JPS5982301A - 生体細胞或は組織の凍結保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生体細胞或は組織の凍結保存方法に係る。近
時、医学・細吻学・免疫学・逍伝子上学などの研究、応
用が盛になるにつれ、種々の生体細胞や組織を凍結保存
する必要性が増大してきている。即ち、血小板、淋巴球
、白血球、骨髄等の血液成分や、角膜・皮虐等の生体細
胞や組ＫＪ（５、白血病細胞その他の１匝瘍細胞、Ｘ’
ｌ’を子、卵子、夕ぞ情理等の人工授精材料、バクテリ
ア、ウィルス等の微生物株や組織培養細胞等を凍結１゛
）コ存して、・Ｌ３′枕な時に解凍し、研究や治療等の
用途に供する方法が広く行われる様になってきている。

しかし、２等生体の細胞や組織は、その凍結ノ゛■作に
於ける冷却速度が過大で急激な凍結を起したり、温度制
御が不良で温度の乱高下を招くと大きな影響を受ける。

急激な温度変化や凍結・解凍は、デリケートな生体の細
胞や組織に所謂失活の現象を惹起し、移植・培養の目的
を達し得ないことも屡々である。冷却のスピードは、余
りに速過ぎても、余りに遅過ぎても細胞は損傷を受け、
例えは液体窒素中に浸漬する瞬間凍結では、生体の細胞
や組織は破壊されてしまう。

そこでこの失活を防ぎ、凍結保存・解凍後の生残率即ち
生体細胞或は組織の回収率を向上させる為の工夫が従来
から行われており、単位時間当りの降下温度を一定のプ
ログラム（計画）に従って制御するプログラム（計画）
温度制御による凍結方法が一般に推奨され、プログラム
フリーザーと名イ」けた装置も幾種か市販されている。

之等の装置で凍結・解凍を行った後の生体細胞或は組織
の回収率としては、実験の結果では最高６５％程度の成
績しか得られなかった。残念ながら十分満足し得る成績
とは痘いｔＩＥのがその実情である。その回収率の高さ
や信頼性は、研究や応用の成否の鍵となるものであるか
ら、この回収率については更に−ｍと信頼性のある向上
が望まれている現状にある。この種の装置の中には、生
体の細胞・組織を保護液中に懸濁浮遊させた浮遊液を収
容する容器スチクステープを巻いてシールした後、冷却
室内に並べて凍結保存をするものがある一方、ポリエチ
レンやポリプロピレン等のポリオレフィン、或はポリエ
ステルやテフロン等のプラスチフス製容器を用い、キャ
ップを本体に螺子溝で固着させ冷ルギーの供給に迅速に
対応し得る点温度制御上有胞毒性に関し信頼性に些か欠
ける点があるのではないかとの危惧を残している点に加
え、外部から内部の様子が観られないという欠点があり
、シールにプラスチクステープを巻付けて使用すると熱
伝導率の高い利点が減殺される上に、接着性のテープを
巻く手間は思ったより繁雑で、テープの殺菌や使用され
る粘着剤の寒冷劣化等のトラブルを考えるとかなり厄介
である。一方プラスチクス容器の場合は、キャップは螺
子止めで殺菌やシール操作が簡単で扱い易く、低価格で
製造できて使い棄てし易い。内部の浮遊液の状況も液状
のま＼であるか、凍結したか等外部から容易に透視、観
察し得るという大きな長所を有する上に、細胞毒性につ
いての危惧をしなくて済みその面での信頼性が高い反面
、軽金属製のものに比して熱伝導率が低いという欠点を
免れ得ない。

凍結・解凍を安心して実施することができ、各段階に於
ける生体細胞・組織の状態を観察・確認しながら操作を
進め得て、しかも従来よりも高い回収率を得たいという
願望は、この分野に携る者にとっＣは切火なものかあっ
たが、この様な願望を如何にして実現するかは、残され
た技術的課題であった。

