ES2871373T3 - Agente crioprotector, composiciones crioprotectoras y crioconservadas, usos de los mismos y métodos de crioconservación - Google Patents

Abstract

Uso de un agente crioprotector, que comprende un crioprotector que es uno o más de: dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido, y derivados de los mismos cuyo derivado se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado, dextrina hidrogenada, isomalto- oligosacárido oxidado, dextrano oxidado, dextrina oxidada, DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomalto- oligosacáridos, carboxialquil C1-10-dextrina, carboxialquil C1-10-dextrano y carboxialquil C1-10-isomalto- oligosacárido; y a) en donde dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, o b) en donde dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, para crioconservar una muestra, y en edonde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente crioprotector, composiciones crioprotectoras y crioconservadas, usos de los mismos y métodos de crioconservación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un crioprotector, un agente crioprotector, composiciones crioprotectoras, usos de los mismos y métodos de crioconservación.

Antecedentes de la invención

La crioconservación de muestras biológicas viables tales como células, tejidos u órganos, que se han extraído de una fuente donante, es de gran importancia y utilidad en las comunidades científica y médica. La crioconservación es generalmente un proceso en el que una muestra, por ejemplo, células o tejido, se conserva mediante enfriamiento a temperaturas bajo cero, normalmente 77 K (= -196 °C, el punto de ebullición del nitrógeno líquido). A estas bajas temperaturas, se detiene eficazmente cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que causarían la muerte celular. Las técnicas de crioconservación se utilizan habitualmente para la conservación a largo plazo de materiales acuosos o que contienen agua, tales como células y tejidos de plantas y animales. Se sabe que tras congelar estos materiales, se forman cristales de hielo, lo que da como resultado concentraciones desiguales de solutos y contaminantes excluidos por las moléculas de agua, lo que se denomina concentración de congelación. Para que las células o los tejidos se conserven, se utilizan normalmente soluciones crioprotectoras para evitar daños debidos a la congelación durante el proceso de enfriamiento o descongelación. Para que la crioconservación sea útil, la muestra conservada debe conservar su integridad y viabilidad a un nivel razonable en el momento de la extracción. Por lo tanto, el proceso de conservación de la muestra no debería, en sí mismo, dañar o destruir gravemente, por ejemplo, las células o la arquitectura tisular.

En las técnicas de crioconservación convencionales, la muestra se extrae, se coloca en una solución de almacenamiento y a continuación se conserva mediante congelación. Cuando se va a utilizar la muestra, se descongela y, por ejemplo, las células tomadas de fuentes de donantes humanas se devuelven a la temperatura normal del cuerpo humano (es decir, aproximadamente 37 °C) y a continuación se colocan en un medio de cultivo celular. Los protocolos de crioconservación someten a las células a una multitud de tensiones e agresiones a lo largo del proceso de extracción, congelación y descongelación celular. Estas tensiones y agresiones pueden causar daños irreversibles a la célula.

El dextrano se ha utilizado como agente crioprotector para células humanas, animales y vegetales (Odavic, R. et al. Experientia 36, 1122 (1980), Ashwood-Smith, M.J. et al. Cryobiology 9, 441 (1972) y Echlin, P. et al. J. Microsc. (Oxford) 110, 239 (1977)). Se encontró que una mezcla de metilsulfóxido al 5% y Dextrano 70 al 9% proporciona una crioprotección óptima de las células madre comprometidas de médula ósea humana (Dextran, Handbook from Amersham BioSciences, 18-1166-12, Edición AA, página 35). Se han investigado el dextrano, el glicerol y el dimetilsulfóxido (DMSO), solos o en combinación, para la crioprotección de células de médula ósea humana (Odavic, R. et al. Experientia 36, 1122 (1980)). Se obtuvo una protección significativamente mejor contra daño por congelación con Dextrano 70 al 9 % en combinación con DMSO al 3 o 5 %, y también con DMSO al 5 o al 10 % solo, que con glicerol al 15 % o dextrano al 9 % con DMSO al 1 %. Se conoce el Dextrano 40 (Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., Vol.

92, págs. 10119-10122, octubre de 1995, Medical Sciences) para la crioconservación de sangre de placenta/cordón umbilical en una combinación de DMSO al 50 % en Dextrano 40 al 5 % (p/v).

Shu Guowei et al. describen en Advanced Materials Research, Trans Tech Publications Ltd., Vol. 328 (2012), págs.

454-457, el efecto del fructo-oligosacárido, isomalto-oligosacárido, inulina y xilo-oligosacárido sobre la supervivencia de B. bifidium durante la liofilización. Kwan Hwa Park et al. describen en el documento KR 2000 034 010 A un crioprotector que contiene fructo-oligosacárido, isomalto-oligosacárido o galacto-oligosacárido para surimi. En J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., Vol. 30(3) (2001), págs. 565-568, se describen los efectos de un crioprotector de fructooligosacárido, isomalto-oligosacárido y galacto-oligosacárido sobre la proteína de vacuno.

Los crioprotectores convencionales son glicoles (alcoholes que contienen al menos dos grupos hidroxilo), tales como etilenglicol, propilenglicol y glicerol. El etilenglicol se usa comúnmente como anticongelante para automóviles y el propilenglicol se ha usado para reducir la formación de hielo en los helados. El dimetilsulfóxido (DMSO) también se considera un crioprotector convencional. Los criobiólogos han utilizado glicerol y DMSO durante décadas para reducir la formación de hielo en los espermatozoides y embriones que se conservan en nitrógeno líquido (-196 °C). Entre estos agentes crioprotectores conocidos, el DMSO se considera el más eficaz y se adopta con frecuencia, pero es fisiológicamente tóxico y se sabe que causa presión arterial alta, náuseas y vómitos si se transfunde a un receptor con las células o para el personal que lo manipula, a menos que se tomen precauciones. Cox et al. (Cell Tissue Bank (2012) 13:203-215) identificaron mediante una revisión retrospectiva de la bibliografía publicada varios cientos de reacciones adversas (por ejemplo, náuseas, escalofríos, arritmias cardíacas, síntomas neurológicos y paro respiratorio) asociadas al trasplante de células madre crioconservadas con dimetilsulfóxido. Además, la toxicidad del DMSO tiende a debilitar las tasas de supervivencia y/o las funciones de las células, incluidas las alteraciones genómicas después de que las células descongeladas se cultivan o transfunden al cuerpo del receptor. Por lo tanto, la toxicidad del DMSO también afecta al tiempo que las células pueden estar expuestas al DMSO durante la manipulación.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un agente crioprotector para proteger una muestra tal como una muestra biológica durante la congelación como reemplazo de otros crioprotectores, tales como DMSO, o como complemento de tales otros crioprotectores para reducir la concentración necesaria de los mismos, preferentemente a concentraciones no tóxicas, que al mismo tiempo tienen los efectos protectores necesarios y baja toxicidad.

Objetivo de la invención

Es un objetivo de las realizaciones de la invención proporcionar un crioprotector como reemplazo de otros crioprotectores tales como DMSO o como complemento de dichos otros crioprotectores para reducir la concentración de los mismos, preferentemente a concentraciones no tóxicas, cuyo crioprotector tiene los efectos protectores necesarios con respecto a conservar la máxima funcionalidad de la muestra crioconservada durante la crioconservación. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector de baja toxicidad para el personal que manipula el crioprotector y para las muestras biológicas, por lo que se prolonga el tiempo que la muestra puede estar en contacto con el crioprotector sin dañarse, se reduce la necesidad de lavar las muestras y, preferentemente, si se desea, se hace posible devolver la muestra al lugar de donde se tomó o a un receptor sin tener que separar la muestra del crioprotector. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector que sea eficaz como crioprotector para una muestra seleccionada del grupo que consiste en órganos, células y tejidos, tales como los seleccionados del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector que sea eficaz como crioprotector para una muestra a trasplantar, tal como un órgano, células o tejidos. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector que sea eficaz como crioprotector de, por ejemplo, células, y dé como resultado una viabilidad aceptable de dichas células. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector que sea eficaz como crioprotector de, por ejemplo, órganos, y dé como resultado una funcionalidad física aceptable de dichos órganos. Un objetivo adicional de las realizaciones de la invención es proporcionar un crioprotector que sea eficaz como crioprotector de, por ejemplo, tejidos, y dé como resultado una funcionalidad física aceptable de dichos tejidos.

Sumario de la invención

Se ha encontrado por el presente o presentes inventores que un agente crioprotector que comprende un crioprotector que es uno o más de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido, y derivados de los mismos, y a) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido, y derivados de los mismos en dicho agente, o b) en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da tal como entre 300 y 7.500 Da, o c) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente, y dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, es muy útil como crioprotector. En comparación con los materiales de dextrano de mayor peso molecular usados anteriormente, tal como Dextrano 40 (40.000 Da) y Dextrano 70 (70.000 Da), el agente crioprotector que comprende el crioprotector descrito anteriormente tiene una viscosidad más baja debido al peso molecular más bajo y, por lo tanto, puede prepararse previamente en una alta concentración que permite añadir una muestra ya en una solución y todavía obtener una composición que comprenda tanto el crioprotector como la muestra en una concentración adecuada para la crioconservación. Además, las moléculas con menor peso molecular son generalmente menos inmunógenas que las moléculas con alto peso molecular. El Dextrano 1 es conocido como un inhibidor de hapteno que reduce el riesgo de reacciones anafilácticas cuando se administra dextrano y, por lo tanto, se usa como preinyección antes de la inyección de dextranos con mayor peso molecular tal como Dextrano 40 (40.000 Da) y Dextrano 70 (70.000 Da). También se ha documentado en estudios de Richter et al. (Int. Arch. Allergy 43:252-268 (1972) e Int. Arch. Allergy 41:826-844 (1971)) que el Dextrano 1 tiene un potencial inmunológico muy bajo en seres humanos. Además, se ha demostrado en los ejemplos que la crioconservación con el crioprotector como se describe en el presente documento proporciona una mejor protección de la funcionalidad después de la crioconservación medida como viabilidad de las células ensayadas que con dextranos que tienen un peso molecular más alto.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente crioprotector que comprende un crioprotector que es uno o más de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos, cuyo derivado se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado, dextrina hidrogenada, isomalto-oligosacárido oxidado, dextrano oxidado, dextrina oxidada, DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomalto-oligosacáridos, carboxialquil C¹-¹⁰-dextrina, carboxialquil C-M⁰-dextrano y carboxialquil C¹-¹⁰-isomaltooligosacárido, y

a) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos, o

b) en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, tal como entre 300 y 7.500 Da o,

c) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, y dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un agente crioprotector que comprende un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como entre 850 y 1.650 Da.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un crioprotector de acuerdo con la invención para crioconservar una muestra, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición de crioconservación que comprende un agente crioprotector de acuerdo con la invención, cuya composición de crioconservación comprende además una muestra a crioconservar, en la que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células madre somáticas o células madre de mamífero y tejidos de mamífero, con la condición de que se excluyan los órganos humanos.

Un aspecto adicional descrito en el presente documento se refiere a una composición crioconservada que comprende un agente crioprotector como se describe en el presente documento, cuya composición crioconservada comprende además una muestra que se ha crioconservado, en la que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos, células y tejidos.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para crioconservar una muestra, que comprende las etapas de poner una muestra a crioconservar en contacto con un agente crioprotector de acuerdo con la invención para obtener una composición de crioconservación y posteriormente reducir la temperatura de la composición de crioconservación a una temperatura de crioconservación, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para crioconservar una composición de crioconservación como se describe en el presente documento poniendo la composición a una temperatura de crioconservación.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un agente crioprotector como se describe en el presente documento para crioconservar una muestra, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un agente crioprotector como se describe en el presente documento para crioconservar una muestra para su trasplante.

