CN114460210A - 用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒及方法,所述试盒包括真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品、真菌毒素质控品;其中,所述真菌毒素标准曲线工作品、真菌毒素同位素混合内标品以及真菌毒素质控品均通过稳定剂固定于相对应的样品瓶内;所述试剂盒可通过真菌毒素同位素混合内标品和/或真菌毒素标准曲线工作品对待测物中相对应的真菌毒素液质联用定量检测。本发明采取标准品稳定剂固化技术手段实现将真菌毒素标准品装配于样品瓶内形成检测试剂盒,提高方法准确度、精密度和检测效率,降低方法操作难度,用于高精准样品检测和标准物质/质控样的精准定值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒及方法。
背景技术
目前,由于真菌毒素种类多样,且存在协同污染,为确保全面、快速的了解粮食中真菌毒素的污染情况,迫切需要一种简单、快速、灵敏、同时准确测定粮食中多种真菌毒素的方法。目前真菌毒素的检测标准主要是免疫亲和柱净化-高效液相色谱检测,由于免疫亲和柱的价格昂贵、净化耗时长、检测毒素单一、难以实现高通量批处理净化样品,大大增长了样品处理时间,降低了检测的效率,真菌毒素污染情况反馈缓慢。
现行有效的粮食行业标准LS/T 6133-2018《粮油检验主要谷物中16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法》通过建立直接提取、稀释,内标法同时精确测定谷物中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(DON-3G)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-AcDON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马毒素B1、B2(FB1、FB2)、杂色曲霉毒素(ST)、T-2毒素、HT-2毒素检测方法。样品通过提取-稀释-检测,有效避免了净化过程中目标物的损失,减少对净化材料的依赖,降低检测成本,提高样品前处理效率,实现多组分快速同时检测。使用稳定同位素内标定量能够有效的补偿每个真菌毒素的基质效应,保证液质分析结果的准确性和稳定性。有效提升多种真菌毒素检测水平,加强我国真菌毒素污染检测能力,保证粮食质量安全。
市面上现有真菌毒素标准品均为单一标准品或某一类标准品,且标准品浓度与限量真菌毒素的限量规定浓度以及实际样品中污染比例不匹配。配制16种真菌毒素外标混合溶液和内标混合溶液复杂费时,而且操作过程容易发生交叉污染,配制器具未经校准,配制浓度不准确等问题。而内标作为定量检测的标尺,容易在操作过程中加入内标量偏差较大,最终导致定值偏差、标准品浪费等一系列问题。实验人员要想对整个实验过程的准确性进行评估,还需挑选比对不同品牌的成分分析标准物质,费时且容易出问题。另外,内标和外标标准品一般采用氮吹来达到固定的目的,但是在氮吹过程中,有机试剂挥发的同时,有可能将黄曲霉毒素真菌毒素等吹飞,导致目标物含量不稳定,无法用于准确定性、定量。
此外,现有产品检测真菌毒素的过程中,检测试剂均需实验人员配制标准品,以及样品的基质效应干扰等导致方法准确度差,操作复杂;液体内标品和标准曲线工作品在运输过程中,容易发生倾洒、溶剂挥发等,容易造成目标化合物的损失,最终影响最终检测结果的准确性。
综上所述,现有的对真菌毒素的检测方法、标准物质/质控样品定值方法等工作中,存在检测结果不准确,检测过程复杂等缺陷,试剂稳定性不佳等问题,亟待进一步改进。
发明内容
为此,本发明提供一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂及方法。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明实施例提供一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,所述试剂盒包括真菌毒素标准曲线工作品和真菌毒素同位素混合内标品;
其中,真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中均通过加入稳定剂后,再经氮吹/冻干/真空烘干或喷雾干燥稳定固定于相对应的样品瓶内;
所述试剂盒可通过真菌毒素同位素混合内标品和/或真菌毒素标准曲线工作品对待测物中相对应的真菌毒素液质联用定量检测;
所述真菌毒素选自黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素、T-2毒素或HT-2毒素、麦角碱类毒素,交链孢霉类毒素,白僵菌素、恩镰孢菌素等其他常见的毒素中的至少一种。