しかるに本発明者は、この問題に取組んで鋭意研究を進
めた結果、遂にそれを解決することに成功し、本発明を
完成するに至った。

本発明は、［生体細胞或は組織を保護液中に浮＃懸濁さ
せた生体細胞或は組織の浮遊液を冷却室内に収容し、こ
の浮遊液にそれを振盪或は攪拌する力を作用させながら
冷却室に寒冷エネルギーを供給し、この浮遊液の冷却・
凍結曲線が実質的に直線上に乗る様に設定した操作刷面
曲線に従って、浮遊液の内温が凝固点に達する迄はその
内温の検出値と操作計画曲線との偏差に応じて寒冷エネ
ルギーの供給速度を制御し、浮遊液が凝固点に達したら
上記操作３１画曲線に従って寒冷エネルギーの供給速度
を急増させ、上記浮遊液を収容する冷却室内で浮遊液外
の雰囲気温度をこの浮＃液の腑同点よりも低い一定温度
に一定時間保つ様に液相から固相への相遷移の間の寒冷
エネルギー供給速度を制御し、その後は再び固化した浮
遊液の内温の検出値と操作計画曲線との偏差に応じ−Ｃ
寒冷エネルギーの供給速度を制御する如く、夫々の冷却
・凍結の段階に対応して上記寒冷エネルギーの供給速度
を制御し、生体細胞或は組織を冷却凍結することを特徴
とする生体細胞或は組織の凍結保存方法。」に門する。

本発明の方法は、血小板、淋巳球、白血球、肯髄等の血
液成分や、角膜、皮／ｉ１ｇ等の生体細胞や組織、白血
病細胞その他の腫瘍細胞、精子、卵子、受精卵等の人工
授精材料、バクテリア、ウィルス等の微生物株や組織培
養細胞等を凍結保存する場合に適用される。凍結保存に
当っては、上に挙けた如き利石には、凍害床性の為グリ
セリンやジメチルスルホキサイド（ＤＮ４ＳＯ）等を水
成は生理的食塩水に溶解して得られる保護液を添加し、
生体細胞或は組織をこの保護液中に浮遊懸濁させたγｊ
’　請ｍをポリプロピレン等のプラスヂクス製或はアル
ミニウム合金等の金Ｒ製のアンプル、チュ・−ブ、→Ｊ
ラックバッグといった容器に入れて凍結装置の冷却室内
に収容する。

実施例１〜２で使用する冷却凍結装置を示す第１１図に
よって該装置を説明する。１は本発明の方法を実施する
ために用いる冷却・凍結装置外装、２は断熱材３で内張
すした冷却室、４は生体細胞或はに、ｎ牟ｊ戊のｌ’ｉ
’−漁液を容れた７７器、５（」このｈン；÷を収容す
るラック、６はγ７−　ｉＩｌ’ｊ　液を′ｄれた’？
）’　２１Ｙ　’ｊクランク共に閘（すする支持台、７
は一ヒ記支持台を勅ｊかづ−クランク軸、８は振、＋Ｈ
＞川−Ｕ襲１モーク、９はファン、］０はファン用モー
タ、１１は！３冷エネルキー供給用液化窒素噴１川管、
１２はｌ（Ｖ化窒斐供給Ｗ４．　（Ｉ−制御用電磁ｆｌ
Σ、１３は安全弁、１４は７Ｔ’　）’Ｊｊ液内温測定
センーリーー、１５は冷却￥′りｆ囲気ン端測定センー
リ−−１１６は制？１用マイク【コンピュータ、１７は
Ｉ′ＩＩＭ　Ｑ’：　Ｎ己ぞ債芹（，１８はヒータ、１
９（計グクト、２０はタクト出口、２１１４液化窒素供
給ラインである。

生体細胞或は組織の浮姉＋Ｉり（以］・、省略してＩｔ
に１７所液と呼ぶ）を容Ｉ］たｂ））：→４Ｉｊ、ン賃
却二４−２　Ｉ’］・こ振ｔ’ｌ　Ｄ１能な様に設けら
れたランク５に９・スリ、振Ｖ１用駆動モータ８とこれ
に連結したクランク軸７によりラック上の浮遊液を振１
ｎさせる。ｚノ拵液を冷却するための寒冷エネルギーを
供給するには、液化窒素噴出管１１から液化ガスを＋１
１＋を出さぜ、この液化カスのイ」１給ノ・１１度は、
制御用マイクロコンピュータ１６によって作動する電磁
弁１２を開閉することによって１ｌｉｌｌ　ｉ’ｌｉ　
″する。マイクロコンピュータ１６番こＣよ、汁＋’ｊ
ｊ液内温測定士ン→ノー１４及び冷却￥ダ１囲気ｌ席ン
則疋センリーｊ！５で検出される温度データを入力し、
コンピュータに内蔵する記（意装置に記１意させｌこ操
作１１１画曲＋’ｉｊ＋ｌを実現丈る様に上記電磁弁の
開閉を制？１１１　’１ろ。、ファン用モータ１０によ
って１嘔動するファン９は、冷却室内の温度を均一にす
るために作動さｌる。センーリー１４・１５によって測
定し７たｒＭ度データハ、マイクロコンピュータ１Ｇを
介して温度記録計Ｖ７で記録させる。