Un aspecto adicional descrito en el presente documento se refiere al uso de una composición de crioconservación como se describe en el presente documento para crioconservar una muestra reduciendo la temperatura de dicha composición a una temperatura de crioconservación, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos, células y tejido.

Leyendas de las figuras

La figura 1 muestra la supervivencia de los NHDF después de la descongelación y la viabilidad después de 1 pase en, respectivamente, 1) DMSO al 10 %, 2) isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM) y DMSO al 2 %, 3) isomaltooligosacárido 1 al 8 % (ISOM) y 4) DMEM como se describe en el Ejemplo 2.

La figura 2 muestra la supervivencia de los NHDF después de la descongelación y la viabilidad después de 1 pase en, respectivamente, 1) Dm SO al 10 %, 2) isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y DMSO al 2 %, 3) isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y 4) DMEM como se describe en el Ejemplo 2.

La figura 3 muestra la supervivencia de los NHEK después de la descongelación y la viabilidad después de 1 pase en, respectivamente, 1) DMSO al 10 %, 2) isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM) y DMSO al 2 %, 3) isomaltooligosacárido 1 al 8 % (ISOM) y 4) DMEM como se describe en el Ejemplo 3.

La figura 4 muestra la supervivencia de los NHEK después de la descongelación en, respectivamente, 1) DMSO al 10%, 2) isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8% (H-ISOM) y DMSO al 2% , 3) isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y 4) DMEM como se describe en el Ejemplo 3.

La figura 5 muestra la supervivencia de las MSC después de la descongelación y la viabilidad después de 1 pase en, respectivamente, 1) DMSO al 10 %, 2) isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM) y DMSO al 2 %, 3) isomaltooligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y DMSO al 2 %, 4) isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM), 5) isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y 6) DMEM como se describe en el Ejemplo 4.

La figura 6 muestra la supervivencia de células iPS humanas en medio de crecimiento PluriPro después de la descongelación y la crioconservación en, respectivamente, medio de crecimiento DMSO al 10%, medio de crecimiento DMSO al 5 %, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 2 % (ISOM), medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 4 % (ISOM), medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido 1 al 2% (ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5% isomalto-oligosacárido 1 al 4% (ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (ISOM), medio de crecimiento isomaltooligosacárido 1 al 2 % (ISOM), medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 4 % (ISOM), medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 8% (ISOM) y medio de crecimiento sin ningún crioprotector como se describe en el Ejemplo 7.

La figura 7 muestra la supervivencia de células iPS humanas en medio de crecimiento PluriPro después de la descongelación y la crioconservación en, respectivamente, medio de crecimiento DMSO al 10 %, medio de crecimiento DMSO al 5 %, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 2 % (H-ISOM), medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 % (H-ISOM), medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 2 % (H-ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 % (H-ISOM), medio de crecimiento DMSO al 5 % isomaltooligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM), medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 2 % (H-ISOM), medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 % (H-ISOM), medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % (H-ISOM) y medio de crecimiento sin ningún crioprotector como se describe en el Ejemplo 8.

La figura 8 muestra la supervivencia de las MSC después de la descongelación y la proliferación después de 3 días en, respectivamente 1) DMSO al 10 %, 2) "CRYO" que designa isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, dextrano con Mw de 10.000 o dextrano con Mw de 40.000, respectivamente, cada uno combinado con DMSO al 5 %, 3) "CRYO" que designa isomalto-oligosacárido 1 al 8%, dextrano con Mw de 10.000 o dextrano con Mw de 40.000, respectivamente, cada uno combinado con DMSO al 1 %, 4) "CRYO" que designa isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, dextrano con Mw de 10.000 o dextrano con Mw de 40.000, respectivamente, y 5) DMEM como se describe adicionalmente en el Ejemplo 9.

La figura 9 muestra la supervivencia de las MSC después de la descongelación en, respectivamente, 1) DMSO al 10 %, 2) DMSO al 2 %, 3) isomalto-oligosacárido al 8 % Mw 1500 (ISOM) y DMSO al 2 %, 4) isomalto-oligosacárido al 8 % Mw 1500 (ISOM) y 5) DMEM como se describe adicionalmente en el Ejemplo 10.

La figura 10 muestra la viabilidad de las células madre hematopoyéticas CD34+ después de la crioconservación con DMSO, isomalto-oligosacárido 1 o isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 como se describe adicionalmente en el ejemplo 11.

La figura 11 muestra la viabilidad de las células madre/estromales derivadas de tejido adiposo (ASC) tras la crioconservación con DMSO, isomalto-oligosacárido 1 o isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 como se describe adicionalmente en el ejemplo 12.

Divulgación detallada de la invención

Definiciones

Como se usa en el presente documento, crioconservación significa un proceso en el que una muestra se conserva por enfriamiento a temperaturas bajo cero, incluida la tecnología de vitrificación en la que la velocidad de enfriamiento es más rápida que un procedimiento de crioconservación convencional. A temperaturas tan bajas, se reduce la actividad, tal como la actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que causarían, por ejemplo, la muerte celular, y se conserva la estructura/función química de, por ejemplo, proteínas/glucoproteínas o lipoproteínas. Si no se usan soluciones crioprotectoras, es probable que las muestras que se conservan se dañen debido a la congelación durante el proceso de enfriamiento o descongelación.

En un aspecto preferido, la crioconservación significa un proceso en el que las muestras se conservan por enfriamiento a temperaturas bajo cero, normalmente 77 K (= -196 °C, el punto de ebullición del nitrógeno líquido). A estas bajas temperaturas, se detiene eficazmente cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que causarían la muerte celular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "temperatura de crioconservación" designa una temperatura de bajo cero a -196 °C, tal como de - 50 °C a -196 °C, tal como de - 80 °C a -196 °C, tal como una temperatura por debajo de -55 °C, tal como por debajo de -60 °C, tal como por debajo de -65 °C, tal como por debajo de -70 °C, tal como por debajo de -75 °C, tal como por debajo de -80 °C, tal como por debajo de -85 °C, tal como por debajo de -90 °C, tal como por debajo de -95 °C, tal como por debajo de -100 °C, tal como por debajo de -105 °C, tal como por debajo de -110 °C, tal como por debajo de -115 °C, tal como por debajo de -120 °C, tal como por debajo de -125 °C, tal como por debajo de -130 °C, tal como por debajo de -135 °C, tal como por debajo de -140 °C, tal como por debajo de -145 °C, tal como por debajo de -150 °C, tal como por debajo de -155 °C, tal como por debajo de -160 °C, tal como por debajo de -165 °C, tal como por debajo de -170 °C, tal como por debajo de -175 °C, tal como por debajo de -180 °C, tal como por debajo de -185 °C, tal como por debajo de -190 °C.

Como se usa en el presente documento, el término "muestra" significa cualquier tipo de material a crioconservar, tales como órganos, células o tejido. En un aspecto, una muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos, células, tejido y sangre. La muestra de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero. El término "muestra" no comprende el cuerpo humano en las distintas etapas de su formación y desarrollo. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un agente crioprotector como se describe en el presente documento para crioconservar una muestra para su trasplante. En un aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero para su trasplante.

Como se usa en el presente documento, el término "células" comprende cualquier tipo de células tales como células somáticas que incluyen todo tipo de células en tejidos u órganos, células madre que incluyen todos los tipos de células madre totipotentes, células madre pluripotentes, células madre multipotentes y células progenitoras; ovocitos; espermatozoides; y células germinales. Las células pueden estar en forma aislada o en forma no aislada, tal como en forma de un fluido corporal que contiene células, un tejido u órgano.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fluidos corporales que contienen células" comprende cualquier fluido corporal que contenga células tales como, por ejemplo, sangre, líquido amniótico, semen, líquido cefalorraquídeo, aspirados de médula ósea y líquido menstrual, que se definen a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término "sangre" comprende cualquier fluido que contenga sangre, tal como sangre del cordón umbilical, sangre periférica y sangre movilizada.

Como se usa en el presente documento, el término "tejido" o "tejidos" comprende cualquier tipo de tejido que comprenda cualquier tipo de tipo de célula y combinaciones de los mismos, incluyendo tejido ovárico, tejido testicular, tejido del cordón umbilical, tejido placentario, tejido conectivo, tejido cardíaco, tejidos de músculo, cartílago y hueso, tejido endocrino y tejido neural. El término "tejido" o "tejidos" también comprende tejido adiposo o tejido de la pulpa dental.

Como se usa en el presente documento, el término "órgano" comprende, por ejemplo, pulmón, hígado, riñón, corazón, ovarios y páncreas. El término "órgano" también comprende cordón umbilical.

Como se usa en el presente documento, la expresión "funcional después de la crioconservación" en relación con una muestra significa que la muestra tal como órganos, tejidos o células después de la crioconservación conserva una función aceptable y/o deseada después de la crioconservación. En un aspecto, la muestra después de la crioconservación conserva toda su función. En otro aspecto, la muestra, tales como células, conserva al menos el 50 % de la función deseada, tal como al menos el 60 % de la función deseada, tal como al menos el 70 % de la función deseada, tal como al menos el 80 % de la función deseada, tal como al menos el 90 % de la función deseada, tal como al menos el 95 % de la función deseada, tal como el 100 % de la función deseada. Como ejemplo, en lo que respecta a las células, una función importante a conservar es la viabilidad de las células. Como otro ejemplo en lo que respecta a los órganos, una función importante que debe conservarse es la función fisiológica de dicho órgano, por ejemplo, para un corazón la función de bombeo. Como otro ejemplo en lo que respecta al tejido, una función importante que debe conservarse es la capacidad de dicho tejido para integrarse con el tejido circundante (por ejemplo, piel) en el caso de un trasplante.

La viabilidad de las células después de la crioconservación se puede medir utilizando el sistema Nucleocounter en el que las células muertas se miden incubando la muestra celular con el colorante de unión a ADN, yoduro de propidio, que solo da como resultado una medición detectable de células muertas como se muestra en los ejemplos. La viabilidad se da como porcentaje de células vivas en la población que se está analizando. La tasa de proliferación de una muestra celular después de la crioconservación se puede analizar usando el ensayo colorimétrico, MTT.

Como se usa en el presente documento, el término "banco" significa cualquier almacenamiento de una muestra para uso futuro.

Como se usa en el presente documento, la expresión "método de banco clínico" significa cualquier almacenamiento de una muestra relacionada con el tratamiento clínico de un mamífero tal como un ser humano.

Como se usa en el presente documento, la expresión "método de banco de médula" significa el almacenamiento de una muestra de médula ósea tal como aspirados de médula ósea y fluido corporal relacionado, o células aisladas de la médula.

Como se usa en el presente documento, la expresión "método de banco de tejido de pulpa dental" significa el almacenamiento de una muestra de tejido de pulpa dental tal como células aisladas de tejido de pulpa dental.

Como se usa en el presente documento, la expresión "método de banco de tejido graso" significa el almacenamiento de una muestra de tejido graso tal como células aisladas de tejido graso. En el presente contexto, el término y en lo sucesivo, "método de banco de cordón umbilical" significa el almacenamiento de sangre del cordón umbilical, tejidos relacionados con el cordón umbilical o células aisladas de tejido o sangre de cordón umbilical.

En el presente contexto, el término y en lo sucesivo, "método de banco de sangre periférica movilizada" significa el almacenamiento de sangre periférica después de movilizar con agentes que, por ejemplo, liberan células madre sanguíneas a la circulación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "método de banco de reproducción" significa el almacenamiento de cualquier muestra relacionada con la reproducción, tal como semen, ovocitos, espermatozoides, óvulos fertilizados, etc.

