JPH0869B2

JPH0869B2 - 胎児及び新生児の造血幹及び前駆血液細胞の単離及び保存

Info

Publication number: JPH0869B2
Application number: JP1500205A
Authority: JP
Inventors: ボーイズ，エドワード，エー; ブロックスマイヤー，ハル，イー; ダグラス，ゴードン，ダブリュ
Original assignee: ビオサイトコーポレーション
Priority date: 1987-11-12
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1996-01-10
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: EP0343217A1; AU2610288A; US5004681A; SG46352A1; US5004681B1; DE3855301T2; JPH03501207A; ATE137974T1; WO1989004168A1; EP0343217A4; DE3855301D1; EP0343217B1

Description

【発明の詳細な説明】 1. 序論本発明は、凍結保存される新生児または胎児の血液の
造血幹及び前駆細胞、及び解凍によるかかる幹及び前駆
細胞の治療使用に関する。かかる細胞は、各種の病気お
よび疾患を有する患者の造血再構成の治療に有効であ
る。好適な実施態様において、凍結保存かつ解凍された
新生児細胞は、自己由来（自己）造血再構成に使用し得
る。

また、本発明は、本発明の新生児および胎児幹および
前駆細胞の採取および凍結保存方法に関する。

2. 発明の背景 2.1. 造血幹および前駆細胞形態学上認められ、かつ、血液中で機能的に循環可能
な細胞には、赤血球、中好性、酸好性及び塩基好性顆粒
球、Ｂ−、Ｔ−、非Ｂ−、非Ｔリンパ球及び血小板が含
まれる。これらの成熟細胞は、赤血球系の赤芽球、顆粒
球の骨髄芽球、前骨髄球および骨髄球、および血小板の
巨核球の如きそれぞれの系統に対する形態学上差異が確
認される前駆体細胞に由来するものであり、必要に応じ
てこれらによって置き換えられる。前駆体細胞はより原
始的な細胞に由来しており、これは単純に２つの主要な
サブグループ、すなわち幹細胞及び前駆細胞に分けられ
る（Broxmeyer,H.E.,1983,“Colony Assays of Hematop
oietic Progenitor Cells and Correlations to Clinic
al Situations,"CRC Critical Reviews in Oncology/He
matology 1（３）:227−257を参照のこと）。幹及び前
駆細胞の定義は、操作上の規準であり、形態学上という
よりはむしろ機能的な規準である。幹細胞は、これらの
細胞の欠如または消耗が１以上の細胞系の完全消耗、す
なわち短時間内に病気および死に至らしめるという結果
を生ずるために、広範な自己複製または自己維持機能
（Lajtha,L.G.,1974,Differentiation 14:23）に欠かせ
ない。幹細胞のなかには必要により分化するものがある
が、幹細胞またはその娘細胞が、他の幹細胞の大切な蓄
積維持のため、その幹細胞を産生することもある。この
ように、自己の腫を維持することに加えて、多分化能を
有する幹細胞は、より限られた自己複製機能を有する，
または自己複製機能を有しない種々の亜系統の前駆細胞
へ分化可能である。これらの前駆細胞は、最終的に形態
学上確認できる前駆体細胞を生ずる。前駆細胞は、骨髄
分化経路の１つ、または１以上、に沿って増殖及び分化
できる（Lajtha,L.G.（Rapporteur）,1979,Blood Cells
5:447）。

幹及び前駆細胞は、骨髄、脾臓および血液中の有核細
胞の極めて少ない割合を占めている。骨髄と比べてこれ
らの細胞は約10倍より少ない量が脾臓に存在し、成人血
液中ではもっと少ない。１例として、骨髄中の有核細胞
およそ1000個中１個が前駆細胞である。幹細胞はもっと
少ない割合で存在している。これらの前駆及び幹細胞
は、これら細胞の分散懸濁液を照射マウスに入れ、脾臓
の如き器官に播種されたこれらの細胞を注目することに
よって検出、かつ、検定され、そして増殖及び分化に貢
献する情況が見い出された。また、これらの細胞は、細
胞を体外に取り出して、培養培地およびある一定の生体
分子またはこれらの分子を産生しかつ放出する細胞集団
を含む寒天、メチルセルロースまたは凝固血漿の如き半
固体培養基からなる培養血（インビトロ）に固定化する
ことによって定量されている。好適な成長条件下におい
て、幹または前駆細胞は、一連の増殖及び分化経路をた
どって最終形成細胞を産生し、こうしてはじめて、コロ
ニーに生じる細胞型が決定される。コロニーが顆粒球、
マクロファージ、赤血球および巨核球（血小板の前駆
体）を含めば、そこに生成した細胞は多能性細胞だった
ということになる。これらの細胞が自己複製性または幹
細胞性を有するか、つまり、それ自身以外の細胞を産生
するか否か決定するために、コロニーからの細胞はイン
ビボまたはインビトロで再プレートされる。これらのコ
ロニーが、第２の培養プレートへ再プレートされて、も
っと多くの多系統細胞コロニーを生じるならば、ある程
度の幹細胞性を有していたことになる。幹細胞および前
駆細胞の区画はそれら自体不均質であり、様々な程度の
自己複製または増殖能を有する幹細胞区画の１つのモデ
ルが、細胞の機能に基づいて提案されている（Hellman,
S.,etal.,1983,J.Clin.Oncol.1:227−284）。自己複製
は細胞分割の最も初期の段階の幹細胞においてより多く
見られ、細胞のその後の分割にしたがって次第に限定さ
れて行く。

第２コロニーのための前駆細胞生成能を有するヒト造
血コロニー形成細胞は、ヒト臍帯血液において同定され
ている（Nakahata,T.and Ogawa,M.,1982,J.Clin,Inves
t.70:1324−1328）。加えて、造血幹細胞は、ヒト臍帯
血液において、コロニー形成によって、成人で見い出さ
れるよりも高いレベルで生ずることが示されている（Pr
indull,G.,et al.,1978,Acta Paediatr.Scand.67:413−
416;Knudtzon,S.,1974,Blood 43（３）:357−361）。ヒ
ト胎児血液（Linch,D.C.,et al.,1982,Blood 59（５）:
976−979）と臍帯血液（Falser,A.A.and Messner,H.A.,
1978,Blood 52（６）:1243−1248）におる循環造血前駆
細胞の存在も示されている。ヒト胎児および新生児血液
は、巨核球およびバースト赤芽球前駆体を含むこと（Va
inchenker,W.,et al.,1979,Blood Cells 5:15−42）ま
た、成人血液に対してヒト臍帯血液または胎児肝臓にお
いてエリトロイド前駆細胞数が多いこと（Hassan,M.W.,
et al.,1979,Br.J.Haematol.41:477−484;Tchernia,G.,
et al.,1981,J.Lab.Clin.Med.97（３）:332−331）が報
告されている。表面Ia抗原を発現するCFU−GM（Colony
formingunit−granulocyte,macrophage）の特性に関し
て臍帯血液と骨髄細胞間に相異があるとする研究結果が
報告されている（Koizumi,S.,et al.,1982,Blood 60
（４）:1046−1049）。

米国特許第4,714,680号には、ヒト幹および前駆細胞
を含む細胞懸濁液と、かかる懸濁液の単離方法および造
血再構成用の細胞懸濁液の用途が開示されている。

2.2. 造血系の再構成造血系の再構成は、骨髄移植によって達成された。ロ
レンツとその共同研究者は、マウスが骨髄の静脈注射に
よって致死量の放射線照射から保護し得ることを示した
（Lorenz,E.,et al.,1951,J.Natl.Cancer Inst.12:197
−201）。その後の研究では、この保護は注入細胞によ
る受容者骨髄のコロニー化から生じることが示された
（Lindsley,D.L.,et al.,1955,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.
90:512−515;Nowell,P.C.,et al.,1956,Cancer Res.16:
258−261;Mitchison,N.A.,1956,Br.J Exp.Pathol.37:23
9−247;Thomas,E.D.,et al.,1957,N.Engl.J.Med.257:49
1−496）。このように、移植された骨髄の幹及び前駆細
胞は、感染防御免疫、組織修復、凝固そして血液の他の
機能に関係する血液細胞を増加しかつ置換し得る。成功
を収める骨髄移植においては、血液、骨髄、脾臓、胸腺
および免疫性の他の器官が、ドナーから誘導された細胞
によって再集団化される。

米国特許第4,721,096号（Naughton et al.）には、骨
髄を採取して凍結保存し、インビトロで骨髄細胞を複製
し、細胞を患者に注入することを含む造血再構成方法が
開示されている。

骨髄は、各種の不治のまたは回復困難な病気の治療に
使用されて次第に成功をおさめてきている。この病気に
はある種の貧血、例えば無形成（aplastic）貧血（Thom
as,E.D.,et al.,Feb.5,1972,The Lancet,pp.284−28
9）、ファンコニ貧血（Gluckman,E.,et al.,1980,Brit.
J.Haematol.45:557−564;Gluckman,E.,et al.,1983,Bri
t.J.Haematol.54:431−440;Gluckman,E.,et al.,1984,S
eminars in Hematology:21（１）:20−26）、免疫不全
（Good,R.A.,et al.,1985,Cellular Immunol.82:36−5
4）、リンパ腫または白血病の如き癌（Cahn,J.Y.,et a
l.,1986,Brit.J.Haematol.63:457−470;Blume,K.J.and
Forman,S.J.,1982,J.Cell.Physiol.Supp.1:99−102;Che
ever,M.A.,et al.,1982,N.Engl.J.Med.307（８）:479−
481）、がん腫（Blijham,G.,et al.,1981,Eur.J.Cancer
17（４）:433−441）、各種固形腫瘍（Ekert,H.,et a
l.,1982,Cancer 49:603−609;Spitzer.G.,et al.,1980,
Cancer 45:3075−3085）、造血機能の遺伝的疾患が含ま
れる。また、骨髄移植は最近遺伝的蓄積症（Hobbs,J.
R.,1981,Lancet 2:735−739）、地中海貧血（Thomas.E.
D.,et al.,1982,Lancet 2:227−229）、鎌状赤血球症
（Johnson,F.J.,et al.,1984,N.Engl.J.Med.311:780−7
83）および骨粗鬆症（osteopetrosis）（Coccia.P.F.,e
t al.,1980,N.Engl.J.Med.302:701−708）の治療に使用
されている。下記文献を参照のこと:Storb,R.and Thoma
s,E.D.,1983,Immunol.Rev.71:77−102:O′Reilly,R.,et
al.,1984,Sem.Hematol.21（３）:188−221;1969,Bone
−Marrow Conservation,Culture and Transplantation,
Proceedings of a Panel,Moscow.July 22−26,1968,Int
ernational Atomic Energy Agency,Vienna;McGlave,P.
B.,et al.,1985,in Recent Advance in Haematology,Ho
ffbrand,A.V.,ed.,Churchill Livingstone,London,pp.1
71−197。

一卵性双生児の片方が利用できる場合または安定期の
患者の骨髄細胞を生育しうる凍結状態で貯蔵できる場合
を除いて、完全に適合（遺伝子的に同一）するドナーが
極めてまれであり、骨髄移植の現在の用途は非常に限ら
れている。かかる自己由来（autologous）系においてさ
えも、検出不能な悪性細胞の混入による危険および骨髄
を受ける患者の十分な健康の必要性のため、厳しい限界
がある。自己由来骨髄移植について下記文献を参照のこ
と:Herzig,R.H.,1983,in Bone Marrow Transplantatio
n,Weiner,R.S.,et al.,eds.,The Committee On Technic
al Workshops,American Association of Blood Banks,A
rlington,Virginia;Dicke,K.A.,et al.,1984,Sem.Hemat
ol.21（２）:109−122;Spitzer,G.,et al.,1984,Cancer
54（Sept.15 Suppl.）:1216−1225。かかる自己由来の
場合を除いて、ある程度の避け難い遺伝子的不適合が生
じ、重症で時には致命的な併発症が避けられない。これ
らの併発症には二重の要因がある。第一に、患者は、外
来骨髄細胞の免疫拒絶（宿主対移植片反応）を避けるた
めに、あらかじめ薬剤によって免疫的に無力化されるの
が普通である。第二に、若しドナー骨髄細胞が定着した
場合には、それらは患者を異物と認識し攻撃し得る（移
植片対宿主病）。たとえ極めて適合した家族ドナーであ
っても、部分不適合状は、遺伝子的に異なる固体からの
骨髄移植に直接基づく死亡及び疾病の原因となる。

また、末梢血液は、造血再構成用の幹細胞源として調
べられている（Nothdurtt,W.,et al.,1977,Scand.J.Hae
matol.19:470−481;Sarpel,S.C.,et al.,1979,Exp.Hema
tol.7:113−120;Raghaachar,A.,et al.,1983,,J.C ell.
Biochem.Suppl.7A:7B;Juttner,C.A.,et al.,1985,Brit.
J.Hamatol.61:739−745;Abrams,R.A.,et al.,1983,J.Ce
ll.Biochem.Suppl.7A:53;Prummer,O.,et al.,1985,Exp.
Hematol.13:891−898）。ある研究において、各種白血
病（Reiffers,J.,et al.,1986,Exp.Hematol.14:312−31
5（凍結保存細胞使用）;Goldman,J.M.,et al.,1980,Br.
J.Haematol.45:223−231;Tilly,H.,et al.,July 19,198
6,The Lancet,pp.154−155;see also To,L.B.and Juttn
er,C.A.,1987,Brit.J.Haematol.66:285−288,およびこ
こに引用された文献）；及びリンパ腫（Korbling,M.,et
al.,1986,Blood 67:529−532）の患者に対し期待しう
る結果が得られている。自己由来末梢成人血液の造血系
を再構成する能力は、癌患者達において見られ、強力な
化学療法および／または照射による細胞減数後に産生さ
れた末梢血液中の循環前駆細胞数がはるかに多くなる事
実と関連することを意味する（rebound現象）（To,L.B.
and Juttner,C.A.,1987,Annot.Brit.J.Haematol.66:285
−288;see also 1987,Brit.J.Haematol.67:252−253、
およびここに引用された文献）。末梢血液を使用する他
の研究は、再構成に失敗している（Hershko,C.,et al.,
1979,The Lancet 1:945−947;Ochs,H.D.,et al.,1981,P
ediatr.Res.15（4 Part 2）:601）。

造血再構成の幹細胞源として胎児肝臓細胞移植（Cai
n,G.R.,et al.,1986,Transplantation 41（１）:32−2
5;Ochs.H.D.,et al.,1981,Pediatr.Res.15（4 part
2｝:601;Paige,C.J.,et al.,1981,J.Exp.Med.153:154−
165;Touraine.J.L.,1980,Excerpta Med.514−277;Toura
ine,J.L.,1983,Birth Defects 19:139;see also Good,
R.A.,et al.,1983,Cellular Immunol.82:44−45および
ここに引用された文献）または新生児脾臓細胞移植（Yu
nis,E.J.,et al.,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:4
100）を使用する研究が進められている。また、新生児
胸腺細胞は、免疫再構成実験で移植された（Vickery,A.
C.,et al.,1983,J.Parasitol.69（３）:478−485;Hirok
awa,K.,et al.,1982,Clin.Immunol.Immunopathol.22:29
7−304）。

2.3. 細胞の凍結保存凍結は、大部分の生存細胞に破壊的である。冷却する
と、外部媒体が氷結するために、細胞は水を失なって細
胞内溶質濃度が増大した状態で平衡に達する。約10〜15
℃以下で細胞内凍結が生ずる。細胞内凍結と溶液効果の
両者が、細胞障害の原因になっている（Mazur,P.,1970,
Science 168:939−949）。細胞外氷からの凍結破壊は、
本質的に細胞の浸透性脱水から生ずる原形質膜障害であ
ると提案された（Meryman,H.T.,et al.,1977,Cryobiolo
gy 14:287−302）。

凍結保護剤および最適冷却速度は、細胞障害を保護し
得る。溶質添加による凍結保護は、２種の可能性のある
機構、すなわち総括的に細胞内へ浸透し形成する氷の量
を減少させ、または動力学的に外部氷の蒸気圧の減少に
対応して細胞外に流れる水の速度を減少させることによ
って生ずると考えられる。（Meryman,H.T.,et al.,197
7,Cryobiology 14:287−302）。種々の細胞に対して最
適冷却速度が記載されている。各種グループは、凍結骨
髄細胞または赤血球の生存または移植効率に関して冷却
速度または凍結保存剤の効果を調べている（Lovelock,
J.E.,and Bishop,M.W.H.,1959,Nature 183:1394−1395;
Ashwood−Smith,M.J.,1961,Nature 190:1204−1205;Row
e,A.W.and Rinfret,A.P.1962,Blood 20:636;Rowe,A.W.a
nd Fellig,J.,1962,Red.Proc.21:157;Rowe,A.W.,1966,C
ryobiology 3（１）:12−18;Lewis,J.P.,et al.,1967,T
ransfusion 7（１）;17−32;Rapatz,G.,et al.,1968,Cr
yobiology 5（１）:18−25;Mazur,P.,1970,Science 16
8:939−949;Mazur,P.,1977,Cryobiology 14:251−272;R
owe,A.W.,and Lenny,L.L.,1983,Cryobiology 20:717;St
iff,P.J.,et al.,1983,Cryobiology 20:17−24;Gorin,
N.C.,1986,Clinics in Hamatology 15（１）:19−4
8）。