本发明的一个实施例中,所述试剂盒还包括真菌毒素质控品。
本发明的一个实施例中,所述稳定剂为二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜和1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种或几种。
本发明的一个实施例中,所述真菌毒素标准曲线工作品包括多个浓度梯度真菌毒素,且每个浓度梯度含精准浓度的对应种类的碳13同位素真菌毒素内标物;
所述真菌毒素同位素混和内标品含精准浓度的对应种类的碳13同位素真菌毒素内标物。
本发明的一个实施例中,所述真菌毒素标准曲线工作品的浓度梯为至少3个浓度。
本发明还提供一种利用所述的试剂盒高精准检测多种真菌毒素方法,所述方法包括以下步骤:
将称取的待测样品,粉碎、提取、稀释后,获得待测样品液;
将定量的所述待测样品液加入所述真菌毒素同位素混和内标品混合均匀,得到待测混合样品液;
将待测混合样品液进行检测,待测混合样品溶液中真菌毒素的浓度为F(μg/L),F=E*A/B,其中,A为待测混合样品液中真菌毒素的峰面积,B为同位素混合内标的峰面积,E为同位素混合内标的浓度(μg/L)。
本发明另一方面还提供一种利用所述的试剂盒高精准检测多种真菌毒素方法,所述方法包括以下步骤:
将称取的待测样品,粉碎、提取、稀释后,获得待测样品液;
将定量的所述待测样品液加入所述真菌毒素同位素混和内标品混合均匀,得到待测混合样品液;
将定量的提取稀释液加入所述真菌毒素标准曲线工作品内混合均匀,得到真菌毒素标准曲线工作溶液;
将真菌毒素标准曲线工作品和待测混合样品液分别进行检测,并以真菌毒素标准曲线工作品检测数值建立标准工作曲线:Y=ax+b,其中,Y为真菌毒素标准曲线工作品中真菌毒素的峰面积与对应种类的碳13同位素真菌毒素的峰面积的比值,x为真菌毒素标准曲线工作品对应的浓度值;
将待测混合样品液中真菌毒素峰面积与对应的真菌毒素同位素混和内标品峰面积的比值代入上述工作曲线公式,得到待测混合样品液中真菌毒素的浓度。
本发明的一个实施例中,将所述真菌毒素质控品用于与所述待测样品液相同处理检测过程,得到真菌毒素质控品的峰面积与真菌毒素同位素混和内标品峰面积的比值,将所述比值代入所述公式,用于验证检测过程是否准确。
本发明的一个实施例中,所述待测样品的浓度计算公式为其中,C为待测样品中待测毒素的含量(μg/kg);x为待测样品液中待测毒素的浓度(μg/L);V待测样品液的体积(L);m为称取待测样品的重量(kg);f为提取液稀释因子。
本发明中,采用二甲基亚砜(DMSO)作为稳定剂,二甲基亚砜(DMSO)常温下为无色无臭的透明液体,高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性,不易被氮吹吹干。
本发明具有如下优点:
本发明采取标准品稳定剂固化技术手段实现将真菌毒素标准品装配于样品瓶内形成检测试剂盒,降低方法操作难度,提高方法检测效率及准确度。
本发明的真菌毒素检测试剂使用一种高沸点、不与目标化合物发生反应、不干扰液质联用仪检测的固化载体,如DMSO、甘油等,避免氮吹等固化过程的目标物损失,从而达到将内标、外标固化在样品瓶内便于检测、运输和保存的目的。由于内标与目标化合物在相同浓度下响应一致,因此可以利用内标的浓度对目标化合物对应浓度水平(±30%)进行准确定量检测。
本发明的试剂通过同位素内标品校正消除样品基质效应,浓度适配限量真菌毒素国家限量标准以及自然污染样品中的实际含量水平的标准曲线以及成分分析国家标准物质的使用,提高方法检测准确度,实现精准定值。
本发明的方法省去复杂费时的混标标准品配制、内标配制、标曲配制、内标加入一系列操作过程,降低标准品配制、内标加入引入的误差,避免试剂对人员毒害作用;使用碳13同位素内标有效解决LCMS离子抑制与离子增强效应,提高相对回收率,试剂套装使用快速便捷,检测时间短,操作简单,准确度高。
本发明的检测试剂盒中真菌毒素成分分析国家标准物质的配备,省去成分分析标准物质选购的时间及检测用量少,避免造成的整袋浪费及几十倍的价格提升。本发明的试剂盒无需传统的净化柱,避免目标物的损失,提高绝对回收率,环保节约;试剂盒的使用进一步提高样品检测通量,同时提高检测方法检测准确度和精密度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是示例性的,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本发明可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的稳定剂对氮吹影响的柱状图;
图2为本发明实施例提供的真菌毒素液体标准品和稳定剂固化标准品对真菌毒素稳定性的试验结果图;
图3为本发明实施例提供的稳定剂固化标准品对真菌毒素在-20℃条件下稳定性的试验结果图;
