KR20150095723A

KR20150095723A - 동결 보호제, 동결 보호 및 동결 보존 조성물, 그 용도 및 동결 보존 방법

Info

Publication number: KR20150095723A
Application number: KR1020157017571A
Authority: KR
Inventors: 한스 베르그 안드레아슨; 라르스 크리스텐슨; 킴 노르필; 예프 스키테; 크리스티안 클라우슨; 뷰헌 홀스트
Original assignee: 파르마코스모스 에이/에스
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2015-08-21
Also published as: PL2934109T3; CN108112575A; SG11201504116SA; JP2016501873A; EP3925443A1; JP2019004904A; EA028147B1; WO2014083169A1; MX370136B; BR112015012161A8; KR102196974B1; BR112015012161A2; CN104918486B; ZA201503397B; EA201591052A1; EP2934109A1; JP2021192625A; AU2013351058B2; CN108112575B; JP2023109957A

Abstract

본 발명은 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상인 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제, 동결 보호 및 동결 보존 조성물, 그 용도 및 동결 보존 방법에 관한 것이다.

Description

동결 보호제, 동결 보호 및 동결 보존 조성물, 그 용도 및 동결 보존 방법{CRYOPROTECTING AGENT, CRYOPROTECTING AND CRYOPRESERVED COMPOSITIONS, USES THEREOF, AND METHODS OF CRYOPRESERVATION}

본 발명은 동결 보호제, 동결 보호 조성물, 동결 보존 조성물, 그 용도 및 동결 보존 방법에 관한 것이다.

공여원 (donor source)로부터의 세포, 조직 또는 장기와 같은 생존가능한 생물 샘플의 동결 보존은 과학 및 의학 분야에서 매우 중요하고 효용성이 크다. 동결 보존은 일반적으로 예를 들면 세포나 조직과 같은 샘플을 영하의 온도, 전형적으로는 77 K (= -196℃, 액화 질소의 비점)으로 냉각함으로써 보존하는 것이다. 이와 같은 저온에서는 세포사를 초래하는 생화학적 반응을 포함해서 세포의 어떠한 생물학적 활성도 효과적으로 중단된다. 동결 보존 기술은 식물과 동물의 세포와 조직과 같은 물을 함유한 물질 또는 수성 물질의 장기 보존에 일상적으로 사용된다. 이와 같은 물질들의 동결 시에, 얼음 결정이 형성되어 물 분자에 의해 배제된 용질과 오염 물질들의 불균일한 농도가 초래된다는 것이 알려져 있고, 이는 '동결 농축'이라 불린다. 보존될 세포와 조직을 위해, 냉각 또는 해동 과정에서 냉각으로 인한 손상을 방지하기 위해 통상 동결 보호 용액이 사용된다. 동결 보존이 유용하기 위해서는, 보존된 샘플은 수확 시에 그 완전성 (integrity)와 생존성 (viability)이 적정 수준에서 유지되어야 한다. 따라서 샘플의 보존 과정은 그 내에서 예를 들면 세포나 조직 구조를 바람직하게는 심각하게 손상시키거나 파괴해서는 안 된다.

종래의 동결 보존 기술에서는, 샘플이 수확되고, 보존 용액 내에 위치된 다음, 동결에 의해 보존된다. 샘플이 사용될 경우에는 해동되고, 예를 들면 인간 공여원으로부터 취해진 세포는 통상의 인체 온도 (즉, 약 37 ℃)가 되도록 한 다음 세포 배양 배지에 위치된다. 동결 보존 프로토콜로 인해 세포의 수확, 동결, 해동 과정에 걸쳐 세포는 다수의 스트레스와 손상을 받게 된다. 이와 같은 스트레스와 손상은 세포에 회복 불가능한 손상을 초래할 수 있다.

덱스트란은 인간, 동물 및 식물 세포에 대해 동결 보호제로서 사용되어 왔다 (Odavic, R. et al. Experientia 36, 1122 (1980), Ashwood-Smith, M.J. et al. Cryobiology 9, 441 (1972) and Echlin, P. et al. J. Microsc. (Oxford) 110, 239 (1977)). 5% 메틸 술폭시드 및 9% 덱스트란 70의 혼합물이 인간 골수 위탁 줄기 세포에 대한 최적의 동결 보호를 제공한다는 것이 밝혀졌다 (Dextran, Handbook from Amersham BioSciences, 18-1166-12, Edition AA, page 35). 덱스트란, 글리세롤 및 디메틸술폭시드 (DMSO)는 단독 또는 조합으로 인간 골수 세포의 동결 보호에 대해 연구되어 왔다 (Odavic, R. et al. Experientia 36, 1122 (1980)). 9% 덱스트란 70과 3 또는 5% DMS0와의 조합 및 5 또는 10% DMS0 단독으로 사용함으로써, 15% 글리세롤 또는 9% 덱스트란과 1% DMSO와의 조합의 경우보다 동결 손상에 대한 유의하게 개선된 보호가 얻어졌다. 덱스트란 40은 덱스트란 40 5% (w/v) 내에서 50% DMSO의 조합으로 태반/제대혈의 동결 보존에 사용되는 것에 대해 알려져 있다 (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 10119-10122, October 1995, Medical Sciences). Shu Guowei 등은 Advanced Materials Research, Trans Tech Publications Ltd., Vol. 328 (2012), pp 454-457에서, 동결 건조 중에 B.비피디움의 생존에 대한 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 이눌린 및 자일로올리고당의 효과에 대해 기재하고 있다. Kwan Hwa Park 등은 Database CA, XP 002698458에서, 동결연육에 대한 프락토올리고당, 이소말토올리고당 또는 갈락토올리고당 함유 동결 보호제에 대해 기재하고 있다. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., Vol. 30(3) (2001), pp 565-568에서는, 쇠고기 단백질에 대한 프락토올리고당, 이소말토올리고당 및 갈락토올리고당의 동결 보호제의 효과에 대해 기재하고 있다.

종래의 동결 보호제는 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤과 같은 글리콜 (적어도 두 개의 하이드록실기 함유 알콜)이다. 에틸렌 글리콜은 통상 자동차용 부동액으로 사용되고, 프로필렌 글리콜은 아이스크림에서 얼음 형성을 감소시키기 위해 사용된다. 디메틸 술폭시드 (DMSO) 역시 종래의 동결 보호제로서 간주된다. 글리세롤과 DMSO는 액화질소 (-196℃) 내에서 보존되는 정자와 배아에서 얼음 형성을 감소시키기 위해 저온 생물학자에 의해 수십년 간 사용되어 왔다. 이들 공지의 동결 보호제 중에서, DMSO가 가장 효과적인 것으로 간주되며, 자주 사용되지만, 생리적으로 독성이 있으며, 주의하지 않는다면 세포와 같이 수혈자에게 주입될 경우 또는 취급자에게 고혈압, 메스꺼움과 구토를 초래하는 것으로 알려져 있다. Cox 등 (Cell Tissue Bank (2012) 13:203-215)은 간행된 문헌의 회고 연구를 통해 디메틸 설폭시드에 의해 동결 보존된 줄기 세포의 이식과 관련된 수백 종의 부작용 (예를 들면 메스꺼움, 오한, 심부정맥, 신경 증상 및 호흡 정지)을 확인하였다. 또한, DMSO의 독성은 해동된 세포가 배양되거나 수용자 체내로 주입된 후 게놈 변이를 포함하여 세포의 생존률 및/또는 기능을 악화시키는 경향이 있다. 따라서 DMSO의 독성은 취급 중에 세포가 DMSO에 노출된 기간에도 영향을 받는다.

따라서, DMSO와 같은 동결 보호제를 대체하거나 또는 다른 동결 보호제로 대체하여 필요한 농도를 감소시키고, 바람직하게는 비독성 농도로 감소시키고, 동시에 필요한 보호 효과와 저독성을 갖는, 동결 중 생물학적 샘플 등의 샘플을 보호하기 위한 동결 보호제에 대한 요구가 존재한다.

본 발명의 구체예의 목적은 DMSO와 같은 다른 동결 보호제의 대체로서, 또는 다른 동결 보호제를 대체하여 그 농도를, 바람직하게는 비독성 농도로 감소시킬 수 있으며, 동결 보존 중에 동결 보존된 샘플의 기능성을 동일한 수준으로 보존한다는 점에서 필요로 하는 보호 효과를 갖는 동결 보호제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 동결 보호제를 취급하는 사람에 대해, 그리고 생물학적 샘플에 대해 낮은 독성을 갖는 동결 보호제를 제공하여, 샘플이 손상 없이 동결 보호제와 접촉할 수 있는 시간을 연장시키고, 샘플의 세척 필요성을 감소시키고, 바람직하게는, 필요한 경우, 샘플을 동결 보호제와 분리시키지 않고 샘플을 취해진 곳 또는 수여자에게 되돌려줄 수 있도록 하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 포유동물 장기, 포유동물 세포 및 포유동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것과 같은 장기, 세포 및 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 샘플에 대해 효과적인 동결 보호제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 장기, 세포 또는 조직과 같은 이식될 샘플에 대한 동결 보호제로서 효과적인 동결 보호제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 예를 들면 세포에 대한 동결 보호제로서 효과적이고, 상기 세포의 수용 가능한 생존 가능성을 제공하는 동결 보호제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 예를 들면 장기에 대한 동결 보호제로서 효과적이며, 상기 장기의 수용가능한 물리적 기능성을 제공하는 동결 보호제를 제공하는 것이다. 본 발명의 구체예의 다른 목적은 예를 들면 조직에 대한 동결 보호제로서 효과적이며, 상기 조직의 수용가능한 물리적 기능성을 제공하는 동결 보호제를 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자(들)은 덱스트린, 덱스트란,이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제로서 a) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내의 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖는 하나 이상의 이소말토올리고당 및 그 유도체를 적어도 1% w/w 포함하거나, 또는 b) 상기 동결 보호 물질은 예컨대 300 내지 7,500 Da인 300 내지 9,500 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는 c) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖고, 상기 동결 보호물질은 300 내지 9,500 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖는 것인 동결 보호 물질이 동결 보호 물질로서 매우 유용하다는 것을 발견하였다. 종전에 사용되었던 덱스트란 40 (40,000 Da) 및 덱스트란 70 (70,000 Da)과 같은 더 큰 분자량의 덱스트란 물질과 비교할 때, 상술한 동결보호물질을 포함하는 동결보호제는 더 작은 분자량으로 인해 더 낮은 점도를 갖고, 따라서 고농도로 미리 제조될 수 있어서 용액 내에 샘플을 부가하거나 또는 동결 보존에 적합한 농도에서 동결 보호 물질과 샘플 모두를 포함하는 조성물을 얻는 것이 가능하게 된다. 또한, 저분자량을 갖는 분자는 일반적으로 고분자량 분자보다 면역성이 적다. 덱스트란 1은 덱스트란이 투여될 때 과민성 반응의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 덱스트란 40 (40,000 Da) 및 덱스트란 70 (70,000 Da)와 같은 고분자량 덱스트란의 주사 전에 미리 주사되는 합텐의 저해제로 알려져 있다. 덱스트란 1은 또한 Richter 등에 의해 (Int. Arch. Allergy 43:252-268 (1972) and Int. Arch. Allergy 41:826-844 (1971)), 인간에 대해 매우 낮은 면역 잠재성을 갖는 것으로 연구되어 기록되어 왔다. 또한, 실시예에서는, 여기서 설명된 동결 보호 물질을 갖는 동결 보호제가 고분자량의 덱스트란에 비해 시험 세포의 생존 가능성으로 측정되는 동결 보존 후의 기능성을 더 잘 보존한다는 것을 제시한다.

따라서, 제1측면에서, 본 발명은 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제로서, a) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내의 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖는 하나 이상의 이소말토올리고당 및 그 유도체를 적어도 1% w/w 포함하거나, 또는 b) 상기 동결 보호 물질은 예컨대 300 내지 7,500 Da인 300 내지 9,500 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는 c) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖고, 상기 동결 보호물질은 300 내지 9,500 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖는 것인 동결 보호제에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예컨대 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 동결 보존하기 위한 여기에 설명된 바와 같은 동결 보호 물질의 용도에 관한 것으로서, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 설명된 동결 보호제를 포함하는 동결 보존 조성물에 관한 것으로서, 상기 동결 보존 조성물은 동결 보존될 샘플을 더 포함하고, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 설명된 동결 보호제를 포함하는 동결 보존된 조성물에 관한 것으로서, 상기 동결 보존된 조성물은 동결 보존되어 온 샘플을 포함하며, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 동결 보존하는 방법에 관한 것으로서, 샘플을 여기에 설명된 동결 보호제와 접촉시켜 동결 보존 조성물을 얻는 단계와, 이어서 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 저하시키는 단계를 포함하며, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 동결 보존 조성물을 동결 보존 온도로 가져감으로써 여기에 설명된 동결 보존 조성물을 동결 보존하는 방법에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 동결 보존하기 위해 여기에 설명된 동결 보호제의 용도에 관한 것으로서, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 설명된 동결 보호제를 이식을 위해 샘플을 동결 보존하기 위해 사용하는 것에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 여기에 설명된 동결 보존 조성물을, 상기 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 저하시킴으로써 샘플을 동결 보존하는 용도에 관한 것으로서, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발명의 상세한 설명

정의

여기에서 사용된 바와 같이, 동결 보존은 냉각 속도가 종래의 동결 보존 공정보다 더 빠른 유리화 기술을 포함하여 샘플이 영하의 온도로 냉각됨으로써 보존되는 과정을 의미한다. 그와 같은 저온에서, 예컨대 세포 사멸을 초래하는 생화학적 반응을 포함하는 생물 활성과 같은 활성이 감소되고, 예를 들면 단백질/당단백질 또는 지질 단백질과 같은 화학 구조/기능이 보존된다. 동결 보호 용액이 사용되지 않을 경우, 보존된 샘플은 냉각 또는 해동 과정 동안 동결으로 인해 손상될 가능성이 큰다.