液体窒素中の長期保存後のヒト骨髄細胞の成功した再
生法が記載されている（1983,American Type Culture C
ollection,Quarterly Newsletter 3（４）:1）。加え
て、骨髄中の幹細胞は、インビトロで凍結前後において
同数の混合骨髄−エリトロイドコロニーを形成する能力
によって示されるように、ほとんど細胞死を招くことな
く凍結保存と解凍に耐え得ることが示された（Fabian,
I.,et al.,1982,Exp.Henatol.10（１）:119−122）。ヒ
ト胎児肝臓細胞（Zuckerman,A.J.,et al.,1986,J.Clin.
Rothol.（London）21（１））:109−110）、胎児心筋細
胞（Robinson,D.M.and Simpson,J.F.,1971,In Vitro 6
（５）:378）、新生児ラット心臓細胞（Alink,G.M.,et
al.,1976,Cryobiology 13:295−304）および胎児ラット
すい臓（Kemp,J.A.,et al.,1978,Transplantation 26
（４）:260−264）の凍結保存および解凍も報告されて
いる。

2.4. 遺伝子療法遺伝子療法は、病気または疾患の治療のために細胞へ
新しい遺伝情報を移入しかつ安定に挿入することに関す
る。外来遺伝子は１つの細胞に移入され、増殖してその
新しい遺伝子が細胞集団全体に広がる。このように、幹
細胞または多能性前駆細胞は、それらが外来遺伝子を発
現することのできる各種の子孫系を産生する増殖細胞で
あるために、通常は遺伝子移入の標的である。

遺伝子療法の多くの研究は、造血幹細胞の使用に向け
られている。造血前駆細胞形質転換のための高効率遺伝
子移入システムが、実用のために研究された（Morrow,
J.F.,1976,Ann.N.Y.Acad.Sci.265:13;Salzar,W.,et a
l.,1981,In Organizationand Expression of Globin Ge
nes,A.R.Liss,Inc.,New York,p.313;Bernstein,A.,198
5,in Genetic Enginnering;Principles and Methods,Pl
enum Press,New York,p.235;Dic,J.E.,et al.,1986,Tre
ds in Genetics 2:165）。ウィルスベクター系の開発に
関する報告には、DNAを介する遺伝子移入法（例えば、C
aPO₄沈降およびDEAEデキストラン）より高効率で形質転
換されること，および広範な細胞型において移入された
遺伝子が安定に組みこまれ得ることが示されている。組
換えレトロウィルスベクターは、造血幹及び前駆細胞を
トランスデュース（形質導入）するために実験的に広く
使われている。レトロウィルスベクターによって移入さ
れた後、マウスでうまく発現された遺伝子には、ヒトヒ
ポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼが
含まれている（Miller,A.,et al.,1984,Science 255:63
0）。また、細菌遺伝子は実験上のモデルの細菌薬剤耐
性遺伝子移入形態で哺乳類細胞へ移入された。造血前駆
細胞の真核ウィルスベクターによる薬剤耐性への形質転
換は、組換えレトロウィルスに基づくベクター系によっ
て達成された（Hock,R.A.and Miller,A.D.,1986,Nature
320:275−277;Joyner,A.,et al.,1983,Nature 305:556
−558;Williams,D.A.,et al.,1984,Nature 310:476−48
0;Dick,J.E.,et al.,1985,Cell 42:71−79）;Keller,
G.,et al.,1985,Nature 318:149−154;Eglitis,M.,et a
l.,1985,Scinece 230:1395−1398）。最近、アデノ関連
ウィルスベクターは、哺乳類細胞系をネオマイシン耐性
へ形質導入することにうまく使用された（Hermonat,P.
L.and Muzyczka,N 1984,supra;Tratschin,J−D.,et a
l.,1985,Mol.Cell.Biol.5:3251）。遺伝子移入用に調べ
られた他のウィルスベクターシステムには、パポーバウ
ィルスとワクシニアウィルスが含まれる（Cline,M.J.,1
985,Pharmac.Ther.29:69−92）。

遺伝子移入の他の方法は、微量注入法、エレクトロポ
レーション、リポソーム、染色体移入およびトランスフ
ェクション法が含まれる（前記Cline,M.J.,1985）。サ
ルサー等（Salser et al.）は、カルシウム沈降トラン
スフェクション法を使用し、メトトレキセート耐性ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）または単純ヘルペスウ
ィルスチミジンキナーゼ遺伝子、およびヒトグロ
ビン遺伝子をネズミの造血幹細胞へ移入した。幹細胞子
孫におけるDHFRとチミジンキナーゼ遺伝子のインビボ
発現が示された（Salser,W.,et al.,1981,in Organizat
ion and Expression of Globin Genes,Alan R.Liss,In
c.,New York,pp.313−334）。

また、遺伝子療法は、酵素置換療法の目的でネズミの
モデルにおいて調べられている。すなわち、ドナーマウ
スからの正常幹細胞は、β−グルクロニダーゼ欠損マウ
スの造血細胞系を再構成するために使用された（Yatzi
v,S.,et al.,1982,J.Lab.Clin.Med.90:792−797）。天
然遺伝子が使用されたので、組換え幹細胞（または遺伝
子移入技術）は必要なかった。

3. 発明の要約本発明は、凍結保存される新生児または胎児の造血幹
および前駆細胞、及び解凍によるかかる幹及び前駆細胞
の治療用途に関する。特に、本発明は造血（または免
疫）再構成用の胎児または新生児幹細胞の治療用途に関
する。本発明の細胞による造血再構成は、貧血、悪性
物、自己免疫疾患、他の免疫機能障害および不全等の各
種の病気及び疾患の治療及び予防に有効である。他の実
施態様において、異種遺伝子配列を含む胎児または新生
児の造血幹および前駆細胞は、遺伝子療法における造血
再構成に使用し得る。

本発明の好適な実施態様において、凍結保存かつ解凍
される新生児または胎児血液細胞は、自己由来（自己）
再構成に使用し得る。

また、本発明は、本発明の新生児および胎児の幹およ
び前駆細胞の採取及び凍結保存方法に関する。

3.1. 定義本明細書中で使用される略称は次のことを意味する： ACD＝酸−クエン酸塩デキストロース。

BFU−Ｅ−１＝バースト形成単位−エリトロイド、半固
形培地においてエリトロイド子孫細胞のコロニーを産生
可能な造血前駆細胞。

BFU−Ｅ−１＝初期エリトロイド前駆細胞。

この細胞は、エリトロポエチン、ヘミン（任意）および
バースト促進因子により刺激されると半固形培地におい
てエリトロイド子孫細胞のコロニーを産生する。

BFU−Ｅ−２＝BFU−Ｅ−１よりも成熟したエリトロイド
前駆細胞。この細胞はエリトロポエチンおよびヘミン
（任意）によって刺激されると半固形培地においてエリ
トロイド子孫細胞のコロニーを産生する。

CFU＝コロニー形成単位。

半固形培地において子孫細胞のコロニーを産生可能な細
胞。

CFU−GEMM＝コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、単球
／マクロファージ、巨核球。

半固形培地において顆粒球、赤血球、単球／マクロファ
ージおよび巨核球子孫から成るコロニーを産生可能な多
能性造血前駆細胞。

CFU−GM＝コロニー形成単位−顆粒球、マクロファー
ジ。半固形培地において顆粒球、マクロファージ子孫か
らなるコロニを産生可能な造血前駆細胞。

CFU−Ｓ＝コロニー形成単位−脾臓。

致死量の放射線を受けたマウスへ接種すると脾臓上にコ
ロニー（結節）を産生可能な自己複製能を有する多能性
細胞。

CPD＝クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース。

CSF＝コロニー刺激因子。

DMSO＝ジメチルスルホキサイド。

DNase＝デオキシリボヌクレアーゼ。

DPBS＝マグネシウムまたはカルシウムを含まないリン酸
塩緩衝溶液。

FCS＝ウシ胎児血清。

異種遺伝子＝指定宿主細胞において存在しないか、また
は機能的に発現しない遺伝子。

IMDM＝イスコベ（Iscove）改良ダルベッコ（Dulbecco）
培地。

LD100/30日＝放射線照射後30日以内に100％死亡率を生
ずる最少のまたはほぼ最少の致死量。

PHALCM＝ヘモクロマトーシスの患者からのフィトヘマグ
ルチニン（植物凝集素）刺激白血球によって調整された
培地。

PWMSCM＝ポークウィードマイトジェン脾臓細胞調整培
地。

Ｓ−細胞＝幹細胞。

SLE＝全身性エリテマトーデス。³ HTdr＝トリチウム化チミジン TLI＝全リンパ照射 4. 図面の説明第１図は、個体の誕生からの１系列の採取において得
られた新生児血液容積のデータを示す。採取された血液
量（ml）は、Ｘ軸に、幼児の体重（kg）はＹ軸に示され
る。白ぬきの円は帝王切開による誕生を表わし、黒ぬり
の円は膣誕生を表わす。

第２図は、個々の誕生からの第２系列の採取において
得られた新生児血液溶積のデータを示す。採取血液量
（ml）はＸ軸に、幼児の体重（kg）はＹ軸に示される。
黒ぬりの円は、臍帯から重力排出によって採取された膣
誕生を示す。白ぬりの円は臍帯から重力排出によって採
取された帝王切開誕生を表わす。黒ぬりの三角形は、膣
誕生で産後の胎盤から採取されたものを示す。白ぬりの
三角形は、帝王切開による誕生で産後の胎盤から採取さ
れたものを示す。

第3Aおよび3B図は、第6.3.1.節に記載のように、フィ
コル−ハイパキュー（Ficoll−Hypaque）密度分離法の
異なる段階における遠心管の組成を示す図であり、造血
幹および前駆細胞が富化された低密度細胞を得るために
使用し得る。臍帯血液細胞懸濁液は、遠心分離前に、フ
ィコル−ハイパキュー上に重層する（第3A図）。遠心分
離後、低密度細胞は、フィコル−ハイパキューとリン酸
塩緩衝溶液間にはっきりとしたバンドとして現われる
（第3B図）。

第４図は、第6.4節に記載の装置を示す図であり、新
生児および胎児の造血幹および前駆細胞の凍結保存に使
用し得る。細胞懸濁液を含有する凍結ガラス容器は、そ
の後４℃のメタノール浴中に入れられる凍結ラックに置
かれる。メタノール浴（金属またはガラス凍結皿中にあ
る）は、さらに−80℃のフリーザーに入れられる。細胞
が凍結状態に達すると、それらは液体窒素含有長期保存
容器に移される。

5. 発明の詳細な説明本発明は、凍結保存される新生児または胎児血液の造
血幹および前駆細胞、および解凍後のかかる幹および前
駆細胞の治療用途に関する。

特に本発明は、胎児または新生児の幹細胞の造血再構
成用の用途に関する。本発明の好適な実施態様におい
て、胎児または新生児の幹細胞は、自己由来（autologo
us）造血再構成、すなわちそれらの幹細胞が取り出され
た個体と同一の個体の造血系の再構成に使用し得る。か
かる実施態様において、本発明は、造血再構成のための
骨髄の現在の使用を越える実質的な利益を提供する。骨
髄移植の現在における使用は、一卵性双生児の片方が利
用でき、また、例えば安定期の癌患者の骨髄細胞が、将
来の再発の治療のために患者にもどすことができるよう
に悪性細胞がなく、十分に健康で、生育できる凍結状態
で貯蔵されている場合を除いて、実際に決して完全に適
合した（遺伝的に同一）ドナーが存在しないという事実
によって厳しく制限されている。かかる場合を除いて、
結果として生ずる避けることのできない遺伝的不適合
は、宿主対移植片または移植片対宿主障害の重大で時々
致死的な合併症をともなう。外来骨髄細胞の宿主拒絶反
応（宿主対移植片反応）を避けるために、患者は免疫学
的に無力にする必要がある。かかる免疫無力化は、それ
自体で重大な合併症の原因となる。その上、ドナー骨髄
細胞が確立された場合に、それらは外来物と認識し患者
を攻撃し得る（移植片対宿主病）。極めて適合した家族
ドナーを用いたとしても、部分的不適合によるこれらの
合併症は、遺伝的に異なる個体からの骨髄移植に直接基
づく死亡および発病の原因となる。

造血再構成用の新生児幹および前駆細胞の使用に関す
る本発明の実施態様において、従来の骨髄移植よりもか
かる新生児細胞の使用を好む種々の主要な理由がある。
第１に、細胞が別の状況では棄てられる新生児血液から
得られるために、ドナーは必要とならない。第２に、好
適な自己由来（autologous）系、すなわち「自己」新生
児細胞の使用を含む、において、移植前薬剤誘導または
放射線誘導免疫無力化の必要性、および急性および慢性
移植片対宿主病から従来の骨髄移植において生ずる合併
症は、この実施態様において新生児細胞が最初の所有者
に戻され、そして、それ故に全体的に適合性なので、す
べて除かれる。これらの理由で、完全にではなくとも適
合したドナーの発見の困難性、および避けることのでき
ない遺伝的不適合性に基づく病気および死亡から生ずる
骨髄移植の使用に関する現在の制限は、新生児細胞によ
る自己再構成にあてはまらない。第３に、好適な自己由
来の実施態様に関して、動物の骨髄移植における遺伝的
に同一（自己）の細胞の効率は、遺伝的に非同一のドナ
ーからの細胞のものよりも数字的に何倍も大きく（Baln
er,H.1977,Bone Marrow Transplantation and Other Tr
eatment after Radiation Injury,Martinus Nijhoff Me
dical Division,The Hague）、したがって好適な自己由
来系において有効な再構成のためにずっと少ない自己細
胞で足りる。

その上、骨髄移植の成功の公算は年齢とともに減少す
る。ドナー又は患者のいずれの年齢がより重要であるか
明らかではないが、若い（新生児）細胞が造血再構成に
好適であると推定することは普通である。かかる新生児
または胎児の細胞は、成人細胞が受けてきている「環境
的侵害」を受けていない。同様に、新生児細胞には適用
できるが従来の骨髄移植には適用できない新規な医学的
適用の１例として、誕生時に採取された自己細胞に基づ
く再蓄積は、年齢とともに増加して生ずる免疫応答の減
少および自己免疫性（自己組織に対する免疫反応）のよ
うな疾患の治療に有効であるというものがある。

上記造血再構成用の骨髄の使用に対する多くの相対的
な不利益は、同様の再構成用の成人末梢血液の使用にお
いても同じであり、そしてこのように本発明による新生
児細胞の造詣再構成への使用は、成人末梢血液の使用を
越える明らかな利益を提供する。自己由来の末梢成人血
液の造血系を再構成する能力は、ある癌患者で見られる
が、強力な化学療法および／または照射による細胞減少
後に産生された末梢血液中での循環前駆細胞の数がはる
かに多いことと関連している（rebound現象）（L.B.and
Juttner,C.A.,1987,Annot.,Brit.J.,Haematol.66:285
−288;see also 1987,Brit.J.Haematol.67:252−253,こ
こに引用されている文献）。これら患者の幹および前駆
細胞集団に対し、この前の化学療法または照射の、既知
または未知の、有害な影響がある可能性がある。

本発明によって提供されるような、造血再構成に新生
児細胞を使用することが好ましい他の理由がある。新生
児血液が、造血再構成用の細胞源として好適である理由
は、母体または陣痛および出産の際に移されるもの以外
の、既知または未知、潜在的またはその他の、（すなわ
ち将来出会うだろう）ウィルスおよび微生物を含まない
からである。加えて、造血幹細胞がその他の細胞と老衰
前に行なう細胞分割全数の制限を他の細胞と共有する程
度に鑑みて、新生児造血幹細胞は、生存中のその後のど
の時期に得られる造血幹細胞よりも少なくとも自己複製
性と再構成能を有すると想定し得よう。

成人において、幹および前駆細胞は、大部分が骨髄に
限定される。極めて少量のものが血液を循環する。しか
しながら、生まれたばかりのヒトまたは動物において、
成人骨髄に見い出されたものと類似数の幹および前駆細
胞が血液を循環する。確かに、このことは生長する幼児
の血液形成の大きな必要性を反映している。我々は、ヒ
トの臍帯および胎盤に含まれる新生児血液（それは通常
誕生時に棄てられる）の再蓄積能が、成人骨髄の平均的
な提供と同等かまたはそれを上まわると結論づける。成
人骨髄比較してヒト新生児血液細胞の効率は、幹細胞及
び前駆細胞の実験室検定によって測定される。前駆細胞
検定は、50mlの臍帯血液（容易に得られる）からの細胞
の再構成能力が、自己由来の造血再構成に使用される成
人骨髄の前駆細胞の平均的な数と少なくとも同等である
ことを暗示する（第6.8節参照のこと）。「Ｓ−細胞」
は、多分幹細胞の初期の発達形態を示すが、ヒト（臍
帯）血液中に発現される（Nakahata,T.and Ogawa,M.,19
82,J.Clin.Invest.70:1324−1328）。このように、新生
児血液細胞は、成人骨髄に対する有効な臨床的代替品と
判断することができる。