图4为本发明实施例提供的利用真菌毒素同位素内标检测待测样品真菌毒素浓度的方法的质谱图;
图5为本发明实施例提供的利用同位素内标品精确定量和超标判定结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、稳定剂对于氮吹的影响
取80个带有内插管的进样小瓶,分别将50μL配制好的17种混合真菌毒素质控品和15种真菌毒素混合内标标液加入内插管小瓶内,10个小瓶为一组,总共分为8组;其中,第一组中每个小瓶中加入100μL甲醇溶液,第二到八组中,分别加入100μL 10%的二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液。
每个内插管小瓶放入氮吹仪中,在相同氮气压力和流速下40℃进行吹干。全部吹干后,加入200μL乙腈:水:乙酸(35:64.5:0.5,v/v/v)涡旋1min复溶后上质谱检测。
如图1和表1所示,结果表明加入稳定剂二甲基亚砜后,在试剂表面形成了一层薄膜,该层薄膜能够有效防止真菌毒素被吹走,减少了氮吹导致的真菌毒素损失,使得固化成为可能,且便于试剂的运输。如表1所述,为稳定剂对氮吹影响的试验结果。
表1
二、稳定剂对真菌毒素稳定性的影响
1、为考察稳定剂二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮固化后的真菌毒素的标准品与液体真菌毒素的标准品在运输过程中是否会发生分解和损失,模拟内插管小瓶在极端运输温度60℃下,往复旋转震荡,保存七天的稳定性,分别在第1天、3天、7天随机抽取3瓶用固化后的真菌毒素标准品和液体真菌毒素标准品进行检测。
检测结果如图2和表2所示,结果表明稳定剂二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮固化后的标准品在极端运输条件下稳定性良好,固化后的真菌毒素标准品更有利于运输。表2为稳定剂在运输条件下试验结果。
表2
2、稳定剂对真菌毒素稳定性的影响
为考察二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮固化后的标准品是否会发生反应或者分解,实验考察在-20℃保存1、3、6、9、12个月的稳定性,如图3和表3所示,表明所有真菌毒素在固化后没有发生明显的分解,稳定性良好,得到很好的保存,有利于储存。表3为稳定剂对储存效果的试验结果。
表3
实施例2
本实施例提供的利用本发明的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂检测待测样品中真菌毒素的方法,其包括以下步骤:称取的待测样品,粉碎、提取后,获得待测样品液;向待测样品液中加入真菌毒素同位素混和内标品混合均匀,得到待测混合样品液;将待测混合样品液进行检测,待测混合样品溶液中真菌毒素的浓度为F(μg/L),F=E*A/B,其中,A为待测混合样品液中真菌毒素的峰面积,B为同位素混合内标的峰面积,E为同位素混合内标的浓度(μg/L)。
1、本实施例利用内标筛查确证
本实施例中,以真菌毒素质控品替代待测样本进行检测验证方法的可行性:
如图4所示,可以看出真菌同位素质控品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON,m/z297.1333)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇稳定同位素内标(13C-DON,m/z312.1836)保留时间一致,均为4.4min;
待测样品液1(样品1)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON与13C-DON的保留时间一致,通过二级质谱图确证可以看出样品1与标准品二级质谱图一致;
待测样品液2(样品2)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON与13C-DON的保留时间很接近,但是通过二级质谱图确证可以看出待测样品液1(样品1)与标准品二级质谱图一致,因此判断样品4.22色谱峰为干扰峰,证明通过同位素内标品保留时间来进行定性确证的方法可行可靠,该方法适用于使用高分辨质谱进行全扫描检测时进行定性确证。
2、本实施例利用同位素内标品精确定量和超标判定
如图5所示,通过图5可以看出真菌同位素质控样品中DON的峰面积(A)为58650777,13C-DON的峰面积(B)为61618609,13C-DON的浓度(E)为125μg/L,假设待测样品液上机检测液中DON的浓度为F(μg/L),利用公式则F=E*A/B,带入公式得待测样品液的浓度为F=125*58650777/61618609=118.98μg/L,进一步的,根据公式C=(x×V×f)/m,其中,x为待测样品液中待测毒素的浓度(μg/L);V为待测样品液的体积(L),;m为称取待测样品的重量(kg);f为提取液稀释因子。本实施例中,加入提取液的体积20mL,0.02升(L);m为称取待测样品的重量(kg),本实施例中,样品称样量5g,即为0.005kg;f为提取液稀释因子,提取液稀释因子为2。