La unidad de masa atómica Dalton (símbolo: Da) es la unidad estándar utilizada para indicar la masa a escala atómica o molecular (masa atómica). Se define como una doceava parte de la masa restante de un átomo neutro de carbono-12 no unido en su estado fundamental nuclear y electrónico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "peso molecular promedio en peso" (Mw) se define como:

en la que gi es la fracción de moléculas que tienen el peso molecular Mi. Los posibles valores de M constituyen un conjunto de números con valores discretos etiquetados Mi, que definen p.

Como se usa en el presente documento, la expresión "peso molecular promedio en número" se define como:

en la que Ni es la fracción de moléculas que tienen el peso molecular Mi, gi es la fracción de moléculas que tienen el peso molecular Mi. Los posibles valores de M constituyen un conjunto de números con valores discretos etiquetados Mi, que definen p.

Como se usa en el presente documento, el término polidispersidad (Pd) se calcula por Mw/Mn = Pd.

Como se usa en el presente documento, el término "Dextrano" seguido de un número tal como "Dextrano 1", "Dextrano 40" y "Dextrano 70" sigue la abreviatura de la Farmacopea de Dextrano X, lo que significa que el peso molecular promedio en peso del dextrano es de aproximadamente X kDA. Por lo tanto, Dextrano 1 significa un dextrano que tiene un peso molecular promedio en peso de 850-1.150 Da. El isomalto-oligosacárido 1 y el isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado se denominan de manera similar. Por lo tanto, isomalto-oligosacárido 1 significa una mezcla de isomaltooligosacáridos que tiene un peso molecular promedio en peso de 850-1.150 Da de acuerdo con las Monografías EP y USP para el Dextrano 1. El isomalto-oligosacárido 1 también se denomina pentaisomaltosa en esta solicitud. Isomaltooligosacárido 1 hidrogenado significa una mezcla de isomalto-oligosacáridos hidrogenados, donde los isomalto oligosacáridos se ajustan a las Monografías EP y USP para el Dextrano 1. El isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado también se denomina pentaisomaltósido en esta solicitud.

Como se usa en el presente documento, la expresión "isomalto-oligosacárido a base de dextrano" significa un isomaltooligosacárido que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como entre 850 y 1.650 Da y obtenido a partir de dextrano hidrolizado tal como por hidrólisis de dextrano de bajo peso molecular.

Como se usa en el presente documento, el término "crioprotector" significa una sustancia que, por ejemplo, en una solución apropiada se usa para proteger una muestra del daño por congelación. Ejemplos de crioprotectores conocidos son, por ejemplo, DMSO, polioles, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "estéril" significa libre de gérmenes vivos, microorganismos y otros organismos capaces de proliferar.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente libre de DMSO" significa DMSO en una cantidad inferior al 0,01 % p/p.

Como se usa en el presente documento, "alquilo C^1-10" es un hidrocarburo que es un alquilo C^1-10 de cadena lineal o ramificada, tal como un alquilo C^1-6 de cadena lineal o ramificada. Los ejemplos son metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, isopropilo, 1 -butilo, 2-metil-1 -propilo, 2-butilo, 1 -pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo y 3-metil-2-butilo.

Como se usa en el presente documento, "carboxialquil C^1-10" significa -alquil C^1-10-COOH. Un ejemplo es carboximetilo (CM) (-CH²COOH).

Como se usa en el presente documento, el término "DEAE" significa dietilaminoetilo.

Agente crioprotector

En el presente documento se describe un agente crioprotector que comprende un crioprotector que es uno o más seleccionado del grupo que consiste en dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos, y

a) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da tal como un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, o

b) en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da tal como de entre 300 y 7.500 Da, o

c) en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da tal como entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, y dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da.

En un aspecto, dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos.

El peso molecular del dextrano y la dextrina, y/o un derivado de los mismos, se determina normalmente por medio de cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés) utilizando, por ejemplo, columnas GPC del tipo geles hidroxilados de poliéter. La calibración se puede realizar como se describe en la 7a edición de la Farmacopea Europea para el dextrano y usando el método matemático iterativo como se describe en la ⁷ a Edición de la Farmacopea Europea, volumen 2, páginas 1816-1817, para el dextrano.

El peso molecular de isomalto-oligosacárido y/o un derivado del mismo, tal como isomalto-oligosacárido hidrogenado se determina normalmente por medio de cromatografía de permeación en gel (GPC). La fase estacionaria en el sistema de columna puede ser dextrano unido covalentemente a perlas de agarosa porosas altamente reticuladas, lo que permite la resolución de oligosacáridos en el intervalo de masa molecular 180-3000 Da. La medición se realiza de acuerdo con la ⁷ a edición de la Farmacopea Europea, volumen 1, págs. 60-61.

Cuando dicho crioprotector es eléctricamente neutro, el peso molecular promedio en peso (Mw) de dicho crioprotector se mide preferentemente mediante GPC. Cuando se mide el peso molecular promedio en peso (Mw) de un crioprotector que lleva una carga eléctrica, el peso molecular promedio en peso (Mw) se calcula basándose en el peso molecular del material de partida eléctricamente neutro y el grado de sustitución del crioprotector cargado. Cada unidad de glucosa en el material de partida no cargado se puede sustituir con entre 1 y 3 sustituyentes. Usando DEAE como un ejemplo de un sustituyente, el experto en la técnica puede medir, por ejemplo, el contenido de nitrógeno (por ejemplo, usando el análisis de Kjeldahl) para calcular el grado de sustitución y, posteriormente, calcular el peso molecular del producto final. Si el sustituyente contiene un grupo ácido, el grado de sustitución lo puede determinar, por ejemplo, un experto en la técnica mediante valoración y, posteriormente, se puede calcular el peso molecular final.

La dextrina, el dextrano y el isomalto-oligosacárido comprenden unidades de D-glucosa repetidas. Los dextranos son una familia de polisacáridos neutros ramificados que consisten predominantemente en una D-glucosa unida a a -(1 ^6 ) como se describe adicionalmente a continuación. Las dextrinas son mezclas de polímeros de unidades de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos a -(1^4 ) o a -(1^6 ) como se describe adicionalmente a continuación. El isomaltooligosacárido es una mezcla de oligómeros de glucosa con enlaces a-D-(1,6) (normalmente menos de 10 unidades de D-glucosa, adecuadamente entre 3-6 unidades de glucosa) y normalmente tiene un peso molecular promedio en peso entre 300 y 1.650 Da, tal como entre 500 y 1.650 Da, tal como entre 850 y 1.650 Da, o tal como entre 850 Da y 1150 Da. En un aspecto, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p. En un aspecto, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p, tal como menor del 15 % p/p, tal como menor del 10 % p/p. En un aspecto adicional, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p y la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p, tal como menor del 15 % p/p, tal como menor del 10 % p/p. La fracción en peso se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo de preparación 1 y 2 en el presente documento.

En un aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado, dextrina hidrogenada, isomalto-oligosacárido oxidado, dextrano oxidado, dextrina oxidada, éster de dextrina, éster de dextrano, éster de isomalto-oligosacárido, éter de dextrina, éter de dextrano, éter de isomalto-oligosacárido, y parcialmente dextrina hidrogenada/oxidada, parcialmente dextrano hidrogenado/oxidado y parcialmente isomalto-oligosacárido hidrogenado/oxidado y derivados de los mismos. En un aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, isomalto-oligosacárido oxidado, éster de isomalto-oligosacárido, éter de isomalto-oligosacárido, y parcialmente isomalto-oligosacárido hidrogenado/oxidado y derivados de los mismos.

A continuación se muestra una descripción esquemática (Tabla A) de ejemplos de las diferentes síntesis y materiales de partida para los derivados de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido descritos anteriormente:

Tabla A:

En un aspecto, el tipo de dicho éter de dextrina, éter de dextrano y éter de isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en éteres que tienen un grupo funcional R. R se selecciona del grupo que consiste en alquilo C¹-¹⁰, tal como alquilo C^1-6, tal como metilo (-CH³) y etilo (-C²H⁵), carboxialquil C^1-10, tal como carboximetilo (-CH²C⁰ OH), hidroxi-alquilo C^1-10,tal como 2-hidroxietilo (-C²H⁴OH), 2-hidroxipropilo (-CH²CHOHCH³), 2-hidroxialquilo (-CH2CHoH(CH2)nCH3, en la que n es 1-10), 3-cloro-2-hidroxipropilo (-CH²CHOHCH²CO, 2-dietilaminoetilo (-C²H⁴N(C²H⁵)²), 3-amino-2-hidroxi propilo (-CH²CHOHCH²NH²), 3-dimetilalquilamonio-2-hidroxi propilo (-CH²CHOHCH²N+(CH³)²R, en la que R es alquilo C^1-10), polietilenglicol cetilo (-CH²CH^{2 0} )¹qC^H ³³) y polietilenglicol estearilo (-CH²CH^{2 0} )¹qC¹⁹H³⁷).

En un aspecto, dicho éter de dextrina, éter de dextrano y éter de isomalto-oligosacárido es, respectivamente, DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomalto-oligosacáridos. En un aspecto, dicho éter de isomalto-oligosacárido es DEAE-isomalto-oligosacárido. En un aspecto, dicho éter de dextrina, éter de dextrano y éter de isomalto-oligosacárido es, respectivamente, carboxialquil C¹-¹Q-dextrina, carboxialquil C^1-10-dextrano, carboxialquil C^1-10-isomaltooligosacárido. En un aspecto, dicho éter de isomalto-oligosacárido es carboxialquil Ci-io-isomalto-oligosacárido.

En un aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado y dextrina hidrogenada. En un aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido es isomalto-oligosacárido hidrogenado.

En otro aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido oxidado, dextrano oxidado y dextrina oxidada. En un aspecto, un derivado de isomaltooligosacárido es isomalto-oligosacárido oxidado. En otro aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomaltooligosacárido se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido oxidado/hidrogenado, dextrano oxidado/hidrogenado y dextrina oxidada/hidrogenada. En un aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido es isomalto-oligosacárido oxidado/hidrogenado.

En otro aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomalto-oligosacárido, carboxialquil C-M⁰-dextrina, carboxialquil C^1-10-dextrano, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido, éster de dextrina, éster de dextrano y éster de isomaltooligosacárido. En otro aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en DEAE-isomalto-oligosacárido, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido y éster de isomalto-oligosacárido.

En otro aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en derivados de dextrina hidrogenada, dextrano hidrogenado, isomalto-oligosacárido hidrogenados tales como los seleccionados del grupo que consiste en DEAE-dextrina hidrogenada, DEAE-dextrano hidrogenado, DEAE-isomaltooligosacárido hidrogenados, carboxialquil C^1-10-dextrina hidrogenada, carboxialquil C^1-10-dextrano hidrogenado, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido hidrogenado, éster de dextrina hidrogenada, éster de dextrano hidrogenado y éster de isomalto-oligosacárido hidrogenado. En otro aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en derivados de isomalto-oligosacárido hidrogenados tales como los seleccionados del grupo que consiste en DEAE-isomalto-oligosacárido hidrogenados, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido hidrogenado y éster de isomalto-oligosacárido hidrogenado. En otro aspecto, un derivado de dextrina, dextrano e isomaltooligosacárido se selecciona del grupo que consiste en derivados de dextrina oxidada, dextrano oxidado e isomaltooligosacárido oxidados tales como los seleccionados del grupo que consiste en DEAE-dextrina oxidada, DEAE-dextrano oxidado, DEAE-isomalto-oligosacárido oxidados, carboxialquil C^1-10-dextrina oxidada, carboxialquil C^1-10-dextrano oxidado, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido oxidado, éster de dextrina oxidada, éster de dextrano oxidado y éster de isomalto-oligosacárido oxidado. En otro aspecto, un derivado de isomalto-oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en derivados de isomalto-oligosacárido oxidados tales como los seleccionados del grupo que consiste en DEAE-isomalto-oligosacárido oxidados, carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido oxidado y éster de isomalto-oligosacárido oxidado.