実験動物において新生児細胞の有効性を直接的に試験
することができる。従って、我々は、循環する新生児細
胞が、臍帯および胎盤に含まれるものよりも数量が少な
いが、致死的に照射を受けた成人動物の全血液形成およ
び免疫系を完全かつ永久に再集団化し、完全回復及び正
常な健康へと促進させることを観察した（第6.11節参照
のこと）。

本発明方法は、単に説明のために次の団第に分割され
る：（ａ）胎児または新生児の造血幹および前駆細胞の
単離、（ｂ）胎児または新生児の血液の検査と試験、
（ｃ）造血幹および前駆細胞の富化、（ｄ）凍結保存、
（ｅ）凍結状態から幹および前駆細胞の再生、（ｆ）再
生細胞の臨床療法用試験、および（ｇ）造血系の再構成
における治療用途。

本発明において胎児および新生児の両方の造血細胞の
使用が意図されているので、新生児細胞に関する本発明
の記述及び実施態様は、特にことわりがなくまた明らか
な場合以外は、同様に胎児細胞に適用される。

5.1. 胎児または新生児の造血幹および前駆細胞の分離胎児または新生児の血液は、本発明の造血幹および前
駆細胞源である。

胎児血液は、当技術分野のいかなる既知の方法によっ
ても得られる。例えば、胎児血液は、超音波（Daffos,
F.,et al.,985,Am.J.Obstet.Gyecol.153:655−660;Daff
os,F.,et al.1983,Am.J.Obstet.Gyecol.146:985）、プ
ラセントセンテシス（placentocentesis）（Valenti,
C.,1973,Am.J.Obstet.Gynecol.115:851;Cao,A.,et al.,
1982,J.Med.Genet.19:81），フェトスコピー（fetoscop
y）（Rodeck,C.H.,1984,in Prenatal Diagnosis,Rodec
k,C.H.and Nicolaides,K.H.,eds.,Royal College of Ob
stetricians and Gynaecologists,Lodon）、等によって
案内された針を使用して胎盤基部において胎児循環系か
ら採取し得る。

本発明の好適な実施態様において、新生児造血幹およ
び前駆細胞は、臍帯血液および／または胎盤血液から得
られる。造血系を再集団化するために細胞源として臍帯
また胎盤血液を使用すると多くの利益がある。臍帯血液
はドナーに外傷を与えることなく容易に得られる。これ
に対して、今日、移植のために骨髄細胞を採取するには
外科処置を要し、入院に費される時間および費用の点に
おいて損失がある。臍帯血液細胞は、必要な場合に、自
己由来移植に使用し得、そして主要組織適合性複合体と
部分的にだけ適合し、または主要組織適合性複合体と十
分に適合するが副組織適合性複合体と部分的にだけ適合
するという同種異系細胞の使用に伴う通常の造血上及び
免疫上の問題は緩和される。

採取は無菌状態で行なうべきである。採取後直ちに、
新生児または胎児血液は抗凝血剤と混合すべきである。
かかる抗凝血剤は当技術分野において公知であり、次の
ものを挙げることができるがそれらに限定されることは
ない:CPD（クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース）、
ACD（酸−クエン酸塩−デキストロース）、オルシーバ
ー溶液（Alsever,J.B.and Ainslie,R.B.,1941,N.Y.St.
J.Med.41:126）、デゴイン溶液（De Gowin,E.L.,et a
l.,1940,J.Am.Md.Ass.114:850）、エドグルゲート−Mg
（Edglugate−Mg）（Smith,W.W.,et al.,1959,J.Thora
c.Cardiovasc.Surg.38:573）、ラウス−ターナー溶液
（Rous,P.and Turner,J.R.,1916,J.Exp.Med.23:219）、
その他のグルコース混合物、ヘパリン、エチルビスコ
ウムアセテート（ethyl biscoumacetite）等。（Hurn,
B.A.L.,1968,Storage of Blood,Academic Press,New Yo
rk,pp.26−160）。好適な実施態様においてACDが使用し
得る。

5.1.1. 新生児血液の採取本発明のこの態様の目的は、汚染物質を含まない十分
な量の新生児血液採取物を得ることである。臍帯血液に
は幹および前駆細胞源が多く含まれるため（第6.6節参
照のこと。Nakahata,T.and Ogawa,M.,1982,J.Clin.Inve
st.70:1324−1328;Prindull.G.,et al.,1978,Acta.Paed
iatr.Scand.67:413−416;Tchernia,G.,et al.,1981,J.L
ab.Clin.Med.97（３）:322−331）、新生児血液の好適
な供給源は臍帯および胎盤である。新生児血液は、臍帯
からの直接排出および／または基部および膨張静脈にお
いて出産後胎盤からのニードルアスピレーションによっ
て得ることが好ましい。

5.1.1.1. 容積好適な実施態様において、50ml以上の新生児血液が得
られる（第6.1節参照のこと）。

実際には、50mlまたはそれ以上が満期出生の80％にお
いて容易に採血され、そして40ml以上が90％以上で得ら
れる。少量も許容され、そしてある状況のもとで示され
る（第5.1.1.2.3.1および第5.1.1.2.3.2節を参照のこ
と）。

次の情報は、50ml程度の臍帯血液には、成人の造血系
を再集団化するために十分な細胞が含まれており、より
少ない臍帯血液も同一の効果を示すことが可能であるこ
とを示唆する。

1.自己由来骨髄移植の場合の小サンプリングにおいて
（Spitzer,Gl.,et al.,1980,Blood 55:317−323）、急
性白血病患者における造血機能の急速な再集団化は24万
個程度の顆粒球−マクロファージ前駆細胞（CFU−GM）
によるものだった。

2.ヒト臍帯血液中には、100,000個の低密度細胞当り約5
0〜200個のCFU−GM、および1ml当り少なくとも500万個
の低密度臍帯血液細胞が存在する。つまり50mlの臍帯血
液には、10万〜50万以上のCFU−GMが含まれる（6.8節参
照のこと）。上限値は、12.5〜19日令胎児血液のGFU−G
M測定値と極めて一致する（Lynch,D.C.,et al.,1982,Bl
ood 59:976−979）。

3.重要なことは、臍帯血液中の幹および前駆細胞は成人
骨髄中のものよりも培養皿中でより大きな増殖能を有す
ることである（Salahuddin,S.Z.,et al.,1981,Blood 5
8:931−938;Gappellini,M.D.,et al.,1984,Brit.J.Haem
atol.57:61−70）。

幹細胞源として臍帯血液を使用することによって、Ｓ
−細胞検定法がヒト臍帯血液の増殖に適合されたことは
重要である（Nakahata,T.and Ogawa,M.,1982,J.Clin.In
vest.70:324−1328）。すべての既知の前駆細胞は臍帯
血液中に多量に存在し、これには多系統、顆粒球、マク
ロファージ、赤血球、マスト細胞および好塩基球の前駆
細胞が含まれる（同上;Fauser,A.A.and Messner,H.A.19
78,Blood 52−1243−1248;Koizumi,S.,et al.,1982,Blo
od 60:1046−1049;Prindull,G.,et al.,1978,Acta Paed
iatr.Scand.67:413−416）。

その上、造血幹および前駆細胞は、凍結保存前後に培
地で効果的に増殖し得（第5.1.3.2,5.3.2節参照のこ
と）、治療に有効な幹細胞の数を増やすことができる。

5.1.1.2. 好適な態様次のサブセクションは、本発明の好適な特定の実施態
様の詳細な記述を提供するものであり、説明目的のため
であり、本発明の範囲を決して限定するものではない。

5.1.1.2.1. 採取キット好適な態様において、無菌容器に収納された採取キッ
トが使用し得る。ある特定の実施態様において、採取キ
ットは、次のものからなる：（ｉ）抗凝血剤を有する広口の目盛付き採取容器（その
中へ臍帯の切断端が重力排出によって採取するように置
かれる）、必要により使用するために小ロートを取りつ
けてある；（ii）（任意の）プラスチック製の、柔軟で、シールさ
れた採取バッグ（それは献血バックに類似し、採取血液
の注入口を有し、抗凝血剤を含有する）；（iii）表示ラベル（それは試料源の出生児名および採
取時期を表示する）。

多重出産では、分離採取、すなわち各々別個のキット
で行なわれるものが好ましい。

容器の殺菌は当技術分野のいかなる既知の技術によっ
ても実施され、β−照射線、蒸気殺菌容器内で使用でき
る材質のオートクレーブ処理等がふくまれるがそれらに
限定されない。例えば、好適な実施態様においてβ−照
射線殺菌は、タングステン源からの2.5メガラッド照射
によって実施し得る（第6.1.節参照のこと）。

採取キットは、すぐに利用できるように、出産前に手
術域に置くとよい。

5.1.1.2.2. 満期育児の腟出産自然な、鉗子によってまたは臀位出産としての満期に
おける赤ん坊の腟出産は、臍帯血液の十分な採取が可能
である。臍帯を結紮した後、臍帯とそれにつながった胎
盤に残っている胎児の血液は45ml/kg出生児体重または
７ポンド（3.2kg）の出生児あたり約145mlと測定された
（Hellman,L.M.,et al.,1971,Williams Obstetrics,14t
h Ed.,Appleon−Century−Crofts,New York,p.216）。

麻酔してあるいはなしで、いかなる方法でも赤ん坊を
分娩後、赤ん坊は腟と同高平面に保持され、そして臍帯
は二重結紮され、そしてへそから約３インチ（７−8c
m）で切られた。赤ん坊は切り離される。

通常の殺菌対策を指示し、臍帯はその後結紮されてつ
ぶされたちょうどその上を横に切断し、そして臍管から
の胎児の血液の流れは準備した容器に採取される。通
常、臍帯をしぼることなく十分に採取され、胎盤分離が
生ずる前、該採取は約２分で終了する。母系血液、尿、
または分娩域の他の体液による汚染を避けるべく十分に
注意すべきである。容器中の血液は、その後貯蔵設備に
移動するように準備したバッグに移され、または最初に
もし強固なスクリューキャップが容器に取り付けられて
いれば、内容物を移すことなくそれ自体を貯蔵設備に送
ることができる。

もし、赤ん坊の出産児、何らかの事由で採取が難しい
場合には、採取は胎盤の排出後行なうことができる（第
5.1.1.2.3.6節参照のこと）。もし母系感染の疑いがあ
る場合、胎盤採取が好ましい。採取は重力排出に加え
て、産後の胎盤からのアスピレーションによっても行な
い得る。

最適な実施態様において、出産後のすばやい臍帯の結
紮が、臍帯血液の最大可能な容量の採取を達成するため
に実施される。研究では、赤ん坊と胎盤回路間の血液の
相対的分配割合は、出産後臍帯結紮の時期が遅れるほ
ど、赤ん坊の血液回路の方が多くなること示される（Ya
o,A.C.,et al.,October 25,1969,Lancet:871−873）。

5.1.1.2.3. 誕生の他の状況と出産 5.1.1.2.3.1. 早産早産児の臍帯血液は、満期臍帯血液よりも多くの割合
の幹および前駆細胞を含んでいる。すなわち、早産赤ん
坊からの臍帯血液は少容量でも幹及び前駆細胞の十分な
収量を与える（第5.4.2節及び第6.6節で記載されたよう
な幹及び前駆細胞検定の使用により収量が決定され
る）。このように、一般に、臍帯血液採取は、たとえ採
取された血液の容量が通常より少なくても、もし早産赤
ん坊の生存が予想されれば行なうべきである。採取法
は、満期誕生のものと同一であるべきである。

5.1.1.2.3.2. 多重出産多重出産児に行なわれる臍帯血液採取には、付加的な
方法の考慮が含まれる。

（ｉ）多重出産はしばしば早産であり、臍帯血液容量
は、それに対応して少ない。それにもかかわらず採取は
行なわれるべきであり、貯蔵のための保存の決定は後に
行えばよい。

（ii）２人以上の赤ん坊の出産が起き、後の自己再構成
に臍帯採取物の使用が予想される場合に、各採取物がそ
れぞれの赤ん坊について識別されることが必須である。
接合状態が疑わしい場合には、臍帯血液および出生後の
サンプルについて血液型の決定を行なえばよい。

（iii）双子の臍帯血液採取のタイミングは、産科医の
判断による（双子の片方の分娩後、または両者の分娩
後）。

（iv）胎盤関係の注意深い記述がなされるべきである
（単一または二重の羊膜；単一、二重または融合絨毛
膜）。

5.1.1.2.3.3. 帝王切開分娩帝王切開児の臍帯血液採取は、膣分娩と同一のキッ
ト、同一の方法で実行し得る。臍帯の切断端は重力排出
促進のため低位にされる。

帝王切開時に、臍帯血液採取は、赤ん坊の分娩後で胎
盤分離前になされることが特に好ましい。しかしなが
ら、出血多量、先に取り出した胎盤に切れ目を入れまた
は分離する必要性または手術中他の出来事によって総力
をあげる必要があれば、そうしなくてもよい。すなわ
ち、これらおよび類似の場合に、胎盤が取り除かれ、臍
帯血液は後にそれから採取される。

5.1.1.2.3.4. 複雑な分娩母系または赤ん坊、または両者の状態から起る分娩の
複雑化は、産科医およびその助手のすばやくかつ緊急な
配慮が必要である。これらの状況のもとで分娩胎盤はと
って置かれ、採取はできる限り早急に実施される。

5.1.1.2.3.5. 異常胎盤臍帯血液採取をうまく行なうためには、胎盤が損なわ
れておらず、またはほぼそのようであることが好まし
い。縁または部分分離の事例でも、もし臨床環境が即座
に除去の必要性を示せば、胎児の分娩後実施されなけれ
ばならないが、採取の機会が与えられる。胎児の循環系
の破壊が生じた場合は、採取が不利となろう。試料は、
後程、母系血液による汚染が試験される（第5.1.2節を
参照のこと）。胎盤異常の正確な記載が好ましい。

5.1.1.2.3.6. 分娩胎盤からの採取胎盤の急速分娩が生じまたは必要となり、臍帯血液採
取が胎盤分離前に実行できない場合でも、十分な量のサ
ンプルは分娩後得ることができる。採取は、第5.1.1.2.
2節に記載と同一技術で行なわれる。しかしながら、採
取は無菌操作を保って、分娩の５分以内で完全に行なう
ことが好ましい。

胎盤分離前臍帯血液採取が、分娩胎盤からの採取より
も好ましいのは次の理由からである。分娩胎盤からの採
取において（ｉ）採取容量が一般に少ない、（ii）胎盤
血流における凝血が再生を制限する場合がある、そして
（iii）母系血液または他の因子による汚染の可能性が
増加するからである。それ故に、分娩胎盤から採取した
試料の適合性の決定は特に重要である。

5.1.1.2.3.7. 母体の医学上の条件胎児に不利な影響を与える薬剤の母系使用に対する一般
的な禁止があるため、母体の治療または投薬が正常な赤
ん坊の臍帯血液採取品からの幹細胞再生に不利な影響を
与えることは一般に考えにくい。しかし、好適な実施態
様において、薬剤乱用、垂直伝播可能なウィルス疾患、
および分娩時の急性の母体の病気の影響について、これ
らが臍帯血液からの幹細胞再生に影響を与える可能性が
あるので、特別の情報が得られるべきである。

5.1.1.2.3.8. 準備されてない分娩入念な計画にもかかわらず、分娩は折悪く、時々尚早
にそして医師の即座の働きなくして起こる。これらの状
況下では、次の方法が好ましい。（ｉ）臍帯血液採取
は、前記標準キットを用いて試されるべきである、（i
i）胎盤は、無菌でない領域で分娩が起これば、臍帯を
結紮したまま、とにかくできるだけ清浄にし、採取は５
分以内に試みられるべきである、（iii）臍帯は洗浄剤
（例えばベタディン）でふき、結紮位置の上を切断して
採取し、そして（iv）試料に添えて分娩状況を記載すべ
きである。

5.1.1.2.4. データの記録好適な実施態様において、後述第Ｉ表のデータが、採
取血液の正確な表示及び評価を確実なものとするため
に、採取時に得られる。

第Ｉ表新生児血液採取時に記録すべきデータ分娩の日時母親の住所と氏名病院の表示赤ん坊の性赤ん坊の体重誕生順序（多重妊娠）妊娠月齢妊娠合併症出産時合併症分娩の型胎盤採取物（採取血液量）胎盤の説明と重さ赤ん坊の状況 5.1.2. 新生児血液の検査および試験好適な実施態様において新生児血液試料は、適合性を
確認するために検査、試験される。適切な検査および試
験には後述の方法が含まれるがそれに限定されることは
ない。