본 발명의 바람직한 일 측면에서, 동결 보존은 샘플이 영하의 온도, 전형적으로는 77 K (= -196 ℃, 액화질소의 비점)로 냉각됨으로써 보존된다. 이들 저온에서, 세포 사멸을 초래하는 생화학 반응을 포함하는 모든 생물 활성이 효과적으로 정지된다.

여기서 사용된 바와 같이, "동결 보존 온도"는 영하 내지 -196 ℃, 예컨대 -50 ℃ 내지 -196 ℃, 예를 들면 -80 ℃ 내지 -196 ℃, 예를 들면 -55 ℃ 미만의 온도, 예를 들면-60 ℃, 예를 들면 -65 ℃ 미만, 예를 들면 -70℃, 예를 들면 -75℃, 예를 들면 -80℃, 예를 들면 -85 ℃, 예를 들면 -90℃, 예를 들면 -95℃, 예를 들면 -100 ℃, 예를 들면 -105℃, 예를 들면 -110 ℃, 예를 들면 -115℃, 예를 들면 -120℃, 예를 들면 -125℃, 예를 들면 -130℃, 예를 들면 -135℃, 예를 들면 -140 ℃, 예를 들면 -145℃, 예를 들면 -150℃, 예를 들면 -155 ℃, 예를 들면 -160℃, 예를 들면 -165℃, 예를 들면 -170 ℃, 예를 들면 -175℃, 예를 들면 -180℃, 예를 들면 -185℃, 예를 들면 -190℃의 온도를 지칭한다.

여기서 사용된 바와 같이, "샘플"이라는 용어는 장기, 세포 또는 조직과 같이 동결 보존되어야 할 모든 종류의 재료를 의미한다. 일 측면에서, 샘플은 장기, 조직 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서, 샘플은 포유동물 장기, 포유동물 세포 및 포유동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바와 같은, 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서, "샘플"이라는 용어는 생성 및 성장의 다양한 단계에서의 인체는 포함하지 않는다. 다른 측면에서, 본 발명은 여기서 설명된 바와 같은 동결 보호제를 이식용 샘플의 동결 보존에 사용하는 것과 관련된다. 일 측면에서, 샘플은 이식용 포유동물 장기, 포유동물 세포 및 포유동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

여기서, "세포"라는 용어는 체세포와 같은 모든 종류의 세포를 포함하며, 조직 또는 장기, 전분화능 줄기 세포 (totipotent stem cells), 분화 다능 줄기 세포 (pluripotent stem cells), 다분화능 줄기 세포 (multipotent stem cells) 및 전구체 세포 (progenitor cells); 난모세포; 정자; 및 생식 세포를 포함하는, 모든 종류의 줄기 세포를 포함한다.

여기서 사용되는, "세포 함유 체액"이라는 용어는 모든 종류의 세포 함유 체액, 예를 들면 하기에 정의된 혈액, 양수, 정액, 뇌척수액, 골수액 및 월경액과 같은 모든 종류의 세포 함유 체액을 포함한다.

여기서 사용되는, "혈액"이라는 용어는 제대혈, 말초 혈액 및 가동화 혈액 (mobilized blood)을 포함하는 모든 혈액 함유 체액을 포함한다.

여기서 사용된, "조직" 또는 "조직들"이라는 용어는 난소 조직, 고환 조직, 제대 조직, 태반 조직, 연결 조직, 심장 조직, 근육으로부터의 조직, 연골 및 뼈, 내분비 조직 및 중성 조직을 포함하는 모든 종류의 세포와 그 조합을 포함하는 모든 종류의 조직 형태를 포함한다. "조직" 또는 "조직들"이라는 용어는 또한 지방 조직 또는 치수 조직을 포함한다.

여기서 사용된 "장기"라는 용어는 예를 들면, 폐, 간, 신장, 심장, 난소 및 췌장을 포함한다. "장기"라는 용어는 또한 제대를 포함한다.

여기서 사용된, "샘플에 대해 동결 보존 후의 기능"이라는 용어는 동결 보존 후 장기, 조직 또는 세포와 같은 샘플이 동결 보존 후 수용가능 및/또는 바람직한 기능을 유지하는 것을 의미한다. 일 측면에서, 동결 보존 후의 샘플은 그 모든 기능을 유지한다. 다른 측면에서, 세포와 같은 샘플은 바람직한 성능의 적어도 50%를, 바람직한 성능의 적어도 60%를, 바람직한 성능의 적어도 70%를, 바람직한 성능의 적어도 80%를, 바람직한 성능의 적어도 90%를, 바람직한 성능의 적어도 95%를, 바람직한 성능의 적어도 100%를 유지한다. 조직에 대한 다른 예로서, 보존되어야 할 중요한 기능은 이식의 경우 주변 조직 (예를 들면 피부)와 융합하는 조직의 능력이다.

동결 보존 후의 세포의 생존 가능성은, 사멸 세포에 대해 세포 샘플을 DNA 바인딩 염료, 프로피듐 요오드화물을 이용하여 배양함으로써 측정하는 뉴클리오 카운터 시스템 (Nucleocounter system)을 이용하여 측정할 수 있으며, 뉴클리오 카운터 시스템은 실시예에 제시된 바와 같이 사멸 세포로부터 검출 가능한 측정만을 얻을 수 있다. 생존 가능성은 분석된 군에서 생존 세포의 비율로 주어진다. 동결 보존 후 세포 샘플의 증식 속도는 비색 분석, MTT를 이용하여 분석될 수 있다.

여기서 사용되는 "뱅킹"이라는 용어는 미래의 사용을 위해 샘플을 보존하는 것을 의미한다.

여기서 사용되는 "임상적 뱅킹 방법" (clinical banking method)의 용어는 인간과 같은 포유 동물의 임상 치료와 관련된 샘플의 보존을 의미한다.

여기서 사용되는 "골수 뱅킹 방법"이라는 용어는 골수액 및 관련된 체액 또는 골수로부터 유리된 세포와 같은 골수 샘플의 보존을 의미한다.

여기서 사용되는 "치수 조직 뱅킹 방법"이라는 용어는 치수 조직으로부터 유리된 세포와 같은 치수 조직 샘플의 보존을 의미한다.

여기서 사용되는 "지방 조직 뱅킹 방법"이란 용어는 지방 조직으로부터 유리된 세포와 같은 지방 조직 샘플의 보존을 의미한다. 이 용어의 현재와 이하의 맥락에서, "제대 뱅킹 방법"은 제대혈, 제대 관련 조직 또는 제대혈 또는 조직으로부터 유리된 세포의 보존을 의미한다.

현재와 이하의 맥락에서, "가동화 말초 혈액 뱅킹 방법"은 예를 들면 혈액 줄기 세포를 순환계로 방출하는 제제에 의해 가동화된 후 말초 혈액의 보존을 의미한다.

여기서 사용되는 "생식 뱅킹 방법"은 생식과 관련된, 예를 들면 정액, 난모 세포, 정자, 수정란과 같은 생식에 관련된 샘플의 보존을 의미한다.

원자량 단위 달톤 (기호: Da)은 원자 또는 분자 스케일의 질량을 나타내는데 사용되는 표준 단위이다 (원자량). 달톤은 중성 및 전자 바닥 상태에서 탄소-12의 비결합 중성 원자의 잔여 질량의 1/12로 정의된다.

여기서 사용되는, "무게 평균 분자량" (M_w)은 다음과 같이 정의된다:

여기서, g_i은 분자량 M_i을 갖는 분자의 비율이다. 가능값 M은 M_i로 표지된 이산값을 갖는 숫자 세트를 구성하고, p를 정의한다.

여기서 사용되는 "수평균 분자량"이란 용어는 다음과 같이 정의된다:

여기서, N_i는 분자량 M_i을 갖는 분자의 비율이고, g_i은 분자량 M_i을 갖는 분자의 비율이다. 가능값 M은 M_i로 표지된 이산값을 갖는 숫자 세트를 구성하고, p를 정의한다.

여기서 사용되는, 다분산성 (Pd)이란 용어는 M_w/M_n = Pd에 의해 계산된다.

여기서 사용되는, "덱스트란 1", "덱스트란 40" 및 "덱스트란 70"과 같이 숫자가 뒤따르는 "덱스트란" 이라는 용어는 "덱스트란 X"의 약전 약어를 지칭하는 것으로서, 덱스트란의 중량 평균 분자량이 약 X kDA임을 의미한다. 따라서 덱스트란 1은 850-1, 150 Da의 중량 평균 분자량을 갖는 덱스트란을 의미한다. 이소말토올리고당 1, 및 수소화 이소말토올리고당 1 역시 비슷하게 명명된다. 따라서 이소말토올리고당 1은 덱스트란 1에 대한 EP 및 USP 모노그래프에 따른 850-1, 150 Da의 중량 평균 분자량을 갖는 이소말토올리고당의 혼합물을 의미한다. 이소말토올리고당 1은 또한 이 출원에서 펜타이소말토스로 명명된다. 수소화 이소말토올리고당 1은 수소화 이소말토올리고당의 혼합물을 의미하며, 여기서 이소말토올리고당은 덱스트란 1에 대한 EP와 USP 모노그래프와 합치한다. 수소화 이소말토올리고당 1은 또한 이 출원에서 펜타이소말토시드로 명명된다.

여기서 사용되는, "덱스트란계 이소말토올리고당"이란 용어는 300 내지 1,650 Da, 예컨대 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖고, 저분자량 덱스트란의 가수분해 등에 의해 가수분해된 덱스트란으로부터 얻어지는 이소말고올리고당을 의미한다.

여기서 사용되는, "동결 보호 물질"이란 용어는 예를 들면 동결 손상으로부터 샘플을 보호하기 위해 사용되기에 적절한 물질을 의미한다. 알려진 동결 보호 물질의 예에는 예컨대, DMSO, 폴리올 등이 있다.

여기서 사용되는, "살균"이라는 용어는 생균, 미생물 및 증식가능한 다른 유기물이 없다는 것을 의미한다.

여기서 사용되는, "실질적으로 DMSO가 없는"이라는 용어는 0.01 % w/w 미만의 양의 DMSO를 의미한다.

여기서 사용되는 "C₁ _-10 알킬"은 직쇄 또는 분지된 C₁ _-6 알킬과 같은 직쇄 또는 분지된 C₁ _-10 알킬인 탄화 수소이다. 예를 들면, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 이소프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, 2-부틸, 1-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸 및 3-메틸-2-부틸이다.

여기서 사용되는 "카르복시 C₁ _-10 알킬"은 -C₁ _- ₁₀알킬COOH 를 의미한다. 예를 들면 카르복시메틸 (CM)(-CH₂COOH)이다.

여기서 사용되는, "DEAE"는 디에틸아미노에틸을 의미한다.

동결보호제

여기에 기재된 바와 같이, 동결 보호제는 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하고,

a) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당의 전체 중량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예를 들면 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체의 하나 이상을 적어도 1% w/w 포함하거나,

b) 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da, 예컨대 300 내지 7,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는

c) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 전체 중량에 대해 300 내지 1,650 Da, 예컨대 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 하나 이상의 이소말토올리고당을 적어도 1% w/w 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

일 측면에서, 상기 동결 보호 물질은 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

덱스트란, 덱스트린 및/또는 그 유도체의 분자량은 통상 예를 들면 폴리에테르 하이드록실화 겔의 GPC 컬럼을 이용하는 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정된다. 보정은 덱스트란에 대한 유럽 약전 7판 (European Pharmacopoeia 7th Edition)에 기재된 바에 따라, 그리고 유럽 약전 7판, 2권, 1816-1817 쪽에 기재된 반복 계산법을 이용하여 수행될 수 있다.

이소말토올리고당 및/또는 그 유도체, 예컨대 수소화 이소말토올리고당의 분자량은 통상 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정된다. 컬럼 시스템에서 정지 상은 고도 가교결합된 다공성 아가로스 비드에 공유결합된 덱스트란일 수 있고, 180-3000 Da의 분자량 범위에서 올리고당의 분해능 (resolution)을 나타내게 한다. 측정은 유럽 약전 7판, 1권, 60-61 쪽에 따라 이루어진다.

상기 동결 보호 물질이 전기적으로 중성일 때, 상기 동결 보호 물질의 중량 평균 분자량 (M_W)은 바람직하게 GPC를 이용하여 측정된다. 전하를 갖는 동결 보호 물질의 중량 평균 분자량 (M_W)을 측정할 때, 중량 평균 분자량 (M_W)은 전기적으로 중성인 출발 물질의 분자량과 하전된 동결 보호 물질의 치환도에 따라 계산된다.

하전되지 않은 출발 물질에서 각각의 글루코스 단위는 1 내지 3개의 치환기로 치환될 수 있다. 치환기로서 예를 들면 DEAE를 이용하여 당업자는 예를 들면 질소 함량을 측정하여 (예를 들면, Kjeldahl 분석을 이용) 치환도를 계산하고, 그 후 최종 산물의 분자량을 계산할 수 있다. 치환기가 산기를 함유할 경우, 치환도는 예를 들면 적정에 의해 당업자에 의해 측정될 수 있고, 그 후 최종 분자량이 계산될 수 있다.

덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당은 모두 D-글루코스 반복 단위를 포함한다. 덱스트란은 이하에서 더욱 상세하게 설명되는 주로 α-(1 → 6) 연결 D-글루코스로 이루어진 중성 분지 다당류이다. 덱스트린은 이하에서 다시 설명되는 바와 같이 α-(1 →4) 또는 α-(1→6)에 의해 연결된 D-글루코스 폴리머의 혼합물이다. 이소말토올리고당은 α-D-(1,6)-연결에 의한 글루코스 올리고머의 혼합물 (전형적으로 10 D-글루코스 단위보다 적고, 적절하게는 3-6 글루코스 단위)이고, 통상 300 내지 1,650 Da, 예컨대 500 내지 1,650 Da, 예를 들면 850 내지 1,650 Da, 또는 850 내지 1150 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일 측면에서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만이다. 일 측면에서, 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만, 예를 들면 15 % w/w 미만, 예컨대, 10 % w/w 미만이다. 다른 측면에서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만이고 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만, 예를 들면 15 % w/w 미만, 예컨대 10 % w/w 미만이다. 중량 비율은 예를 들면 여기서 제조예 1 과 2에서 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

일 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트란, 수소화 덱스트린, 산화 이소말토올리고당, 산화덱스트란, 산화 덱스트린, 덱스트린 에스테르, 덱스트란 에스테르, 이소말토올리고당 에스테르, 덱스트린 에테르, 덱스트란 에테르, 이소말토올리고당 에테르 및 부분적 수소화/산화 덱스트린, 부분적 수소화/산화 덱스트란 및 부분적 수소화/산화 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서 이소말토올리고당의 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 산화 이소말토올리고당, 이소말토올리고당의 에스테르, 이소말토올리고당의 에테르 및 부분적으로 수소화/산화된 이소말토 올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이하는 상술한 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체에 대한 각각 다른 합성 및 출발 물질의 실시예의 개략이다 (표 A).

* 일 측면에서, 합성은 예를 들면, US 6,977,249 에 기재된 바와 같이 부분적으로 산화 및 수소화된 유도체를 얻기 위한 부분적인 산화 및 수소화 방법일 수 있다.

일 측면에서, 상기 덱스트린의 에테르, 덱스트란의 에테르 및 이소말토올리고당의 에테르의 유형은 관능기 R을 갖는 에테르로 이루어지는 군으로부터 선택된다. R은 C₁ _-10알킬, 예를 들면 C₁ _-6알킬, 예컨대 메틸(-CH₃) 및 에틸 (-C₂H₅), 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬, 예를 들면 카르복시메틸 (-CH₂COOH), 하이드록시 C₁ _-10알킬, 예를 들면 2-하이드록시에틸 (-C₂H₄OH), 2-하이드록시프로필 (-CH₂CHOHCH₃), 2-하이드록시알킬 (-CH₂CHOH(CH2)_nCH₃, n 은 1-10), 3-클로로-2-하이드록시프로필 (-CH₂CHOHCH₂Cl), 2-디에틸아미노에틸 (-C₂H₄N(C₂H₅)₂), 3-아미노-2-하이드록시프로필 (-CH₂CHOHCH₂NH₂), 3-디메틸알킬암모늄-2-하이드록시프로필 (-CH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₂R, R 은 C₁ _- ₁₀알킬), 폴리에틸렌글리콜 세틸 (-CH₂CH₂O)₁₀C₁₆H₃₃), 및 폴리에틸렌글리콜 스테아릴 (-CH₂CH₂O)₁₀C₁₈H₃₇)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일 측면에서, 상기 덱스트린의 에테르, 덱스트란의 에테르 및 이소말토올리고당의 에테르는 각각 DEAE-덱스트린, DEAE-덱스트란, DEAE-이소말토올리고당이다. 일 측면에서, 상기 덱스트린의 에테르, 덱스트란의 에테르 및 이소말토올리고당의 에테르는 각각 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-덱스트린, 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-덱스트란, 카르복시 C_1-10알킬-이소말토올리고당이다. 일 측면에서, 상기 이소말토올리고당의 에테르는 카르복시 C₁ _-10알킬-이소말토올리고당이다.

일 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트란 및 수소화 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일측면에서, 이소말토올리고당의 유도체는 수소화 이소말토올리고당이다.

다른 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 산화 이소말토올리고당, 산화 덱스트란 및 산화 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서, 이소말토올리고당의 유도체는 산화 이소말토올리고당이다. 다른 측면에서 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 산화/수소화 이소말토올리고당, 산화/수소화 덱스트란 및 산화/수소화 덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서 이소말토올리고당의 유도체는 산화/수소화 이소말토올리고당이다.

다른 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 DEAE-덱스트린, DEAE-덱스트란, DEAE-이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-덱스트린, 카르복시 C₁ _-10 알킬-덱스트란, 카르복시 C₁ _-10 알킬-이소말토올리고당, 덱스트린 에스테르, 덱스트란 에스테르 및 이소말토올리고당 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 이소말토올리고당의 유도체는 DEAE-이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-이소말토올리고당 및 이소말토올리고당의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는, 수소화 덱스트린, 수소화 덱스트란, 수소화 이소말토올리고당의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면 DEAE-수소화 덱스트린, DEAE-수소화 덱스트란, DEAE-수소화 이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-수소화 덱스트린, 카르복시 C₁ _-10 알킬-수소화 덱스트란, 카르복시 C₁ _-10 알킬-수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트린의 에스테르, 수소화 덱스트란의 에스테르 및 수소화 이소말토올리고당의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

다른 측면에서 이소말토올리고당의 유도체는 수소화 이소말토올리고당의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면 DEAE-수소화 이소말토올리고당, C₁ _-10 알킬-수소화 이소말토올리고당 및 수소화 이소말토올리고당의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 다른 측면에서, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체는 산화 덱스트린, 산화 덱스트란 및 산화 이소말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면 DEAE-산화 덱스트린, DEAE-산화 덱스트란, DEAE-산화 이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-산화 덱스트린, 카르복시 C₁ _-10 알킬-산화 덱스트란, 카르복시 C₁ _-10 알킬-산화 이소말토올리고당, 산화 덱스트린의 에스테르, 산화 덱스트란의 에스테르, 산화 이소말토올리고당의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 다른 측면에서, 이소말토올리고당의 유도체는 산화 이소말토올리고당의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면 DEAE-산화 이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-산화 이소말토올리고당 및 산화 이소말토올리고당의 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

또 다른 측면에서, 동결 보호 물질은 수소화 이소말토올리고당, 산화 이소말토올리고당, DEAE-이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _-10 알킬-산화 이소말토올리고당, 이소말토올리고당의 에스테르, 이소말토올리고당의 에테르 또는 카르복시 C₁ _-10 알킬 이소말토올리고당이다.

또 다른 측면에서, 동결 보호 물질은 카르복시메틸 이소말토올리고당 또는 카르복시에틸 이소말토 올리고당이다.

일 측면에서, 동결 보호 물질은 이소말토올리고당, 예를 들면 이소말토올리고당 1이다. 다른 측면에서 동결 보호 물질은 수소화 이소말토올리고당, 예컨대 수소화 이소말토올리고당 1이다.

유도체화의 변형에 의해 다양한 치환도가 얻어질 수 있다. 적절하게, 치환도는 각 글루코스 단위에 대해 1 내지 3개의 치환기의 범위에 있다. 예를 들면 DEAE-덱스트란의 경우, 세 개의 글루코스 단위에 대해 대략 하나의 하전기 (charge group)가 바람직하다.

일 측면에서, 동결 보호제는 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상인 동결 보호 물질을 포함하고, 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 중 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 전체 중량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예를 들면 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1% w/w 포함한다.

다른 측면에서, 상기 동결 보호제는 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상인 동결 보호 물질을 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da, 예컨대 300 내지 7,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다. 일 측면에서, 상기 동결 보호 물질은 최대 9500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예컨대 9,500 Da, 예컨대 최대 9000 Da, (M_W)Da, 예컨대 최대 7000 Da, 예컨대 최대 6000 Da, 예컨대 최대 5000 Da, 예컨대 최대 4000 Da, 예컨대 최대 3000 Da, 예컨대 최대 2000 Da, 예컨대 최대 1900 Da, 예컨대 최대 1800 Da, 예컨대 최대 1700 Da, 예컨대 최대 1650 Da을 갖는다.

또 다른 측면에서, 동결 보호제는 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상인 동결 보호 물질을 포함하고, 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 중 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예컨대 850 내지 1,650 (M_W)의 분자량을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예를 들면 300 내지 7500 Da, 예컨대 500 내지 7500 (M_W)을 갖는다.

일 측면에서, 전기적으로 하전된 유도체는 하전되지 않은 출발 물질, 예를 들면 상기 덱스트란, 덱스트린 및 이소말토올리고당으로부터 만들어진 유도체의 분자량 분포에 의해 특징지워진다. 따라서, 일 측면에서 덱스트란, 덱스트린 및/또는 이소말토올리고당의 상기 유도체는 300 내지 9500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예컨대 300 내지 7500 Da, 예컨대 500 내지 7500 Da를 갖는다. 다른 측면에서, 상기 유도체는 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당의 유도체이다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 300 내지 9500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예를 들면 300 내지 7500 Da, 예를 들면, 500 내지 7500 Da를 갖는다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 1650 내지 7500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 1650 내지 7500 Da의 중량 평균 분자량을 갖고, ≥ 1 및 ≤ 5의 다분산성을 갖는다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 1650 내지 3500 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 1650 내지 3500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

일 측면에서, 덱스트란, 덱스트린 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 1650 내지 3500 Da의 중량 평균 분자량을 갖고, ≥ 1 및 ≤ 5의 다분산성을 갖는다.

일 측면에서, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다.

일 측면에서 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 ≥ 1 및 ≤ 3의 다분산성을 갖는다.

다른 측면에서, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질은 850 내지 1150 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는다.

다른 측면에서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만이다. 일 측면에서 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만, 예를 들면 15 % w/w 미만, 예를 들면 10 % w/w 미만이다. 다른 측면에서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만이고, 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만, 예를 들면 15 % w/w 미만, 예를 들면 10 % w/w 미만이다. 중량 비율은, 예를 들면, 제조예 1 및 2에서 기재된 바와 같이 측정된다.

일 측면에서, 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내의 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 전체 중량에 대해 300 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w), 예를 들면 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는 하나 이상의 이소말토올리고당 및 그 유도체를 적어도 10%, 예를 들면 20% w/w 포함한다. 다른 측면에서, 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내의 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당의 전체 중량에 대해 300 내지 1650의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는, 예를 들면 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 30 %, 예를 들면 40 %, 예를 들면 50 %, 예를 들면 60 %, 예를 들면 70 %, 예를 들면 80 %, 예를 들면 90 %, 예를 들면 95 % 포함한다.

덱스트란 및 그 유도체

덱스트란은 다양한 박테리아 균주, 주로 그램 양성, 조건 혐기성 구균, 예를 들면 "Advances in polymer science," Volume 205, Polylsaccharides II, editor D.Klemm, Springer Verlag에 기재된 바와 같이 류코노스토크 및 스트렙토코쿠스 균주로부터 만들어질 수 있다. 약학적 용도의 덱스트란은 통상 미국 및 유럽 약전에 정의된 특정 박테리아 균주, 예를 들면 Leuconostoc Mesenteroides NCTC 10817 or B512 F에 의해 제조된다. 균주 NCTC 10817 및 B512F는 1971년 이래로 National Collection Type Cultures (Central Public Health Laboratory) UK로부터 누구나 이용가능하다.

덱스트란은 발효 시 사용된 박테리아에 따라 연결 및 분지의 비율이 달라지는 주쇄를 갖는 주로 α-(1→6) 연결된 D-글루코스로 이루어진 중성 분지 다당류이다. 덱스트란 분자는 화학식 1에는 도시되지 않은 하나의 자유 말단 알데하이드기를 함유한다. 덱스트란에서 α-(1→6) 연결은 전체 글루코시드 결합의 50 내지 97%의 범위에서 변화한다. 잔여 글루코시드 결합은 분지로서 결합된 α-(1→2) , α-(1→3) 및 α-(1→4) 연결을 나타낸다. 화학식 I은 2-, 3-, 및 4- 위치에서 분지점을 갖는 α-(1→6) 연결된 글루코스 주쇄의 일부를 나타낸다. 상술한 B512F 균주를 이용하여, α-(1→6) 연결의 비율은 통상 95% 이상이다.

천연 덱스트란의 경우 매우 높은 분자량 값을 나타낸다. 10⁷ 내지 4 ×10⁸ Da의 값이 보고되었다. 따라서, 이 덱스트란을 다수의 용도에 대해 사용가능하도록 만들기 위해 천연 덱스트란을 저분자량으로 가수분해할 필요가 있다. 당업자에게 알려지고, 이용가능한 다수의 방법이 있지만, 가수 분해는 통상 염산을 이용하여 약 pH 1.5에서, 그리고 약 95℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가수 분해에 의해 저분자량의 덱스트란과 글루코스가 제조된다. 가수분해물은 알콜에 의한 침강, 여과 및 막 여과법을 포함하는 다른 다양한 크로마토그래피법과 같은 다양한 방법에 의해 통상 정제되고, 분획된다.

약학적 용도의 덱스트란은 전형적으로 예를 들면 류토노스토크 메센테로이드 NCTC 10817 (Leuconostoc Mesenteroides NCTC 10817) 또는 B512 F를 이용하여 미국 또는 유럽 약전에 정의된 특정 박테리아 균주에 의해 제조된다.

덱스트란 중에서, 특히 덱스트란 40과 덱스트란 70이 인간 약학 용도로서 사용되어 왔다. 덱스트란 500과 덱스트란 5 및 그 중간 분자량의 다른 분자량 크기들은 합성, 세포 분리를 위한 캐리어, 백신의 부형제 또는 인간 각막의 보존과 같은 다른 용도로서, 동결 보존 외의 분야에서 사용된다. 또한, 덱스트란 1은 덱스트란 1의 사전 주입은 합텐 저해를 나타내고 인간 덱스트란 항체를 차단하여 인간에게서 고분자량 덱스트란의 투여 후 종종 나타나는 것으로 알려진 잠재적인 알러지 반응을 저해하기 때문에 인간에게 있어서 특별한 용도를 갖는다. 덱스트란 1, 덱스트란 40 및 덱스트란 70은 약전 (유럽 약전 7판, 2권, 1816-1819 페이지)에 상세하게 기재되어 있다.

덱스트란은 또한 수용성 폴리머의 합성에 사용되는 뛰어난 원재료이다.