En un aspecto adicional más, el crioprotector es un isomalto-oligosacárido hidrogenado, un isomalto-oligosacárido oxidado, DEAE-isomalto-oligosacárido, un carboxialquil C^1-10 isomalto-oligosacárido oxidado, un éster de isomaltooligosacárido, un éter de isomalto-oligosacárido o un carboxialquil C^1-10-isomalto-oligosacárido.

En un aspecto adicional más, el crioprotector es carboximetil isomalto-oligosacárido o carboxietil isomaltooligosacárido.

En un aspecto, el crioprotector es isomalto-oligosacárido, tal como isomalto-oligosacárido 1. En otro aspecto, el crioprotector es isomalto-oligosacárido hidrogenado, tal como isomalto-oligosacárido hidrogenado 1.

Mediante la variación de la derivatización, se pueden lograr diversos grados de sustitución. De forma adecuada, el grado de sustitución se sitúa en el intervalo de uno a tres sustituyentes por cada unidad de glucosa. En el caso de, por ejemplo, DEAE-dextrano, es preferible aproximadamente un grupo de carga con respecto a tres unidades de glucosa.

En un aspecto, el agente crioprotector comprende un crioprotector que es uno o más de: dextrina, dextrano, isomaltooligosacárido y derivados de los mismos, y en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como con un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente.

En un aspecto adicional, el agente crioprotector comprende un crioprotector que es uno o más de: dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos, en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, tal como entre 300 y 7.500 Da, tal como entre 500 y 7.500 Da. En un aspecto, dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de como máximo 9500 Da, tal como, como máximo 9000 Da, tal como, como máximo 8000 Da, tal como, como máximo 7000 Da, tal como, como máximo 6000 Da, tal como, como máximo 5000 Da, tal como, como máximo 4000 Da, tal como, como máximo 3000 Da, tal como, como máximo 2000 Da, tal como, como máximo 1900 Da, tal como, como máximo 1800 Da, tal como, como máximo 1700 o tal como, como máximo 1.650 Da.

En un aspecto adicional más, el agente crioprotector comprende un crioprotector que es uno o más de: dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos, y en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como con un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente, y en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, tal como entre 300 y 7.500 Da, tal como entre 500 y 7.500 Da.

En un aspecto, los derivados cargados eléctricamente se caracterizan por la distribución del peso molecular de los materiales de partida no cargados tales como los derivados elaborados a partir de los dextranos, dextrinas e isomaltooligosacárido mencionados anteriormente. Por lo tanto, en un aspecto, dichos derivados de dextranos, dextrinas y/o isomalto-oligosacárido tienen un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, tal como entre 300 y 7.500 Da, tal como entre 500 y 7.500 Da. En un aspecto adicional, dichos derivados son derivados de isomaltooligosacárido que tienen un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrano, dextrina y derivados de los mismos tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da, tal como entre 300 y 7.500 Da, tal como entre 500 y 7.500 Da.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrano, dextrina y derivados de los mismos tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 1.650 y 7.500 Da.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrano, dextrina y derivados de los mismos tiene un peso molecular promedio en peso de entre 1.650 y 7.500 Da, y una polidispersidad de >1 y <5.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrano, dextrina y derivados de los mismos tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 1.650 y 3.500 Da.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrano, dextrina y derivados de los mismos tiene un peso molecular promedio en peso de entre 1.650 y 3.500 Da, y una polidispersidad de >1 y <5.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido y derivados del mismo tiene un peso molecular promedio en peso de entre 850 y 1.650 Da.

En un aspecto, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido y derivados del mismo tiene una polidispersidad de >1 y <3.

En un aspecto adicional, el crioprotector seleccionado del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido y derivados del mismo tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.150 Da.

En un aspecto adicional, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p. En un aspecto, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p, tal como menor del 15 % p/p, tal como menor del 10 % p/p. En un aspecto adicional, la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p y la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p, tal como menor del 15 % p/p, tal como menor del 10 % p/p. La fracción en peso se puede determinar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo de preparación 1 y 2 en el presente documento.

En un aspecto, el agente crioprotector comprende al menos el 10 %, tal como el 20 % p/p de uno o más de isomaltooligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como con un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente. En un aspecto adicional, el agente crioprotector comprende al menos el 30 %, tal como el 40 %, tal como el 50 %, tal como el 60 %, tal como el 70 %, tal como el 80 %, tal como el 90 %, tal como el 95 % p/p o más de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da tal como con un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente.

Dextrano y derivados del mismo

El dextrano puede estar formado por varias cepas bacterianas, en su mayoría cocos anaerobios facultativos grampositivos, por ejemplo, cepas de Leuconostoc y Streptococcus como se describen, por ejemplo, en "Advances in polymer science", Volumen 205, Polysaccharides II, editor D. Klemm, Springer Verlag. Los dextranos para uso farmacéutico se han fabricado normalmente mediante cepas bacterianas específicas definidas en las farmacopeas de EE.UU. o Europa, tales como, por ejemplo, NCTC 10817 o B512 F de Leuconostoc Mesenteroides. La cepa NCTC 10817 y B512F está disponible públicamente desde 1971 en la National Collection Type Cultures (Central Public Health Laboratory), Reino Unido.

Los dextranos son una familia de polisacáridos ramificados neutros que consisten predominantemente en una D-glucosa unida a a -(1^6 ) que tiene una cadena principal con proporciones variables de enlaces y ramificaciones dependiendo de las bacterias utilizadas en la fermentación. La molécula de dextrano contiene un grupo aldehido terminal libre que no se muestra en la Fórmula I. Los enlaces a -(1^6 ) en el dextrano pueden variar del 50 al 97 % de los enlaces glucosídicos totales. Los enlaces glucosídicos restantes representan enlaces a-(1^2), a-(1^-3) y a -(1^4) unidos como ramificaciones. La fórmula I ilustra parte de la cadena principal de glucosa unida a a -(1^6 ) de dextrano con puntos de ramificación en las posiciones 2, 3 y 4. Usando la cepa B512F mencionada anteriormente, la relación de enlaces a-(1-6) es normalmente del 95 % o más.

Se encuentran valores extremadamente altos de peso molecular para los dextranos nativos. Se han informado valores que varían de 107 a 4x108 Daltons. Por lo tanto, para hacer que los dextranos se puedan utilizar para muchas aplicaciones, es necesario hidrolizar los dextranos nativos a un peso molecular inferior. Hay varios métodos conocidos y disponibles para el experto, sin embargo, la hidrólisis se puede realizar a aprox. pH 1,5, normalmente usando ácido clorhídrico, y a una temperatura de aprox. 95 °C. Mediante la hidrólisis se producen dextranos y glucosa de bajo peso molecular. El hidrolizado se purifica y fracciona normalmente mediante diversos métodos, tales como sedimentación con alcohol, filtraciones y diversos otros métodos cromatográficos, incluida la filtración por membrana.

Los dextranos para uso farmacéutico se han fabricado normalmente mediante cepas bacterianas específicas definidas en las farmacopeas de EE.UU. o Europa, tales como, por ejemplo, NCTC 10817 o B512 F de Leuconostoc Mesenteroides. La cepa B512F y NCTC 10817, como se han mencionado anteriormente, están disponibles públicamente en la National Collection Type Cultures (Central Public Health Laboratory), Reino Unido.

Entre los dextranos, se han utilizado particularmente Dextrano 40 y Dextrano 70 para uso farmacéutico humano. Otros tamaños moleculares, tales como, por ejemplo, Dextrano 500 y Dextrano 5 y los pesos moleculares intermedios se utilizan fuera del área de crioconservación como portadores para la síntesis, para la separación de células, como excipientes en vacunas o en diversas otras aplicaciones tales como la conservación de la córnea humana. Además, el Dextrano 1 tiene un uso especial en seres humanos ya que la preinyección de Dextrano 1 exhibe inhibición de hapteno y bloquea los anticuerpos de dextrano humano, evitando así reacciones alérgicas potenciales que se sabe que se producen ocasionalmente después de la administración de dextrano de alto peso molecular en seres humanos. El Dextrano 1, el Dextrano 40 y el Dextrano 70 son productos de la Farmacopea ya descritos (7a Edición de la Farmacopea Europea, volumen 2, página 1816-1819).

El dextrano también es una excelente materia prima utilizada para sintetizar polímeros solubles en agua.

Los siguientes son ejemplos de derivados de dextrano:

1) Dextrano hidrogenado que puede sintetizarse por reacción de dextrano con un agente reductor tal como borohidruro en condiciones alcalinas, por ejemplo, a pH 8-12, reduciendo los grupos terminales aldehído a sorbitol.

2) Éteres de dextrano que pueden sintetizarse mediante métodos conocidos por el experto. Como ejemplo, se puede mencionar 2-(dietilamino)etilo-dextrano (DEAE-dextrano) (mostrado en el Esquema de reacción 1) que puede sintetizarse por reacción de dextrano con cloruro de (2-cloroetil)dietilamonio en solución alcalina.

Esquema de reacción 1: Grupos DEAE-dextrano que contienen 2-(dietilamino)etilo (A) y 2-[(2-(dietilamino)etil]dietilamonio]etilo (B)

Otro ejemplo es carboxialquilo C1-10-dextrano tal como carboximetildextrano (CMD) como se muestra en el Esquema de reacción 2 que puede sintetizarse por reacción con ácido acético monocloro (MCA) en condiciones alcalinas fuertes.

Esquema de reacción 2

3) Ésteres de dextrano tales como acetato de dextrano que pueden sintetizarse por reacción de dextrano con anhídrido de ácido acético.

Esquema de reacción 3

4) El dextrano oxidado se puede sintetizar, por ejemplo, mediante un hipoclorito de sodio en una solución acuosa básica.

5) Dextrano parcialmente oxidado/hidrogenado. Un método de preparación de este tipo de derivados se divulga, por ejemplo, en el documento US 6.977.249. Como ejemplo, se puede mencionar un dextrano que se prepara mediante un proceso en el que el peso molecular de un dextrano se reduce mediante hidrólisis y los grupos terminales aldehído funcionales del mismo se convierten en grupos alcohol mediante hidrogenación; caracterizado por que la hidrogenación es solo parcial, dejando como máximo el 15 % en peso de azúcar reductor, calculado sobre la cantidad total de hidratos de carbono, y posteriormente dicho dextrano se somete a oxidación, realizándose dicha hidrogenación y oxidación para obtener dextrano que tiene sustancialmente todos los grupos aldehído convertidos en grupos alcohol y carboxílicos, y dicho producto dextrano no tiene grupos aldehído funcionales o grupos ácido carboxílico funcionales en los grupos glucosilo intermedios; en el que la hidrogenación se realiza por medio de borohidruro de sodio en una solución acuosa; y en el que la oxidación se realiza por medio de un hipoclorito de sodio en solución acuosa básica.

6) Pueden prepararse ésteres y éteres adicionales sustituidos con DEAE, sustituidos con carboxialquilo C¹-¹⁰, de dextrano hidrogenado y/u oxidado anteriormente por métodos conocidos por el experto en la técnica similares a los descritos anteriormente.

Isomalto-oligosacárido y derivados del mismo

Los isomalto-oligosacáridos son oligómeros de glucosa con una cadena principal unida a a-D-(1,6). En un aspecto, el isomalto-oligosacárido descrito en el presente documento es a base de dextrano y está elaborado por hidrólisis de dextrano de bajo peso molecular. En un aspecto adicional, el isomalto-oligosacárido descrito tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da tal como con un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da. En un aspecto, el isomalto-oligosacárido descrito en el presente documento es dextrano hidrolizado que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da.