血液採取試料が加工工場へ輸送されるならば、血液容
器およびその内容物は不十分な密閉および漏れの如き欠
陥について検査すべきである。随意に、採取キットは、
輸送中の温度変化範囲を記録するために好適に設置され
た再使用可能な最高−最低水銀温度計を含んでいてもよ
い。凝固、血漿の不透明度および明らかな溶血は、細菌
汚染または他の誤った取り扱いの結果を示す。採取後の
経過時間にも注意を要する。

採取新生児血液試料に関する次の試験は、定型的かま
たは臨床的に示されている場合に実施し得る：（ｉ）細菌培養：微生物汚染のないことを確認するため
に、好気性および嫌気性条件下における細菌の定型ホス
ピタル培養の如き確立した検定が実施し得る。

（ii）病原性微生物の診断上のスクリーニング；特定の
病原性微生物のないことを保証するために、多くの診断
上の試験法が使用し得る。血液によって伝播可能な多く
の病原菌のいずれかに関する診断上のスクリーニング
は、標準的手法によって実施得る。１例として、採取血
液試料は、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、すなわち後
天性免疫不全症候群（AIDS）原因ウィルスの存在を確認
する診断上のスクリーニングに委ねられる（Gallo et a
l.,1984,Science 224:500−503;Barre−Sinoussi,F.,et
al.,1983,Science 220:868;Levy,J.A.,et al.,1984,Sc
ience 225:840）。多数の検定システムのいずれも、ビ
リオン、ウィルスコード化タンパク質、HAV特異核酸、H
IVタンパク質の抗体等の検出に基づいて使用し得る。

（iii）血液が新生児源であることの確認：母体血液に
よる汚染は、貯蔵および臨床有効性を損なうものではな
いが、分娩の経過から推測される。母体細胞および成人
血液の存在は、一般に次の試験法が含まれるがそれらに
限定されけることのない各種の試験法によって示し得
る。すなわちＩタイピング（I typing）（Wiener,A.S.,
et al.,1965,Am..phys.Anthropol.23（４）:389−39
6）；新生児および母体血液細胞間の大きさの相違を検
出するコールターチャンネライザ（Coluter Channely
zer）分析（Draffos,F.,et al.,1985,Am.J.Obstet.Gyne
col.153:655−660）；クラインハウアー−ベトケ（Klei
nhauer−Betke）技術の如きヘモグロビン染色法（Betk
e,K.,1968,Bibl.Haematologica 29:1085）及び誕生前と
その後の赤血球に含まれるヘモグロビンの型の相違を検
出できるその他の方法（Clayton,E.M.,et al.,1970,Obs
tetrics and Gynecology 35（４）:642−645）がある。

好適な実施態様にいおて、Ｉタイピングは、抗−ｉお
よび抗−Ｉ抗体による凝集の如き確立した方法によって
実施し得る。新生児赤血球はｉ（強）,I（弱）であり、
18ケ月令ではＩ（強）、ｉ（弱）である（Marsh,W.L.,1
961,Brit.J.Haemat.7:200）。このように抗−ｉまたは
抗−Ｉ抗体との反応度合は、新生児と成人血液混合物中
の新生児血液と赤血球との割合の尺度である。母体の幹
および前駆細胞の混入は、幹および前駆細細胞が成人血
液ではまれであるので、母体細胞の総混入量よりも極め
て少ない（コロニー検定法における幹および前駆細胞の
少なさ（第5.4.2節参照のこと）は、新生児と成人血液
間のもう一つの特徴的な差異である）。

5.1.3. 任意手順本発明の好適な実施態様において全新生児血液は、採
取された時に、低温で凍結され、細胞処理プロトコール
の間に受ける細胞損失を最少にできる。しかしながら、
細胞分離手順およびインビトロ培地における幹および前
駆細胞数の増大化は、任意である。かかる手順は、それ
ぞれ凍結すべき試料容積の減少および細胞総数の増加等
に有効である。後述の第5.1.3.1および5.1.3.2節に記載
の手順は、処理時の造血幹および前駆細胞損失が造血再
構成における採取血液試料の治療効率を危うくしないこ
とを保証するために、使用前に注意深く選択されるべき
である。

5.1.3.1. 造血幹および前駆細胞の富化：細胞分離手順抗凝血剤（例えばACD）中の臍帯血液または骨髄試料
を入手後、細胞は物理的および／または免疫学的細胞分
離手順に委ねられる。かかる手順は、造血幹および前駆
細胞を富化するので、少量の前細胞で貯蔵し移植でき
る。しかしながら、細胞分離が望まれるならば、造血幹
細胞及び前駆細胞の十分な再生を保証するために注意深
く行なうべきである。

各種の手順は当技術分野にいおて公知であり、そして
本発明の幹および前駆細胞の富化に使用し得る。これに
は、平衡密度遠心分離、単位重力における沈降速度、免
疫ロゼッティング（rosetting）と免疫付着、向流遠心
エルトリエーション、Ｔリンパ球枯渇およびケイ光活性
化細胞分類、それぞれ単独でまたは組合せたものがある
がこれらに限定されることはない。最近、極めて富化さ
れた母集団の幹／前駆細胞単離手順が報告された。ネズ
ミのCFU−Ｓは、若干異なる手順によって各種のグルー
プに精製された（Visser,J.W.M.,et al.,1984,J.Exp.Me
d.59−1576;Nijhof,W.,et al.,1984,Exp.Cell Res.155:
583;Bauman,J.G.J.et al.,1986,J.Cell.Physiol.128:13
3;Lord,B.I.and Spooncer,E.,1986,Lymphokine Res.5:5
9）。ヒト（Emerson,S.G.,et al.,1985,J.Clin.Invest.
76−1286）またはネズミ（Nicola,N.A.et al.,1981,Blo
od 58:376）の胎児肝臓細胞を使用する実験では、多重
−、エリトロイド−および顆粒球−マクロファージ系統
のコロニー形成細胞を90％まで有する高富化前駆細胞が
産生された。CFU−Ｅも極めて高度に富化されていた（N
ijhof,W.,et al.,1983,J.Cell Biol.96:386）。半固形
培地における成体マウス骨髄CFU−GMのクローニングに
よる99％までの精製は、犠牲にする前の３日間シクロホ
スファミドでマウスを前処置し、フィコル−ハイパキュ
ー（Fikoll−Hypaque）による密度分離および向流遠心
エルトリエーションによって達成された（Williams,D.
E.,et al.,1987,Exp.Hematol.15:243）。得られた細胞
フラクションは、検出可能なCFU−GEMM,BFU−ＥまたはC
FU−MKが含まれていなかったが、12日目に測定すると10
％までの細胞がCFU−Ｓを形成していた。これらの手順
またはその改良法が使用され、これらも本発明の範囲内
である。

ヒト幹および前駆細胞は、骨髄、脾臓および（成人と
臍帯）血液細胞の非付着、低密度、Ｔリンパ球枯渇フラ
クションに存在する。特定の実施態様において、低密度
（密度1.077gm/cm³より小さい）細胞は、フィコル−ハ
イパキュー（Ficoll−Hypaque）（ニュージャージー州
ピスカタウェイ、ファーマシアファインケミカルズ）
（後述の第6.3.1節参照のこと）またはパーコール（Per
col）（Broxmeyer,H.E.,1982,J.Clin.Invest.69:632−6
42）を使って分離し得る。この手順において、顆粒球系
列の成熟細胞は、移植には必要なく、試験管の底の高密
度フラクションとして除かれる。付着／非付着分離法
は、造血幹および前駆細胞富化にも使用し得る。使用し
得る方法は、第6.3.2節及びブロキシマイヤーらにより
記載されている（Broxmeyer,H.E.,et al.,1984,Clin.In
vest.73:939−953）。

必要により、自己由来血漿は、凍結プロセスで使用す
るために除かれる。特に、血液または骨髄試料は、試験
管を用いて単位重力で沈降させられる。沈降工程は、殺
菌−発熱物質を含まないデキストラン硫酸添加により早
められる。約15分後、血漿中の有核細胞を含有する上層
をとって遠心分離にかけられる（例えば200〜400xg）。
有核細胞は試験管底部にペレット化され、血漿は除か
れ、４℃において試験管で貯蔵される。有核細胞は洗浄
され、計数され、必要により更に分離される（例えばFi
koll−HypaqueまたはPercolによる密度“分離”手順を
用いることによる）。

造血幹および前駆細胞を富化するために、細胞を免疫
的に認識する細胞分離手順を使用することが可能であ
る。幹および前駆細胞は、細胞表面の抗原決定基を認識
する抗体を使用するポジティブまたはネガティブ選択に
よって単離し得る。１手段として、ケイ光活性細胞分類
またはパンニングの如き分離法と組合せて、細胞上の細
胞表面決定基を認識するモノクローナル抗体を使って細
胞を分離する手段が挙げられる（Boxmeyer,H.E.,et a
l.,1984,Clin.Invest.73:939−953）。現在、ヒト造血
幹および前駆細胞に絶対的に特異性のある既知の抗原決
定基はない。しかしながら、これらの細胞は他の細胞に
存在しない抗原決定基を含有しており、富化目的のため
の抗体選択プロトコールに使用し得る。かかる抗原に
は、後述のものが含まれるがそれらに限定されることは
ない。

ヒトにおいて、種々の抗原が幹／前駆細胞上に見い出
された。広範に研究された第１の抗原系は、MHCクラスI
I抗原、特にHLA−DRであった。これは、CFU−GEMM、BFU
−Ｅ、およびCFU−GM上で見い出された（Lu,L.,et al.,
1983,Blood 61:250;Winchester,R.J.,et al.,f1977,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:4012;Busch,F.W.,et al.,19
87,Blut 54:179）。何人かの研究者達は、HLA−DRが存
在しないか、またはCFU−GEMMより初期に細胞上に低密
度で存在することを示唆した（Moore,M.A.S.,et al.,19
80,Blood 55:682;Keating,A,et al.,1984,Blood 64:115
9）が、同意しない者もいる（Falkenberg,J.H.F.,et a
l.,1985,J.Exp.Med.162:1359）。この不一致は、初期前
駆細胞の特定のサブセットの存在によるかもしれない。
事実HLA−DRの発現は、造血前駆細胞の細胞周期におけ
るＳ−期が高い（Broxmeyer,H.E.,1982,J.Clin.Invest.
69:632;Cannistra,S.A.,et al.,1985,Blood 65:414）。
14日目のCFU−GMは、７日目のCFU−GMよりも高レベルの
HLA−DRを発現し、７日目のCFU−GMのなかで単球前駆細
胞は顆粒球前駆細胞よりもHLA−DRを多く発現する（Gri
ffin,J.D.,et al.,1985,Blood 66:788）。HLA−DR発現
は減少し、初期骨髄前駆細胞段階において消失し、そし
てHLA−DR抗原が骨髄発育である役割を担うことが示唆
された（Winchster,R.J.et al.,1977）。

抗体群が、顆粒球−マクロファージ系統の異なる前駆
細胞を区別するために使用された（Ferrero,D.,et al.,
1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4114）。タイプ１
CFU−GMは、末梢血CFU−GMの全てと少数の骨髄CFU−G
Mとに寄与する。それらは、S3−13およびS17−25抗体に
よって認識されるけれどもR1B19及びWGHS−29−１抗体
によって認識されない表面抗原を発現する。タイプ２
CFU−GMは骨髄だけに存在し、S3−13、R1B19、およびWG
HS−29−１と反応する。液体培地中のタイプ１ CFU−G
Mの培養はタイプ２ CFU−GMを生成する。これらの抗体
は、慢性骨髄増殖性疾患の患者からのCFU−GMを同定す
るためにも使用された（Robak,T.,et al.,1985,Leukenm
ia Res.9:1023;Ferrero.D.,et al.,1986,Cancer Res.4
6:975）。

ヒト幹／前駆細胞上の他の抗原には、My10（Leary,A.
G.,et al.,1987,Blood 69:953;Strauss,L.C.,et al.,19
86,Exp.Hematol.14:879）,3C5（Katz,FE.,et al.,1985,
Leukemia Res.9:191;Katz,F.E.,et al.,1986,Leukemia
Res.10:961）,RFB−１（Bodger,M.P.,et al.,1983,Bloo
d 61:1006）,12−８（Andrews,R.G.,et al.,1986,Blood
67:842），およびL4F3（Andrews,R.G.,et a.,1986,Blo
od 68:1030）抗体と反応するものが含まれる。L4F3によ
って認識される抗原は、CFU−GM、CFU−MK,BFU−Ｅおよ
びCFU−GEMM上に存在するが、懸濁培養でこれらの前駆
細胞を生成する細胞を明らかに欠いている（同上）。L4
F3は、急性骨髄性白血病患者からの大部分の幼若細胞と
反応し、かかる患者由来の細胞のL4F3による処理はイン
ビトロで正常前駆細胞の成長を許容した（Bernstein,I.
D.,et al.,1987,J.Clin.Invest.79:1153）。他の抗体My
11により認識される抗原はGFU−GM上で発現されるが、B
FU−ＥはCFU−GEMM上では発現されない（Strauss,L.C.,
et al.,1986,Exp.Hematol.14:935）。各種レクチンのレ
セプターも幹／前駆細胞上で発現される（Nicola,N.A.,
et al.,1980,J.Cell Physiol.103:217;Reisner,Y.,et a
l.,1982,Blood 59:360;Reisner,Y.,et al.,1978,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.75:2933;Aizawa,S.,and Tavassol
i,M.,1986,Int.J.Cell Cloning 4:464）。

成人ヒト骨髄前駆細胞の富化に関するある成功例は、
モノクローナル抗体の使用と細胞選別とに基づいて報告
されている。ある研究において、細胞はポジティブ対ネ
ガティブ集団だけに関して選別されている（Katz,F.E.,
et al.,1986,Leukemia Res.10:961）。最近My10とHLA−
DR抗体は、二色選別と関連させてヒト骨髄から高富化前
駆細胞集団を得るために使用された（Lu,L.,et al.,198
7,J.Immunol.139（６）:1823−1829）。

特定の実施態様において、現在利用でき、かつ富化プ
ロトコールに使用し得る抗体には、My−10、3C5またはR
FB−１が含まれる。これらの抗体は、単独でまたは“パ
ンニング（panning）”（Broxmeyer,H.E.et al.,1983,
J.Clin.Invest.73:939−953）やケイ光活性化細胞選別
（FACS）（Williams,D.E.,et al.,1985,Immunol.135:10
04;Lu,L.,et al.,1986,Blood 68（１）:126−133）のよ
うな手法と組合せて使用し、モノクローナル抗体によっ
て認識される表面決定基を含有する細胞を単離すること
ができる。

他の実施態様において、富化は、所望により、所要組
織適合性（MHC）クラスII抗原（特にHLA−DR）およびMy
10に対するモノクローナル抗体を使用することにより進
められる（Lu,L.,et al.,1987,J.Immunol.139（６）:18
23−1829）。

Ｔリンパ球枯渇は、造血幹または前駆細胞富化に使用
し得る。この方法において、Ｔリンパ球は、細胞をＴ細
胞抗原を認識するモノクローナル抗体と補体で前処理す
ることによって細胞集団から選択的に除かれる。かかる
手順は前記されている（Broxmeyer,H.E.et al.,1984,Cl
in.Invest.73:939−953）。

使用し得る他の方法は、大豆の如きレクチンを使用す
る選択的凝集法によって幹および前駆細胞を分離する方
法である（Reisner,Y.,et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.77:1164）。この方法は、必要と考えられる補
助細胞を除くことなく、幹および前駆細胞の分離及び富
化を実行することが可能な代替法である（Reisner,Y.,e
t al.,1983,Blood 61（２）:341−348;Reisner,Y.,et a
l.,1982,Blood 59（２）:360−363）。

理論的に、１つの初期幹細胞だけで全造血系の再集団
化が可能である。理想的な条件下でかつ受容動物の幹及
び前駆細胞を育てる微小環境が影響を受けない時に、単
一の幹細胞はマウスの欠損造血系を全体的に再集団化
し、かつ、貧血の致死的合併症からマウスを救うという
実験室的知見が存在する（Boggs,D.R.,et al.,1982,J.C
lin.Invest.70:242−253）。明らかに、ヒトの臨床条件
下で造血系を回復させるために一般に１個以上の幹細胞
を必要とする。その上、補助またはヘルパー細胞（幹／
前駆細胞の成長に影響を与える非幹／前駆細胞）の存在
が、幹および前駆細胞に加えて、特に宿主の微小環境が
照射または化学療法の如き処理によって傷つけられた場
合には、必要となる（Spooncer,F.,et al.,1985,Nature
（London）316:62−64）。このように、他の臍帯血液細
胞から造血幹および前駆細胞を分離する方法があり（Le
ary,A.G.,et al.,1984,J.Clin.Invest.74:2193−219
7）、そしてこれら及び他の方法が移植用細胞の純粋ま
たは高富化調製物を単離しかつ貯蔵するために使用でき
るけれども、患者に幹および前駆細胞の精製調製物を移
植する際には十分に注意が払われるべきである。