この扛ＩｔＬで本発明の方法を実施して浮遊液を冷却７
．）ｉｆ結した場合の時間一温度の関係を、ｊＪ５２図
に示した。実線は浮荷液内温の操作計画（目標）曲線で
あり、殆どこの直線状の目標曲線と重なった点１「ｊ８
が、１メ栃液内温として検出された温度を示しＣいる。

浮ｔＤｖ内に振）及力を与゛えながら、冷却開始点へか
ら次第に７ｇ度を下げ凝固点Ｂに達する迄は、浮、弄液
内温度とこの目標曲線との偏差をＯならしめる様に、液
化窒素の供給速度を電磁弁を細かく開閉して制作する。

Ｂ点に達したら、′電磁弁の操作は記憶装置の記憶に基
いて、冷却室内イｆ囲気温が一点鎖線で示したＢ−＋Ｆ
→Ｇのコースを辿る様に切替えさせる。即ちＢで電磁弁
は連続量の状態となり、Ｆ−＋６間で冷却室昼間気温を
一定時間一定に保ち、Ｇ点に達したら、再び電磁弁１゛
−作を浮酔液内温と目標曲線との偏差をＯならしめる作
動に切替える。Ｂ　−＋　Ｆ−＋６間では、浮′ａｊ液
の液相から固相への相遷移に伴って発生ずる凝固熱を吸
収して、浮遊液内温の下降を目標曲線に沿って直線状に
するために（」、上述の如く寒冷エネルギー供給速度制
御の基阜とする検出温を切替えることが極めて重要であ
る。Ｇ点で再ひこの切替えを゛行うことによって、浮澹
液内温は直線状に下１パコすると共に、冷却室内温は凝
固熱の余ツ゛、シによって若干上昇し、一点鎖線によっ
て示した如＜Ｇ−＋Ｈ＝Ｉの如き曲線を描く。

記憶装置に電子プログラムとして入力すべきＢ→Ｆ　−
Ｇという折線グラフを設定するに＋−Ｊ、　、試行錯誤
による予備試験を行うのであるが、凝固点は保護液の種
類・濃度によって殆ど決定されるので、一定の保内液の
一定の濃度の浮遊液の凝固点と目標曲線の所望の勾配即
ち冷却速度を決めて、操作計画曲線を設定すれば、浮遊
液に入れる生体細胞・組織の種類が異っても、同一の操
作計画曲線を用いてその冷却凍結を行って差支えない。

本発明の方法が、浮遊液を冷却凍結させる際１こ温度を
途中で乱高下させる様なことがなく、凝固を起す相遷移
の間も浮遊液内温が如何に直線的に下降するかを理解し
易くするため、他の種々の制御方法を実験した場合の温
度・時間曲線即ち冷却凍結曲線を第３図〜第７図に示し
た。

第３図は、冷却室内雰囲気温（一点鎖線）を一定勾配で
下降させ、浮遊液の凝固点に達しても特に操作を斐えな
い場合を示す。浮遊液の温度（点線）は、冷却室雰囲気
温（一点鎖線）が下降するにつれ、一定の温度差を以っ
て降下するが、凝固点Ｂに到達すると発生する凝固熱に
より浮遊液温はＢ−、Ｃと横這いになり、０点に至って
再び下降に転じ、Ｄ−、Ｅでは再ひ最初の下降曲線上に
乗る。

この場合は、浮遊液に振盪・攪拌力を与えても与えなく
ても、浮遊液内温の曲線は同様の形をとる。

た＼゛し、振盪攪拌力を与えると浮遊液内温と冷却室内
雰囲気温との温度差が小さくなり、振盪攪拌を与えない
とこの温度差が大きくなる。

第４図は、実績で示した目標曲線に対して、点線で示し
た浮遊液内温度を近づけるため、目標温度より一定温度
低い冷却室内雰囲気温の目標曲線（一点鎖線）を設定し
、冷却室内温の検出値とこの目標値との偏差を０ならし
める様に、液化窒素供給用電磁弁の開閉をマイクロコン
ピュータ制御した場合を示す。浮遊液に振盪撹拌力は与
えない。