다음은 덱스트란 유도체의 예이다:

1) 알데하이드 말단기를 솔비톨로 환원하는 예를 들면, pH 8-12의 알칼리 조건 하에서 수소화붕소와 같은 환원제와 덱스트란을 반응시킴으로써 합성될 수 있는 수소화 덱스트란.

2) 당업자에게 공지된 방법에 의해 합성될 수 있는 덱스트란의 에테르. 일예로, 알칼리 용액 내에서 덱스트란과 (2-클로로에틸)디에틸암모늄 클로라이드를 반응시킴으로써 합성될 수 있는 2-(디에틸아미노)에틸 덱스트란 (DEAE 덱스트란)을 언급할 수 있다 (반응 스킴 1에 도시).

반응 스킴 1: 2-(디에틸아미노)에틸 (A) 및 2-[(2-디에틸아미노)에틸]디에틸암모늄]에틸 (B)기 함유 DEAE 덱스트란

다른 예는 반응 스킴 2에 도시한 카르복시 C₁ _-10 알킬 덱스트란, 예를 들면 카르복시메틸덱스트란 (CMD)으로서 강알칼리 조건 하에서 모노클로릭 아세트산 (MCA)과의 반응에 의해 합성될 수 있다.

반응 스킴 2

3) 덱스트란과 아세트산 무수물과의 반응에 의해 합성될 수 있는 덱스트란 아세테이트와 같은 덱스트란의 에스테르.

반응 스킴 3

4) 염기성 수용액에서 예를 들면 소듐 하이포클로라이트 (sodium hypochlorite)에 의해 합성될 수 있는 산화 덱스트란.

5) 부분적으로 산화/수소화된 덱스트란. 이 종류의 유도체의 제조 방법은 예를 들면 여기에 원용되는 US 6,977,249에 기재되어 있다. 일예로서 상기 분자량의 덱스트란을 가수분해에 의해 환원시키고, 그 관능성 알데하이드 말단기를 수소첨가에 의해 알콜기로 전환하는 방법에 의해 만들어지는 덱스트란을 언급할 수 있으며, 상기 수소첨가는 부분적인 것이어서 전체 탄소 수화물에 대해 계산했을 때 최대 15 중량%의 환원당만을 남기는 것을 특징으로 하며, 상기 덱스트란은 이어서 산화되고, 상기 수소화 및 산화가 수행되어 실질적으로 모든 알데하이드기가 알콜 및 카르복실기로 전환된 덱스트란을 얻게 되고, 상기 덱스트란 산물은 중간체 글리코실기에서 알데하이드 관능기 또는 카르복실산 관능기를 갖지 않고, 상기 수소화는 수용액 중에서 수소화붕소 나트륨에 의해 이루어지며, 상기 산화는 염기성 수용액에서 소듐 하이포클로라이트에 의해 이루어진다.

6) 또한 상기 수소화 및/또는 산화 덱스트란의 DEAE-치환, 카르복실 C₁ _-10 알킬-치환, 에스테르 및 에테르가 상술한 바와 유사하게 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.

이소말토올리고당 및 그 유도체

이소말토올리고당은 α-(1,6) 결합 주쇄를 갖는 글루코스 올리고머이다. 일 측면에서 여기서 기재된 이소말토올리고당은 덱스트란계이고, 저분자량 덱스트란의 가수분해에 의해 만들어진다. 다른 측면에서, 기재된 이소말토올리고당은 300 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예컨대 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다. 일 측면에서, 여기에 기재된 이소말토올리고당은 850 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 가수분해된 덱스트란이다.

이소말토올리고당으로부터 출발하여 그 유도체는 알데하이드 말단기를 글리시콜/솔비톨로 변화시킴으로써 제조될 수 있다. 이소말토올리고당으로부터 수소화 이소말토올리고당으로의 전환은 이소말토올리고당을 하기의 반응 스킴 4에 도시한 바와 같이 알칼리 조건 하에서 환원제, 예컨대 수소화붕소로 처리함으로써 수행될 수 있다.

반응스킴 4

덱스트란 유도체의 제조를 위한 상술한 방법에 의해, 이소말토올리고당의 유도체가 예를 들면 (2-클로로에틸)디에틸암모늄 클로라이드와의 반응에 의해 만들어져 2-(디에틸아미노덱스트란)에틸 (DEAE) 이소말토올리고당을 만들 수 있다. 다른 선택으로는 카르복시메틸 이소말토올리고당의 합성을 위해 모노클로로아세트산 (MCA)와의 반응에 의해 이소말토올리고당 유도체를 제조하는 것이다. 당업자에게는 덱스트란과 이소말토올리고당에 대해 상술한 바와 같이 각각 (2-클로로에틸)디에틸암모늄 클로라이드와 모노클로로아세트산과 반응함으로써 수소화 이소말토올리고당의 유도체를 만드는 것은 자명할 것이다.

올리고-이소말토스

출발 물질로서 덱스트란과, 중간 물질로서 덱스트란 1(이소말토올리고당)을 사용하여, 올리고-이소말토스를 합성할 수 있으며, 상기 올리고-이소말토스는 덱스트란 분자를 정의하는 분지 측쇄 α-(1→2), α-(1→3) 및 α-(1→4)를 전혀 갖지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 맥락에서 올리고이소말토스는 이소말토올리고당의 하위군 으로 간주된다. 따라서, 일 측면에서, 올리고이소말토스는 300 내지 1650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W), 예를 들면 850 내지 1650 Da, 바람직하게는 850 내지 1150 Da를 갖고, α-(1→2), α-(1→3) 및 α-(1→4)를 전혀 갖지 않는다. 명확하게, 이소말토올리고당에 대한 상술한 유도체의 합성과 동일한 방법이 올리고-이소말토스를 이용하여 수행될 수 있다.

덱스트린 및 그 유도체

덱스트린은 전분의 가수분해에 의해 제조되는 저분자량 탄수화물군이다. 덱스트린은 다양한 길이의 백본 글루코스를 갖는 분자의 혼합물로 이루어지는 덱스트란 폴리머이다. 덱스트린의 이용 전에 이들은 통상 예컨대 가수분해 또는 하나 이상의 알콜 침강법 및/또는 특정 컷-오프를 갖는 하나 이상의 막을 적용하는 막처리법을 포함하는 다양한 크로마토그래피법에 의해 정제 및 분획되어 바람직한 분자 크기와 무게 분포를 갖게 된다.

덱스트린은 화학식 II에 도시된 바와 같이 α-(1→4) 또는 α-(1→6) 글루코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코스 단위의 폴리머의 혼합물이다.

덱스트린 유도체는 덱스트란과 이소말토올리고당에 대해 설명한 바와 동일하게 당업자에게 알려진 방법에 의해 만들어질 수 있다.

동결 보존

동결 보존될 샘플의 오염을 피하기 위해, 동결 보호 물질이 살균되고, 또 동결 보존제/조성물의 다른 부가적인 성분들 역시 살균되는 것이 바람직하다.

일부 용도에서는, 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질을 부가적인 동결 보호 물질로 보충하여 그와 같은 부가적인 동결 보호 물질의 농도를 바람직하게는 비독성 농도까지 감소시키는 것이 유용할 수 있다. 이것은 특히 특정 세포 종류, 예컨대 간세포 또는 다능성 줄기 세포와 같은 세포 유형의 경우 특히 유용하다. 다른 측면에서, 동결 보호제는 따라서 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로이틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 디에틸렌글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, α-글리세롤포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 하이드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 염화 마그네슘, 마그네슘 설페이트, 말토스, 만니톨, 만노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 우레아, 페놀, 플루로닉 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 브롬화 나트륨, 염화 나트륨, 요오드화 나트륨, 질산 나트륨, 황산 나트륨, 솔비톨, 수크로스, 트레하로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 우레아, 발린 및 자일로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 동결 보호 물질을 더 포함한다. 일 측면에서, 상기 부가적인 동결 보호 물질은 DMSO이다. 감소된 양으로 DMSO를 부가하는 것의 장점은 매우 연약한 세포에 대해 부가적인 보호가 얻어질 수 있다는 점이다. 바람직한 측면에서, 동결 보호제는 DMSO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다. 따라서, 더욱 바람직한 측면에서 상기 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 또는 그 유도체는 동결 보호제 내에서 유일한 동결 보호 물질이다. DMSO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 동결 보호제는 샘플의 해동 후 세정이 필요하지 않다. 해동된 샘플은 배양액 내에 직접 현탁되어 샘플을 세정하지 않고 즉시 배양 과정을 시작하거나 또는 잠재적으로 실질적인 세포 손실을 초래할 수 있는 세정 단계 없이 환자에게 직접 사용될 수 있다. DMSO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 동결 보호제를 이용하는 다른 장점은 손상 없이 샘플이 동결 보호 물질에 더 오랜 기간 동안 노출될 수 있어서 더욱 효과적인 작업 공정이 가능하게 된다는 점이다.

다른 측면에서, 동결 보호제는 적어도 하나의 부동 단백질 및/또는 부동 당단백질을 동결 보호제의 0.01 내지 1 mg/mL의 양으로 더 포함한다. 부동 당단백질의 예는 단일하고 긴, 양친매성 알파 나선인 롱혼 스컬핀 (longhorn sculpin)으로부터의 1형 AFP 이다.

동결 보호제 또는 조성물은 샘플의 생존 가능성을 개선하기 위한 성분을 더 포함할 수 있다. 그와 같은 성분의 예로는 IAP (세포 사멸 저해제), rho-관련 단백질 키나아제 (ROCK) 신호 경로 저해제, EGF, FGF, PDGF, IGF, EPO, BDNF, TGF, TNF, VEGF와 같은 생장 인자를 언급할 수 있다. 다른 측면에서, 인간, 소, 말, 개 기원의 혈청 성분을 예로 들 수 있다. 동결 보호제 또는 조성물은 또한 생장 배지를 포함할 수 있다. 일 측면에서, β-카테닌/P300 안타고니스트 및 악티빈/TGFβ 리간드, 예를 들면 ID-8과 악티빈 및 TGFβ의 조합을 포함하는 생장 배지가 사용될 수 있다. 이 유형의 배지는 특히 다능성 줄기 세포의 배양에, 예를 들면 WO 2013/054112에 기재된 배아 줄기 세포의 배양에 특히 유용하다. 또 다른 예로는 GlutaMAX^TM 보충제, FGF, NEAA 및 BME를 갖는 DMEM/F12, KnockOut Replacement을 포함하는 표준 녹아웃 배지를 들 수 있다. 다른 예로는 mTSER^TM 시스템을 들 수 있다. 동결 보존될 샘플에 따른 생장 배지의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

여기에 개시된 동결 보호제는 동결 건조 또는 분무 건조 분말 등의 분말 형태일 수 있다.

다른 측면에서, 상기 동결 보호제는 용액 형태이다. 동결 보호제는 따라서 예를 들면 살균수와 같은 용매를 더 포함할 수 있다. 일 측면에서 동결 보호제는 상기 동결 보호 물질을 30 내지 70 % w/w, 예를 들면 40 내지 65 % w/w, 또는 50 내지 60 % w/w 포함한다.

동결 보존될 세포, 조직 또는 장기와 같은 샘플은 또한 가장 일반적으로 적어도 하나의 염기성 염 용액, 에너지원 (예를 들면, 글루코스) 및 저온에서 중성 pH를 유지할 수 있는 버퍼를 포함하는 동결에 적합한 pH 버퍼와 접촉할 수 있다. 잘 알려진 물질로는 예를 들면 둘베코 변성 이글 배지 (DMEM)을 들 수 있다. 이 물질은 또한 동결 보존 조성물 및/또는 동결 보존제의 일부로서 포함될 수 있다.

여기서 개시된 일 측면은 여기에 기재된 동결 보호제를 포함하는 동결 보존 조성물로서, 상기 동결 보존 조성물은 동결 보존될 샘플을 더 포함한다.

여기에 개시된 다른 측면은, 동결 보호제와 동결 보존된 샘플 또는 동결 보존 중인 샘플을 포함하는 동결 보존 조성물이다. 여기서 기재된 용어로서, "동결 보존된 조성물"이란 용어는 동결 보존 중이거나 또는 이미 동결 보존된 "동결 보존 조성물"을 의미한다.

여기에 개시된 다른 측면은 동결보존될 샘플에 대한 생장 배지 또는 기질을 더 포함하는 동결 보존된 조성물이다.

일 측면에서, 샘플은 예컨대 포유동물의 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 샘플은 장기, 세포, 혈액 또는 조직이다. 동결 보존될 그와 같은 세포의 예는 일차 세포, 세포주를 포함하는 인-비트로 배양된 세포, 인간 혈액 세포를 포함하는 인-비트로 소팅된 세포 (in-vitro sorted cells) 및 동물과 인간 기원의 수정란이다. 또 다른 예는 정자 세포, 배아 줄기 세포, IPS 세포, 간엽 줄기 세포, 혈액 형성 줄기 세포 (haemopoietic stem cells), 신경 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 간세포, 신경 세포, 심근 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 평활근 세포 및 혈액 세포이다. 다른 측면에서 샘플은 간엽 줄기 세포, 혈액 형성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, IPS 세포, 각질 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포, 바람직하게는 혈액 형성 줄기 세포, 예컨대 CD34 양성 혈액 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 배아 줄기 세포 및 IPS 세포이다. 다른 측면에서, 샘플은 간엽 줄기 세포와 혈액 형성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 측면에서, 세포는 동물 또는 인간 기원이다. 장기의 예는, 폐, 간, 신장, 심장, 난소 및 췌장이다. 조직의 예는 골수 조직, 피부, 난소, 고환, 혈관, 연결 조직이고, 바람직하게는 난소 조직 및 연결 조직이다. 다른 측면에서, 혈액은 제대혈 및 가동화 말초 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 제대혈이다. 다른 측면에서 샘플은 세포 함유 체액, 예컨대 혈액, 생리액 또는 양수이다.