Se puede preparar a partir de derivados de isomalto-oligosacárido de los mismos caracterizados por el cambio de los grupos terminales del aldehído reductor en glicitol/sorbitol. La conversión de isomalto-oligosacárido a isomaltooligosacárido hidrogenado puede realizarse tratando el isomalto-oligosacárido con un agente reductor, tal como, por ejemplo, borohidruro en condiciones alcalinas como se muestra en el siguiente Esquema de reacción 4:

Esquema de reacción 4

Con los procesos descritos anteriormente para elaborar derivados de dextrano, también se pueden elaborar derivados de isomalto-oligosacárido, por ejemplo, mediante la reacción con cloruro de (2-cloroetil)dietilamonio cloruro obteniendo 2-(dietilaminodextran)etilo (DEAE)-isomalto-oligosacárido. Otra opción es elaborar derivados de isomalto oligosacárido por reacción con ácido monocloroacético (MCA) para sintetizar carboximetil isomalto-oligosacárido. Para el experto en la técnica será obvio elaborar derivados adicionales de isomalto-oligosacárido hidrogenado por reacción con cloruro de (2-cloroetil)dietilamonio y ácido monocloroacético, respectivamente, como se ha descrito anteriormente bajo dextrano e isomalto-oligosacárido.

Oligo-isomaltosa

Con los dextranos como materiales de partida y Dextrano 1 (isomalto-oligosacárido) como intermedio, es posible sintetizar oligo-isomaltosa, caracterizada por una ausencia total de cadenas laterales ramificadas a-(1^-2), a-(1^-3) y a -(1^4 ) que definen las moléculas de dextrano. En el presente contexto, la oligo-isomaltosa se considera un subconjunto de isomalto-oligosacárido. Por lo tanto, en un aspecto, la oligo-isomaltosa tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da, tal como entre 85o y 1.650 Da, preferentemente entre 850 y 1.150 Da, y que tiene una ausencia total de cadenas laterales ramificadas a-(1^2), a-(1^-3) y a-(1^4). Obviamente, la misma síntesis de derivados descrita anteriormente para el isomalto-oligosacárido se puede realizar usando oligo-isomaltosa.

Dextrina y derivados del mismo

Las dextrinas son un grupo de carbohidratos de bajo peso molecular producidos por la hidrólisis del almidón. Las dextrinas son polímeros de dextrano que consisten en una mezcla de moléculas con longitud variable de la cadena principal de glucosa. Antes de usar las dextrinas, normalmente se purifican y se fraccionan, por ejemplo, aplicando hidrólisis o uno o más procesos de sedimentación de alcohol y/o mediante diverso métodos cromatográficos, incluyendo el procesamiento de membranas aplicando una o más membranas con valores de corte específicos para obtener el tamaño molecular y la distribución de peso deseados.

Las dextrinas son mezclas de polímeros de unidades de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos a -(1^4 ) o a-(1 ^ 6 ) como se muestra en la Fórmula II.

Fórmula II

Se pueden preparar derivados de dextrina mediante métodos conocidos por el experto en la técnica similares a los descritos anteriormente en dextrano e isomalto-oligosacárido.

Crioconservación

Para evitar la contaminación de la muestra a crioconservar, se prefiere que el crioprotector sea estéril y que otros componentes opcionales del agente/composición de crioconservación también sean estériles.

En algunas aplicaciones, podría ser útil complementar un crioprotector seleccionado del grupo que consiste en dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos con un crioprotector adicional para reducir la concentración de dicho crioprotector adicional, preferentemente a concentraciones no tóxicas. Esto puede ser particularmente útil para tipos de células específicos, como hepatocitos o células madre pluripotentes. En un aspecto adicional, por lo tanto, el agente crioprotector comprende además al menos un crioprotector adicional seleccionado del grupo que consiste en acetamida, agarosa, alginato, 1-analina, albúmina, acetato de amonio, butanodiol, sulfato de condroitina, cloroformo, colina, dietilenglicol, dimetil acetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido (DMSO), eritritol, etanol, etilenglicol, formamida, glucosa, glicerol, a-glicerofosfato, monoacetato de glicerol, glicina, hidroxietilalmidón, inositol, lactosa, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, maltosa, manitol, manosa, metanol, metilacetamida, metilformamida, metilureas, fenol, polioles plurónicos, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, prolina, propilenglicol, N-óxido de piridina, ribosa, serina, bromuro de sodio, cloruro de sodio, yoduro de sodio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, sorbitol, sacarosa, trehalosa, trietilenglicol, acetato de trimetilamina, urea, valina y xilosa. En un aspecto, dicho crioprotector adicional es DMSO. Una ventaja de añadir DMSO en una cantidad reducida puede ser que para células muy frágiles se puede obtener una protección adicional. En un aspecto preferido, el agente crioprotector está libre o sustancialmente libre de DMSO. Por lo tanto, aún en un aspecto preferido, dicha dextrina, dextrano, isomaltooligosacárido o un derivado de los mismos es el único crioprotector en el agente crioprotector. Un agente crioprotector libre o sustancialmente libre de DMSO puede no requerir lavado después de descongelar la muestra. A continuación, la muestra descongelada puede suspenderse directamente en un medio de cultivo para iniciar inmediatamente un proceso de cultivo sin tener que lavar la muestra o puede usarse directamente en un paciente sin una etapa de lavado que potencialmente conduce a una pérdida sustancial de células. Otra ventaja de usar un agente crioprotector libre o sustancialmente libre de DMSO es que la muestra puede exponerse al crioprotector durante un período más largo sin dañar, lo que permite un proceso de trabajo más eficiente.

En otro aspecto, el agente crioprotector comprende además al menos una proteína anticongelante y/o glucoproteína anticongelante tal como en una cantidad de 0,01 a 1 mg/ml del agente crioprotector. Un ejemplo de una glucoproteína anticongelante es AFP de tipo I de sculpin de cuernos largos, que es una hélice alfa anfipática única y larga.

El agente o composición crioprotectora puede comprender sustancias adicionales para mejorar la viabilidad de la muestra. Como ejemplos de dichas sustancias se pueden mencionar IAP (inhibidores de la apoptosis), inhibidores de las vías de señalización de la proteína cinasa asociada a rho (ROCK), factores de crecimiento tales como EGF, FGF, PDGF, IGF, EPO, BDNF, TGF, TNF, VEGF. En un aspecto adicional, se puede mencionar cualquier componente sérico de origen humano, bovino, equino, canino. El agente o composición crioprotectora también puede comprender un medio de crecimiento. En un aspecto, se puede usar un medio de crecimiento que comprende un antagonista de p-catenina/P300 y un ligando de activina/TGFp, tal como, por ejemplo, ID-8 junto con activina y TGFp. Este tipo de medio es especialmente útil para el cultivo de células madre pluripotentes, en particular, células madre embrionarias como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2013/054112. Otro ejemplo es el medio de inactivación estándar que comprende el reemplazo de suero KnockOut, DMEM/F12 con complemento GlutaMAX™, FGF, NEAA y BME. Otro ejemplo es el sistema mTSER™. El experto en la técnica conoce bien otros ejemplos de medios de cultivo que dependen de la muestra a crioconservar.

El agente crioprotector como se divulga en el presente documento puede estar en forma de un polvo tal como un polvo liofilizado o secado por pulverización.

En un aspecto adicional, dicho agente crioprotector está en forma de solución. Por lo tanto, el agente puede comprender además un disolvente tal como, por ejemplo, agua estéril. En un aspecto, dicho agente comprende del 30 % al 70 % p/p de dicho crioprotector, tal como del 40 % al 65 % p/p o del 50 % al 60 % p/p de dicho crioprotector.

La muestra, tales como células, tejidos u órganos a crioconservar, también puede estar en contacto con un tampón de pH compatible con congelación compuesto más normalmente por al menos una solución salina básica, una fuente de energía (por ejemplo, glucosa) y un tampón capaz de mantener un pH neutro a bajas temperaturas. Los materiales bien conocidos incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Este material también puede incluirse como parte de la composición y/o agente de crioconservación.

Un aspecto divulgado en el presente documento es una composición de crioconservación que comprende un agente crioprotector como se describe en el presente documento, cuya composición de crioconservación comprende además una muestra a crioconservar.

Un aspecto adicional divulgado en el presente documento es una composición crioconservada que comprende un agente crioprotector y una muestra que se ha crioconservado o está en el proceso de crioconservarse. Como se describe en el presente documento, la expresión "una composición crioconservada" significa "una composición crioconservada" que está en el proceso de crioconservarse o ya se ha crioconservado.

Un aspecto adicional divulgado en el presente documento es una composición crioconservada que comprende un medio de crecimiento o sustrato para la muestra a crioconservar.

En un aspecto, la muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos, células y tejidos, tales como de mamífero.

De acuerdo con la invención, la muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero. En un aspecto más descrito en el presente documento, la muestra son órganos, células, sangre o tejidos. Ejemplos de dichas células a crioconservar son células cultivadas in vitro que incluyen células primarias, líneas celulares, células clasificadas in vitro que incluyen células sanguíneas humanas y óvulos fertilizados de origen animal y humano. Ejemplos adicionales son los espermatozoides, células madre embrionarias, células IPS, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales, células madre de sangre de cordón umbilical, hepatocitos, células nerviosas, cardiomiocitos, células endoteliales vasculares, células de músculo liso vasculares y células sanguíneas. En un aspecto adicional, la muestra son células seleccionadas del grupo que consiste en células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células

IPS, queratinocitos, preferentemente células madre hematopoyéticas tales como células madre sanguíneas positivas para CD34, células madre mesenquimales, células madre embrionarias y células IPS. En un aspecto adicional, la muestra se selecciona del grupo que consiste en células madre mesenquimales y células madre hematopoyéticas. En un aspecto, la célula es de origen animal o humano. Ejemplos de órganos son pulmón, hígado, riñón, corazón, ovarios y páncreas. Ejemplos de tejidos son tejidos de médula ósea, piel, ovarios, testículos, vasos sanguíneos, tejido conectivo, preferentemente tejidos de ovarios y tejido conectivo. En un aspecto adicional, la sangre se selecciona del grupo que consiste en sangre de cordón umbilical y sangre periférica movilizada, preferentemente sangre de cordón umbilical. En un aspecto adicional, la muestra es un fluido corporal que contiene células, tales como sangre, fluido menstrual o líquido amniótico.

Dependiendo de la muestra específica a crioproteger, el crioprotector está normalmente presente en la composición a crioconservar en una cantidad del 1 al 50 % p/p, tal como del 2 al 50 % p/p, tal como del 4 al 45 % p/p, o del 6 al 20 %

p/p, o de 6 al 12 % p/p, o preferentemente del 6 al 10 % p/p, o más preferentemente del 7 al 9 % p/p. En un aspecto, el crioprotector está presente en la composición a crioconservar en una cantidad de como máximo el 60 % p/p, tal como en una cantidad de como máximo el 55 % p/p, tal como en una cantidad de como máximo el 50 % p/p, tal como en una cantidad de como máximo el 45 % p/p, tal como en una cantidad de como máximo el 40 % p/p, tal como en una cantidad de como máximo el 35 % p/p. En otro aspecto, el crioprotector está normalmente presente en una cantidad de al menos el 2 % p/p, tal como presente en una cantidad de al menos el 4 % p/p, tal como prese cantidad de al menos el 6 % p/p, tal como presente en una cantidad de al menos el 6 % p/p, tal como prese cantidad de al menos el 7 % p/p.