次第に冷ｆｆＪ’して浮遊液が凝固点に達する迄は、浮
遊液内の温度曲線は小さな波動を示しながら下降するが
、凝固点に達したところでは波動は大きくなり、この波
動が小さくなる迄には相当時間がか＼ることが示されて
いる。

第５図は、実線で示した目、標曲線に対して、点線で示
した浮遊液内温度を近つけるため、両温度の偏差をＯな
らしめる様に、液化窒素供給の電磁弁をマイクロコンピ
ュータ制御した場合を示す。

これは浮遊液に振盪攪拌力は与えず、凝固点Ｂ＃こ′　
達し相遷移が開始されても電磁弁の制御方法を変えない
場合である。過冷却や急激な温度上昇を交互に繰返して
温度が乱高下するのを免れない。

第６図は、浮遊液を振盪し、実線で示した設定目標温度
曲線に乗せようと、浮遊液内温度と該曲線との偏差を０
にする様に、液化窒素供給の電磁弁開閉をマイクロコン
ピュータ制御した場合を示す。浮遊液内温が凝固点Ｂに
達する迄は、本発明の方法と同一の条件で極めて良好な
制御となり、浮遊液内温曲線を示す点線は、殆ど目標温
度曲線である実線と重なっているが、凝固点Ｂに達した
後は、相遷移により発生する大量の熱を吸収するには、
浮遊液内温と目標曲線との偏差から電磁弁を開閉する制
御という操作では若干のタイムラグを免れず、目標曲線
に対し過熱・過冷を交互に繰返す波を発生させ、これを
目標曲線に乗る様に収斂させるには相当の時間を要し、
相当低温の領域に達してしまうことが分る。

第７図では、浮遊液に振盪を与えず浮遊液の凝固点まで
は浮遊液内温の目標温度曲線（実線）からの偏差をＯな
らしめる様に欧化窒素供給弁の開閉をマイクロコンピュ
ータ制御し、凝固点Ｂに達したら冷却室内雰囲気温を一
定温度まで丁げてその後は再ひ浮遊液内温度と目標温度
曲線との偏差を０にする様に液化窒素供給の電磁弁の開
閉をコンピュータ制御した場合である。即ちこの場合は
本発明の方法に於ける振盪攪拌力を与えない場合に相当
するのであるが、この場合浮遊液内の温度分布が不均一
になるためか浮遊液内温曲線を示す点線は目標温度曲線
に対し、冷却開始直後から過冷・過熱を交互に繰返し、
凝固点Ｂて液化窒素を多量に供給した後はこの過冷・過
熱の波の振幅が増大された恰好で温度制御の状態は不良
であった。

これ等の実験結果から分る様に、本発明の方法は、（１
）浮遊液にそれを振盪或は攪拌する力を作用させること
と、（２）冷却・凍結の段階に対応して冷却室に供給す
る寒冷エネルギーの供給速度を制御すること、この制御
の内容としては、浮りｋ液の冷却・凍結曲線が実質的に
直線上に乗る様に設定した操作計画曲線に従って■浮遊
液の内温か凝固点に達する迄はその内温の検出値と操作
計画曲線との偏差に応じて寒冷エネルギーの供給速度を
制御し、■浮ＩＪｊ液が凝固点に達したら上記操作曲線
に従って寒冷エネルギーの供給速度を急増させ、上記浮
遊液を収容する冷却室内で浮遊液外の雰囲気温度を、こ
の浮遊液の凝固点よりも低い一定温度に一定時間保つ様
に、液相から固相への相遷移の間の寒冷エネルギー供給
速度を制御し、■その後は再び固化した浮遊液の内温の
検出値と操作計画曲線との偏差に応じて寒冷エネルギー
の供給速度を制御することが必須の要件であり、この要
件を外すと目的とする良好な温度制御を実現することは
できないか、これ等の要件を満たすと、冷却凍結時の温
度制御を驚く程精緻に実施し得るのである。この著しい
効果は、生体細胞或は組織の浮遊液を容れる容器が、金
属製のものは勿論、プラスチフス製のものであっても充
分発揮されるので、熱伝導の不良を危惧することなくプ
ラスチフス製容器を使用でき、その場合、細胞毒性の懸
念、容器を使い棄てにすることによるコスト高等を免れ
、しかも透明又は半透明の容器はその中を観察し得るし
キャップの着脱も容易で、本発明は生体細１１）η或は
組織の浮遊液の冷却凍結による保存の技雨を著るしく進
歩させるものである。

