JP3509148B2 - 凍害保護剤および凍結保存方法 - Google Patents
凍害保護剤および凍結保存方法Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
であるニストースを有効成分とする凍害保護剤および凍
結保存方法に関する。さらに詳細には、ビフィズス菌,
乳酸菌,大腸菌等のような微生物または植物,動物の培
養細胞を凍結するときに起こる凍結障害を抑制し、生存
率を向上させる凍害保護剤および凍結保存方法に関す
る。
物や細胞の貯蔵・保存は単に優れた系統の保存に用いら
れるのみならず、その利用範囲が拡大しつつある。例え
ば、微生物では、ビフィズス菌や乳酸菌等は、その凍結
乾燥菌体が整腸効果をもつ食品素材として繁用されてい
る。また、特定の遺伝子を導入された大腸菌等の保存は
遺伝子工学上重要な課題となっている。
貯蔵・保存のために凍結保存が行われている。従来、こ
のような凍結保存においては、生理学的に受容可能な凍
害保護剤で希釈した後、凍結貯蔵・保存する方法が殆ど
である。しかしながら、凍結は生物にとって苛酷であ
り、凍結および融解工程で生ずる熱的衝撃や結晶生成の
ために、その生存率を低下させることが多い。従って、
凍結保存後の生存率をより高める凍害保護剤と凍結保存
方法の開発が切望されていた。
理的に受容可能な保護剤で希釈する方法が検討され、グ
リセロールが有効であることが見出された(Polge,ネイ
チャー(Nature),164巻,666頁,1949
年]。その後も凍害を抑制するための保護剤の開発が行
われている。例えば、ビフィズス菌や乳酸菌の凍結乾燥
製剤化において、生存率を向上させるために添加する保
護剤としてラクチュロース(特開昭52−151787
号公報)、ビタミンE類(特公昭53−5747号公
報)、コーンスティープリカー(特開昭58−1047
87号公報)、生澱粉(特開昭58−149675号公
報)およびサイクロデキストリン(特開昭63−251
080号公報)を用いる方法が知られている。しかし、
これらの方法は、該保護剤を大量に使用するにはその物
質が高価であったり、嗜好性が好ましくない等の問題点
があった。また、動物細胞を凍結保存する場合、その凍
結培地中に血清の添加を必要とするか、あるいは血清の
代わりに保護剤として、メチルセルロースやトレハロー
ス(特表平4−501112号公報)あるいはトレハロ
ースとゼラチン(特開平5−7489号公報)を添加す
る方法も確立されている。しかしながら、これらの方法
も生存率の向上が課題となっている。
過程における微生物や細胞の死滅を抑制するため種々検
討した結果、イヌリン型フルクタンであるニストースを
希釈液中の凍害保護剤として使用することにより、凍結
保存時または凍結乾燥時においても微生物や細胞の死滅
を著しく抑制できることを見出し、本発明を完成させ
た。
有することを特徴とする微生物または細胞のための凍害
保護剤並びにニストースを含む溶液中に微生物または細
胞を浸した後、凍結または凍結乾燥させることを特徴と
する微生物または細胞の凍結保存方法を提供するもので
ある。
ものがあり、例えばビフィドバクテリウム・アドレスセ
ンテス,ビフィドバクテリウム・インファンテス,ビフ
ィドバクテリウム・ビフィダム,ビフィドバクテリウム
・ロンガム,ビフィドバクテリウム・ブレーベ等のビフ
ィズス菌、ストレプトコッカス・フェーカリス,ラクト
バチルス・アシドフィラス等の乳酸菌、エッシェリシア
・コリK−12のような大腸菌、バチルス・ズブチリス
・マルブルグ168株のような枯草菌、サッカロミセス
・セレビシェのような酵母を挙げることができる。
山羊,羊,兎,ハムスター,ラット,マウスの胚,癌細
胞,T−cell白血病細胞,ハイブリドーマ,繊維芽
細胞,血管構成細胞,骨髄細胞,分散膵島細胞,魚類の
培養細胞等が挙げられる。植物細胞としては、イネ,コ
ムギ,ニチニチソウ,トウモロコシ,サトウキビ,タバ
コ,ラベンダー,リンゴ,ニンジン,ダイズ,ゼニゴ
ケ,イチゴ,バレイショ,カーネーション,エンドウ,
アスパラガス,メキャベツ,ナシ等の培養細胞やプロト