5.1.3.2. 造血幹および前駆細胞のインビトロ培養インビトロにおいて造血幹および前駆細胞を増加させ
るために任意の手法（凍結保存の前あるいは後）がなさ
れる。しかしながら、インビトロにおける増殖が、造血
再構成に治療上必要な多分化能幹および前駆細胞を消費
して分化された子孫細胞の形成をもたらさないよう注意
を要する。臍帯血液おおび骨髄細胞のインビトロ増殖に
関する多くのプロトコールが提唱されており、そしてこ
れらの手法ないしはその変更態様が用いられ得ることが
理解されよう（以下の第6.9節を参照のことSmith,S.and
Broxmeyer,H.E.,1986,Br.J.Haematol.63:29−34;Dexte
r,T.M.,et al.,1977,J.Cell.Physiol.91:335;Witlock,
C.A.and Witte,O.N.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7
9:3608−3612）。インビトロ増殖の刺激のために、種々
の因子がまた試験され得る。これらの因子には例えば、
インターロイキン−３（IL−３）、顆粒球−マクロファ
ージ（GM）−コロニ−刺激因子（CSE）、IL−１（ヘモ
ポエチン−１）、1L−４（Ｂ細胞増殖因子）およびIL−
６の単独ないし組合せが含まれるが、もちろんこれらに
限定されけるわけではない。

5.2. 凍結保存細胞の凍結は、一般に破壊的である。冷却時、細胞中
に含まれる水分が凍結する。そして、細胞膜における浸
透圧効果、細胞脱水、溶質濃縮および氷結晶形成によっ
て損傷が発生する。氷が細胞の外で形成されると、利用
可能な水分が溶液から除去されそして細胞から抜き取ら
れるため、浸透圧による脱水が生起し、溶質濃縮が生
じ、これによって細胞が結果的に破壊される（この論議
に関しては、Mazur,P.,1977,Cryobiology 14:251−272
を参照のこと）。

このような損傷結果は、（ａ）凍結保護剤の使用、
（ｂ）凍結速度の制御、および（ｃ）変性反応を最小化
するのに十分低い温度での貯蔵、によって回避すること
が可能である。

使用され得る凍結保護剤としては、ジメチルスルフォ
キシド（DMSO）（Lovelock,J.E. and Bishop,M.W.H.,19
59,Nature 183:1394−1395;Ashwood−Smith,M.J.,1961,
Nature 190:1204−1205）、グリセロール、ポリビニル
ピロリジン（Rinfret,A.P.,1960,Ann.N.Y.Acad.Sci.85:
576）、ポリエチレングリコール（Sloviter,H.A.and Ra
vdin,R.G.,1962,Nature 196:548）、アルブミン、デキ
ストラン、ショ糖、エチレングリコール、ｉ−エリスリ
トール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール（Rowe,A.
W.,etal.,1962,Fed.Proc.21:157）、Ｄ−ソルビトー
ル、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン
（Bender,M.A.,et al.,1960,J.Appl.Physiol.15:52
0）、アミン酸（Phan The Tran and Bender,M.A.,1960,
Exp.Cell Res.20:651）、メタノール、アセトアミド、
グリセロールモノアセテート（Lovelock,J.E.,1954,B
iochem.J.56:265）、および無機塩類（Phan The Tran a
nd Bender,M.A.,1960,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104:388;
Phan The Tran and Bender,M.A.,1961,in Radiobiolog
y,Proceedings of the Third Australian Conference o
n Radiobiology,Ilbery,P.L.T.,ed.,Butterworth,Londo
n,p.59）などが含まれるがもちろんこれらに限定される
ものではない。好ましい実施態様においては、低濃度で
細胞に対して非毒性の液体であるDMSOが用いられる。小
分子であるため、DMSOは細胞に自由に浸透し、そして水
と結合してその凍結能を変更しそして氷形成からの損傷
を防ぐことによって細胞内小器官を保護するものであ
る。DMSO添加の後、約１％のDMSO濃度が、４℃以上の温
度では毒性であるため、細胞は凍結まで０℃に保たれる
べきである。

制御された徐冷速度は重要である。異なる凍結保護剤
（Rapatz,G.,et al.,1968,Cryobiology5（１）:18−2
5）および異なる細胞種は、異なる最適冷却速度を有す
るものである（例えば、Rowe,A.W.and Rinfret,A.P.,19
62,Blood 20:636;Rowe,A.W.,1966,Crybiology3（１）:1
2−18;Lewis,J.P.,et al.,1967,Transfusion7（１）:17
−32;and Mazur,P.1970,Science 168:939−949を参照の
こと。なおこれらには数種の骨髄幹細胞の生存およびそ
れらの移植能における冷却濃度の影響に関する記載があ
る。）水が氷に変化する融合相の熱は最小化されるべき
である。冷却手順は例えばプログラム可能な凍結装置な
どの使用によって、あるいはメタノール浴法の使用によ
って実行され得る。

プログラム可能な凍結装置は、最適冷却速度の決定を
許容し、そして標準的な再現性のある冷却を容易なもの
とする。クリオメド［Cryomed］やプラナー［Planar］
などのごときプログラム可能な制御速度を持つ冷凍機
は、所望の冷却速度曲線への凍結規制の調整を可能にす
る。例えば、10％DMSOおよび20％血漿中の骨髄細胞に関
しては、最適速度は０℃〜−80℃で１〜３℃／分であ
る。好ましい実施態様においては、この冷却速度は本発
明の新生児細胞に関して用いられることができる。細胞
を保護する貯蔵器は凍結温度にて安定なものでなければ
ならず、そして凍結および解凍の双方の有効な制御のた
めの迅速な熱移動をもたらすものでなければならない。
密封されたプラスチックバイアル（例えば、ナンク［Nu
nc］、ウェアトンクリューレ［Wheaton cryule］）ま
たはガラス製アンプルが、少量（１〜2ml）多数個に関
し使用可能であり、一方より大きい容量（100〜200ml）
は、ポリオレフィンバック（例えばデルムド［Delme
d］）中において凍結されることが可能であ、冷却の間
のより望ましい熱移動のために金属プレート間に保持さ
れる。（骨髄細胞のバッグは、−80℃の冷凍機中にこれ
らを静置することによって偶然にも約３℃／分の冷却速
度で首尾よく凍結される。）他の実施態様において、メタノール浴法での冷却が用
いられ得る。メタノール浴法は、多数の小容量のものを
大規模に日常的に凍結保存するのに非常に適している。
この方法は、凍結速度の人手による制御および速度をモ
ニターするための記録者を必要としない。好ましい観点
において、DMSO処理細胞は、氷上で予冷され、そして冷
却したメタノールが入っている皿中に移され、そしてこ
れは、機械的冷却機（例えばハリス［Harris］あるいは
レブコ［Revco］）中に−80℃にて配置される。メタノ
ール浴と試料との熱電対測定は、１〜３℃／分の所望の
冷却速度を示す。少なくとも２時間の後、試料は−80℃
の温度に達し、そして永久貯蔵のために液体窒素（−19
6℃）中へ直接置くことができる。

完全な凍結の後、細胞は、迅速に長期冷凍保存容器へ
と移されることができる。好ましい実施態様において、
試料は液体窒素（−196℃）ないしはその蒸気（−165
℃）中で凍結保存され得る。このような貯蔵は、極低真
空度と内部超絶縁を有するために熱漏洩および窒素損失
が非常に最小量に保持されている大容量のサーモス［Th
ermos］貯蔵容器に類似する非常に効果的な液体窒素冷
凍機が利用可能であることから、きわめて容易である。

ある好ましい実施態様においては、下記第6.4節にお
いて述べられる凍結保存法が用いられることが想像され
る。滅菌貯蔵容器は、好ましくは内側にねじの切られた
キャップを有しており、汚染することなく容易に取り扱
えるようにされている。好ましい載架システムは商業的
に入手可能であり、そして個々の検体の分類登録、貯蔵
および回収のために用いられ得る。

造血幹細胞、特に骨髄あるいは末梢血由来の造血幹細
胞の取扱い、凍結保存および長期保存は、本発明の新生
児のおよび胎児の幹細胞にほぼ適用される。このような
論述は、例えば、参照によりここに引用される、以下の
参考文献において見ることができるものである:Gorin,
N.C.,1986,Clinics In Haematology 15（１）:19−48;B
one−Marrow Conservation,Culture and Transplantati
on,Proceedings of a Panel,Moscow,July 22−26,1968,
International Atomic Energy Agency,Vienna,pp.107−
186。

生存可能な細胞の凍結保存に関するその他の方法、も
しくはその変更機能も利用可能であり、使用が意図され
ている（例えば、冷却金属鏡技術;Livesey,S.A.and Lin
ner,J.G.,1987,Nature 327:255;Linner,J.G.,et al.,19
86,J.Histochem.Cytochem.34（９）:1123−1135;センカ
ン［Senkan］らの米国特許第4,199,022号、シュワルツ
［Schwartz］の米国特許第3,753,357号、フェイ［Fah
y］の米国特許第4,559,298号および上記第2.3節も参照
のこと）。

5.3. 幹細胞および前駆細胞の凍結状態からの再生 5.3.1 解凍凍結細胞は好ましくは急速解凍（例えば37〜41℃に保
持された水浴中にて）され、そして融解の際にすぐに冷
却される。特に凍結細胞を収容してなるビンは、温水浴
中にその首部まで浸すことができる。ゆっくりとした回
転により、融解した細胞懸濁液の混合が可能となり、か
つ温水から内部の氷塊への熱移動が増加する。氷が完全
に融解すると直ちに、このビンは氷中に迅速に配置され
る（以下、第6.5節を参照のこと）。

5.3.2. 任意的手順本発明の好ましい実施態様においては、解凍された新
生児血液試料が造血再構成のために注入される。これゆ
え、凍結保存されそして解凍された新生児全血を治療の
ために注入することが意図される。しかしながら、解凍
された細胞のプロセッシングに関するいくつかの手法が
利用可能であり、そして望ましいと思われる場合は用い
ることができる。これらの手法が下記にある。

解凍の際の細胞凝集を防止するために、細胞を処理す
ることは好ましいことであろう。凝集（クランピング）
を防止するために、種々の手法が用いられ得るが、例え
ば凍結の前および／または後におけるDNアーゼ（DNas
e）の添加（Spitzer,G.,et al.,1980,Cancer 45:3075−
3085）、低分子量デキストランおよびクエン塩酸、ヒド
ロキシエチルデンプンの添加（Stiff,P.J.,et al.,198
3,Cryobiology 20:17−24）等がある。しかしながらも
ちろんこれらに何ら限定されるものではない。

凍結保護剤が人体に有毒である場合、これは解凍され
た新生児幹細胞および前駆細胞の治療的使用の前に除去
されなければならない。凍結保護剤としてDMSOを用いた
実施態様においては、DMSOがたいした毒性を有しないも
のであるがゆえに、細胞の損失をなくすためにこの工程
を省略することが好ましい。しかしながら、凍結保護剤
の除去が望まれる場合は、この除去を解凍時に行なうこ
とが望ましい。

凍結保護剤を除去するための１つの方法は、影響のな
い濃度まで希釈することである。これは、媒体を添加す
る（さらに必要に応じて、細胞ペレット化のための遠心
分離、上澄液の除去、そして細胞の際懸濁からなる１回
以上のサイクルを行う）ことによって達成され得る。例
えば解凍された細胞の細胞内DMSOは、あるレベル（１％
未満）まで低減することができるが、このレベルは再生
された細胞に悪影響を及ぼさないだろう。これは、DMSO
除去の間に生じ得る浸透圧勾配による損傷を最小化する
ために、ゆっくりと行うことが好ましい（下記第6.5節
を参照のこと）。

凍結保護剤の除去の後、細胞数計測（例えば、血球細
胞計測器を用いる）および生存テスト（例えばトリパン
ブルー排除;Kuchler,R.J.1977,Biochemical Methods in
Cell Culture and Virology,Dowden,Hutchinson＆Ros
s,Stroudsburg,Pa.,pp.18−19;1964,Methods in Medica
l Research,Eisen,H.N.,et al.,eds.,Vol.10,Year Book
Medical Publishers,Inc.Chicago,pp.39−47）が細胞
生存数を確認するために行なわれる。

解凍された細胞のプロセッシングに関し、用いられる
その他の手法としては、造血幹細胞および前駆細胞の富
化（上記第5.1.3.1節参照）およびインビトロ培養によ
る増殖（上記第5.1.3.2節参照）が包含される。しかし
ながら、好ましい実施態様においては、これらの工程
は、細胞の損失を最小化するために実施しない。

5.4. 再生された細胞の臨床的治療のための検査本発明の好ましい、しかしながら、必要とはされない
観点において、解凍された細胞は、生存性の標準的検定
法（例えばトリパンブルー排除）および微生物学的無菌
性の標準的検定法（上記第5.1.2節参照）によって検査
され、また、患者に対するそれらの同一性を確認および
／または決定するために検査され、さらにまた造血機能
に関して検査される。

5.4.1 同一性試験用いられ得る同一性試験法としては、HLA（ヒトにお
ける主要組織適合性複合体）タイピング（Bodmer,W.,19
73,in Manual of Tissue Typing Techniques,Ray,J.G.,
et al.,eds.,DHEW Publication No.（NIH）74−545,pp.
24−27）、および細胞の遺伝的同一性を確定するために
用いられるDNAフィンガープリンティングが包含される
が、もちろんこれらに限定されるものではない。DNAフ
ィンガープリンティング（Jeffreys,A.J.,et al.,1985,
Nature 314:67−73）は、それぞれの個体に特異的な、D
NA試料の起源の固定を可能とする、ヒトDNAの超可変ミ
ニサテライト領域に関連する広範な制限断片長多型を利
用するものであり（Jeffreys,A.J.,et al.,1985,Nature
316:76;Gill,P.,et al.,1985,Nature 318:577;Vassar
t,G.,et al.,1987,Science 235:683）、これゆえに使用
に適したものである。

治療のために再生された細胞が自己由来系において用
いられる本発明の特定の実施態様においては、細胞は、
それらの出所起源である受容患者に正確に適合されるは
ずである。

5.4.2 幹細胞および前駆細胞に関する検定幹細胞ないしは前駆細胞に関する数多くの検定の任意
のものを用いることが可能である（第2.1節参照）。下
記の第6.6節およびその分節において、特異的検定法の
例が開示される。そこに述べられる検定法の変更態様が
また使用可能であろう。例えば、種々の因子は単独で、
あるいは組合せにおいて、培養混合物中への添加の際の
コロニー形成の刺激に関して試験され得る（Broxmeyer,
H.E.,1986,Int.J.Cell Cloning 4:378−405;Lu,L.and B
roxmeyer,H.E.,1983,Exp.Hematol.11（８）:721−729;L
u,L.and Broxmeyer,H.E.,1985,Exp.Hematol.13:989−99
3参照のこと）。このような因子としては、酸素圧、Ｅ
型プロスタグランジン、インターロイキン−３（IL−
３）、顆粒球−マクロファージ（GM）コロニー刺激因子
（CSF）、顆粒球（Ｇ）−CSF、マクロファージ（Ｍ）−
CSF、エリスロポエチン、IL−１、IL−４（Ｂ細胞増殖
因子）、ヘミン（塩化第二鉄プロトポルフィリンIX）お
よび種々の細胞型によって調整された培地などが包含さ
れるが、もちろんこれらに限定されるわけではない。培
養物検定法はこれゆえ、コロニー成長にとってより効果
的な条件を用いるように変更され得る。インビトロコロ
ニー形成検定法のほかに、CFU−Ｓ（コロニー形成単位
−脾臓）についての幹細胞検定法を行うことができる。
この検定法において、自己複製能を有する多能性幹細胞
であるとみなされる細胞は、該細胞を含む組成物を注入
された致死的照射を受けたマウスの脾臓におけるコロニ
ー（小節）の数をかぞえることによって計測し得る。

特定の実施態様においては、Ｓ細胞（幹細胞）、なら
びにCFU−GEMM（多能性）およびCFU−GMおよびBFU−Ｅ
（より分化されている）カテゴリーの前駆細胞の識別の
ために、低密度フィコール−ハイパキュー分離細胞（1.
077g/cm³未満の密度）（幹細胞や前駆細胞を含む）を、
通常１プレート当り0.5〜2.0×10⁵で、まく。

5.5 造血の再構成本発明の新生児造血幹細胞および前駆細胞は、同系の
あるいは同種異系の宿主での、造血の再構成に関し治療
学的に用いられることができる。新生児細胞は、以下の
第5.6節において述べられるような、種々の疾病ないし
疾患の処置あるいは予防において、血液およびその他の
造血器官の再集団化［repopulation］のために患者内へ
導入され得る。新生児細胞の導入は、当分野において公
知の任意の方法によって行うことができるが、細胞の全
身的注入が好適な経路である。