本発明の方法では、浮遊液に振盪１２拌力を与えて浮遊
液内部の温度の均一化と伝熱の促進か行われるので、浮
遊液の容器を成る程度大きくてきる。

既述の説明及び後述の実施例では、浮遊液を容れた容器
をラックに載せ、このランクを冷却室内に設置した支持
台に載せ、この支持台をモータに連結したクランク軸に
よって往復運動させることによって、浮遊液を振盪して
いるが、ラックを収容した冷却室全体を振盪しても差支
えなく、成る程度大きな容器を使用する場合は、容器中
に生体細胞或は組織に対して無害の月料（例えばプラス
チフスやセラミックス等）で被覆した電磁撹拌用回転子
を入れて攪拌してもよく、振盪と攪拌を併用しても差支
えない。

本発明の方法に於て、寒冷エネルギーを供給する手段と
しては、液化ガスを冷却室内に直接吹込んで蒸発させ蒸
発潜熱を奪うことによって冷却する方法が使い易いが、
冷却室の壁面或は冷却室内部室間に冷却管を設け、冷却
管中に深冷した冷媒（液化ガス）を通して冷却すること
もできる。この間接冷却に用いる液化ガスとしては一般
に冷凍機用の冷媒として使用できるものであれば何れも
使用でき、例えばアンモニア、炭酸ガス、クロロメチル
、フロンガス（フレオン）、亜硫酸カス、クロロエチル
、ジクロルメタン、エタン等は使い易い。冷却室内に直
接吹込んで冷却に用いるガスは、■生体細胞・組織に無
害なもの、■防災上問題の少いものである必要がある。

代表的なものとしては、液化窒素、液化ヘリウム、液化
空気等があげられるか、上記■、■の条件を満たす限り
、例えは、ネオン、アルゴン等の不活性ガス液化物や、
窒素富化ガス（窒素以外に無害の成分の混在したもの）
の液化物の如き混合ガスを使用することもできる。

液化ガスを直接冷却室に吹込む場合の力パスの１噴出管
は、冷却室の容量・構造と必要な寒冷エネルギーの供給
速度に対応して、その寸法・個数・ＮＱ置場所等を適宜
決定する必要かある。浮Ｉｎ　Ｉ＋５の４目遷移の際に
は急檄に寒冷エネノシ・ギーをイノ（半合しな番）れは
ならないので、この様な供給速度の激変番こＩＪＩ応す
るために、一般に噴出管は複数個設置してｖ友給速度の
緩急に応じて夫々の開閉を別々齋こ行ｂ）ｉ−４一つ綜
合的に制御すること゛が望ましし）。

温度制御を肌理細かく設定繰作計画的んＩ（こ忠実に行
うためには、温度センサー、マイクロコンピュータ等が
鋭敏、正確であることも当然望ましＧ１゜また、寒冷エ
ネルギーの供給速度制御審こ１０吉する電磁弁や温度を
均一に且つ熱交換を促進するためのファンや振盪攪拌装
置等も装置全体の）くランスを崩さない様、夫々の性能
を選メく必要力）あり、これ等は本発明の範囲内で適宜
設計を変更し得る。

次に実施例を挙げて、本発明に史番こ説明を加えるが、
これ等の実施例は、単に本発明の説明の為に示したもの
であり、これ等実施例によって何等本願が限定されるも
のではなく、本発明はその趣旨を逸脱しない限りその実
施態様を広汎に変形し得ることは勿論である。

実施例　１〜２　及び　対照例１〜２ ヒト淋巴球細胞（実施例１及び対照例１）及びマウス白
血病細胞（実施例２及び対照例２）を試料として、第１
図に示した本発明の方法を実施する様に製作した装置（
実施例）及び、市販の冷却凍結装置（対照例、米国ユニ
オンカーバイト社製、型番　ＣＲＦ−１、液化窒素噴射
冷却式、試行錯誤により設定したプログラムに基き、液
化窒素供給速度を電磁弁により制御、凝固点ては液化窒
素を急増して噴射、各点に於ける供給量制御は経過時間
に対して行われ、測定温度による修正は行わない。プロ
グラムに組みずみ）の冷却室内ラックに収容した。