プラスト,茎頂および不定胚などを挙げることができ
る。
離等により集菌し、適当な洗浄液で洗浄を行った湿菌体
が利用され、細胞は振盪培養などの任意の方法で培養し
た細胞を用いることができる。得られた微生物または細
胞は、そのままもしくは少量の緩衝液を加えた懸濁液と
して用い、予め殺菌したイヌリン型フルクタンを含む希
釈液中に懸濁させる。
て含み、他の成分としてはスキムミルク,ジメチルスル
フォキシド,グリセリン,ブドウ糖,ショ糖,乳糖,ビ
タミン類などを単独で、もしくは適宜組み合わせ、必要
に応じて同時にまたは付加的に添加して用いることがで
きる。
凍結する微生物や細胞に適した濃度で使用すればよく、
好ましくは1〜40重量%の範囲で用いる。また、本発
明のニストースは、凍害保護剤の組成の一部または全部
として使用することができる。ニストースはショ糖にフ
ルクトースが直鎖的に結合している重合度4のフルクタ
ンである。
抽出し、あるいはショ糖にフルクトース転移能力を持つ
酵素を作用させることにより得られるイヌリン型フルク
タンをカラムクロマトグラフィーまたは膜等を用いて部
分精製することにより重合度3〜6の糖を主成分とする
フルクタン混合物を得、さらにカラムクロマトグラフィ
ーや晶析等を組み合わせることにより、イヌリン型フル
クタンである重合度4のニストースを得ることができ
る。
を特徴とする微生物または細胞のための本発明凍害保護
剤は、従来知られている有効成分を含む既知凍害保護剤
に比べて、凍結保存後に微生物や細胞が生き残る比率
(生存率)の大幅な向上を示しており、微生物または細
胞の凍結過程における死滅を有効に防止することができ
る。
までも例示であって、本発明はこれに限定されるもので
はない。 実施例1 ビフィズス菌(ビフィドバクテリウム・ロンガム)をB
L培地で37℃,24時間嫌気培養し、培養後直ちに遠
心分離により培養液より菌体を分離した。集菌した菌体
を嫌気性リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し、これを再び
遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量3分し、以
下の実験に供した。 (イ)得られた湿菌体をニストース(重合度4のイヌリ
ン型フルクタン)6.7重量%のみを含む希釈液に均一
に懸濁させた後、−25℃で凍結させ、24時間保存
後、凍結・融解(−25℃で凍結、30℃で急速融解)
を3回繰り返した。 その結果、凍結保存菌の生菌数は
2.08×108 /mlで、生存率は41.6%であった。
イヌリン型フルクタン(組成:重合度3〜10のもの5
2%、重合度11以上のもの34%)6.7重量%のみ
を含む希釈液に湿菌体を均一に懸濁させた後、前記
(イ)と同様の操作を行った。その結果、凍結保存菌の
生菌数は1.25×108 /mlで、生存率は25.5%
であった。 (ハ)対照例としてショ糖6.7重量%(モル濃度0.1
M)のみを含む希釈液に湿菌体を均一に懸濁させた後、
前記(イ)と同様の操作を行ったところ、凍結保存菌の
生菌数は6.30×107 /mlで、生存率は12.9%
であった。
ス)をBL培地で37℃、24時間嫌気培養し、培養後
直ちに遠心分離により培養液より菌体を分離した。集菌
した菌体を嫌気性リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し、こ
れを再び遠心分離、集菌した。得られた湿菌体を等量4
分し、以下の実験に供した。 (イ)得られた湿菌体を、ニストース(重合度4のイヌ
リン型フルクタン)3重量%およびスキムミルク10重
量%を含む希釈液に重量比1:1で混合し、pH7.0(5
規定水酸化ナトリウム溶液)に調整した。混合液をシャ
ーレに分注し、−20℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後の
生菌数は1.18×1011/gであり、生存率は33.5
%であった。
の混合物であるメイオリゴP(商品名、明治製菓社製、
組成:重合度3のもの44.4%、重合度4のもの42.