本発明の好ましい実施態様において、新生児細胞は自
己由来の細胞、すなわち、該細胞を受け入れる宿主に由
来する細胞である。このような実施態様においては、衰
弱させる移植片対宿主病ないしは宿主対移植片病をなく
すために同種異系移植においてはしばしば必要とされる
免疫抑制療法（例えば、照射、化学療法）が避けられ
る。

5.6. 治療的使用本発明の新生児幹細胞および前駆細胞を用いての造血
系（あるいは免疫系）の再構成は、数多くの病気および
疾患に対して治療学的に価値のあるものである。

自己由来の新生児細胞の使用を包含する好ましい実施
態様においては、誕生後の任意の時期において造血再構
成を目的として予め凍結保存されていた新生児造血幹細
胞および前駆細胞を注入することは、同種異系骨髄移植
によって治療できることが現在知られている疾病の治療
に適用されるのみならず、同種異系骨髄移植からほとん
ど恩恵を受けることがないと現在考えられているいくつ
かのその他の病気に対する治療の可能性を提供する。こ
のことは、同種異系骨髄移植（すでに免疫的に不全であ
る少数の患者を除く）が、移植された骨髄を定着させる
ことができるように宿主（受容体）免疫系を抑制するこ
とを目的として照射あるいは化学療法での集中的な細胞
減少化を行なうといったレンピエントの移植前処置を必
要とするという事実に帰因するものである。同種異系の
HLA同一骨髄移植に伴うこの移植前細胞減少は、例え
ば、致命的な感染、慢性的な免疫不全症および頻繁に移
植片対宿病などのようないくつかの深刻な移植誘発合併
症を招く結果となろう。

幹細胞の注入によって治療されることのできる疾患
は、もちろんこれらに限定されるものではないが、５つ
の広いカテゴリーに包含されるものである。その第１
は、正常血液細胞産性および成熟化の欠損ないしは機能
不全による病気（すなわち、再生不良性貧血および高増
殖性幹細胞疾患）である。第２のグループは、造血器官
における腫瘍性の悪性疾患（例えば、白血病およびリン
パ腫）である。疾患の第３のグループは非造血性由来の
広範囲にわたる悪性固形腫瘍を有する患者の疾患からな
るものである。これらの患者への幹細胞注入は、悪性腫
瘍の致命的な化学療法ないし照射によって損なわれた骨
髄の救済法として役立つものである。病気の第４のグル
ープは自己免疫疾患で、該幹細胞が異常免疫系の置換物
の源として供給されるものである。病気の第５のグルー
プは、造血幹細胞、好ましくは同系造血幹細胞の注入に
よって治療され得るいくつかの遺伝的疾患（これらは移
植前に遺伝子療法を受けていたものである）からなるも
のである。新生児幹細胞および前駆細胞を用いての造血
再構成によって治療され得る特定の疾病および疾患は、
第２表中に表示され、そして以下に述べられるものを包
含するものであるが、もちろんこれらに限定されるもの
ではない。

第２表新生児幹細胞および前駆細胞を用いての造血再構成によ
って治療され得る病気ないし疾患 I.正常血液細胞の産生および成熟化の不全ないし機能障
害による病気高増殖性幹細胞疾患再生不良性貧血汎血球減少症顆粒球減少症血小板減少症赤血球形成不全症ブラックファン−ダイアモンド症候群薬剤、照射あるいは感染によるもの特発性のもの II.造血性悪性疾病急性リンパ球性白血病慢性リンパ球性白血病急性顆粒球性白血病慢性顆粒球性白血病急性悪性骨髄硬化症多発性骨髄腫真性多血球血症特発性骨髄様化生ヴァルデンストレームマグログロブリン血症ホジキンリンパ腫非ホジキンリンパ腫 III.悪性、固定腫瘍を有する患者における免疫抑制悪性黒色腫胃癌卵巣癌乳癌小細胞肺癌網膜芽腫睾丸の癌膠芽腫横絞筋肉腫神経芽細胞腫ユーイング腫瘍リンパ腫 IV.自己免疫疾患慢性関節リウマチＩ型糖尿病慢性肝炎多発性硬化症全身性紅斑性狼瘡 V.遺伝的（先天性）疾患貧血家族性再生不良性ファンコニ症候群ブルーム症候群（Bloom′s syndrome）真性赤血球形成不全症（RRCA）先天性角化不全症ブラックファン−ダイアモンド（Blackfan−Diamond）
症候群先天性赤血球造血異常症候群Ｉ−IV チュワッシュマン−ダイアモンド（Chwachmann−Diamon
d）症候群ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏症ホルムアミノ転移酵素欠乏症レシュ−ニーハン（Lesch−Nyhan）症候群先天性球状赤血球症先天性楕円球症先天性口腔細胞増加症先天性無Rh因子疾患発作的ヘモグロビン夜尿症 G6PD（グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ）変異体1,2,3 ピルベートキナーゼ欠乏症先天性エリトロポエチン感受性欠乏症鎌状赤血球症および赤血球鎌状形成体質アルファ、ベータ、ガンマ地中海貧血メトヘモグロビン血症免疫の先天性疾患重度合併免疫不全症（SCID）裸リンパ球症候群イオンノフォア応答性合併免疫不全症キャッピング異常を有する合併免疫不全症ヌクレオシドホスホリラーゼ欠乏症顆粒球アクチン欠乏症幼児無顆粒球症ゴーシェ（Goucher）病アデノシンデアミナーゼ欠乏症コストマン症候群網状赤血球発育不全先天性白血球機能不全症候群 VI.その他骨化石症骨髄硬化症後天性溶血性貧血後天性免疫不全症一次ないし二次免疫不全の原因となる感染性疾患細菌感染症（例えば、ブルセラ症、リステリア症、結
核、癩）寄生虫感染症（例えば、マラリア、リーシュマニア症）真菌感染症リンパ様細胞群の不均衡および老化により損なわれた免
疫機能を伴う障害食細胞障害コストマン無顆粒球症慢性肉芽腫性疾患チュディアック−東症候群好中球アクチン欠乏症好中球膜GP−180欠乏症代謝貯蔵疾患ムコ多糖沈着症ムコリピドーシス免疫機構を含む種々雑多な疾患ウィスコット−アルドリッチ症候群 α_１抗トリプシン欠乏症 5.6.1. 正常血液細胞の産生および成熟化の不全ないし
は機能障害による疾病本発明のこの実施態様においては、新生児幹細胞およ
び前駆細胞を用いる造血再構成が、正常血液細胞の産生
および成熟化の不全ないしは機能障害による疾病、すな
わち再生不良性貧血および低増殖性幹細胞疾患を治療す
るために用いられ得る。これらの疾患は、機能的血液細
胞を正常な数だけ供給する骨髄中の幹細胞の機能不全を
伴う。再生不良性貧血は、赤血球、白血球および血小板
の中間および成熟形態のもとになる幹細胞の機能不全に
よるものである。赤血球産生が通常最も深刻な影響を受
けるが、その他の成熟した血液細胞成分の産生における
注目されるべき減少もまた見られるものである。これら
の貧血のかなり大多数は、成人時における後天的なもの
であり、そして明白な遺伝的素質を有していないもので
ある。これらの後天的貧血の約半分は、明らかな原因因
子（例えば、幹細胞機能が損なわれるような毒薬、薬剤
または病気）の不在において生起する。これは、特発性
再生不良性貧血と定義される。残りのものは、化学薬品
および薬剤の極めて多様な種類のものにさらされること
に関連するものであり、そして肝炎のような細菌性感染
に後発するものとしておよび妊娠後もまた生起し得るも
のである。再生不良性貧血のその他のタイプは、主要な
欠損がそれぞれ、特に白血球に、あるいは血小板産生に
存在することを示す無顆粒球症あるいは血小板減少症と
定義される。無顆粒球症は全身性紅斑性狼瘡（SLE）の
ような自己免疫症候群に、あるいは感染、特に新生児風
疹に関連しているものと考えられる。

再生不良性貧血のすべての患者の総死亡率は、幹細胞
療法の不在においては、高いものである。この疾患に病
んでいる個体の約60〜75％が、新しい幹細胞の不在にお
いては、12カ月以内に死亡する。これらの疾患の総発生
率は１年間に100万人当り約25人である。すべての再生
不良性貧血に関して説明する単一の発症機構があるもの
とはとても考えられないが、新しい造血幹細胞の供給が
通常永久的な回復をもたらすのに十分であるということ
は明らかである。なぜなら、再生不良性貧血の患者へ
の、一卵性双生児から得られた（すなわち、同系の）
（Pillow R.P.,et al.,1966,N.Engl.J.Med.275（２）:9
4−97）、あるいはHLA同一の兄弟から得られた（すなわ
ち、同種異系の）（Thomas,E.D.,et al.,Feb.5,1972,Th
e Lancet,pp.284−289）骨髄の移植が、完全に病気を癒
やすものであるからである。しかしながら、再生不良性
貧血の患者のいく人かは、移植された骨髄を拒絶する。
この併発症は、多数回の治療的輸血の結果として免疫的
感受性の高いものとなった患者の間においては、特に一
般的なものである。造血再構成のために自己由来の新生
児幹細胞を用いる本発明の好ましい実施態様において
は、このような併発症をなくすことができるものであ
る。

本発明の特定の実施態様において、新生児幹細胞の注
入による造血再構成は、骨髄不全に関連する先天性奇形
によって露呈される常染色体劣性疾患の１つであるファ
ンコニ貧血の治療に用いられよう。幹細胞欠損は染色体
不安定性および悪性度の増加した危険性に関連するもの
である。この病気は、その自然な経移においては、常に
致死的なものである。本発明のこの実施態様は、以下の
第12節における実施例によって説明されるものであり、
そこには、病気の治療のために造血幹細胞および造血前
駆細胞を有する新生児血液をファンコニ貧血の患者に注
入することが述べられている。この実施態様の好ましい
観点は、幹細胞注入前に、この患者がアルキル化剤およ
び照射に対する細胞感受性に応じて変更されるコンディ
ショニング療法によりコンディショニングされていると
いうことである（参照により本明細書中に引用されるGl
uckman,E.,et at.,1983,Brit.J.Haematol.54:431−440;
Gluckman,E.,et al.,1984,Seminars in Haematol.21
（１）:20−26;Gluckman,E.and Dutreix,J.,1985,The C
ancer Bulletin37（５）:238−242:Gluckman,E.,et a
l.,1980,Brit.J.Haematol.45:557−564を参照のこ
と）。例えば、細胞遺伝学的分析が、アルキル化剤に対
する細胞感受性を予測するのに用いられ得る（Berger,
R.,et al.,1980,Brit.J.Haematol.45:565−568）。放射
線感受性に関する検査もまたすでに論述されている（Gl
uckman,E.and Dutreix,J.,1985,Ther Cancer Bulletin
37（５）:238−242;Gluckman,E.,et al.,1983,Brit.J.H
aematol.54:431−440）。特殊な実施態様においては、
シクロホスファミドおよび胸腔−腹腔部照射を用いたコ
ンディショニング療法を用いることができる。

5.6.2 造血悪性疾患新生児幹細胞および前駆細胞を用いての造血再構成によ
って治療され得る高増殖性悪性幹細胞疾患としては、急
性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性およ
び慢性顆粒球性白血病、多発性骨髄腫、真性多血球血
症、特発性骨髄様化生、ヴァルデンストレームマクログ
ロブリン血症、ならびにホジキンおよび非ホジキンリン
パ腫が含まれるが、もちろんこれらに限定されるもので
はない。これらの白血病は、現在のところ化学療法によ
って治療されており、そして可能な場合には、骨髄移植
によって治療されている。しかしながら、同種異系のHL
A同一兄弟の骨髄は、患者のわずか1/3未満にしか得られ
ないもので、そしてこの治療法は、免疫不全症や移植片
対宿主病などのような移植関連併発症を伴なうものであ
る。本発明の好ましい実施態様に基づく、同系（自己）
の凍結保存造血幹細胞の供給は、適当な同種異系ドナー
（提供者）をもたない患者における造血再構成をもたら
すものであり、そして同種異系骨髄移植から生じる移植
片対宿主病の危険性をなくすものである。

5.6.3. 非造血起原の悪性固形腫瘍新たな幹細胞を提供することによる造血再構成は、照
射ないしは化学療法に堪えている悪性固形腫瘍の患者の
治療において大きく役立つことのできるものである。こ
のような腫瘍としては、上記第２表に列挙されたような
ものが含まれているが、もちろんこれらに限定されるわ
けではない。

数種の癌が、常用量では効果のない抗腫瘍剤の極めて高
い投薬量に著しく感受性であることが明らかになってき
ている。これらの癌は、悪性黒色腫、胃、卵巣および乳
房の癌、小細胞肺癌、および幼児期の悪性腫瘍（網膜芽
腫および睾丸癌を含む）、ならびにいくつかの脳腫瘍、
特に膠芽腫を含むものである。しかしながら、このよう
な強烈な高用量化学療法は、造血不全および死を高頻度
でもたらすものであることから、広く用いることができ
ない。強烈な化学療法後の新しい幹細胞の供給は、細胞
障害性薬剤の投与前に患者から得ていた骨髄細胞を用い
ることによって行なわれていた（Spitzer,G.,et al.,19
80,Cancer 45:3075−3085）。このアプローチは２つの
大きな困難性を有するものである。その第１は、長期間
の癌患者から十分な量の骨髄細胞を得ることが根本的に
不可能であることである。さらに、臨床医は、患者の骨
髄細胞が少量の腫瘍細胞によって汚染されている可能性
ゆえに、このアプローチの使用をきらうものであった。
このことは特に、血液学的悪性腫瘍において真実である
が、また転移性癌の多くに関しても適合するものであ
る。本発明による（癌にかかる前の、健康な時に得られ
た）幹細胞の供給は、幹細胞不全の危険性なしに、治癒
性のある強烈な化学療法を使用することを可能とするも
のである。

5.6.4 自己免疫疾患多くの慢性炎症性および変性疾病は、身体のそれ自体の
組織に対する連続的免疫反応によって特徴づけられる。
このような自己免疫疾患には、慢性関節リウマチおよび
その他の炎症性骨障害、Ｉ型糖尿病、慢性肝炎、多発性
硬化症ならびに全身性紅斑狼瘡が含まれるが、もちろん
これらに限定されるものではない。自己免疫疾患はしば
しばリンパ系の照射によって治療される。本発明による
造血再構成のための新生児造血幹細胞および前駆細胞の
使用は、放射線療法後にきわめて価値のあるものである
ということができる。

ステロイドなどのような抗炎症性薬剤は、自己反応性
Ｔ細胞によって活性化される炎症性細胞を抑制するもの
であるが、自己タンパク質を確認するＴ細胞が新たな炎
症性細胞を活性化することを防御することはない。自己
免疫疾患を治療する、より直接的なアプローチは、リン
パ系組織の照射によるＴ細胞の根絶化に基づくものであ
り、また患者の造血系の再集団化するために非照射骨髄
から得られる幹細胞を頼みとするものである。骨髄細胞
からの成熟Ｔ細胞の新しい集団の形成が、自己特異性抗
原に対して反応性を有するＴ細胞の消滅をもたらすとい
うことがその理由である。全リンパ系照射（TLI）と呼
ばれるこの手法は、難治性慢性関節リウマチの治療に用
いられた（Strober,S.,et al.,1985,Annals of Interna
l Medicine 102:441−449,450−458）。これらの臨床的
試行は、これ以外の治療法では難治性の症例の大部分に
おいて、併発症が少なくとも２〜３年の間顕著に軽減さ
れたことを示している。しかしながら、このような治療
法の主な欠点は、造血系を十分に再集団化するほど、こ
れらの年輩の患者の骨髄中に幹細胞がないということで
あり、このことが、感染ならびに出血性疾患をもたらす
ものである。SLEの治療に関して、細胞障害性薬剤に代
わるものとしてのTLIの効果が、類似する研究において
調べられている（Strober,S.,et al.,1985,Ann.Interna
l Med.102:450）。難治性SLEの治療のためのTLIの使用
の研究はまた、この治療が疾患の活動を軽減するという
ことを示している。しかしながら、この治療は、照射後
に造血系を迅速かつ十分に再集団化する骨髄幹細胞が不
足するということによって極めて限定されるということ
も示されている。本発明の好ましい観点において、誕生
時に得られた個体それ自身の幹細胞の利用可能性が、最
小限のリンパ系放射線療法の後に成体環境で成熟Ｔ細胞
の十分な再集団化をもたらすことを可能としている。そ
してそれゆえこの療法は顕著により効果的なものとなる
ことができる。