Si la composición a crioproteger comprende un crioprotector adicional tal como DMSO, el crioprotector adicional normalmente está presente en una cantidad de menos del 8 % p/p, tal como del 1-8 % p/p, tal como, por ejemplo, en una cantidad por debajo del 5 % p/p, tal como por debajo del 4 % p/p, tal como del 1-4 % p/p.

En las técnicas de crioconservación convencionales, se extrae una muestra, se suspende en una solución de almacenamiento y a continuación se conserva mediante congelación. Cuando se van a utilizar muestras, tales como células, se descongelan, por ejemplo, las células tomadas de fuentes de donantes humanas se devuelven a la temperatura normal del cuerpo humano (es decir, aproximadamente 37 °C) y a continuación se colocan en un medio de cultivo celular.

En el presente método de crioconservación, la muestra se protege durante la crioconservación poniéndola en contacto con un agente crioprotector como se describe en el presente documento antes de congelarla a la temperatura de crioconservación. Por poner en contacto con el agente crioprotector significa que la muestra se pone en contacto de alguna manera con el crioprotector de modo que durante la reducción de la temperatura a la temperatura de crioconservación, la muestra esté protegida por el crioprotector en la composición de crioconservación. Por ejemplo, las células pueden ponerse en contacto con el agente crioprotector llenando los pocillos apropiados de una placa a la que se unen las células a proteger, suspendiendo las células en una solución del agente crioprotector o añadiendo el agente crioprotector, por ejemplo, en forma liofilizada a las células, sangre u órgano ya en una solución de, por ejemplo, tampón, o resuspendiendo el sedimento celular después de la centrifugación en el agente crioprotector que lleva las células a una solución, etc.

En un aspecto, se divulga en el presente documento un método para crioconservar una muestra, que comprende las etapas de poner una muestra a crioconservar en contacto con un agente crioprotector como se define en el presente documento para obtener una composición de crioconservación y posteriormente reducir la temperatura de la composición de crioconservación a una temperatura de crioconservación.

En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método para crioconservar una composición como se define en el presente documento mediante la reducción de la temperatura de dicha composición a una temperatura de crioconservación.

La velocidad de cambio de la temperatura ambiente a 1-2 °C por debajo del punto de congelación de la solución puede tener un efecto importante sobre la viabilidad final si las células son sensibles al choque térmico.

Entre 3,5 °C y -5 °C, la muestra normalmente se induce a congelarse mediante la introducción de un cristal de hielo,

tocando la superficie del medio con una sonda fría, por vibración mecánica o reduciendo rápidamente la temperatura hasta que se produzca la nucleación del hielo. Dado que la congelación es un proceso exotérmico, el calor debe alejarse de la solución de congelación. Esto se puede hacer manteniendo las muestras sumergidas en un líquido con un punto de congelación bajo o proporcionando un disipador de calor sustancial. A medida que se forma hielo en los medios extracelulares, se une cada vez más agua libre en la fase de hielo. Las membranas celulares, al ser hidrófobas, actúan como barrera para la nucleación del hielo intracelular y, por lo tanto, las células no congeladas quedan expuestas a una solución cada vez más hipertónica. La concentración de sal extracelular aumenta como consecuencia del secuestro de agua en hielo. Las células descongeladas encogen debido al transporte de agua fuera de la célula en respuesta al desequilibrio osmótico entre las fases del líquido intracelular y extracelular. A continuación, la muestra se enfría a una velocidad finita que debe optimizarse para cada tipo de célula.

La velocidad óptima de enfriamiento se determina por la permeabilidad de la membrana celular al agua, la relación superficie/volumen de la célula, junto con el tipo y concentración de aditivos crioprotectores en el agente crioprotector como se describe en el presente documento. Para la mayoría de las células de mamífero nucleadas congeladas en glicerol o DMSO, la velocidad de enfriamiento óptima suele estar entre aproximadamente 0,3 y 10 °C por minuto. El enfriamiento continuo entre aproximadamente 4 °C y -80 °C es el más utilizado. Una vez que la muestra alcanza aproximadamente -80 °C, se puede transferir directamente a nitrógeno líquido (-196 °C) o en la fase de vapor de nitrógeno líquido para su almacenamiento. Otro método utilizado para la crioconservación es la tecnología de vitrificación en la que es posible obtener velocidades de enfriamiento muy rápidas de 1000 °C -2000 °C/min. Con esta tecnología, un dispositivo de vitrificación especializado, que contiene la composición de crioconservación con la muestra, se coloca directamente en nitrógeno líquido. En un aspecto, la temperatura de crioconservación se alcanza a una velocidad de 0,05-15, tal como 0,1-10, tal como 0,2-8, tal como 0,3-6, tal como 0,4-4, tal como 0,5-2 °C por minuto. En otro aspecto, la temperatura de crioconservación se alcanza a una velocidad de 500-3000, tal como 800­ 2500, tal como 1000-2000, tal como 1200-1800 °C por minuto.

La duración del almacenamiento de células viables a la temperatura del nitrógeno líquido depende predominantemente de la velocidad de generación de radicales libres causada por el fondo de rayos cósmicos.

Por ejemplo, se ha estimado que la semivida de los embriones de mamífero almacenados en nitrógeno líquido es de aproximadamente 30.000 años. Es importante no permitir que las células congeladas se calienten por encima de su temperatura de almacenamiento ni siquiera durante breves períodos de tiempo. El calentamiento intermitente promueve la recristalización migratoria rápida, que puede dañar la estructura celular y disminuir la viabilidad general.

En un aspecto adicional más, la muestra se descongela después de la crioconservación. La velocidad óptima de descongelación de la muestra depende de las condiciones de congelación utilizadas y de la muestra específica a conservar. En general, para células individuales congeladas en suspensión y para tejidos tales como válvulas cardíacas, es deseable una velocidad de calentamiento rápida. Un calentamiento tan rápido limita el crecimiento de cristales de hielo en las muestras congeladas y, a menudo, es un requisito absoluto para una alta supervivencia. Con muchos tejidos, este calentamiento se puede lograr agitando la muestra en un baño de agua a 37-42 °C. La razón fundamental del calentamiento rápido es que limita el crecimiento de los cristales de hielo que se formaron durante el enfriamiento.

Algunos tejidos pueden ser sensibles al calentamiento rápido. Esto se debe al choque osmótico transitorio, ya que las células quedan expuestas a una solución hipertónica extracelular cuando el hielo se derrite y se ven obligadas a rehidratarse para mantener su equilibrio osmótico. Para otras muestras más sensibles, los procesos metabólicos pueden reactivarse o llevarse a niveles normales mediante diluciones sucesivas usando suero u otros polímeros de alto peso molecular en el medio de descongelación.

Una vez completado el procedimiento de descongelación, las células todavía se exponen a concentraciones multimolares de agentes crioprotectores que deben diluirse gradualmente para devolver las células a un medio isotónico. Para las células de mamífero, se usa normalmente un protocolo de dilución escalonada. La dilución de la muestra se realiza normalmente a preferentemente 37 °C, para reducir los efectos tanto del choque osmótico como de la toxicidad del crioprotector. En un aspecto adicional, la concentración de dicho crioprotector es del 4 al 45 % p/p, tal como del 4 al 20 % p/p, tal como del 5 al 15 % p/p, o del 6 al 12 % p/p, o preferentemente del 6 al 10 % p/p, o más preferentemente del 7 al 9 % p/p de crioprotector.

En un aspecto adicional, la temperatura de la muestra en la composición de crioconservación se reduce a una temperatura de crioconservación por debajo de -50 °C, tal como entre -50 °C y -196 °C, tal como entre -80 °C y -196 °C.

En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco. En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco clínico. En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco de sangre periférica movilizada.

En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco clínico tal como en el trasplante de células madre para enfermedades neoplásicas o en un trasplante de órganos. En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco de sangre periférica movilizada, método de banco de médula ósea o en un método de banco de cordón umbilical.

En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco de médula ósea o en un método de banco de cordón umbilical. En un aspecto, el agente crioprotector se usa en un método de banco de tejido graso o en un método de banco de tejido de pulpa dental. En un aspecto adicional, el agente crioprotector se usa en un método de banco de reproducción.

Ejemplo de preparación 1

Producción de isomalto-oligosacárido 1

Hidrólisis de dextrano de bajo peso molecular

Se hidrolizan 3345 kg de dextrano hidrolizado recogido como permeado de una membrana que tiene un valor de corte <5.000 Daltons, a pH 1,5 a una temperatura de 95 °C.

La hidrólisis se monitoriza por cromatografía usando cromatografía de permeación en gel (GPC), y se termina por enfriamiento cuando se estima que el peso molecular del material que se hidroliza ha alcanzado el valor deseado, es decir, un peso molecular promedio en peso de 850-1.150 Daltons.

Mediante la hidrólisis se produce isomalto-oligosacárido de bajo peso molecular pero también se forma glucosa. Después del enfriamiento y la neutralización, la cantidad de glucosa y oligómeros de muy bajo peso molecular se reduce mediante procesos de membrana que tienen un valor de corte de 340-800 Daltons. Después de este proceso, el contenido de isomalto-oligosacárido se determina mediante rotación óptica (ao20 ~ 200) que es de 915 kg, y la cantidad de azúcar reductor se determina mediante el uso del reactivo de Somogyi que es del 22,5 %.

T l 1 R l l n li i r P

Como se ve en la Tabla 1 anterior, el isomalto-oligosacárido tiene un PM de 1020 Da y el Mn equivale a 827 Da, lo que da una polidispersidad Pd = 1,23. El azúcar reductor se mide que es del 22,5%. Este isomalto-oligosacárido también se denomina pentaisomaltosa en esta solicitud.

Ejemplo de preparación 2

Producción de isomalto-oligosacárido hidrogenado 1

Después de la hidrólisis y el fraccionamiento quedaron 418 kg de isomalto-oligosacárido. El azúcar reductor se midió al 30,8%. Esta cantidad se trató con 10 kg de borohidruro de sodio y dio como resultado 362 kg de isomaltooligosacárido hidrogenado antes del intercambio iónico final. A continuación, la solución se neutralizó a pH <7,0, y posteriormente se desionizó y finalmente se secó por pulverización. El azúcar reductor del producto final se midió al 0,09 %.

T l 2 R l l n li i r P

Como se ve a partir de la Tabla 2, el isomalto-oligosacárido hidrogenado tiene un Mw de 968 Da y el Mn equivale a 780 Da, lo que da una polidispersidad Pd = 1,24. Este isomalto-oligosacárido hidrogenado también se denomina pentaisomaltósido en esta solicitud.

EJEMPLO 1

Preparación del agente de crioconservación

El agente de crioconservación usado en los siguientes ejemplos se prepararon mediante la solubilización aséptica del crioprotector (tal como DMSO, pentaisomaltosa (isomalto-oligosacárido 1) preparada como se describe en el Ejemplo de preparación 1 o pentaisomaltósido (isomalto-oligosacárido hidrogenado 1) preparado como se describe en el Ejemplo de preparación 2) en medio de crecimiento (DMEM/F12 FBS al 10% penicilina/estreptomicina) a la concentración final deseada (por ejemplo, para el 8 % de composición de crioconservación de isomalto-oligosacárido 1, 8 gramos con respecto a 100 ml de medio de crecimiento) y con esterilización por filtro de las composiciones de crioconservación individuales.