9%、重合度5のもの8.9%、重合度6のもの0.6
%)3重量%およびスキムミルク10重量%を含む希釈
液と湿菌体を重量比1:1で混合した後、前記(イ)と
同様の操作を行った。凍結乾燥後の生菌数は1.08×1
011/gであり、生存率は30.6%であった。 (ハ)対照例としてフラクトシルニストース(重合度5
のイヌリン型フルクタン)3重量%およびスキムミルク
10重量%を含む希釈液と湿菌体を重量比1:1で混合
した後、前記(イ)と同様の操作を行ったところ、凍結
乾燥後の生菌数は1.09×1011/gであり、生存率は
30.8%であった。 (ニ)対照例として乳糖3重量%およびスキムミルク1
0重量%を含む希釈液に湿菌体を重量比1:1で混合し
た後、前記(イ)と同様の操作を行った。その結果、凍
結乾燥後の生菌数は5.88×1010/gであり、生存
率は16.7%であった。
37℃、24時間培養し、培養後直ちに遠心分離により
培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン酸緩衝
液(pH7.0)で洗浄し、これを再び遠心分離、集菌し
た。得られた湿菌体を等量3分し、以下の実験に供し
た。 (イ)得られた湿菌体をニストース(重合度4のイヌリ
ン型フルクタン)10重量%のみを含む希釈液に均一に
懸濁し、−25℃で凍結した。24時間保存後、凍結・
融解(−25℃で凍結、30℃で急速融解)を3回繰り
返した。その結果、凍結保存菌の生菌数は3.99×1
08 /mlで生存率は41.6%であった。
度3のイヌリン型フルクタン)10重量%のみを含む希
釈液に湿菌体を均一に懸濁させ、前記(イ)と同様の操
作を行ったところ、凍結保存菌の生菌数は2.47×1
08 /mlで、生存率は25.8%であった。 (ハ)対照例としてトレハロース10重量%のみを含む
希釈液に湿菌体を均一に懸濁させ、前記(イ)と同様の
操作を行ったところ、凍結保存菌の生菌数は1.86×
106 /mlで生存率は20.2%であった。 (ニ)対照例としてショ糖10重量%のみを含む希釈液
に湿菌体を均一に懸濁させ、前記(イ)と同様の操作を
行った。その結果、凍結保存菌は生菌数1.77×108
/mlで生存率は18.3%であった。
地で37℃、24時間培養し、培養後直ちに遠心分離に
よって培養液より菌体を分離した。集菌した菌体をリン
酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し、これを再び遠心分離、集
菌した。得られた湿菌体を等量2分し、以下の実験に供
した。
ヌリン型フルクタン)6.7重量%のみを含む希釈液に
均一に懸濁し、−25℃で凍結した。24時間保存後、
凍結・融解(−25℃で凍結、30℃で急速融解)を3
回繰り返した。凍結保存菌の生菌数は4.0×108 /
mlで生存率は47.6%であった。 (ロ)対照例としてショ糖6.7重量%のみを含む希釈
液に湿菌体を均一に懸濁させ、前記(イ)と同様の操作
を行った。その結果、凍結保存菌の生菌数は1.32×1
08 /mlで生存率は15.7%であった。
胎児血清を添加したMEM培地で37℃で培養した後、
0.25%トリプシン液で処理して細胞を剥した。これ
を遠心管に入れ、500〜600rpmで5〜10分間
遠心して細胞を採集した。得られた細胞を等量3分し、
以下の実験に供した。 (イ)ニストース(重合度4のイヌリン型フルクタン)
を最終濃度10重量%になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し1〜2時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−80℃で凍結し9日間保存し
た。37℃の恒温槽で融解後、増殖培地で10〜20倍
程度希釈し、500〜600rpmで5〜10分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果、9
3%生存していた。
10重量%になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記(イ)と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は6
5%であった。 (ハ)対照例としてグルコースを最終濃度10重量%に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記(イ)と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は62%であっ
た。
O−K1細胞を用い、10%牛胎児血清を添加したHa
m's F12培地にて37℃で培養した後、0.25%
トリプシン液で処理して細胞を剥した。これを遠心管に
入れ、500〜600rpmで5〜10分間遠心して細
胞を採集した。得られた細胞を等量3分し以下の実験に
供した。 (イ)ニストース(重合度4のイヌリン型フルクタン)
を最終濃度10重量%になるように血清を含む増殖培地
に加えてよく撹拌して凍結用培地を調製した。冷温状態
で、凍結用培地に細胞を加えて懸濁し1〜2時間静置
し、凍害保護剤を細胞内に浸透させた後、アンプルに封
入した。このアンプルを−80℃で凍結し9日間保存し
た。37℃の恒温槽で融解後、増殖培地で10〜20倍
程度希釈し、500〜600rpmで5〜10分間遠心
して細胞を採集した。融解した細胞は、トリパンブルー