计算即C=(118.98*0.02*2)/0.005kg=951.84μg/kg,在本实施例的质控品DON的标示值990±130μg/kg范围内,证明本发明内标法计算待测溶液真菌浓度的方法是可行可靠的。
3、超标判定
由于DON的峰面积低于13C-DON的峰面积,因此判为未超限量,通过公式计算结果为951.84μg/kg,未超限量,证明本发明的方法采用内标浓度和响应来判断是否超限量值,简单可靠。本发型将内标品浓度设定为限量真菌毒素的限量值,可以实现快速判定样品中对应真菌毒素是否超限量,即待测样品液中目标化合物响应高出内标响应即为超出限量值,低于内标响应则判定为未超限量值。
实施例3
本实施例提供一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,该试剂盒包括真菌毒素质控品、真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品;其中,所述真菌毒素质控品、真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中均通过稳定剂固定于相对应的样品瓶内,具体的是在真菌毒素质控品、真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中加入稳定剂后,利用氮吹、冻干、真空烘干或喷雾干燥将真菌毒素质控品、标准曲线工作品以及内标品稳定固定在内插管小瓶内,以达到便于使用、运输、储存的目的。具体的,稳定剂为二甲基亚砜;该试剂盒可通过真菌毒素同位素混合内标品和/或真菌毒素标准曲线工作品对待测物中相对应的真菌毒素定量检测。
具体的,本实施例中,真菌毒素质控品包括黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮质控品,其中,黄曲霉毒素B1的浓度为17.5±2.5μg/kg、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度为990±130μg/kg、赭曲霉毒素的浓度为5±0.65μg/kg、玉米赤霉烯酮的浓度为46.5±6.3μg/kg,真菌毒素质控品用于验证所建立的真菌毒素标准曲线以及所得到的待测样品的浓度计算公式的计算结果是否准确、可靠。
真菌毒素标准曲线工作品包括五个浓度梯度黄曲霉毒素B1和恒定浓度水平同位素黄曲霉毒素B1内标物;即黄曲霉毒素B1标准曲线工作品。
五个浓度梯度脱氧雪腐镰刀菌烯醇和同位素脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标物;即脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准曲线工作品;
五个浓度梯度赭曲霉毒素和恒定浓度水平同位赭曲霉毒素内标物;即赭曲霉毒素标准曲线工作品;
五个浓度梯度玉米赤霉烯酮和恒定浓度水平同位素玉米赤霉烯酮内标物;即玉米赤霉烯酮标准曲线工作品;
真菌毒素同位素混和内标品为与标准曲线相同浓度的同位素黄曲霉毒素B1内标物、同位素脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标物、同位素赭曲霉毒素内标物、同位素玉米赤霉烯酮内标物。
本实施例提供的利用上述检测待测样品中的黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮,其包括以下步骤:
步骤一、称取5g待测样品,并将该待测样品进行粉碎后,得到粉碎后的待测样品;
步骤二、向待测样品中加入20mL乙腈-水-乙酸提取液,得到待测样品提取液,该乙腈-水-乙酸提取液中,乙腈、水和乙酸的体积比为:70:29:1;
步骤三、将待测样品提取液振荡提取20min;
步骤四、将振荡后的提取液进行高速离心,离心转速为3500×g,离心时间为5min,得到待测样品上清液;
步骤五、取0.5mL待测样品上清液,在向待测样品上清液中加0.5mL水稀释,得到待测样品稀释液;
步骤六、将待测样品稀释液低温高速离心,离心力7200×g,4℃,离心时间为10min,取上清液;
步骤七、将步骤六得到的上清液过0.2μm滤膜,获得待测样品液;
步骤八、取200μL待测样品液加入真菌毒素同位素混和内标品,涡旋振荡混合均匀;
步骤九、取200μL提取稀释液乙腈-水-乙酸溶液(乙腈-水-乙酸溶液中,乙腈:水:乙酸的体积比为35:64.5:0.5)加入真菌毒素标准曲线工作品中,涡旋混匀;
步骤十、分别将真菌毒素标准曲线工作品、待测样品液进行上机检测。