동결 보존될 특정 샘플에 따라, 동결 보호 물질은 통상 동결 보존되는 조성물 내에 1 내지 50 % w/w, 예를 들면 2 내지 50 % w/w, 예를 들면 4 내지 45 % w/w, 또는 6 내지 20 % w/w, 또는 6 내지 12 % w/w, 바람직하게는 6 내지 10 % w/w, 또는 더욱 바람직하게는 7 내지 9 % w/w 존재한다. 일 측면에서, 동결 보호 물질은 동결 보존되는 조성물 내에 최대 60 % w/w의 양으로, 예를 들면 최대 55 % w/w의 양으로, 예를 들면 최대 50 % w/w의 양으로, 예를 들면 최대 45 % w/w의 양으로, 예를 들면 40 % w/w의 양으로, 예를 들면 최대 35 % w/w의 양으로 존재한다. 다른 측면에서, 동결 보호 물질은 통상 최소 2 % w/w의 양으로, 예를 들면 최소 4 % w/w의 양으로, 예를 들면 최소 6 % w/w의 양으로, 예컨대 최소 6 % w/w의 양으로, 예컨대 최소 7 % w/w의 양으로 존재하다.

동결 보존될 조성물이 DMSO와 같은 부가적인 동결 보호 물질을 포함할 경우, 상기 부가적인 동결 보호 물질은 통상 8 % w/w 미만의 양으로, 예를 들면 1 내지 8 % w/w의 양으로, 예를 들면 5 % w/w 미만의 양으로, 예를 들면 4 % w/w 미만의 양으로, 예를 들면 1 내지 4 % w/w의 양으로 존재한다.

종래의 동결 보존 기술에서는, 샘플은 수확되고, 보존 용액 내에 현탁되고, 그 다음 동결 보존되었다. 세포와 같은 샘플이 사용될 때, 이들은 해동되고, 예를 들면 인간 기증원으로부터의 세포는 통상의 인체 온도 (즉, 대략 37 ℃)로 되돌려두고, 세포 배양 배지에 위치시킨다.

본 발명의 동결 보존방법에서, 샘플은 동결 보존 온도로 동결되기 전에 여기서 설명한 동결 보호제와 접촉함으로써 동결 보존 중에 보호된다. 동결 보호제와 접촉시킨다는 것은 동결 보존 온도로 온도 감소 중에 샘플이 동결 보존 조성물 내에서 동결 보호 물질에 의해 보호될 수 있도록 동결 보호 물질과 접촉하게 된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 세포는, 보호될 세포들이 부착된 플레이트의 적절한 웰을 충전함으로써, 동결 보호제 용액에 세포를 현탁시킴으로써, 또는 동결 보호제를, 예를 들면, 동결 건조된 형태로, 예를 들면, 버퍼 용액 내의 세포, 혈액 또는 장기에 부가함으로써, 또는 세포를 포함하는 동결 보호제 내에서 원심 분리 후 세포 펠렛을 용액 등에 재현탁시킴으로써 동결 보호제와 접촉할 수 있다.

일 측면에서, 여기에 개시된 것은 샘플을 동결 보존하는 방법으로서, 동결 보존될 샘플을 여기에 정의된 동결 보호제와 접촉시켜 동결 보존 조성물을 얻는 단계와, 이어서 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시키는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 여기에 정의된 바와 같이, 상기 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시킴으로써 조성물을 동결 보존하는 방법이 개시된다.

세포가 열 충격에 민감할 경우, 실온에서 용액의 동결점 1-2℃ 미만의 온도로 변화하는 속도는 궁극적인 생존 가능성에 주된 영향을 미친다.

3.5℃ 내지 -5 ℃ 사이에서, 샘플은 통상 얼음 결정을 도입하거나, 또는 배지 표면을 콜드 프로브 (cold probe)로 접촉함으로써, 기계적 진동에 의해, 또는 빙핵 (ice nucleation)이 생길 때까지 온도를 급속하게 저하시킴으로써 냉각된다. 냉각은 발열 과정이기 때문에, 열은 반드시 냉각액으로부터 제거되어야 한다. 이것은 샘플을 저온점을 갖는 액체에 담가 두거나, 또는 실질적인 히트 싱크를 제공함으로써 이루어질 수 있다. 세포외 배지에서 얼음이 형성됨에 따라 점점 더 많은 유리수 (free water)가 얼음 상으로 결합된다. 소수성인 세포막이 세포내 얼음의 핵으로 작용하기 때문에 냉각되지 않은 세포는 더 많이 고장액에 노출된다. 세포외 염 농도는 물이 얼음 안으로 분리됨으로써 증가하게 된다. 세포내 및 세포외 유체 상 사이의 삼투압 불균형에 따라 세포 밖으로 물이 이송되기 때문에 냉각되지 않은 세포는 수축된다. 샘플은 각각의 세포 종류에 따라 최적화되어야 하는 유한 속도 (finite rate)로 냉각된다.

냉각의 최적 속도는 세포막의 물 침투성, 세포의 표면-부피비, 여기에 설명된 동결 보호제에서 동결보호 첨가제의 종류와 농도에 따라 정해진다. 글리세롤 또는 DMSO에서 냉각되는 대부분의 유핵 포유동물 세포의 경우, 최적 냉각 속도는 통상 분당 0.3 내지 10 ℃이다. 약 4 ℃ 내지 -80 ℃ 사이의 연속 냉각이 가장 흔하게 사용된다. 샘플이 일단 약 -80 ℃에 이르면, 저장을 위해 직접 액화 질소 (-196℃) 안으로 이동되거나 또는, 액화 질소의 수증기상 안으로 이동된다. 동결 보존을 위해 사용되는 다른 방법은, 유리화 기술로서, 1000 ℃-2000 ℃/분의 매우 빠른 냉각 속도를 얻을 수 있다. 이 기술을 이용하여, 샘플과 함께 동결 보존 조성물을 함유하는 특수화된 유리 장치가 직접 액화 질소 내에 위치된다. 일 측면에서, 동결 보존 온도에는 분당 0.05 - 15, 예를 들면, 0.1 - 10, 예컨대 0.2 - 8, 예컨대 0.3 - 6, 예컨대 0.4 - 4, 예컨대 0.5 - 2℃의 속도로 도달된다. 다른 측면에서 동결 보존 온도에는 분당 500 - 30000, 예를 들면, 800 - 2500, 예를 들면 1000 - 2000, 예를 들면 1200 - 1800 의 속도로 도달된다.

액화질소 온도에서 생존가능한 세포 보존 기간은 주로 주변 우주선으로 인한 자유 라디컬의 발생 속도에 따라 결정된다.

예를 들면, 액화 질소 내에 저장된 포유동물 배아의 반감기는 대략 30,000 년으로 추정되어 왔다. 동결된 세포가 짧은 기간이라도 그 보존 온도 이상이 되지 않도록 하는 것이 중요하다. 간헐적인 가온은 신속한 이동성 재결정화를 촉진하여 세포 구조를 손상시키고, 전체적인 생존 가능성을 감소시킬 수 있다.

또 다른 측면에서, 샘플은 동결 보존 후 해동된다. 샘플 해동의 최적 속도는 사용된 동결 조건과, 보존되는 특정 샘플에 따라 달라진다. 일반적으로 현탁액 내에서 동결된 단일 세포의 경우 및 심장 판막과 같은 조직의 경우, 신속한 속도의 가온이 바람직하다. 그와 같은 신속한 가온은 동결 샘플에서 얼음 결정의 성장을 제한하며, 종종 높은 생존율을 위해 절대적인 조건이다. 다수의 조직에 의해, 이와 같은 가온은 샘플을 37 - 42 ℃의 수조 내에서 교반함으로써 달성될 수 있다. 신속한 가온이 필요한 이유는 냉각 중에 형성되는 얼음 결정의 성장을 제한하기 때문이다.

일부 조직들은 신속한 가온에 민감할 수 있다. 이것은 얼음이 녹고, 그 삼투압 균형을 유지하기 위해 재수화됨에 따라 세포가 세포외 고장액에 노출되기 때문에, 일시적인 삼투압 충격으로 인한 것이다. 다른 더욱 민감한 샘플의 경우, 대사 과정은 해동 매체 내에서 혈장이나 다른 고분자량 폴리머를 이용한 연속적인 희석에 의해 재활성화되거나, 또는 통상의 수준으로 회복될 수 있다.

해동 절차가 완료되면, 세포는 여전히 다수 몰 농도의 동결 보호제에 노출되어 있으며, 이 동결 보호제는 세포를 등장 매체로 회복시키기 위해 점진적으로 희석되어야 한다. 포유 동물 세포의 경우, 단계적인 희석 프로토콜이 통상 사용된다. 샘플의 희석은 통상 바람직하게는 37 ℃에서 수행되어 삼투압 충격과 동결 보호 물질 독성의 효과를 모두 감소시킨다. 다른 측면에서, 상기 동결 보호 물질의 농도는 4 내지 45 % w/w, 예를 들면 4 내지 20 % w/w, 예를 들면 5 내지 15 % w/w, 또는 6 내지 12 % w/w, 또는 바람직하게는 6 내지 10 % w/w, 또는 바람직하게는 7 내지 9 % w/w 이다.

다른 측면에서, 동결 보존 조성물 내에서 샘플의 온도는 -50 ℃ 미만의 동결 보존 온도, 예를 들면 -50 내지 -196 ℃, 예를 들면 - 80 내지 -196 ℃로 저하된다.

다른 측면에서, 동결 보호제는 뱅킹 방법 (banking method)에서 사용된다. 일 측면에서 동결 보호제는 임상 뱅킹 방법에서 사용된다. 일 측면에서, 동결 보호제는 가동화된 말초 혈액 뱅킹 방법에서 사용된다.

일 측면에서, 동결 보호제는 악성 질환에서 줄기 세포 이식 또는 장기 이식과 같은 임상적 뱅킹 방법에서 사용된다. 일 측면에서, 동결 보호제는 가동화된 말초 혈액 뱅킹 방법, 골수 뱅킹 방법 또는 제대혈 뱅킹 방법에서 사용된다.

일 측면에서, 동결 보호제는 골수 뱅킹 방법 또는 제대혈 뱅킹 방법에서 사용된다. 일 측면에서 동결 보호제는 지방 조직 뱅킹 방법 또는 치수 조직 뱅킹 방법에서 사용된다. 다른 측면에서, 동결 보호제는 재생 뱅킹 방법에서 사용된다.

다음에서 추가적인 구체예가 개시된다.

1. 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상, 예를 들면 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상인 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제로서,

a) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 중 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하고, 및/또는,

b) 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

2. 예를 들면 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제로서,

a) 상기 동결 보호제는, 상기 보호제 중 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하거나, 또는,

b) 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는,

c) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 중에 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토덱스트린 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

3. 구체예 1-2 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 7,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결보호제는 상기 동결 보호제 중에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함한다.

6. 구체예 1 내지 5 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 이소말토올리고당 및 그 유도체는 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

7. 샘플을 동결 보존하기 위한 구체예 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면 포유 동물 장기, 포유 동물 세포 및 포유동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

8. 샘플을 동결 보존하기 위한 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 샘플은 이식을 위한 것이다.

9. 샘플을 동결 보존하기 위한 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 샘플은 동결 보존 후 기능성을 갖는다.

10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 샘플은 장기로서, 상기 장기는 동결 보존 후 상기 장기의 생리적 기능으로 측정되는 기능성을 갖고, 및/또는 상기 샘플은 조직이며, 상기 조직은 주변 조직과의 통합능으로 측정되는 기능성을 갖고, 및/또는 상기 샘플은 세포로서, 상기 세포는 동결 보존 후 상기 세포의 생존 가능성에 의해 측정되는 기능성을 갖는다.

11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 1,650 내지 7,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

12. 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 500 내지 3,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 1,650 내지 3,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

14. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 다분산성 Pd를 갖고, Pd 는 ≥1 및 ≤5 이다.

15. 구체예 1 내지 14 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

16. 구체예 1 내지 15 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 850 내지 1,150 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는다.

17. 구체예 1 내지 16 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 다분산성 Pd를 갖고, Pd 는 ≥1 및 ≤3 이다.

18. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을, 상기 보호제 중에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 적어도 10 % w/w 포함한다.

19. 구체예 1 내지 18 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만이다.

20. 구체예 1 내지 19 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만이다.

21. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % 미만이고, 9 글루코스 단위 이상을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만, 예를 들면 15 % w/w 미만, 예를 들면 10 % w/w 미만이다.

22. 구체예 1 내지 21 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제 중 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 이소말토올리고당 및 그 유도체의 하나 이상을 적어도 30 % w/w, 적어도 40 % w/w, 적어도 50 % w/w, 적어도 60 % w/w, 적어도 70 % w/w, 적어도 80 % w/w, 적어도 90 % w/w, 적어도 95 % w/w 포함한다.

23. 구체예 1 내지 22 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 이소말토올리고당, 예를 들면 850 내지 1,150 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당이다.

24. 구체예 1 내지 23 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 이소말토올리고당 및 그 유도체는 덱스트란계이다.

25. 구체예 1 내지 24 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 유도체는, 수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트란, 수소화 덱스트린, 산화 이소말토올리고당, 산화 덱스트란, 산화 덱스트린, 덱스트린 에스테르, 덱스트란 에스테르, 이소말토올리고당 에스테르, 덱스트린 에테르, 덱스트란 에테르, 이소말토올리고당 에테르, 부분적 수소화/산화 덱스트린, 부분적 수소화/산화 덱스트란 및 부분적 수소화/산화 이소말토올리고당, 예를 들면, 수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트란, 수소화 덱스트린, 산화 이소말토올리고당, 산화 덱스트란, 산화 덱스트린, DEAE-덱스트린, DEAE-덱스트란, DEAE-이소말토올리고당, 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-덱스트린, 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-덱스트란, 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-이소말토올리고당, 덱스트린 에스테르, 덱스트란 에스테르 및 이소말토올리고당의 에스테르 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당의 유도체이다.

26. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 의한 보호제로서,상기 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 산화 이소말토올리고당, DEAE-이소말토올리고당, 카르복시 C_1-10알킬-산화 이소말토올리고당 또는 카르복시 C₁ _- ₁₀알킬-이소말토올리고당이다.

27. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 예를 들면 850 내지 1,150 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 수소화 이소말토올리고당이다.

28. 구체예 25 내지 27 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 카르복시 C_1-10알킬-이소말토올리고당은 카르복시메틸 이소말토올리고당 또는 카르복시에틸 이소말토올리고당이다.

29. 구체예 1 내지 28 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로이틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, α-글리세롤포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 하이드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 말토스, 만니톨, 만노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 우레아, 페놀, 플루로닉 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 브롬화 나트륨, 염화 나트륨, 요오드화 나트륨, 질산 나트륨, 황산 나트륨, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 우레아, 발린 및 자일로센으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 동결 보호 물질을 포함한다.

30. 구체예 1 내지 29 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 부가적인 보호제는 DMSO이다.

31. 구체예 1 내지 30 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 실질적으로 DMSO를 포함하지 않는다.

32. 구체예 31에 의한 보호제로서, DMSO를 포함하지 않는다.

33. 구체예 1 내지 32 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 유일한 동결 보호 물질로서 구체예 1에 정의된 동결 보호 물질을 포함한다.

34. 구체예 1 내지 33 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제는 분말 형태이다.

35. 구체예 1 내지 34 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제는 동결 건조 또는 분무 건조 분말 형태이다.

36. 구체예 1 내지 35 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제는 용액 형태이다.

37. 구체예 1 내지 36 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제는 상기 동결 보호 물질을 30 내지 70 % w/w, 예를 들면 40 내지 65 % w/w, 또는 50 내지 60 % w/w 포함한다.

38. 구체예 1 내지 37 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 보호제는 상기 부가적인 동결 보호 물질을 30 내지 70 % w/w, 예를 들면 40 내지 65 % w/w, 또는 50 내지 60 % w/w의 상기 부가적인 동결 보호 물질을 포함한다.

39. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 동결 보존될 샘플을 위한 생장 배지 또는 기질을 포함한다.

40. 구체예 1 내지 39 중 어느 하나에 의한 보호제로서, IAP (세포 사멸 저해제), rho-관련 단백질 키나제 (ROCK) 신호 경로 저해제 및/또는 EGF, FGF, PDGF, IGF, EPO, BDNF, TGF, TNF 및/또는 VEGF와 같은 생장 인자에 속하는 단백질을 더 포함한다.

41. 구체예 1 내지 40 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 인간, 소, 말 또는 개 기원의 혈청 성분을 더 포함한다.

42. 구체예 1 내지 41 중 어느 하나에 의한 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 살균된 것이다.

43. 구체예 1 내지 42 중 어느 하나에서 정의된 동결 보호제를 포함하는 동결 보존 조성물로서, 동결 보존될 샘플을 더 포함한다.

44. 구체예 43에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 장기, 유리 세포 또는 예를 들면 혈액과 같은 체액 함유 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

45. 구체예 44에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 포유동물 장기, 포유동물 세포 및 포유 동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 예를 들면, 이식용 포유동물 장기, 포유동물 세포 및 포유동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

46. 구체예 43 내지 45 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은, 체세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포로서, 모든 종류의 조직 유래 세포, 예컨대 간엽성 조직 세포, 조직 특정 전구체 세포, 케라틴 생성 세포 ( keratinocytes), 섬유아세포, 연골세포, 골 세포 또는 심근세포, 혈액 유래 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포, 대식세포, 플레이트 (plates), 적혈구를 포함하고, 또는 모든 종류의 분화 다능 줄기 세포, 전분화능 줄기 세포 및 단분화능 세포 및 배엽 세포를 포함하는 줄기 세포를 포함한다.

47. 구체예 43 내지 46 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 케라틴 생성 세포, 섬유아세포, 간엽 줄기 세포, 대식 세포 및 조혈 줄기 세포, 예컨대 CD34 양성 혈액 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

48. 구체예 43 내지 45 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 난소 조직, 고환 조직, 제대 조직, 태반 조직, 연결 조직, 심장 조직, 근육으로부터의 조직, 뼈 및 연결 조직, 내분비 조직 및 중성 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

49. 구체예 43 내지 45 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물에 있어서, 상기 샘플은 제대혈, 말초혈액 및 가동화된 말초 혈액 등의 혈액, 양수, 정액, 뇌척수액, 월경액 및 골수액으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

50. 구체예 43 내지 45 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 폐, 심장, 신장, 간, 제대 및 난소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

51. 구체예 43 내지 45 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 동결 보호 물질을 1 내지 50 % w/w의 양, 예컨대 2 내지 50 % w/w, 또는 4 내지 45 % w/w, 또는 6 내지 12 % w/w, 또는 바람직하게는 6 내지 10 % w/w, 더욱 바람직하게는 7 내지 9 % w/w의 양으로 포함한다.

52. 구체예 43 내지 51 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 조성물은 8 % w/w 미만, 예컨대 1 내지 8 % 의 양의 DMSO를 포함한다.

53. 구체예 43 내지 52 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 샘플은 동결 보존 후에 기능성을 갖는다.

54. 구체예 43 내지 53 중 어느 하나에 의한 동결 보존 조성물로서, 상기 조성물은 8 % w/w 미만, 예컨대 4 % w/w 미만, 예를 들면, 1 내지 8 % 의 양의 DMSO를 포함한다.

55. 샘플을 동결 보존하는 방법으로서, 샘플을 구체예 1 내지 42 중 어느 하나에서 정의한 동결 보호제와 접촉시켜 동결 보존 조성물을 얻고, 이어서 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시키는 것을 포함한다.

56. 구체예 55에 의한 방법으로서, 상기 동결 보존 조성물은 구체예 43 내지 54에서 정의한 것이다.

57. 상기 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시켜 구체예 43 내지 56 중 어느 하나에 정의된 조성물을 동결 보존하는 방법.

58. 구체예 55 내지 57 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 상기 동결 보존 온도는 분당 0.05-15, 예컨대 0.1-10, 예컨대 0.2-8, 예컨대 0.3-6, 예컨대 0.4-4, 예컨대 0.5-2의 속도로 도달한다.

59. 구체예 55 내지 58 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 상기 동결 보호 물질의 농도는 4 내지 20 w/w %, 예컨대 5 내지 15 % w/w, 또는 6 내지 12 % w/w, 또는 바람직하게는 6 내지 10 % w/w, 또는 더욱 바람직하게는 7 내지 9 % w/w이다.

60. 구체예 55 내지 59 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 동결 보존 조성물에서 상기 샘플의 온도는 -50 ℃ 미만의 온도, 예컨대 -50 ℃ 내지 -196 ℃, 예를 들면 -80 ℃ 내지 -196 ℃의 온도로 감소된다.

61. 구체예 55 내지 60 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 상기 샘플은 동결 보존 후 해동된다.

62. 구체예 55 내지 61 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 상기 샘플은 동결 보존 후 기능성을 갖는다.

63. 구체예 55 내지 62 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 동결 보존될 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

64. 구체예 55 내지 63 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 임상적 뱅킹 방법에서의 방법이다.

65. 구체예 55 내지 64 중 어느 하나에 의한 방법으로서, 가동화된 말초 혈액의 뱅킹 방법, 골수 뱅킹 방법, 지방 조직 뱅킹 방법, 치수 조직 뱅킹 방법, 재생 뱅킹 방법 또는 제대혈 뱅킹 방법에서의 방법이다.

66. 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질, 예를 들면 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제의 샘플의 동결 보존용 용도로서, a) 상기 동결 보호 물질은 상기 보호제 내의 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖는 하나 이상의 이소말토올리고당 및 그 유도체를 적어도 1% w/w 포함하거나, 또는 b) 상기 동결 보호 물질은 예컨대 300 내지 9,500 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는 c) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균 분자량 (M_W)을 갖고, 상기 동결 보호물질은 300 내지 9,500 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖고, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

67. 구체예 66에 의한 동결 보호제의 용도로서, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 7,500 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖는다.

68. 300 내지 1,650 Da의 중량평균분자량 (M_W), 예컨대 850 내지 1,650 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호제의 샘플의 동결 보존용 용도로서, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

69. 구체예 1 내지 42 중 어느 하나에서 정의된 동결 보호제의, 예컨대 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플의 동결 보존용 용도.

70. 구체예 66 내지 69 중 어느 하나에 의한 용도로서, 동결 보존될 상기 샘플을 상기 동결 보호제와 접촉시켜 동결 보존 조성물을 얻고, 이어서 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시킨다.

71. 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 감소시킴으로써 이루어지는 구체예 43 내지 54 중 어느 하나에서 정의된 동결 보존 조성물의 샘플의 동결 보존을 위한 용도.

72. 구체예 66 내지 71 중 어느 하나에 의한 용도로서, 상기 동결 보존 온도는 분당 0.05-15, 예컨대 0.1-10, 예컨대 0.2-8, 예컨대 0.3-6, 예컨대 0.5-2의 속도로 감소된다.

73. 구체예 66 내지 72 중 어느 하나에 의한 용도로서, 상기 동결 보호 물질의 농도는 4 내지 20 % w/w, 예를 들면 5 내지 15 % w/w, 또는 6 내지 12 % w/w, 또는 바람직하게는 6 내지 10 % w/w, 또는 더욱 바람직하게는 7 내지 9 % w/w이다.

74. 구체예 66 내지 73 중 어느 하나에 의한 용도로서, 동결 보존 조성물에서 상기 샘플의 온도는 -50 ℃ 미만의 온도로, 예컨대 -50 내지 -196 ℃, 예를 들면 -80 내지 -196 ℃의 온도로 감소된다.

75. 구체예 66 내지 72 중 어느 하나에 의한 용도로서, 상기 샘플은 동결 보존 후 해동된다.

76. 구체예 66 내지 75 중 어느 하나에 의한 용도로서, 상기 샘플은 동결 보존 후 기능성을 갖는다.

77. 구체예 66 내지 76 중 어느 하나에 의한 용도로서, 동결 보존될 샘플은 이식용 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.

78. 구체예 66 내지 77 중 어느 하나에 의한 용도로서, 가동화 말초 혈액 뱅킹 방법, 골수 뱅킹 방법, 지방 조직 뱅킹 방법, 치수 조직 뱅킹 방법, 재생 뱅킹 방법 또는 제대 뱅킹 방법과 같은 뱅킹 방법에서 사용되는 것이다.

79. 구체예 66 내지 78 중 어느 하나에 의한 용도로서, 임상적 뱅킹 방법에서 사용되는 것이다.

이상에서 언급된 모든 문헌은 참고로서 원용된다. 상술한 본 발명의 조성물, 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범위와 정신으로부터 벗어나지 않고 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 구체적인 바람직한 구체예와 관련지어 설명되지만 본 발명의 범위는 그와 같은 구체적인 구체예로 부당하게 한정되어서는 안된다.

도 1은 각각 1) 10% DMSO, 2) 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM) 및 2% DMSO, 3) 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM) 및 4) 실시예 2에 기재한 DMEM에서의 해동 후 NHDF의 생존 및 1 계대 후 생존 가능성을 나타낸다.
도 2는 각각 1) 10% DMSO, 2) 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 2% DMSO, 3) 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 4) 실시예 2에 기재한 DMEM에서의 해동 후 NHDF의 생존 및 1 계대 후 생존 가능성을 나타낸다.
도 3은 각각 1) 10% DMSO, 2) 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM) 및 2% DMSO, 3) 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM) 및 4) 실시예 3에 기재한 DMEM에서의 해동 후 NHEK의 생존 및 1 계대 후 생존 가능성을 나타낸다.
도 4는 각각 1) 10% DMSO, 2) 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 2% DMSO, 3) 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 4) 실시예 3에 기재한 DMEM에서의 해동 후 NHEK의 생존을 나타낸다.
도 5는 각각 1) 10% DMSO, 2) 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM) 및 2% DMSO, 3) 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 4) 실시예 4에 기재한 DMEM에서의 해동 후 MSC의 생존 및 1 계대 후의 생존 가능성을 나타낸다.
도 6은 각각 생장 배지 + 10% DMSO, 생장 배지 + 5% DMSO, 생장 배지 + 10% DMSO + 2% 이소말토올리고당 1 (ISOM), 생장 배지 + 10% DMSO + 4% 이소말토올리고당 1(ISOM), 생장 배지 + 10% DMSO + 8% 이소말토올리고당 1(ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 2% 이소말토올리고당 1 (ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 4% 이소말토올리고당 1 (ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM), 생장 배지 + 2% 이소말토올리고당 1(ISOM), 생장 배지 + 4% 이소말토올리고당 1(ISOM), 생장 배지 + 8% 이소말토올리고당 1 (ISOM), 및 실시예 7에 설명한 어떤 동결 보호 물질도 없는 생장 배지 내에서의 해동 및 동결 보존 후의 PluriPro 생장 배지에서의 인간 iPs 세포의 생존을 나타낸다.
도 7은 각각, 생장 배지 + 10% DMSO, 생장 배지 + 5% DMSO, 생장 배지 + 10% DMSO + 2% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 10% DMSO + 4% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 10% DMSO + 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 2% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 4% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 5% DMSO + 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 2% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 4% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM), 생장 배지 + 8% 수소화 이소말토올리고당 1 (H-ISOM) 및 생장 배지 실시예 8에 기재된 어떠한 동결 보호 물질도 없는 생장 배지 내에서, 해동 및 동결 보존 후의 PluriPro 생장 배지에서 인간 iPs 세포의 생존을 나타낸다.
도 8은 각각, 1) 10% DMSO, 2) 각각 5% DMSO와 조합된 8% 이소말토올리고당 1, 덱스트란 Mw10.000 또는 덱스트란 Mw 40.000으로 지정된 "CRYO", 3) 각각 1% DMSO와 조합된 8% 이소말토올리고당 1, Dextran Mw 10.000 또는 Dextran Mw 40.000으로 지정된 "CRYO", 4) 각각 8% 이소말토올리고당 1, Dextran Mw 10.000 또는 Dextran Mw 40.000으로 지정된 "CRYO" 및 5) 실시예 9에 기재된 DMEM에서 MSC의 해동 후의 생존 및 3일 후의 증식율을 나타낸다.
도 9는 각각, 1) 10% DMSO, 2) 2% DMSO, 3) 8% 이소말토올리고당 Mw 1500 (ISOM) 및 2% DMSO, 4) 8% 이소말토올리고당 Mw 1500 (ISOM), 및 5) 도 10에 기재된 DMEM내에서의 해동 후 MSC의 생존을 나타낸다.
도 10은, DMSO, 이소말토올리고당 1 또는 실시예 11에 기재된 수소화 이소말토올리고당에 의한 동결 보존 후 CD34+ 조혈모세포의 생존 가능성을 나타낸다.
도 11은 DMSO, 이소말토올리고당 1, 또는 도 12에 설명된 수소화 이소말토올리고당에 의한 동결 보존 후 지방 조직 유래의 기질/줄기 세포 (ASC)의 생존 가능성을 나타낸다.