染色を用いて生死を確認し、生存率を算出した結果、8
8%生存していた。
10重量%になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記(イ)と
同様の操作を行ったところ、凍結・融解後の生存率は6
1%であった。 (ハ)対照例としてグルコースを最終濃度10重量%に
なるように血清を含む増殖培地に加えてよく撹拌して凍
結用培地を調製した。これを前記(イ)と同様の操作を
行ったところ、凍結・融解後の生存率は48%であっ
た。 (ニ)対照例としてジメチルスルフォキシドを最終濃度
10重量%になるように血清を含む増殖培地に加えてよ
く撹拌して凍結用培地を調製した。これを前記(イ)と
同様の操作を行った。その結果、凍結・融解後の生存率
は78%であった。
培養し、0.7Mマンニトール中でメイセラーゼP−1
(商品名、明治製菓社製)で処理し、濾過・遠心・洗浄
し、プロトプラスト懸濁液を得た。得られたプロトプラ
ストを等量3分し以下の実験に供した。 (イ)ニストース(重合度4のイヌリン型フルクタン)
を最終濃度20重量%、ジメチルスルフォキシドを最終
濃度10%になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾
過・滅菌して凍結用培地とした。プロトプラスト懸濁液
に冷温状態で、この凍結用培地を少量ずつ穏やかに撹拌
しながら加えた。30分〜1時間程度静置し、凍害保護
剤をプロトプラスト内に浸透させた後、液体窒素中−1
96℃で凍結し9日間保存した。37℃の恒温槽で急速
融解後、氷中で0.4Mマンニトールを含む液体培地で
希釈し、遠心してプロトプラストを採集した。融解した
プロトプラストは、エバンズブルー染色を用いて生死を
確認し、生存率を算出した結果、52%生存していた。
20重量%、ジメチルスルフォキシドを最終濃度10%
になるよう上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌
し、凍結用培地とした。これを前記(イ)と同様の操作
を行ったところ、凍結・融解後の生存率は42%であっ
た。 (ハ)対照例としてシュークロースを最終濃度20重量
%、ジメチルスルフォキシドを最終濃度10%になるよ
う上記培地に加えてよく撹拌して濾過・滅菌し、凍結用
培地とした。これを前記(イ)と同様の操作を行ったと
ころ、凍結・融解後の生存率は28%であった。
や植物、動物の細胞を凍結する際に、凍結障害を抑制
し、その生存率を向上させることができる。したがっ
て、本発明は食品工業,医薬品工業等の分野において有
用性が高い。
Claims (4)
- 【請求項1】 ニストースを有効成分として含有するこ
とを特徴とする微生物または細胞のための凍害保護剤。 - 【請求項2】 微生物または細胞がビフィズス菌,乳酸
菌,大腸菌,枯草菌,酵母または植物,動物の培養細胞
である請求項1記載の凍害保護剤。 - 【請求項3】 ニストースを含む溶液中に微生物または
細胞を浸した後、凍結または凍結乾燥させることを特徴
とする微生物または細胞の凍結保存方法。 - 【請求項4】 微生物または細胞がビフィズス菌,乳酸
菌,大腸菌,枯草菌,酵母または植物,動物の培養細胞
である請求項3記載の凍結保存方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27482793A JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27482793A JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0799965A JPH0799965A (ja) | 1995-04-18 |
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ID=17547130
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
JP27482793A Expired - Lifetime JP3509148B2 (ja) | 1993-10-07 | 1993-10-07 | 凍害保護剤および凍結保存方法 |
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EP1504663A4 (en) * | 2002-03-28 | 2010-07-21 | Meiji Seika Kaisha | COMPOSITION FOR ORGAN STORAGE AND ORGAN STORAGE METHOD |
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KR102196974B1 (ko) * | 2012-11-30 | 2020-12-31 | 파르마코스모스 에이/에스 | 동결 보호제, 동결 보호 및 동결 보존 조성물, 그 용도 및 동결 보존 방법 |
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-
1993
- 1993-10-07 JP JP27482793A patent/JP3509148B2/ja not_active Expired - Lifetime
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