步骤十一、以真菌毒素标准曲线工作品的浓度点为横坐标(x轴),以真菌毒素标准曲线工作品的外标峰面积与同位素真菌毒素内标物内标的峰面积比为纵坐标(y轴),对各个数值点进行最小二乘线性拟合,得到标准曲线Y=ax+b;其中,Y为黄曲霉素B1标准曲线工作品/同位素黄曲霉毒素B1内标物的峰面积比值;a为回归曲线的斜率;x为黄曲霉素B1标准曲线工作品上机检测浓度,单位为微克每升(μg/L);b为回归曲线的截距。
对于待测样品液的浓度,计算的峰面积比Y=1.517=0.7731x+0.002808,得到待测样品液中黄曲霉素B1(AFB1)的上机检测浓度计算值为x=(1.517-0.002808)/0.7731=1.958μg/L;
根据绘制得到的标准曲线Y=3.624=0.03248x-0.2412待测样品液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的计算值为:
x=(3.624+0.2412)/0.03248=119.00μg/L;
根据绘制得到的标准曲线Y=0.465=0.2509x-0.01138待测样品液中赭曲霉毒素的计算值为:x=(0.465+0.01138)/0.2509=1.90μg/L;
根据绘制得到的标准曲线Y=0.77=0.147x-0.08742待测样品液中玉米赤霉烯酮毒素的计算值为:x=(0.77+0.08742)/0.147=5.83μg/L;
步骤十二、待测样品的浓度计算公式为:
C=(x×V×f)/m,计算即黄曲霉素B1 C=(1.958*0.02*2)/0.005kg=15.664μg/kg;
计算脱氧雪腐镰刀菌烯醇的C为:C=(119.00*0.02*2)/0.005kg=952.0μg/kg;
计算赭曲霉毒素的C为:C=(1.90*0.02*2)/0.005kg=15.2μg/kg;
计算玉米赤霉烯酮毒素的C为:C=(5.8*0.02*2)/0.005kg=46.4μg/kg;
其中,C为为待测样品中待测毒素的含量(μg/kg);x为待测样品液中待测毒素的浓度(μg/L);待测样品液的体积(L),本实施例中,加入提取液的体积20mL,0.02升(L);m为称取待测样品的重量(kg),本实施例中,样品称样量5g,即为0.005kg;f为提取液稀释因子,本实施例中,提取液稀释因子为2。
步骤十三、按照上述处理待测样品的方式和方法计算质控品中黄曲霉毒素B1的浓度为19.8μg/kg、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度为1069μg/kg、赭曲霉毒素的浓度为5.1μg/kg、玉米赤霉烯酮的浓度为60.5μg/kg,在标示值范围内,表明结果准确可靠,结果可信。
本实施例通过内标校正消除样品基质效应,浓度适配限量真菌毒素国家限量标准以及自然污染样品中的实际含量水平的标准曲线以及成分分析国家标准物质的使用,提高方法检测准确度。
实施例4
本实施例提供一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,该试剂盒包括真菌毒素标准曲线工作品和真菌毒素同位素混合内标品;其中,真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中均通过稳定剂固定于相对应的样品瓶内,具体的是在真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中加入稳定剂后,利用氮吹、冻干、真空烘干或者喷雾干燥的方法将真菌毒素标准曲线工作品以及内标品稳定固定在内插管小瓶内,以达到便于使用、运输、储存的目的。其中,稳定剂为二甲基亚砜;该试剂盒可通过真菌毒素同位素混合内标品和/或真菌毒素标准曲线工作品对待测物中相对应的真菌毒素定量检测;
本实施例中,真菌毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素、T-2毒素或HT-2毒素、麦角碱类毒素、交链孢霉类毒素、白僵菌素和恩镰孢菌素毒素。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于,稳定剂采用甘油,其他均与实施例4相同。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于,稳定剂采用丙二醇,其他均与实施例4相同。
实施例7
本实施例与实施例4的区别在于,稳定剂采用丁二醇,其他均与实施例4相同。
试验实施例
本实施例4的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒在粮油基质中的加标回收率见表4,由表4可知发明的高精准检测多种真菌毒素的试剂盒在粮油基质中的加标回收率在84.3%-107.0%,RSD在0.2%-5.0%,证明方法精准可靠,适用于样品高精准检测以及标准物质/质控定值。
