239027A patent/IL239027B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-09-07 JP JP2018167835A patent/JP6978644B2/ja active Active
-
2021
- 2021-09-03 JP JP2021143853A patent/JP2021192625A/ja active Pending
-
2023
- 2023-05-26 JP JP2023086708A patent/JP2023109957A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5982301A (ja) * | 1982-11-01 | 1984-05-12 | Taiyo Sanso Kk | 生体細胞或は組織の凍結保存方法 |
| JPS60129102A (ja) * | 1983-12-15 | 1985-07-10 | Fujirebio Inc | 凍結乾燥物の製造方法 |
| JPH0799965A (ja) * | 1993-10-07 | 1995-04-18 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
| JP2012500021A (ja) * | 2008-08-20 | 2012-01-05 | アンスロジェネシス コーポレーション | 改良型細胞組成物およびその作製方法 |
| WO2015150394A1 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHU GUOWEI ET AL., ADVANCED MATERIALS RESEARCH, vol. 382, JPN5016000234, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 454 - 457, ISSN: 0005108727 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6978644B2 (ja) | 凍結防止剤、凍結防止および凍結保存組成物、その使用ならびに凍結保存方法 | |
| CN109090100A (zh) | 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法与使用方法 | |
| WO2015150394A1 (en) | Cryoprotective agent, cryoprotective and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation | |
| Seo et al. | Cryopreservation of amniotic fluid-derived stem cells using natural cryoprotectants and low concentrations of dimethylsulfoxide | |
| JP7323290B2 (ja) | 凍結保存組成物およびその使用方法 | |
| Stoll et al. | Membrane stability during biopreservation of blood cells | |
| KR20190087611A (ko) | 포유동물 세포 동결 보존액 | |
| Ng et al. | Sugar-assisted cryopreservation of stem cell-laden gellan gum–collagen interpenetrating network hydrogels | |
| WO2005056763A2 (en) | Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue | |
| US20230097342A1 (en) | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation | |
| US11985968B2 (en) | Cryosolutions and uses thereof | |
| JP2019033707A (ja) | ガラス化凍結保存液およびガラス化凍結保存方法 | |
| TWI837281B (zh) | 細胞冷凍保存液及細胞的漸凍方法 | |
| ES2871373T3 (es) | Agente crioprotector, composiciones crioprotectoras y crioconservadas, usos de los mismos y métodos de crioconservación | |
| US20200396985A1 (en) | Preservation and cryopreservation media | |
| CN115590018B (zh) | 一种犬的临床用间充质干细胞冷藏保存液及其应用方法 | |
| Murray et al. | Trehalose in cryopreservation. Applications, mechanisms and intracellular delivery opportunities | |
| Wang et al. | Effects, methods and limits of the cryopreservation on mesenchymal stem cells | |
| Pilbauerova et al. | Innovative Approach in the Cryogenic Freezing Medium for Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules 2022, 12, 610 | |
| Nascimento et al. | Addition of synthetic polymer in the freezing solution of mesenchymal stem cells from equine adipose tissue as a future perspective for reducing of DMSO concentration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210929 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210929 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220823 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221121 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230526 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230602 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20230721 |