EJEMPLO 2

Crioconservación de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF, por sus siglas en inglés):

Se cultivaron NHDF (pase 2) en matraces en T convencionales en condiciones convencionales (37 °C, CO² al 5 % y medio de crecimiento estándar [DMEM/F12 FBS al 10% penicilina/estreptomicina)]). Cuando se alcanzó la confluencia (70-80%), la población celular se liberó de los matraces y se centrifugó (1000 rpm, 10min). Se suspendieron de nuevo 0,5x106 células en seis agentes de crioconservación diferentes (1 ml); 1) medio de crecimiento DMSO al 10 %, 2) medio de crecimiento DMSO al 2 % isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, 3) medio de crecimiento + DMSO al 2 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 %, 4) medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, 5) medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % y 6) medio de crecimiento sin ningún aditivo (DMEM/F12 sin FBS). A continuación, las células se crioconservaron en condiciones de crioconservación controladas estándar utilizando una metodología basada en isopropanol, congelando a una velocidad constante de 1 °C/min hasta la temperatura del N² líquido. Después de una semana, las células se descongelaron usando un protocolo de descongelación estándar (sumergir directamente el vial en un baño de agua, 37 grados y transferir gota a gota la solución celular a un medio de crecimiento fresco a 37 °C). El siguiente análisis se realizó después de la descongelación; 1) viabilidad, usando el equipo Nucleocounter (NC200), y 2) viabilidad en 1 pase usando el equipo Nucleocounter (NC200). Los resultados se muestran en la figura 1 y 2 y se resumen en la tabla 3-5.

La viabilidad después de la descongelación se reduce ligeramente cuando se usa isomalto-oligosacárido 1 como único agente de crioconservación en comparación con la condición estándar que usa DMSO al 10 %. Cuando se usa DMSO al 2 % junto con isomalto-oligosacárido 1, no se observa ninguna diferencia con respecto a la viabilidad. La viabilidad de las células crioconservadas con isomalto-oligosacárido 1 solamente en 1 pase es similar a las condiciones estándar que utilizan DMSO al 10%. Este experimento demuestra que la crioconservación de NHDF en una solución de crioconservación usando isomalto-oligosacárido 1 como el único crioprotector da como resultado cultivos que pueden usarse en la misma extensión que los cultivos de condiciones estándar de crioconservación.

EJEMPLO 3

Crioconservación de queratinocitos humanos normales (NHEK, por sus siglas en inglés):

Los NHEK se crioconservaron usando el mismo protocolo que se ha descrito en el Ejemplo 2. Se incluyeron los mismos grupos experimentales. Los resultados se muestran en la figura 3-4 y se resumen en la tabla 3-5.

Como también se muestra para los NHDF, los resultados demuestran claramente que los NHEK se pueden crioconservar en una solución de crioconservación usando isomalto-oligosacárido 1 como único crioprotector. La viabilidad en el primer pase de cultivo está al mismo nivel que los NHEK crioconservados en condiciones estándar usando DMSO al 10 %.

EJEMPLO 4

Crioconservación de células madre mesenquimales humanas normales (hMSC):

Las hMSC se crioconservaron usando el mismo protocolo que se ha descrito en el Ejemplo 2 con dos grupos experimentales más incluidos, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 8 % trehalosa al 2 % y medio de crecimiento trehalosa al 2 %. Se realizó el análisis de viabilidad, usando la técnica Nucleocounter como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la figura 5 y se resumen en la tabla 3-5.

Los resultados demuestran claramente que las hMSC se pueden crioconservar en una solución de crioconservación usando isomalto-oligosacárido Da como único crioprotector. Se muestra que la viabilidad después de la descongelación está al mismo nivel que la formulación estándar que contiene DMSo al 10 %.

Tabla 3-5:

T1: Supervivencia después de la descongelación

T2: Supervivencia después de 1 pase

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

EJEMPLO 5

Exposición de hMSC a isomalto-oligosacárido 1

Se cultivaron hMSC hasta la confluencia en matraces en T convencionales. Las células se liberaron y se suspendieron de nuevo en dos formulaciones diferentes 1) medio de crecimiento DMSO al 10 % y 2) isomalto-oligosacárido 1 al 8 %. La concentración final de células en cada formulación fue de 1 x 106/ml de células. Se usó el mismo protocolo básico que se ha descrito en el Ejemplo 2. Se añadió 1 ml de cada vial a los crioviales y la viabilidad se analizó usando el NucleoCounter en tres puntos temporales diferentes; 1) 0 min (T0), 10 min (T10) y 30 min (T30). Los resultados se resumen en la tabla 6.

Tabla 6

Se demuestra claramente que la exposición a condiciones de crioconservación estándar afecta seriamente a la viabilidad de las hMSC. La exposición a la crioformulación con isomalto-oligosacárido 1 como único componente crioprotector solo afecta significativamente a la viabilidad después de la exposición durante 60 min. Esto demuestra que es posible manipular cultivos celulares para crioconservación en la composición de crioconservación que contiene isomalto-oligosacárido 1, lo que hace posible procedimientos de trabajo más flexibles.

EJEMPLO 6

Isomalto-oligosacárido 560 Da para la crioconservación de hMSC

Las hMSC se crioconservaron usando el mismo protocolo básico que se ha descrito en el Ejemplo 2 y se incluyeron los mismos grupos experimentales. Los resultados demuestran que es posible crioconservar las hMSC en isomaltooligosacárido 560 Da, sin embargo, el isomalto-oligosacárido 560 Da hidrogenado no es tan eficaz como el isomaltooligosacárido 560 Da en este experimento. Los resultados se resumen en la tabla 7.

EJEMPLO 7

Células iPS humanas en medio de crecimiento PluriPro

El isomalto-oligosacárido 1 usado en este ejemplo se prepara como se ha descrito en el Ejemplo de preparación 1. Se cultivaron células madre pluripotentes inducidas humanas, iPSC (por sus siglas en inglés), (pase 12) en matraces en T convencionales como células individuales en condiciones estándar (37 °C, CO² al 5 % y medio de crecimiento PluriPro, Cell Guidance System). Cuando se alcanzó la confluencia (70-80 %), la población celular se liberó de los matraces y se centrifugó (1000 rpm, 10min). Se suspendieron de nuevo 0,5x106 células en doce soluciones de crioconservación diferentes (1 ml); medio de crecimiento DMSO al 10%, medio de crecimiento DMSO al 5%, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 2 %, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 4 %, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido 1 al 2 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomaltooligosacárido 1 al 4 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 2 %, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 4 %, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido 1 al 8 % y medio de crecimiento sin ningún crioprotector. A continuación, las células se crioconservaron en condiciones de crioconservación controladas estándar (utilizando una metodología basada en isopropanol) hasta el punto de N² líquido. Después de una semana, las células se descongelaron utilizando el protocolo de descongelación estándar (sumergir directamente el vial en un baño de agua, 37 °C y transferir gota a gota la solución celular a un medio de crecimiento fresco). El inhibidor de ROCK se añadió en la primera siembra. Se realizó el análisis de viabilidad después de la descongelación, usando la técnica Nucleocounter. Los resultados se muestran en la figura 6.

Los resultados demuestran que las células iPS humanas se pueden crioconservar utilizando isomalto-oligosacárido 1 como único crioprotector, aunque la viabilidad de las células crioconservadas es significativamente menor que en los casos en los que se añade DMSO.

EJEMPLO 8

Células iPS humanas en medio de crecimiento PluriPro

El isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado usado en este ejemplo se prepara como se ha descrito en el Ejemplo de preparación 2. Se cultivaron células madre pluripotentes inducidas humanas, iPSC (por sus siglas en inglés), (pase 12) en matraces en T convencionales como células individuales en condiciones estándar (37 °C, CO² al 5 % y medio de crecimiento PluriPro, Cell Guidance System). Cuando se alcanzó la confluencia (70-80 %), la población celular se liberó de los matraces y se centrifugó (1000 rpm, 10min). Se suspendieron de nuevo 0,5x106 células en doce soluciones de crioconservación diferentes (1 ml); medio de crecimiento DMSO al 10 %, medio de crecimiento DMSO al 5%, medio de crecimiento DMSO al 10% isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 2%, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 %, medio de crecimiento DMSO al 10 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 2 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 %, medio de crecimiento DMSO al 5 % isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 %, medio de crecimiento isomaltooligosacárido hidrogenado 1 al 2 %, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 4 %, medio de crecimiento isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 8 % y medio de crecimiento sin ningún crioprotector. A continuación, las células se crioconservaron en condiciones de crioconservación controladas estándar (utilizando una metodología basada en isopropanol) hasta el punto de N² líquido. Después de una semana, las células se descongelaron utilizando el protocolo de descongelación estándar (sumergir directamente el vial en un baño de agua, 37 °C y transferir gota a gota la solución celular a un medio de crecimiento fresco). El inhibidor de ROCK se añadió en la primera siembra. Se realizó el análisis de viabilidad después de la descongelación, usando la técnica Nucleocounter. Los resultados se muestran en la figura 7.

Los resultados demuestran que las células iPS humanas se pueden crioconservar utilizando isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado como único crioprotector, aunque la viabilidad de las células crioconservadas es significativamente menor que en los casos en los que se añade DMSO. En las muestras crioconservadas sin DMSO, se observó una tendencia a mejorar la viabilidad en función de la concentración utilizada de isomalto-oligosacárido 1.

EJEMPLO 9

Crioconservación de células madre mesenquimales humanas normales (hMSC) en crioprotectores con diferentes pesos moleculares:

Las hMSC se crioconservaron usando el mismo protocolo que se ha descrito en el Ejemplo 2 que implica los siguientes grupos experimentales, medio de crecimiento DMSO al 10 %, isomalto-oligosacárido 1 al 8%, dextrano con Mw promedio de 10.000 o dextrano con Mw promedio de 40.000 DMSO al 5 %, isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, dextrano con Mw promedio de 10.000 o dextrano con Mw promedio de 40.000 DMSO al 1 %, isomalto-oligosacárido 1 al 8 %, dextrano con Mw promedio de 10.000 o dextrano con Mw promedio de 40.000 y medio de crecimiento. Se realizó el análisis de viabilidad, usando la técnica Nucleocounter como se ha descrito anteriormente. Después de la descongelación, las MSC se cultivaron durante 3 días en condiciones estándar y se analizó la tasa de proliferación mediante análisis colorimétrico in vitro, ensayo MTT que mide la actividad mitocondrial en la población celular.

Los resultados se muestran en la figura 8.

Los resultados demuestran claramente que las hMSC se pueden crioconservar en una solución de crioconservación usando isomalto-oligosacárido 1, dextrano con Mw promedio de 10.000 o dextrano con Mw promedio de 40.000 como único crioprotector. No se observaron diferencias significativas entre el Mw en el análisis de viabilidad directa después de la descongelación. Sin embargo, el análisis de la tasa de proliferación después de 3 días demostró que las hMSC crioconservadas en isomalto-oligosacárido 1 al 8 % (Mw promedio 1000) proliferaron más activamente en comparación con el 8 % de dextrano con Mw promedio de 10.000 y Mw promedio de 40.000.

EJEMPLO 10

Crioconservación de células madre mesenquimales humanas normales (hMSC) en isomalto-oligosacárido con un Mw promedio de 1500 Mw:

Las hMSC se crioconservaron usando el mismo protocolo que se ha descrito en el Ejemplo 2 que implica los siguientes grupos experimentales, medio de crecimiento DMSO al 10%, medio de crecimiento DMSO al 2%, isomaltooligosacárido al 8 % que tiene un Mw promedio 1500 Mw DMSO al 2 %, isomalto-oligosacárido al 8 % que tiene un Mw promedio 1500 Mw y medio de crecimiento. Se realizó el análisis de viabilidad, usando la técnica Nucleocounter como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la figura 9.

Los resultados demuestran claramente que las hMSC se pueden crioconservar en una solución de crioconservación usando isomalto-oligosacárido que tiene un Mw promedio de 1500 como único crioprotector.

EJEMPLO 11

Viabilidad de las células madre hematopoyéticas CD34+ después de la crioconservación con DMSO, isomaltooligosacárido 1 o isomalto-oligosacárido hidrogenado 1.