表4真菌毒素在粮油基质中的加标回收率
本实施例的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒与现有真菌毒素检测方法比较如下:
如表5所示,从表5中可知,本发明内标法定量与外标法定量对玉米粉中六种真菌毒素成分分析标准物质的检测结果进行比较,可以看出外标法定量结果不在标准物质标示范围,而本发明内标法定量方法的检测结果全在标准物质标示范围内,结果表明与外标法定量相比,本发明内标法定量准确性更高,精密度更好。
表5本发明内标法定量与外标法定量结果比较
试验例2
如表6所示,与传统内标法定量相比,单以检测一种真菌毒素计,本发明实施例4的试剂盒成本远低于传统内标法、检测时间缩短一半,操作步骤简化,且可同时检测17种真菌毒素。
表6本发明试剂盒内标法与传统内标法比较
项目 | 传统内标法 | 本发明试剂盒内标法 |
内标加标量/样品/1种真菌毒素(ng) | 10 | 0.2 |
成本/样品/1种真菌毒素(元) | 350 | 10 |
操作步骤/样品(步) | 10 | 6 |
检测时间/样品(小时) | 2.5 | 1 |
可检测真菌毒素(个) | 1~6 | 17 |
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,其特征在于,
所述试剂盒包括真菌毒素标准曲线工作品和真菌毒素同位素混合内标品;
其中,真菌毒素标准曲线工作品以及真菌毒素同位素混合内标品中均通过加入稳定剂后,再经氮吹/冻干/真空烘干或喷雾干燥稳定固定于相对应的样品瓶内;
所述试剂盒可通过真菌毒素同位素混合内标品和/或真菌毒素标准曲线工作品对待测物中相对应的真菌毒素液质联用定量检测;
所述真菌毒素选自黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素、T-2毒素或HT-2毒素、麦角碱类毒素,交链孢霉类毒素,白僵菌素、恩镰孢菌素等其他常见的毒素中的至少一种。
2.如权利要求1所述的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,其特征在于,
所述试剂盒还包括真菌毒素质控品。
3.如权利要求1所述的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,其特征在于,
所述稳定剂为二甲基亚砜、甘油、丙二醇、丁二醇、丁三醇、环丁砜和1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂盒,其特征在于,
所述真菌毒素标准曲线工作品包括多个浓度梯度真菌毒素,且每个浓度梯度含精准浓度的对应种类的碳13同位素真菌毒素内标物;
所述真菌毒素同位素混和内标品含精准浓度的对应种类的碳13同位素真菌毒素内标物。
5.如权利要求4所述的用于高精准检测多种真菌毒素的试剂,其特征在于,
所述真菌毒素标准曲线工作品的浓度梯为至少3个浓度。
6.一种利用权利要求1所述的试剂盒高精准检测多种真菌毒素方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
将称取的待测样品,粉碎、提取、稀释后,获得待测样品液;
将定量的所述待测样品液加入所述真菌毒素同位素混和内标品混合均匀,得到待测混合样品液;
将待测混合样品液进行检测,待测混合样品溶液中真菌毒素的浓度为F(μg/L),F=E*A/B,其中,A为待测混合样品液中真菌毒素的峰面积,B为同位素混合内标的峰面积,E为同位素混合内标的浓度(μg/L)。
7.一种利用权利要求1所述的试剂盒高精准检测多种真菌毒素方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
将称取的待测样品,粉碎、提取、稀释后,获得待测样品液;
将定量的所述待测样品液加入所述真菌毒素同位素混和内标品混合均匀,得到待测混合样品液;
将定量的提取稀释液加入所述真菌毒素标准曲线工作品内混合均匀,得到真菌毒素标准曲线工作溶液;
将真菌毒素标准曲线工作品和待测混合样品液分别进行检测,并以真菌毒素标准曲线工作品检测数值建立标准工作曲线:Y=ax+b,其中,Y为真菌毒素标准曲线工作品中真菌毒素的峰面积与对应种类的碳13同位素真菌毒素的峰面积的比值,x为真菌毒素标准曲线工作品对应的浓度值;
将待测混合样品液中真菌毒素峰面积与对应的真菌毒素同位素混和内标品峰面积的比值代入上述工作曲线公式,得到待测混合样品液中真菌毒素的浓度。
8.如权利要求7所述的高精准检测多种真菌毒素方法,其特征在于,
将所述真菌毒素质控品用于与所述待测样品液相同处理检测过程,得到真菌毒素质控品的峰面积与真菌毒素同位素混和内标品峰面积的比值,将所述比值代入所述公式,用于验证检测过程是否准确。
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