제조예 1

이소말토올리고당 1의 제조

저분자량 덱스트란의 가수 분해

컷-오프 값 < 5,000 달톤을 갖는 멤브레인으로부터의 투과물로서 수집된 3345 kg의 가수분해된 덱스트란이 95 ℃, pH 1.5 에서 가수분해된다.

가수분해는 겔투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여 크로마토그래피적으로 모니터링되고, 가수분해될 재료의 분자량이 바람직한 값, 즉, 중량 평균 분자량 850-1,150 Da에 도달한 것으로 추정될 때 냉각에 의해 종료된다.

가수분해에 의해 저분자량 이소말토올리고당이 생성되지만, 또한 글루코스 역시 형성된다. 냉각과 중성화 후, 글루코스와 극저분자량 올리고머의 양은 컷-오프 값 340-800 Da을 갖는 멤브레인 공정에 의해 감소된다. 이 과정 후, 이소말토올리고당의 함량은 광학 회전 (a_D)에 의해 915 kg으로 결정되었고, 환원당의 양은 Somogy 시약을 사용하여 22.5%로 측정되었다.

상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 이소말토올리고당은 1020 Da의 Mw를 갖고, Mn은 827 Da에 해당하여 Pd = 1.23의 다분산성을 얻는다. 환원당은 22.5 %로 측정되었다. 이 이소말토올리고당은 이 출원에서 펜타이소말토스로 명명한다.

제조예 2

수소화 이소말토올리고당 1의 제조

가수분해 후, 분획 418 kg의 이소말토올리고당이 남았다. 환원당은 30.8%로 측정되었다. 이 양을 10 kg 수소화 붕소 나트튬으로 처리하여 최종 이온 교환 전에 2 kg의 수소화 이소말토올리고당을 얻었다. 이후에, 용액을 pH < 7.0으로 중화하고, 이어서 탈이온화하고 최종적으로 분무 건조하였다. 최종 산물의 환원당은 0.09%로 측정되었다.

상기 표2로부터 알 수 있는 바와 같이 수소화 이소말토올리고당은 968 Da의 Mw 를 갖고, Mn은 780 Da에 해당하여 다분산도 Pd = 1.24를 나타낸다. 이 수소화 이소말토올리고당은 이 출원에서 펜타이소말토시드로 명명한다.

실시예 1

동결 보호제의 제조

다음의 실시예에서 사용된 동결 보호제는 동결 보호 물질 (예를 들면, DMSO), 제조예 1 에서 설명된 바와 같이 제조된 펜타이소말토스 (이소말토올리고당 1) 또는 제조예 2에서 설명된 바와 같이 제조된 펜타이소말토시드 (수소화 이소말토올리고당 1)을 무균 상태에서 생장 배지 (DMEM/F12 +10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신) 내에 원하는 최종 농도 (예를 들면, 8% 이소말토올리고당 1 동결 보존 조성물에 대해, 8g 내지 100g)에 용해시켜 제조하고, 개별 동결 보존 조성물을 여과 소독한다.

실시예 2

통상의 인간 피부 섬유아 세포 ( NHDF )의 동결 보존

NHDF (계대 2)를 표준 조건 (37 ℃, 5% CO₂ 및 표준 생장 배지 [DMEM/F12 +10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신]) 하에서 종래의 T-플라스크에서 배양하였다. 컨플루언스 (70-80%)에 도달하면, 세포 집단을 플라스크에서 분리하여 원심분리하였다 (1000 rpm, 10 분). 0.5×10⁶ 세포를 6개의 서로 다른 동결 보존제 (1 ml)내에 재현탁시켰다; 1) 생장 배지 + 10% DMSO, 2) 생장 배지 + 2% DMSO + 8% 이소말토올리고당 1, 3) 생장배지 + 2% DMSO + 8% 수소화 이소말토올리고당 1, 4) 생장 배지 +8% 이소말토올리고당 1, 5) 생장 배지 + 8% 수소화 이소말토올리고당 1 및 6) 첨가제 없는 생장 배지 (FBS 없는 DMEM/F12). 세포들을 이소프로판올계 방법을 사용하여 액화 N₂ 온도로 1 ℃/분의 일정한 속도로 냉각하여 표준 제어된 동결 보존 조건 하에 동결 보존하였다. 일주일 후, 세포들을 표준 해동 프로토콜 (37 ℃에서 바이알을 직접 수조에 침지하고 세포액을 한방울씩 신선한 37 ℃ 생장 배지로 이동). 다음의 분석이 해동 후에 이루어졌다; 1) 뉴클레오카운터 장치 (NC200)을 이용한 생존가능성 및 2) 뉴클레오카운터 장치 (NC200)을 이용한 1 계대에서의 생존 가능성. 결과는 도 1과 도 2에 도시되고, 표 3-5에 요약된다.

해동 후의 생존 가능성은 유일한 동결 보존제로서 이소말토올리고당 1을 사용한 경우, 10% DMSO를 이용한 표준 조건에 비교할 때 약간 감소하였다. 2% DMSO를 이소말토올리고당과 함께 사용한 경우에는, 생존 가능성에 차이가 관측되지 않았다. 계대 1에서 이소말토올리고당만을 이용하여 동결 보존된 세포의 생존가능성은 10 % DMSO를 이용한 표준 조건과 유사하였다. 이 실험은 유일한 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 1을 이용하여 동결보존된 조성물 내에서 동결 보존된 NHDF로부터 표준 동결 보존 조건으로부터의 배양물과 동일한 정도로 사용될 수 있는 배양물을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3

통상의 인간 케라틴세포 ( NHEK )의 동결 보존:

NHEK는 실시예 2에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 이용하여 동결 보존되었다. 동일한 실험군이 포함되었다. 결과는 도 3-4에 도시되고, 표 3-5에 요약된다.

NHDF에 대해 제시된 바와 같이, 이 결과는 NHEK는 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 1을 이용한 동결 보존 용액에서 동결 보존될 수 있다는 점을 명확하게 보여준다. 배양물의 1계대에서의 생존 가능성은 10 % DMSO를 이용한 표준 조건 하에서 동결 보존된 NHEK에서와 동일한 수준이다.

실시예 4

통상의 인간 간엽 줄기 세포 ( hMSC )의 동결 보존

hMSC는 실시예 2에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 이용하며, 생장 배지 + 8% 이소말토올리고당 1 + 2% 트리할로즈 및 생장 배지 + 2% 트리할로스가 포함된 두 가지 실험군이 더 포함된다. 생존가능성 분석은 상술한 바와 같이 뉴클레오카운터 기술을 이용하여 수행되었다. 결과는 도 5에 제시되고, 표 3-5 에 요약된다.

이 결과는 hMSC가 유일한 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 Da를 이용하여 동결 보존 용액 내에 동결 보존될 수 있다는 점을 명확하게 보여준다. 해동 후의 생존 가능성은 10 % DMSO 함유 표준 제제에서와 동일한 수준을 나타내었다.

실시예 5

이소말토올리고당 1에 대한 hMSC 의 노출

hMSC를 종래의 T-플라스크에서 컨플루언스까지 생장시켰다. 세포를 분비하고 두 개의 서로 다른 제제 1) 생장 배지 + 10 % DMSO 및 2) 8% 이소말토올리고당 1에 재현탁시켰다. 각 제제에서 세포의 최종 농도는 1×10⁶ /ml 세포였다. 실시예 2에 기재한 것과 동일한 기본 프로토콜이 이용되었다. 각 바이알로부터의 1ml를 동결 바이알에 가하고 서로 다른 세 가지 시점에서 뉴클레오카운터를 이용하여 생존가능성을 분석하였다: 1) 0 분 (T0), 2) 10 분 (T10) 및 30분 (T30). 결과는 표 6에 요약된다.

이 결과는 표준 동결 보존 조건에 대한 노출은 hMSC의 생존 가능성에 심각한 영향을 미친다는 점을 명확하게 보여준다. 유일한 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 1을 이용한 동결 제제에 대한 노출은 60 분 노출 후의 생존 가능성에만 유의하게 영향을 미쳤다. 이것은 이소말토올리고당 1을 함유하는 동결 보존 조성물에서 동결 보존용 세포 배양물을 취급할 수 있으며, 따라서 더욱 유연한 작업 절차를 가능하게 한다는 점을 나타낸다.

실시예 6

hMSC 의 동결 보존을 위한 이소말토올리고당 560 Da

hMSC는 실시예 2에 기재된 바와 동일한 기본 프로토콜을 이용하여 동결 보존되고, 동일한 실험군이 포함되었다. 그 결과는 이소말토올리고당 560 Da에서 hMSC를 동결 보존할 수 있지만, 수소화 이소말토올리고당 560 Da는 이 실험에서 이소말토올리고당 560 Da만큼 효과적이지 않다는 것을 보여준다. 결과는 표 7에 요약된다.

실시예 7

PluriPro 생장 배지 내에서의 인간 iPS 세포

이 실시예에서 사용되는 이소말토올리고당은 제조예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells, iPSC) (계대 12)가 표준 조건 (37 ℃, 5% CO 및 PluriPro 생장 배지, 세포 유도 시스템)하에서 단일 세포로서 종래의 T-플라스크에서 배양되었다. 컨플루언스 (70-80%)에 도달했을 때, 세포 집단은 플라스크에서 분리되어 원심분리되었다 (1000 rpm, 10분). 0.5×10⁶ 세포가 12개의 서로 다른 동결 보존 용액 (1 ml) 내에 재현탁되었다; 생장 배지 + 10% DMSO, 생장 배지 + 5% DMSO + 2% 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 10 % DMSO + 4 % 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 10 % DMSO + 8% 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 5% DMSO + 2% 이소말토올리고당 1, 생장배지 + 5% DMSO + 4% 이소말토올리고당, 생장 배지 + 5% DMSO + 8 % 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 2% 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 4% 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 8 % 이소말토올리고당 1, 및 동결 보호제를 포함하지 않는 생장 배지. 세포는 표준 제어된 동결 보존 조건 (이소프로판올계 방법을 이용) 하에서 액화 질소 온도로 동결 보존된다. 일주일 후, 세포는 표준 해동 프로토콜 (37 ℃에서 바이알을 직접 수조에 침지하고 세포액을 한방울씩 신선한 37 ℃ 생장 배지로 이동)을 이용하여 해동되어다. 첫번째 파종 하에서 ROCK 저해제가 부가되었다. 해동 후에 뉴클레오카운터 기술을 이용하여 생존 가능성이 분석되었다. 그 결과는 도 6에 도시된다.

이 결과는 비록 DMSO 가 부가된 경우보다 동결 보존된 세포의 생존 가능성이 유의하게 저하되었지만, 인간 iPS 세포가 유일한 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 1을 이용하여 동결 보존될 수 있음을 나타낸다.

실시예 8

PluriPro 생장 배지 내의 인간 iPS 세포

이 실시예에서 사용되는 수소화 이소말토올리고당 1은 제조예 2에서 설명된 바와 같이 제조된다. 인간 유도 만능 줄기 세포, iPSC (계대 12)를 표준 조건 (37 ℃, 5% CO₂ 및 PluriPro 생장 배지, 세포 유도 시스템) 하에서 단일 세포로서 종래의 T-플라스크에서 배양하였다. 컨플루언스 (70-80%)에 도달했을 때, 세포 집단을 플라스크로부터 분리하고 원심 분리하였다 (1000 rpm, 10 분). 0.5×10⁶ 세포를 12개의 서로 다른 동결 보존 용액 (1 ml)에 재현탁시킨다; 생장 배지 + 10% DMSO, 생장 배지 + 5% DMSO, 생장 배지 + 10% DMSO + 2% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 10% DMSO + 4% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 10% DMSO +8% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 5% DMSO + 2% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 5% DMSO + 4% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 5% DMSO + 8% 수소화 이소말토올리고당, 생장 배지 + 2% 수소화 이소말토올리고당 1, 생장 배지 + 4% 수소화 이소말토올릭고당 1, 생장 배지 + 8 % 수소화 이소말토올리고당 1 및 동결 보호 물질 없는 생장 배지. 세포들은 표준 제어된 동결 보존 조건 하에서 (이소프로파놀계 방법을 이용) 액화 질소로 냉각되어 동결 보존된다. 일주일 후, 세포들을 표준 해동 프로토콜 (37 ℃, 수조 내에 바이알을 직접 침지, 세포 용액을 신선항 생장 배지에 한 방울씩 옮김)을 이용하여 해동하였다. ROCK 저해제를 제1 파종 하에서 부가하였다. 해동 후 생존 가능성 분석이 뉴클레오카운터 기술을 이용하여 수행되었다. 그 결과는 도 7에 도시된다.