Se recogieron células de sangre periférica movilizadas mediante leucoféresis y se congelaron en medio crioprotector que contenía DMSO al 10 % o diferentes concentraciones de isomalto-oligosacárido 1 (isom) o isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado (h-isom). Las muestras se congelaron usando un congelador de velocidad controlada (Kryo 560-16, Planer; temp. de inicio 4 °C, -1 °C/min reducida a 0 °C, -2 °C/min reducida a -45 °C y -5 °C/min reducida a -100 °C) y se movieron a -150 °C. Las muestras se descongelaron en un baño de agua a 37 °C. Se aplicó citometría de flujo para estimar la viabilidad de las células madre hematopoyéticas CD45+, CD34+. El compuesto de unión a ADN fluorescente 7-aminoactinomicina D (7-AAD) se usó como marcador live/dead. Se asumió que las células capaces de excluir 7AAD eran viables. Los resultados se muestran en la figura 10: Isomalto-oligosacárido 1 (barras de color gris claro), isomaltooligosacárido hidrogenado 1 (barras de color gris oscuro) y DMSO (barras de color negro). Los datos que se muestran aquí son de 3 experimentos diferentes, cada uno medido en dobletes. Las barras de error indican la desviación estándar.

Tanto el h-isom como el isom soportan la viabilidad de las células hematopoyéticas CD34+ después de la crioconservación en el mismo grado que el DMSO estándar al 10 %. Se demuestra una clara tendencia hacia un efecto protector más alto con concentraciones más altas tanto de i-som como de isom. Las concentraciones del 4 % ejercen un efecto protector significativamente menor (por debajo del 60 %) que las concentraciones del 6 %, 8 %, 10 % y el 12 %. Las concentraciones del 10 % y el 12 % tienen un efecto protector similar en comparación con el DMSO al 10 %. En el estudio no se observaron diferencias significativas entre los efectos protectores del h-isom y el isom.

EJEMPLO 12

Viabilidad de las células madre/estromales derivadas de tejido adiposo (ASC) tras la crioconservación con DMSO, isomalto-oligosacárido 1 o isomalto-oligosacárido hidrogenado 1.

Se recogieron ASC de tejido adiposo obtenido mediante liposucción cosmética del abdomen o la parte interna de los muslos usando el dispositivo Vibrasat (Moller Medical GmbH & Co. KG, Fulda, Alemania). Las ASC de la fracción vascular estromal se expandieron ex vivo en un medio de cultivo que consistía en medio de Eagle modificado de Dulbecco, penicilina-estreptomicina al 1 %, GlutaMAX al 1 % y lisado de plaquetas humanas combinado al 10 %. Las células se congelaron en medio crioprotector que contenía DMSO al 10 % o diferentes concentraciones de isomaltooligosacárido 1 (isom) o isomalto-oligosacárido 1 hidrogenado (h-isom). Las muestras se congelaron usando un congelador de velocidad controlada (Kryo 560-16, Planer; temp. de inicio 4 °C, -1 °C/min reducida a 0 °C, -2 °C/min reducida a -45 °C y -5 °C/min reducida a -100 °C) y se movieron a -150 °C. Las muestras se descongelaron en un baño de agua a 37 °C. Se aplicó citometría de flujo para la caracterización del fenotipo (positivo para CD73, CD90, CD105 y negativo para CD14, CD20, CD45 y CD34) y para estimar la viabilidad de las ASC. El compuesto de unión a ADN fluorescente 7-aminoactinomicina D (7-AAD) se usó como marcador live/dead. Se asumió que las células capaces de excluir 7AAD eran viables. Los resultados se muestran en la figura 11: Isomalto-oligosacárido 1 (barras de color gris claro), isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 (barras de color gris oscuro) y DMSO (barras de color negro). Los datos que se muestran aquí son de un solo experimento medido en dobletes. Las barras de error indican la desviación estándar. El resultado para el DMSO es menor de lo esperado.

Tanto el h-isom como el isom como crioprotectores soportan la viabilidad de las ASC en la misma medida que el DMSO al 10 %. Excepto por una baja concentración del 4 %, las concentraciones más altas dan como resultado una viabilidad superior al 70 %. Una concentración del 12 % da como resultado una viabilidad significativamente mayor (80 % - 90 %) en comparación con concentraciones más bajas. En el estudio no se observaron diferencias significativas entre los efectos crioprotectores del h-isom y el isom excepto en el grupo del 4 %.

EJEMPLO 13

Después de la extirpación de los ovarios de ratón, se transfieren a un medio McCoy complementado con 10 mg/ml de HSA, pen./estrep. y se mantienen a 37 °C hasta que se transfieren a las siguientes soluciones de crioconservación: 1) condiciones estándar (PBS, 1,5mol/l de etilenglicol, 0,1 mol/l de sacarosa, 10mg/ml de HSA similar a la crioconservación de tejido ovárico humano) o 2) con PBS, isomalto-oligosacárido 1 al 10 % (p/v).

Los ovarios se equilibran durante 30 min en hielo y a continuación se transfieren a un criocongelador programable (congelador programable Planner Cryo 10, Reino Unido) donde las muestras se enfrían a -140 °C con las siguientes rampas (temp. de inicio: -1 °C; -2 °C/min hasta -9 °C; mantenimiento de 5 min; siembra; -0,3 °C/min hasta -40 °C, -10°C/min hasta -140 °C y a continuación directamente en nitrógeno líquido). Posteriormente, se sumergen en nitrógeno líquido y se mantienen en un tanque de nitrógeno líquido durante un período de tiempo variable. Descongelación: Temperatura ambiente en agua caliente a 37 °C; 10 min en un medio con isomalto-oligosacárido 1 (20 % p/v) y a continuación directamente en medio de fijación. En las preparaciones histológicas, ambos ovarios muestran folículos supervivientes en diferentes etapas de desarrollo.

EJEMPLO 14

Los ovarios de ratón se tratan como se ha descrito en el Ejemplo 13 anterior pero en las siguientes soluciones de crioconservación: 1) condiciones estándar (PBS, 1,5 mol/l de etilenglicol, 0,1 mol/l de sacarosa, 10mg/ml de HSA similar a la crioconservación de tejido ovárico humano) o 2) con PBS, 1,5 mol/l de etilenglicol, 10 mg/ml de HSA, isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 10% (p/v) o 3) con PBS, 10 mg/ml de HSA, isomalto-oligosacárido hidrogenado 1 al 10 % (p/v). En las preparaciones histológicas, todos los ovarios muestran folículos supervivientes en diferentes etapas de desarrollo.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente crioprotector, que comprende un crioprotector que es uno o más de:

dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido, y derivados de los mismos cuyo derivado se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado, dextrina hidrogenada, isomaltooligosacárido oxidado, dextrano oxidado, dextrina oxidada, DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomaltooligosacáridos, carboxialquil C^1-10-dextrina, carboxialquil C-Mü-dextrano y carboxialquil C^1-10-isomaltooligosacárido; y

a) en donde dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, o

b) en donde dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da,

para crioconservar una muestra, y en edonde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector.

3. El uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1-2, en el que dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 500 y 3.500 Da.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1-3, en el que dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido y derivados del mismo y tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.650 Da.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho crioprotector tiene una polidispersidad de >1 y <5.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho crioprotector es isomaltooligosacárido que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.150 Da.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p y/o en el que la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p.

8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido o un derivado de los mismos son el único crioprotector en el agente crioprotector.

9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho agente comprende al menos un crioprotector adicional seleccionado del grupo que consiste en acetamida, agarosa, alginato, 1-analina, albúmina, acetato de amonio, butanodiol, sulfato de condroitina, cloroformo, colina, dietilenglicol, dimetil acetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido (DMSO), eritritol, etanol, etilenglicol, formamida, glucosa, glicerol, a-glicerofosfato, monoacetato de glicerol, glicina, hidroxietilalmidón, inositol, lactosa, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, maltosa, manitol, manosa, metanol, metilacetamida, metilformamida, metilureas, fenol, polioles plurónicos, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, prolina, propilenglicol, N-óxido de piridina, ribosa, serina, bromuro de sodio, cloruro de sodio, yoduro de sodio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, sorbitol, sacarosa, trehalosa, trietilenglicol, acetato de trimetilamina, urea, valina y xilosa.

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dichos órgano de mamífero, célula de mamífero o tejido de mamífero son funcionales después de la crioconservación, preferentemente, en donde dicho órgano de mamífero conserva al menos el 50 % de su función fisiológica; en donde dicho tejido de mamífero conserva al menos el 50 % de su capacidad para integrarse con el tejido circundante; o en donde dicha célula de mamífero conserva al menos el 50 % de su viabilidad.

11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero de un ser humano.

12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicha muestra son células seleccionadas del grupo que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre embrionarias y células IPS, o en el que dicha muestra son células sanguíneas, o en el que dicha muestra es tejido ovárico.

13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicha muestra son células sanguíneas.

14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicha muestra son células madre hematopoyéticas.

15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicha muestra son células madre hematopoyéticas derivadas de sangre periférica tales como células madre sanguíneas positivas para CD34.

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho crioprotector es isomaltooligosacárido que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 850 y 1.150 Da, en el que la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene menos de 3 unidades de glucosa es menor del 15 % p/p y en el que la fracción en peso de isomalto-oligosacáridos que tiene más de 9 unidades de glucosa es menor del 20 % p/p, para crioconservar una muestra en donde dicha muestra son células madre hematopoyéticas.

17. Un agente crioprotector que comprende un crioprotector que es uno o más de dextrina, dextrano, isomaltooligosacárido y derivados de los mismos, cuyo derivado se selecciona del grupo que consiste en isomalto-oligosacárido hidrogenado, dextrano hidrogenado, dextrina hidrogenada, isomalto-oligosacárido oxidado, dextrano oxidado, dextrina oxidada, DEAE-dextrina, DEAE-dextrano, DEAE-isomalto-oligosacáridos, carboxialquil C¹-¹⁰-dextrina, carboxialquil C¹-¹⁰-dextrano y carboxialquil C¹-¹⁰-isomalto-oligosacárido; y

a) en donde dicho agente crioprotector comprende al menos el 1 % p/p de uno o más de isomalto-oligosacárido y derivados del mismo que tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 1.650 Da basado en el peso total de dextrina, dextrano, isomalto-oligosacárido y derivados de los mismos en dicho agente crioprotector, o

b) en donde dicho crioprotector tiene un peso molecular promedio en peso (Mw) de entre 300 y 9.500 Da.

18. El agente crioprotector de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el crioprotector es como se define adicionalmente en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 16.

19. Una composición de crioconservación que comprende un agente crioprotector como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y cuya composición de crioconservación comprende además una muestra a crioconservar, en donde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células somáticas o células madre de mamífero, y tejidos de mamífero, con la condición de que la muestra no comprenda el cuerpo humano en las distintas etapas de su formación y desarrollo.

20. La composición de crioconservación de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha muestra es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10-15.

21. La composición de crioconservación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-20, que comprende dicho crioprotector en una cantidad del 1 al 50 % p/p.

22. La composición de crioconservación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, que comprende DMSO en una cantidad del 1 al 4 % p/p.

23. La composición de crioconservación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-22 que comprende además un tampón de pH compatible con la congelación capaz de mantener un pH neutro a bajas temperaturas.

24. Un método para crioconservar una muestra, que comprende las etapas de poner una muestra a crioconservar en contacto con un agente crioprotector como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 para obtener una composición de crioconservación y posteriormente reducir la temperatura de la composición de crioconservación a una temperatura de crioconservación, en donde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en órganos de mamífero, células de mamífero y tejidos de mamífero.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha muestra es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10-15.