5.6.5. 遺伝子療法遺伝子療法を受けた、すなわち、子孫細胞によって発
現できる異種遺伝子が安定して組み込まれた本発明の新
生児幹細胞及び前駆細胞を用いた造血再構成は、造血系
統の細胞に影響を与える病気や疾患の治療において、非
常に価値を持っている。一つの実施態様では、このよう
な組み換え体幹細胞を用いた造血の再構成が造血系の遺
伝的疾患の治療に用いられることができる。このような
遺伝的疾患としては、前に述べた第２表に挙げられたも
のを含むがこれに限定されることはない。造血細胞の遺
伝的欠損ないし機能障害は、患者に対して、組み換え体
幹細胞及び前駆細胞を供給することによって治療するこ
とができる。特定の実施例では、遺伝子が欠失した造血
細胞を有する、或いは変異体の遺伝子を有する患者は、
欠損遺伝子の機能的同等物が組み込まれた新生児幹細胞
及び前駆細胞によって再構成することができる。特に、
遺伝子療法に適用できる上記遺伝子は、ヘモグロビン又
はその合成経路を仲介する酵素を含むが、これに限定さ
れるものではない（例えばβ地中海貧血、鎌状赤血球症
のような貧血の治療のために用いられる）他の特定の実施例では、造血細胞系統において生じた
り、これに影響を与えることになる病原微生物によって
感染した患者は組み換え体新生児幹細胞及び前駆細胞に
よって治療することができる。このときの組み換え体幹
細胞及び前駆細胞は異種遺伝子を含むことができる。こ
の異種遺伝子は疾患症状を改善する産生物として発現さ
れる。宿主に対して著しい障害を与えることなく病原菌
に対して毒性を有する、または病原菌のライフサイクル
等を阻害するものなどである。本発明のこの実施態様に
係る組み換え体幹細胞によって治療される感染を引起こ
す病原体は、ヒト免疫不全症ウィルス（HIV、つまり後
天性免疫不全症候群（AIDS）の病因物質）のような向リ
ンパ球性ウィルス（Gallo et al.,1984,Science 24:500
−503;Barre−Sinoussi,F.,et al.,1983,Science 220:8
68;Levy J.A.,et al.,1984,Science 225:840）；ブルセ
ラ属やリステリア属のようなグラム陰性杵菌；結核病や
ハンセン病（らい病）の病因因子であるミコバクテリウ
ム；プラスモディウム属（マラリアの病因因子）やリー
シュマニア属のような寄生虫；および真菌（肺炎や免疫
不全に至る他の致命的な二次感染を引き起こすような病
因因子）とを含むがこれらに限定されない（これらの疾
病の多くの討論は、Harrison′s Principle of Interna
l Medicine,1970,6th Edition,Wintrobe,M.M.,et al.,e
ds.,McGraw−Hill,New York,pp.798−1044を参照）。特
定の実施例として、造血細胞病原体の核酸に対し、アン
チーセンスな配列を発現する組換え体新生児造血幹細胞
又は前駆細胞を構築することが可能である。病原体のRN
AやDNAに相補的な前記のような配列は、核酸の機能ない
しは発現を阻害しかつ病原体のライフサイクルを破壊す
るために、このようなRNAあるいはDNAにハイブリダイズ
し、そして不活性化することができる。特定の実施例と
して、組換え体新生児造血細胞はAIDS、つまりHIVによ
って引き起こされるT4⁺リンパ球の明らかな感染による
疾患の治療に使用され得る（Dagleish et al.,1984,Nat
ure 312:763−766;Klatzmann et al.,1984,Nature 312:
767−768）。HIVゲノム（Wain−Hobson et al.,1985 Ce
ll 40:9−17）の重要な領域（例えば、ロング・ターミ
ナル・リピートないしポリメラーゼ配列）に相補的なア
ンチーセンス核酸を発現する組み換え体新生児造血幹細
胞および前駆細胞は、AIDS治療のための造血再構成に使
用できよう。

本発明の当該実施態様に関連して外来遺伝子を細胞に
組み込む技術が当技術分野で数多く知られており、これ
らを使って、遺伝子治療の目的のために組換え体新生児
造血幹細胞及び造血前駆細胞を構築することができる。
使用する技術は異種遺伝子配列を安定的に幹細胞へ移入
させるものでなければならないが、その理由は、異種遺
伝子配列を幹細胞子孫が受け継ぎかつ発現することがで
きるようにすると共に、受容細胞が必要とする発達機能
及び生理機能を破壊しないようにするためである。使用
可能な技術として、染色体移入（例えば、細胞融合、染
色体媒体遺伝子移入、微細胞媒体遺伝子移入）、物理的
方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラス
ト融合、マイクロイジェクション、エレクトロポレーシ
ョン、リポソームキャリアー）、ウィルスベクター移入
（例えば、組み換え体DNAウィルス、組み換え体RNAウィ
ルス）などがあるが（参照によりここに引用されるClin
e,M.J.,1985,Pharmac.Ther.29:69−92に記載される）、
これらに限られるものではない。

5.6.6. 免疫機構が関与する種々の疾患本発明の新生児造血幹細胞と前駆細胞を用いての造血
再構成は、免疫機が関与する種々の疾患を有する患者の
治療に使用することができる。造血細胞系統の機能不
全、機能欠如あるいは機能障害によりもたらされる疾患
は、造血細胞子孫を、正常な機能を有する新生児造血幹
細胞および前駆細胞から誘導された造血細胞子孫と置換
することによって軽減され得る。特定の実施例として、
溶血性の疾患が治療できる（溶血性疾患の詳論に関して
は、例えば、1985,Cecil,Textbook of Medicine,Wyngaa
rden,J.B.and Swith,L.H.,eds.,17th Ed.,W.B.Saunders
Co.,pp.900−915参照）。成人生活中に後天的に獲得さ
れる溶血性疾患は、このタイプの貧血症の大部分を占め
ており、リンパ球産物による赤血球の破壊となって表わ
れる。本発明の新生児細胞による造血幹細胞置換療法
は、新しい赤血球産生源を提供でき、さらに自己由来の
細胞を用いる実施態様においては患者の赤血球に対する
免疫応答を起こさせることのない新しい形成された細胞
で破壊的リンパ球を置換することができる。他の特定の
実施例では、例えば、照射や化学療法の結果として免疫
系が損傷された患者は、新生児造血幹細胞および前駆細
胞を用いた造血再構成によって治療されよう（第5.6.3
節参照）。さらに他の実施態様では、老化によりリンパ
系細胞群における不均衡があって免疫機能が害されてい
る疾患は、本発明の新生児細胞を用いた再構成によって
治療することができる。骨髄における代謝産物の異常な
蓄積をもたらす代謝の遺伝的疾患（例えば、骨石化症、
代謝貯蔵疾患）はまた、治療が意図された多くの疾患の
中に含まれるものである。

更に、病原微生物による一次感染もしくは二次感染の
結果である免疫不全は、本発明の幹細胞を用いた造血再
構成によって治療を行なうことができるものである。こ
の実施態様では、新生児幹細胞を必要とする造血細胞系
統の細胞供給源として役立てることができる。例えば造
血細胞の細胞内病原体である微生物により引き起こされ
た免疫不全は、注入された新生児幹細胞により補給され
た新しい造血細胞の供給により治療することができる。
本発明のこの実施態様により治療できる免疫不全症を引
き起こす微生物には、ブラセラ属やリステリア属のよう
なグラム陰性杵菌、結核症やハンセン氏病（らい病）の
病因因子であるミコバクテリウム、プラスモディスム属
（マラリアの病因因子）やリーシュマニア属のような寄
生虫、および真菌（肺炎や免疫不全に至る他の致命的な
二次感染を引き起こすような病因因子）（これらの疾病
の多くの討論は、Harrison′s Principles of Internal
Medicine,1970,6th Edition,Wintrobe,M.M.,et al.,ed
s.McGraw−Hill,New York pp.798−1044を参照）を含む
が、もちろんこれらに限定されるわけではない。

6. 実施例 6.1. ヒトの臍帯と胎盤の血液の採取新生児の血液は、人間の臍帯からの重力排出によって
及び／又は摘出された胎盤からのニードルアスピレーシ
ョンによって採取された。個体の誕生からの一連の採取
物において得られた量のデータは、第１図に示されてお
り50mlあるいはそれ以上が得られることが示されてい
る。他の一連の採取からのデータは、個体の誕生からの
採取が重力流出、膣分娩；重力流出、帝王切開；胎盤吸
引、膣分娩；あるいは胎盤吸引、帝王切開のいずれかの
採取及び分娩方式によって区別されて第２図に示されて
いる。このデータは、採取の大部分が30ml以上の総量で
あるが、その多くは、50ml以下のものであることを示し
ている。最近の採取では、臍帯排出液と組合せて、分娩
された胎盤から、胎盤の基部で、および拡張された表面
静脈中において、ニードルアスピレーションすることに
よって、第２図に示された量のほぼ２倍の量（例えば36
週懐胎後の新生児から99mlの血液）を得ることができる
ようになっている。

臍帯血の採取は、前記第5.1.1節とその分節に記載さ
れているように、また下記に詳述するようにして本質的
に行なわれた。

臍帯血採取キットは：広口ビン（200ml）（コーニング社、コーニング、N
Y）， Cat.No.25625−200;VWR,サウス、プレインフィールド， NJ,Cat.No.28199−756）ラップ（手術室の滅菌したシート）からなっている。

ニードルアスピレーションによる採取のために、Ｂ−
D Luerlok式（VWR,Cat.No.BD5663）の60cc注射器と、18
ゲージ針1 1/2インチ（VWR,Cat.No.BD5196）を用いた。

採取ビンは、タングステン源（ニューヨーク州メルビ
ルのラジエーションダイナミック社製のダイナマトロ
ンアクセラレーター）からの2.5メガラドでベータ照射
を行なうことにより、採取前に滅菌した。注射器と針
は、オートクレーブ滅菌を行った（別法として、注射器
と針とはエチレンオキサイドで滅菌した）。

CPD（クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース）20ml
を、各臍帯血採取容器に、抗凝血剤として加えた。CPD
は、以下のように調製した：クエン酸三ナトリウム（二水和物） 28.8 ｇクエン酸（一水和物） 3.2 ｇリン酸二水素ナトリウム（一水和物） 2.19 g デキストロース 25.0 ｇをpHが5.63となるように1000mlに調製する。最高120ml
の血液あたり20mlのCPDを用いた。

選択された試料においては、酸−クエン酸塩−デキス
トロース（ACD）（Hurn,B.A.L.,1968,Storage of Bloo
d,Academic Press,New York,p.137）をCPDの代わりに使
用した。ACDは次のように調製した：クエン酸三ナトリウム（二水和物） 1.65 g クエン酸（一水和物） 1.983g デキストロース（無水物） 6.13 g 総量250ml中 ACDのCPDとの置換は、得られた造血幹細胞および前駆
細胞数の明確な差異をもたらすものではなかった。

ペニシリンとストレプトマイシンも採取血液に加え
た。1ml当りペニシリン5000単位と、1ml当りストレプト
マイシン500μｇからなる溶液の0.01×臍帯血容量を臍
帯血の各試料に加えた。

約109の採取されたヒト臍帯血試料を以下に述べる更
なる分析にかけた。

6.2. 採取した臍帯血中の造血幹及び前駆細胞第6.1節のおよそ109の採取した臍帯血は、夜行便（ポ
リスチレン輸送容器内に納められた：フィッシャ、フェ
アハーベン、ニュージャージ、Cat.No.03−528−10）に
より、加工サイトに送られた。該サイトでは、採取した
臍帯血を分離し、生存細胞数を計測し、（たいていの場
合には）造血前駆細胞分析を実施し、貯蔵のために冷凍
し、また、ある場合にはすべての有核細胞及び造血前駆
細胞の再生の評価を行うために解凍した（以下の第6.7
節参照）。評価された前駆細胞は、未熟及び成熟の顆粒
球−マクロファージ（７日 CFU−GM,14日 CFU−GM）
と、“未熟”及び“成熟”の赤血球系細胞（BFU−Ｅ−
1,BFU−Ｅ−２）と、多能性細胞とを含有していた（前
駆細胞のアッセイについては第6.6節及び分節参照）。
第３表は、受け取った試料の完全な一覧を示しており、
また試料当りの造血前駆細胞の数はフィコル−ハイパキ
ュー（Ficoll−Hypaque）を用いて分離した後の低密度
画分中に存在するものを示してある。

サンプル受領からその細胞が冷凍されるまで、その細
胞をプロセッシングするのに16時間が費された。（この
時間は、フィコルーハイパキューで細胞を分離するこ
と、その細胞を計測すること、前駆細胞アッセイを実施
すること、及び細胞を凍結することを含んでいた）。

第３表に示すように、前駆細胞の顕著な総数が１晩の
輸送時間にプロセッシングの16時間を加えた時間経過で
さえも得られた。輸送に48時間を要した試料の中にさ
え、生存可能な前駆細胞が認められた。前駆細胞の観察
された数には、ドナー間に変動があった。第３表に示さ
れた数値は、細胞分離の操作に起因する前駆細胞の損失
後に残存している前駆細胞を示していることに注意すべ
きである（以下の第４表参照）。

6.3. ヒト造血幹及び前駆細胞の富化：細胞分離の手順この発明の好ましい実施態様においては、細胞分離手順
に伴う細胞の損失をなくすために、新生児の全血を凍結
保存し、そして解凍後に造血の再構成のために使用する
ことができる。しかしながら、細胞分離手順は、必要で
あれば、例えば血液の貯蔵体積を最小限度にするために
用いられよう。従って、以下の実施例の節においては、
採取された血液中の新生児の造血幹細胞を富化するのに
使用できる細胞分離手順が記載されている。手順の多く
は、成人の骨髄や成人の血液から抽出された幹細胞の富
化に関連しているけれども、同じ手順あるいは、その変
更態様が本発明の新生児の造血幹細胞に対しても同様に
適用され得ることが理解されよう。

ヒト幹細胞及び前駆細胞は、骨髄、脾臓、及び（成人
及び臍帯）血液細胞の非付着性で、低密度のＴ−リンパ
球−除去分画中に存在するものである。幹細胞および前
駆細胞の精製ないし富化は、フィコル−ハイパキュー密
度分離、付着／非付着分離、及び抗体結合による陽性選
択によって行なわれている。

6.3.1. 密度分離ヒトの造血幹細胞および前駆細胞の富化は、フィコル
−ハイパキュー（ファーマシアファインケミカルズ、
ピスカタウェイ、NJ）によって分離された低密度（1.07
7gm/cm³以下の密度）細胞の単離によって行なわれてい
る。

以下のプロトコールは骨髄又は末梢血の試料に対して
用いられる： 1.骨髄又は末梢血の試料を入手する。

骨髄試料は、ヘパリンが含まれた１〜5mlのものとすべきで
ある。滅菌した17×100mmのチューブ中に入れる。２〜3
mlの無菌DPBS（マグネシウム又はカルシウムを含まない
燐酸緩衝溶液）を加える。良く混合する。

全血マッコイズ5A［McCoy′s 5A］培地又はDPBSを用いて少
なくとも1:1に試料を希釈する。容積を20ml（複数個）
に調整する。

2.骨髄４℃で約400×ｇ（1500rpm;ベックマン［Beckman］TJ−
6Rローター）で10分間遠心。

全血次の工程に進む。

3.骨髄バッフィーコートを取り出し、DPBSで１回洗浄する。20
〜40mlの最終容量に再懸濁する（それぞれ2mlのものが
１〜２杯ならば20mlへと再懸濁し、３〜５杯ならば40ml
へと再懸濁する）。細胞をカウントする。容積を20ml当
り最大６×10⁷個の細胞となるように調整する。

全血次の工程に進む。

4.骨髄 10mlのピペットを用いて、50mlのポリプロピレンチュー
ブ内に入れられたフィコール−ハイパーク15ml上に、20
mlのバッフィーコート懸濁液を注意深く重層する。

全血 10mlのピペットを用いて、50mlのポリプロピレンチュー
ブ内に入れられたフィコール−ハイパーク15ml上に、血
液懸濁液20mlを注意深く重層する。

5.はかりを用いて、チューブの重さをブランクと注意深
く合わせる。

6.ゆっくりとした加速度で、試料を400×ｇ（1500rpm）
で30分間４℃で遠心する。ブレーキを放す。

7.注意深く低密度バンドを取り出し、それを清潔な滅菌
チューブ内に入れる。マッコイズ5A培地又はDPBSを用い
て少なくとも1:10で希釈する。

8.4℃で10分間400×ｇの遠心処理により細胞を２回洗浄
する。50mlへと再懸濁し、くり返す。

9.最終再懸濁物を、マッコイズ培地を用いて10〜15mlと
すべきである。

10.細胞のカウントを行なう。

上記手順の次の変更態様が、臍帯血分離に用いられた
（そして、第３表および第４表に示されているデータの
入手に用いられた）： 1.抗凝血剤として保存剤を含まないヘパリンナトリウム
又はACD3000〜4000単位を含有する60ccシリンジを用い
て臍帯血を無菌的に得る。

2.フィコル−ハイパキュー密度勾配を用いた低密度細胞
分離を実行する。これは無菌のpH7.0のDPBS（Mg⁺⁺,Ca⁺⁺
を含まないリン酸緩衝溶液）を用いて臍帯血を1:3（臍
帯血:PBS）の比で希釈することにより行う。50mlのポリ
プロピレン製遠心分離チューブ中の15mlのフィコル−ハ
イパキュー上に20mlの血液懸濁液を重層する（第３
図）。４℃、400×ｇで30分間遠心分離する。