상기 결과는 DMSO 가 부가된 경우에 비해 동결 보존된 세포의 생존 가능성이 유의하게 저하되었지만, 인간 iPS 세포가 유일한 동결 보존 물질로서 수소화 이소말토올리고당 1을 이용하여 동결 보존될 수 있음을 나타낸다. DMSO 없이 동결 보존된 샘플에서, 사용된 이소말토올리고당 1의 농도 함수로서 개선된 생존 가능성의 경향이 관측되었다.

실시예 9

서로 다른 분자량의 동결 보호 물질 내에서 통상의 인간 간엽 줄기 세포 (hMSC)의 동결 보존

hMSC는 다음 실험군을 포함하여 실시예 2에서 설명한 바와 동일한 프로토콜을 이용하여 동결 보존되었다; 생장 배지 + 10% DMSO, 8% 이소말토올리고당 1, 평균 M_W 10,000 덱스트란 또는 평균 M_W 40,000 덱스트란 + 1% DMSO, 8% 이소말토올리고당 1, 평균 M_W 10,000 덱스트란 또는 평균 M_W 40,000 덱스트란 및 생장 배지. 상술한 바와 같이 뉴클레오카운터 기술을 이용하여 생존 가능성 분석이 수행되었다. 해동 후, MSC는 표준 조건 하에서 3일 간 배양되었고, 증식 속도는 인 비트로 분석에서 비색 분석과, 세포 집단에서 미토콘드리아 활성을 측정하는 MTT를 이용하여 분석되었다.

결과는 도 8에 도시된다.

상기 결과는 hMSC가 유일한 동결 보호 물질로서 이소말토올리고당 1, 평균 M_W 10,000 덱스트란 또는 평균 M_W 40,000 덱스트란을 이용하여 동결 보존 용액 내에 동결 보존될 수 있음을 명확하게 나타낸다. 해동 후 직접 생존 가능성 분석에서 M_W 간의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 3일 후 증식 속도의 분석은 8% 이소말토올리고당 1 (평균 M_W 10,000)에서 동결 보존된 hMSC가 평균 M_W 10,000 덱스트란 및 평균 M_W 40,000 덱스트란에 비해 더 활동적으로 증식됨을 나타내었다.

실시예 10

평균 M_W 1500을 갖는 이소말토올리고당 내에서 통상의 인간 간엽 줄기 세포 (hMSC)의 동결 보존

hMSC는 다음의 실험군을 포함하며 실시예 2에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 이용하여 동결 보존된다: 생장 배지 + 10% DMSO, 생장 배지 +2% DMSO, 평균 M_W 1500을 갖는 8% 이소말토올리고당 및 생장 배지. 생존 가능성 분석이 상술한 바와 같이 뉴클레오카운터 기술을 이용하여 수행되었다. 그 결과는 도 9에 도시된다.

상기 결과는 hMSC가 유일한 동결 보호 물질로서 평균 M_W 1500을 갖는 이소말토덱스트린을 이용하는 동결 보존액에서 동결 보존될 수 있음을 명확하게 나타낸다.

실시예 11

DMSO, 이소말토올리고당 1 또는 수소화 이소말토올리고당 1을 이용한 동결 보존 후 조혈모 줄기 세포 CD34⁺의 생존 가능성

가동화 말초 혈액 세포를 백혈구 성분 채집술 (leukapheresis)에 의해 수확하고, 10% DMSO 또는 서로 다른 농도의 이소말토올리고당 1 (isom) 또는 수소화 이소말토올리고당 1 (h-isom)을 함유하는 동결 보존 배지에서 동결하였다. 샘플은 제어된 속도의 동결기를 이용하여 동결되었다 (Kryo 560-16, Planer; 개시 온도 4℃, -1℃/분으로 0℃로 감온, -2℃/분으로 -45℃로 감온 후 -5℃/분으로 -100℃로 감온) 후 -150℃로 이동. 샘플은 37 ℃ 수조에서 해동되었다. CD45+, CD34+ 조혈모 줄기 세포의 생존 가능성을 측정하기 위해 유세포 분석을 행하였다. 화합물 7-아미노액티노마이신 D (7-ADD) 결합 형광 DNA를 생존/사멸 마커로 사용하였다. 7-ADD를 배제할 수 있는 세포들은 생존 가능한 것으로 추정하였다. 결과는 도 10에 도시된다: 이소말토올리고당 1 (밝은 회색 막대), 수소화 이소말토올리고당 1 (어두운 회색 막대), DMSO (검은 막대). 여기에 도시한 데이터는 3개의 개별 실험으로부터 얻은 것으로서 각각은 이중 측정되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.

h-isom 및 isom은 모두 동결 보존 후 CD34+ 조혈모 세포의 생존 가능성이 표준 10% DMSO와 동일한 정도임을 입증한다. i-som 및 som의 농도가 높을수록 더 높은 보호 효과가 나타난다는 명확한 경향이 확인되었다. 4% 농도는 6%, 8%, 10% 및 12%에 비해 현저하게 낮은 보호 효과 (60% 미만)을 나타낸다. 10% 와 12% 농도는 10% DMSO와 유사한 보호 효과를 갖는다. 연구에서 h-isom 및 isom의 보호 효과 사이에는 유의한 차이가 관측되지 않았다.

실시예 12

DMSO , 이소말토올리고당 1 또는 수소화 이소말토올리고당 1을 이용한 동결 보존 후 지방 유래 기질/줄기 세포 ( ASC )의 생존가능성

ASC는 바이브라셋 장치 (Moller Medical GmbH & Co.KG, Fulda, Germany)를 이용하여 복부 또는 허벅지 안쪽의 미용 지방 흡입에 의해 얻은 지방 조직으로부터 수확하였다. 기질 혈관 분획으로부터의 ASC를 둘베코 변형 이글 배지, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% GlutaMAX 및 10% 혼주 인간 혈소판 용해물 (pooled human platelet lysate)로 이루어진 배양 배지에서 체외 증폭시켰다. 세포는 10% DMSO 또는 다른 농도의 이소말토올리고당 1 (isom) 또는 수소화 이소말토올리고당 1 (h-isom)을 함유하는 동결 보호 배지에서 동결되었다. 샘플은 제어된 속도의 동결기 (Kryo 560-16, Planer; 시작 온도 4℃, -1℃/분으로 0℃로 저하, -2℃/분으로 -45℃로 저하, -5℃/분으로 -100℃로 저하)로 동결되고, -150℃로 이동되었다. 샘플은 37℃ 수조에서 해동되었다. 표현형 특정 (CD73, CD90, CD105에 대해 포지티브, CD14, CD20, CD45 및 CD34에 대해 네거티브)과 ASC의 생존가능성 측정을 위해 유세포 측정기가 이용되었다. 형광 DNA 결합 화합물 7-아미노악티노마이신 D (7-ADD)이 생존/사멸 마커로서 이용되었다. 7AAD를 배제할 수 있는 세포는 생존가능한 것으로 추정되었다. 결과는 도 11에 도시된다: 이소말토올리고당 1 (밝은 회색 막대), 수소화 이소말토올리고당 1 (어두운 회색 막대) 및 DMSO (검은색 막대). 여기에 제시된 데이터는 단일 실험에서 더블렛으로 측정되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. DMSO에 대한 결과는 기대에 비해 낮았다.

동결 보호 물질로서 h-isom 및 isom은 모두 10% DMSO와 동일한 정도로 ASC의 생존 가능성을 지지한다. 4% 의 낮으나 농도를 제외하고는, 더 높은 농도에서 70%를 넘는 생존가능성이 나타난다.12%의 농도는 더 낮은 농도와 비교해서 유의하게 높은 생존가능성 (80-90%)를 나타낸다. 4% 그룹을 제외하고는 연구에서 h-isom 및 isom의 동결 보호 효과 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 13

마우스 난소 제거 후, 10 mg/ml HSA, 페니실린/스트렙토마이신 보충된 McCoy 배지로 이동되어 다음의 동결 보존 용액에 이동 전까지 37 ℃에서 유지되었다: 1) 표준 조건 (인간 난소 조직의 동결 보존과 유사한 PBS, 1.5 mol/L 에틸렌 글리콜, 0.1 mol/L 수크로스, 10 mg/ml HSA), 또는 2) PBS, 10% (w/v) 이소말토올리고당 1. 난소는 얼음 위에서 30분 동안 평형화된 다음 프로그램 가능한 극저온동결고 (Planner Cryo 10 프로그램가능한 동결고, UK)로 이동시키며, 여기서 샘플은 다음의 기울기로 -140℃로 냉각된다 (시작 온도: -1℃; -9℃까지 -2℃/분; 5분간 유지; 접종; -40℃까지 -0.3℃/분; -140 ℃까지 -10℃/분, 그 다음 직접 액화 질소). 이 후 액화 질소에 침지되고, 가변 기간 동안 액화 질소 탱크 내에 유지된다. 해동: 37 ℃ 뜨거운 물에서 실온; 이소말토올리고당 1 (20% (w/v)) 추가 배지에서 10분, 그 다음 고정 배지로 직접 이동. 조직학 검사에서 난소들은 발생의 여러 단계에서 생존 난포들을 나타냈다.

실시예 14

마우스 난소들을 다음의 동결 보존 용액을 이용하여 실시예 13에서 설명한 바와 같이 처리하였다: 1) 표준 조건 (인간 난소 조직의 동결 보존과 유사한 PBS, 1.5 mol/L 에틸렌 글리콜, 0.1 mol/L 수크로스, 10 mg/ml HSA), 또는 2) PBS, 1.5 mol/L 에틸렌 글리콜, 10 mg/ml HSA, 10% (w/v) 수소화 이소말토올리고당 1 또는 3) PBS, 10 mg/ml HSA, 10% (w/v) 수소화 이소말토올리고당 1. 조직학적 검사에서 모든 난소들은 발생의 여러 단계에서 생존 난포들을 나타냈다.

Claims

덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제의 샘플을 동결 보존하기 위한 용도로서,
a) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 전체 중량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량평균분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하거나, 또는
b) 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖거나, 또는
c) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 전체 중량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1% w/w 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖고,
상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제1항에 있어서, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 7500 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 것인 용도.
샘플을 동결 보존하기 위한 동결 보호제의 용도로서, 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질을 포함하며, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 동결 보호 물질은 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 850 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 것인 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 동결 보호 물질은 ≥ 1 및 ≤ 5의 다분산성을 갖는 것인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 수소화 덱스트란, 수소화 덱스트린, 산화 이소말토올리고당, 산화 덱스트란, 산화 덱스트린, 덱스트린 에스테르, 덱스트란 에스테르, 이소말토올리고당 에스테르, 덱스트린 에테르, 덱스트란 에테르, 이소말토올리고당 에테르, 부분적으로 수소화/산화된 덱스트린, 부분적으로 수소화/산화된 덱스트란 및 부분적으로 수소화/산화된 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이소말토올리고당 유도체는 수소화 이소말토올리고당, 산화 이소말토올리고당, 이소말토올리고당 에스테르, 이소말토올리고당 에테르 및 부분적으로 수소화/산화된 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 동결 보호 물질은 850 내지 1,150 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 이소말토올리고당인 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 동결 보호 물질은 850 내지 1,150 Da의 중량 평균 분자량 (M_W)을 갖는 수소화 이소말토올리고당인 것인 용도.
제8항 또는 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 3 글루코스 단위 미만을 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 15 % w/w 미만인 것인 용도.
제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 9 글루코스 단위를 초과하여 갖는 이소말토올리고당의 중량 비율은 20 % w/w 미만인 것인 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이소말토올리고당과 그 유도체는 덱스트란계인 것인 용도.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 샘플은 포유 동물 장기, 포유 동물 세포 및 포유 동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 샘플은 이식용인 것인 용도.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제는 분말 또는 용액 형태인 것인 용도.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제는 상기 동결 보호 물질을 30 내지 70 % w/w 포함하는 것인 용도.
덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제로서,
a) 상기 동결 보호제는 상기 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w을 포함하거나,
b) 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖거나, 또는
c) 상기 동결 보호제는 상기 동결 보호제 내에서 덱스트린, 덱스트란, 이소말토올리고당 및 그 유도체의 총량에 대해 중량 평균 분자량 (M_w) 300 내지 1,650 Da을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체 중 하나 이상을 적어도 1 % w/w 포함하고, 상기 동결 보호 물질은 300 내지 9,500 Da의 중량 평균 분자량 (M_w)을 갖는 것인 동결 보호제.
300 내지 1,650 Da의 중량 평균 분자량을 갖는 이소말토올리고당 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 동결 보호 물질을 포함하는 동결 보호제.
제17항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 보호제로서, 상기 동결 보호 물질은 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에서 정의된 것인 동결 보호제.
제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1항 내지 제12항 및 제15항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에서 추가로 정의된 것인 동결 보호제.
제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에서 정의된 동결 보호제를 포함하는 동결 보호 조성물로서, 상기 동결 보호 조성물은 동결 보존될 샘플을 더 포함하고, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결 보호 조성물.
제21항에 있어서, 상기 샘플은 포유 동물 장기, 포유 동물 세포 및 포유 동물 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결 보호 조성물.
제21항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 의한 동결 보호 조성물로서, 1 내지 50 % w/w의 동결 보호 물질을 포함하는 것인 동결 보호 조성물.
제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 DMSO를 8 % w/w 미만의 양으로, 예컨대 5 % w/w 미만, 예컨대 4 % w/w 미만의 양으로 더 포함하는 것인 조성물.
샘플을 동결 보존하는 방법으로서, 샘플을 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에서 정의된 동결 보호제와 접촉시켜 동결 보존 조성물을 얻는 단계와, 이어서 동결 보존 조성물의 온도를 동결 보존 온도로 저하시키는 단계를 포함하며, 상기 샘플은 장기, 세포 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 샘플은 포유 동물의 장기, 포유 동물의 세포 및 포유 동물의 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 샘플은 이식용인 것인 방법.