試料は、夫々の細胞の懸濁液１．８１ｎｌに保護液とし
てジメチルスルホキサイド０．２７！を添加して生成す
る浮遊液として試験に供した。夫々の浮遊液は、容量４
−のプラスチフス製ｉ　（ＮＵ　ＮＣｖｉａｌ、米国ユ
ニオンカーバイド社製品）に入れ、夫々の冷却凍結装置
の冷却室内のラックに載せた。

浮遊液内温の冷却速度の目標値は、すべて−１℃／分と
して冷却凍結実験を行った。

実施例１及び２では、凍結後−１５０℃まで冷却、また
対照例１及び２では、凍結後−８０℃まで冷却し、その
後−１９６℃の液化窒素式凍結保管容器に移して、−昼
夜この温度で保管した。

次に試料を３７℃の恒温槽中で解凍し、遠心洗滌（１ｏ
ｏｏ　ｒｐｍ、　１０分間、２回）後、常法によりカウ
ント試験に供した（エリスロシンＢ０．０２％濃度）試
験の結果を第１表に示した。生細胞回収率が、実施例で
は対照例に比較して断熱優秀であり、極めて好い成績を
示した。

なお、参考のため、対照例１及び２の場合の冷却凍結曲
線を第８図に示した。実施例１及び２の場合の冷却・凍
結曲線は既述の第２図であり、両図を比較すると、本発
明の方法を実施すると温度制御が極めて良好に行われる
ことが理解される。

第　　　１　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施する際に用いる冷却凍結装
置の１例を示す説明図、第２図は本発明の方法を実施し
た場合の浮遊液の冷却凍結曲線、第３図〜第７図は、制
御方法を種々変えた場合を比較する冷却凍結曲線、第８
図は市販の冷却凍結装置の１例によって得られる冷却凍
結曲線である。 １・・・・・冷却凍結装置外装、２・・・・・・冷却室
、３・・・・・断熱材、４・・・・・・生体細胞或は組
織の浮遊液を容れた容器、５・・・・・・ラック、６・
・・・・・支持台、７・・・・・・クランク軸、８　、
、、、、、振盪用駆動モータ、９・・・・・・ファン、
１０・・・・・・モータ、１１・・・・・・液化窒素噴
出孔、１２・・・・・・制御用電磁弁、１３・・・・・
安全弁、１４・・・・・・浮遊液内温測定センサー、１
５・・・・雰囲気温測定センサー、１６・・・・・・制
御用マイクロコンピュータ、１７・・・・・・温度記録
計、１８・・・・・　ヒータ、１９・・・・・ダクト、
２０・・・・・タクト出口、２１・・・・・液化窒素供
給ライン。 特許出願人　大陽酸素株式会社 −７＝ 湿　　　　第４図 度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 生体細胞或は組織を保護液中に浮ｉ庁懸濁させた生体細
   胞或は組織の浮遊液を冷却室内に収容し、この浮遊液に
   それを振帰或は龍拌する力を作用さぜｌＪがら冷却室に
   寒冷エネルギーを供給し、このノア、１弄液の冷却・凍
   結曲線が実質的に直線上に乗る様に設定した操作計画曲
   線に従って、浮１Ｊｆｊ液の内）１−Ａが心固点に達す
   る迄はその内温の検出値と操作計画面ソ′鵠との１１１
   ４差に応じて寒冷エネルギーの供給１・ｊｊ　Ｊ（Ｊ：
   を制ｉ１：ｌ　Ｌ、浮訪液がトＪ固点に達したら上記操
   。 作計画曲線にｉ、；Ｙ：って寒冷エネルギーの供給速度
   を急増させ、上記浮遊液を収容する冷却室内て浮瀞ａ￥
   外の祥１ｆｌｌ気温度をこの浮ｉ詐゛液の凝固点よりも
   低い一定温Ｊｒ［に一定時間保つ様に液相から同相への
   相帛移の間の寒ン７５エネルギー供給速度を制御し、そ
   の後は古び固化した浮遊液の内温の検出イｊｉ’ｊと１
   ゛−作計画曲線との偏差に応じて寒冷エネルギーの供給
   速ｐ：を側番１ｊする如く、夫々の冷却・ｄ１５．結の
   ｊ１階に対）、ふして上記寒冷エネルギーのｌｌ−給速
   度を制御し、生体細胞或は組織を冷却凍結することを特
   ｔ′（［とする生体細Ｉｌａ或は組織の凍結保存方法。