3.個体ドナーの夫々からの低密度細胞バンド（第４図）
の全てを採取し、プールする。きわめてわずかしかフィ
コル−ハイパキューが細胞と共に採取されないようにす
る。そうしないと細胞は採取されたフィコル中でペレッ
ト化されないことがある。“X"mlの細胞が採取されたな
らば、DPBS“X"mlで希釈するというように細胞懸濁液を
1:1に希釈する。これは採取されたフィコルを細胞がペ
レット化するのを許容する程度にまで希釈するためであ
る。４℃、200×ｇでの10分間の遠心処理によって細胞
をペレット化させる。

4.それぞれのペレットから上澄液を吸引し、廃棄する。
複数のチューブが使用された場合、各々のペレットにDP
BSを5ml加え再懸濁した後に同じドナーのペレットをプ
ールする。４℃、200×ｇで、10分間の遠心処理により
細胞をペレット化する。

5.上澄液を吸引し、廃棄する。10mlピペットを使用して
ペレットをDPBS10ml中に再懸濁し、ゆるやかな上下吸引
を行なう。DPBSで容量を50mlとする。４℃、200×ｇで1
0分間の遠心処理により細胞をペレット化する。

6.5％の自己血漿又は熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）を
補給されたRPMI−1640培地中に再懸濁する。細胞数およ
び細胞生存度を調べる。細胞懸濁液を４℃に冷却保存す
る。

採取されたヒト臍帯血中の前駆細胞の収量に対する種々
の密度分離方法（上記第6.1節に詳述）の効果が評価さ
れた。我々は、何ら分離処理を施されていない全血中の
前駆細胞数を、成熟赤血球が塩化アンモニア（NH₄Cl）
を用いた処理によって溶解された全血中の前駆細胞、フ
ィコル−ハイパキュー分離後の低密度細胞（1.077g/cm³
未満の密度）、フィコル−ハイパキュー分離後の高密度
細胞、および赤血球を溶解するためにNH₄Clで処理した
後の高密度細胞と比較した（第４表、実験例１）。

第４表の実施例１が示すように、前駆細胞は、低密度
フィコール調製物の中よりも未分離血液中により多く検
出された。しかし、この差異は、主に成熟した好中性の
顆粒球が含まれるフィコル高密度分画において細胞が失
われるためではない。全血赤血球の溶解も前駆細胞のよ
り低い収量をもたらした。実施例２では、全血と、赤血
球を取り除くためメチルセルロースを使って沈殿させた
全血と、低密度並びに高密度のフィコール分離細胞とを
比較した。その結果は、全血に最も多くの前駆細胞が含
まれ、その前駆細胞の一部はメチルセルロースによる赤
血球沈殿後に得られた細胞画分から失われるというもの
であった。第４表の実験例２と３の双方が示すように、
メチルセルロースを使って細胞を沈殿させることは、前
駆細胞の数に関して、低密度フィコル画分に比べて劣っ
ていた。フィコール分離は成熟した顆粒球及び赤血球を
前駆細胞画分から分離したが、一方、この方法を用いる
ことによって前駆細胞の一部も、全血と比べた場合、失
われていた。

6.3.2. 付着性／非付着分離造血幹細胞及び前駆細胞を富化するための付着／非付
着分離のプロトコールは以下に示される通りである： 1.60mmコーニング組織培養皿において、10％ウシ胎児血
清（熱不活性化）を有するマッコイ5A培地（補給された
もの）の最大3ml中に10−15×10⁶個の低密度細胞をま
く。

2.5％CO₂の雰囲気中において37℃で1.5時間インキュベ
ートする。

3.非付着細胞を解離するためにプレートをゆるやかに旋
回させる。減菌した遠心分離チューブにピペットを用い
て移す。3mlのマッコイ培地を用いて培養皿を入念に洗
浄し、その培地を集める。

4.その皿にマッコイ培地を1ml加え、細胞を無菌ゴムポ
リスマンを用いて静かに取り出す。細胞を取り出し、無
菌の遠心分離用チューブにこれらを入れる。その培養皿
を3mlの培地で洗浄し、その培他を集める。

5.4℃で400×ｇの遠心処理を10分間行って細胞をペレッ
ト化する。上澄液を吸引しそして細胞を培地中に再懸濁
する。

6.ステップ５を繰返す。

7.細胞数を計測する。

6.4. 臍帯血幹及び前駆細胞の凍結保存次のプロトコールは、ヒトの臍帯と胎盤の血液から得
られた生存可能な造血幹及び前駆細胞の凍結保存のため
に用いられている： 1.4℃ 200×ｇで10分間にわたる遠心処理によって低密
度のフィコール分離された細胞をペレット化する。

2.トリパンブルー排除（Kucher,R.J.,1977,Biochemical
Methods in Cell Culture and Virology,Dowden,Hutch
inson ＆ Ross,Stroudsburg,Pa.,PP.18−19）および血
球細胞計測器を用いた手動細胞計数によって生存可能な
細胞数を検査する。

3.50％の自己由来血漿/RPMI−1640、又は50％の熱不活
性化FCS/RPMIからなる冷却混合物（４℃）を用いて、４
×10⁶生存細胞/mlの濃度にまでゆっくりと細胞を再懸濁
させ、この再懸濁物を氷の上に載置する。

4.冷却された無菌の凍結保護用培地である20％DMSO/RPM
I−1640を1ml含む凍結保存用バイアルの中で、前記凍結
保護用培地の頂部に上述した細胞懸濁物の1mlを、注意
深く重層する。

5.凍結するほぼ10分間前に、混合を促進すべく1:1の混
合物をゆっくり反転させ、それからそれを氷の上に載置
してその細胞と凍結保護用培地とを平衡化させる。

（注）“重層した”チューブは、非常に長い間、冷凍し
ない状態のままにすべきでなく、DMSO/RPMI溶液に細胞
をさらした後20〜30分以内に、凍結がなされることが望
ましい。

6.そのバイアルを凍結ラックの中に置き、順次、細胞懸
濁物を覆うに充分な深さの４℃メタノール浴の中に置く
（第４図）。これは、それから、２時間以上でかつ24時
間未満にわたり、−80℃の冷凍機の底部（適正な温度を
保つため）に置かれる。

7.細胞が凍結状態となった後、注意深くそして迅速にそ
れらを長期保存用の液化窒素充填容器の中に移す。使用
できる凍結保存用容器としては、LR1000冷蔵容器（イン
ディアナ州、インディアナポリスのユニオカーバイド社
製）があり、これは最大40,000クリューレを収容する。

6.5. 細胞融解次のプロトコールは、凍結保存された臍帯血幹細胞お
よび前駆細胞の融解のために用いられる： 1.液化窒素から凍結細胞のバイアルを取り出す。37℃の
温浴の中で少量の氷片が残るまでバイアルをゆっくり動
かすことによって、細胞懸濁物を直ちに融解する。

2.無菌状態で、懸濁物容量が二倍になるまで、50％自己
由来血清/RPMI−1640或いは50％FCS/RPMI−1640倍地か
らなる冷却混合物を、滴下毎に少し撹拌しながら、滴下
し始める。

3.この懸濁物をより大きな遠心分離用チューブ（12〜15
ml）に移し、50％血清/RPMI混合物を、滴下毎に撹拌し
ながら加え、これによりその容量を６−7mlにする。希
釈液を0.5mlの増加分ごとに混合しながら滴下し、その
容量を９〜10mlにする。（注：希釈液を段階的に加える
ようにした理由はDMSOが細胞懸濁物中において希釈され
ることにより浸透ショックが細胞に作用しないようにす
るためである。） 4.10分間にわたり、４℃ 200×ｇでの遠心処理によっ
て細胞をペレット化する。上澄液を吸引する。

5.このペレットに対して、冷却された20％自己由来血清
/RPMI−1640混合物1mlをゆっくりと滴下する。指でチュ
ーブを静かに“振る”ことによってペレットを“再懸
濁”する。ペレットが再懸濁された後に（凝集魂が残存
する場合がある）、1mlのピペットを用いて静かに上下
吸引させることによって、それを更に再懸濁させる。

6.冷却した20％自己由来血清/RPMI 4mlを滴下毎に撹拌
しながら加える。それから上述したように、容量が増加
するまで、0.5mlずつ加えて行く。

7.10分間にわたり、４℃、200×ｇの遠心処理によって
細胞をペレット化する。上澄液を吸引する。

8.冷却した20％血清/RPMI混合物の２〜5mlを用いて再懸
濁させる。

9.細胞数を（血球細胞計測器を用いて）カウントしそし
て、生存の試験を（トリパンブルー排除により）行う。

DMSOの段階的な除去の間の凝集（クランピング）によ
る細胞の損失は、DNアーゼ（２×10⁶細胞当り20U）又は
低分子量デキストランおよびクエン酸（pHを6.5に下げ
る）を含めることによって減少される。

6.6. ヒトの造血幹及び前駆細胞検定ヒトの造血幹細胞及び前駆細胞を定量的に評価するた
めに用いることができる検定法は、以下の実施例の節に
記述されている。顆粒球−マクロファージ（CFU−G
M）、エリトロイド（BFU−Ｅ）そして、多能性（CFU−G
EMM）の前駆細胞（第6.6.1節及び第6.6.2節）のための
検定は、前記第３表中に示されたヒトの臍帯血細胞のデ
ータの一部を得るために用いられた。

6.6.1. CFU−GM検定以下の検定法をCFU−GMを定量するのに用いた： 1.公知の細胞濃度の細胞（臍帯血液、骨髄、脾臓、細胞
ライン等）の懸濁液を得る。この細胞懸濁液の濃度は、
プレート中で必要な最終濃度よりも少なくとも10倍高く
なければならない。

2.培養すべきプレートの数に応じて培養混合物の量は変
わる。例として、10mlの懸濁液が下記のように調製され
る： 17mm×10mmのポリスチレン管内で寒天（0.6％）およ
び細胞^＊以外のつぎの成分を混合する。

10ml 寒天（0.6％ W/V）（bacto−agar、ディフコ社）5ml（5
0％）^＊＊ 2xマッコイ 5A 2ml（20％） FCS（熱不活性化） 1ml（10％）^＊＊＊刺激剤 1ml（10％）^＊細胞 1ml（10％）＊細胞は、細胞が２×マッコイ中に長時間存在するのを
避けるために、溶解した寒天を加える直前に加えられ
る。寒天は沸騰しているので、充分冷却する必要があ
る。

＊＊この容量は、所望のものよりも細胞が濃縮されてい
る場合には、変えることができる。例：細胞が最終細胞
濃度１×10⁵細胞/mlでプレートされ、かつストック細胞
懸濁液が１×10⁶細胞/mlの代わりに５×10⁵細胞/mlであ
る場合には、0.2mlの細胞が用いられ、0.8mlの２×マッ
コイを加えて1ml容量にされる。一般に、容量が他の成
分を加えたのちに足りないときには、２×マッコイが加
えられる（下記第6.6.1.1節のマッコイ培地の調製参
照）。

＊＊＊コロニーの形成は、慣例的に使用された5637膀胱
がん細胞ライン（下記6.6.1.2の項参照）により調整さ
れた培地、あるいはPHAL細胞株により調整された培地
（ヘモクロマト−シス患者からのフィトヘマアグルチニ
ン刺激白血球、Lu,L.and Broxmeyer,H.E.,1985,Exp.Hem
atol.13:989−993）中に存在する因子により、あるいは
精製された成長因子により刺激される。ヒトコロニー刺
激について試験され得る成長因子は、インターロイキン
−３（IL−３）、顆粒球−マクロファージ（GM）−コロ
ニー刺激因子（CSF）、顆粒球（Ｇ）−CSF、マクロファ
ージ（Ｍ）−CSF（CSF−１ともいう）、エリトロポエチ
ン、IL−１、IL−４（Ｂ細胞成長因子ともいう）および
Ｅ型プロスタグランジンなどがあるが、これらのみに限
定されるものではない。これらの分子はCetus,Immunex
およびAmgenなどの会社から精製された形で入手でき
る。ネズミの細胞検定用には、ポークウィード（pokewe
ed）ミトゲン脾臓細胞で調整された培地も使用できる
（下記6.6.1.3参照）。

3.寒天を充分冷却したのち、適当容量の細胞と0.6％の
寒天を加える。

4.管にキャップを嵌め、懸濁液をよく混合する。ボルテ
ックス混合も使用できるが注意を要する。

5.適当なピペットで1mlの培養懸濁液を10×35mmの皿
（必要に応じてコロニー刺激因子を含む）にとる。すべ
ての皿にとりおわった後、固化させる。

6.適当な培養器内にプレートのトレーに標識を付して入
れる。培養は低酸素圧（５％O₂）で５％CO₂の潤滑雰囲
気中で７日間および14日間行なわれる。低酸素圧は、CF
U−GM、BFU−ＥおよびCFU−GEMM細胞の検出を高める。

7.プレートを培養器から取出し、倒立あるいは立体鏡顕
微鏡でコロニーの観察により記録する。７日目および14
日目に記録したコロニーは、CFU−GM細胞の成熟段階を
表わす。（７日目のCFU−GMは、顆粒球−マクロファー
ジ系列の後期またはより成熟した前駆細胞を表わし、14
日目のCFU−GMは顆粒球−マクロファージ系列の初期の
前駆細胞を表わす）。

6.6.1.1. マッコイ5A培地の調製以下の手順が１×マッコイ5A培地（McCay′s 5A Medi
um）を調製するのに用いられる： 1.1包みのマッコイ5A培地（Gibco ＃430−1500） NaHCO₃ 2.2g ２回蒸留した水H₂Oで１とし、pH7.0〜7.2とする。

2.0.2μｍのフィルターおよび蠕動ポンプ（陽圧）の使
用による濾過滅菌。

3.培地が増殖またはインキュベーションに使用される場
合には、下記のものを補給する。

培地１当り 8ml MEM 必須アミノ酸（Gibco ＃320−1130） 4ml MEM 非必須アミノ酸（Gibco ＃32−1140） 10ml MEM ピルビン酸ナトリウム（Gibco ＃320−136
0） 4ml MEM ビタミン類（Gibco ＃320−1120） 10ml ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco ＃600
−5140） 15ml セリン／アスパラギン／グルタミン混合物（以下
処方参照）２×マッコイ5A培地（培養用）を調製するには、１
の代りに容量を500mlにした以外は１×の場合と同一の
手順を行なう。同量の補給物質を加える。

セリン／アスパラギン／グリタミン混合物は、下記に
より調製される。

Ｌ−アスパラギン（Sigma ＃Ａ−0884） 800mg Ｌ−セリン（Sigma ＃Ｓ−4500） 420mg Ｌ−グルタミン（Gibco ＃320−5030） 200ml 1.セリンおよびアスパラギンを450mlの２回蒸溜水（H
₂O）に溶解し、容量を500mlとし、0.2μｍのフィルター
を通して濾過滅菌する。

2.この滅菌混合物に200mlのＬ−グルタミンを加える。
よく混合し、7.5ml/管ずつ分注する。−20℃で保管。

6.6.1.2. ヒト5637膀胱がん細胞ライン調整培地の調製ヒト5637膀胱がん細胞ラインにより調整された培地を
得るために、下記の手順が使用できる。

1.凍結ストックから細胞を解凍しかつ開始する（下記6.
5の項「急速解凍」のプロトコール）。5637細胞を、50m
lの下記の培地を含む150cm²のフラスコ中に入れて全面
成長させる。

RPMI 1640 グラタミン（2mM）ペニシリン−ストレプトマイシン（10ml/、1000単位/
ml） 10％の牛胎児血清（熱不活性化） 2.通常のO₂を含む５％CO₂雰囲気中で３〜５日間培養。
毎日チェック。

3.50mlのRPMI1640培地（上記のとおり）を含む20×150c
m²フラスコに1:20で細胞を分ける。

4.通常のO₂、５％CO₂中で７日間培養。

5.3〜５日間で、必要により１個のフラスコの細胞を選
んで細胞のストック供給物として凍結する。液体窒素貯
蔵用に10⁶細胞／バイアル（1ml）を凍結する（下記6.4
の項のプトロコール参照）。

6.7日間で、20×50ccの遠心分離管に細胞培地を集め
る。細胞および細胞残骸を500×ｇまたはそれ以上で10
分間遠心分離に共する。

7.培地を集め、0.2μｍのフィルターを用いて濾過滅菌
し、100mlのびんに分注する。０℃未満（通常−20℃ま
たは−80℃）で凍結保存する。

8.例えば、ヒト骨髄細胞を用いて6.6.1の項に記載したC
FU−GMアッセイにより培地の刺激活性を検定する。

6.6.1.3. ネズミのポークウィードミトゲン脾臓細胞調
整培地の調製マウス細胞用の造血コロニー刺激に使用される成長因
子の粗供給源であるネズミポークウィードミトゲン脾臓
細胞調整培地（PWMSCM）を得るために、下記の手順が使
用される。

1.20×10⁶細胞/mlと同一またはそれ以上の既知の細胞濃
度のCBA/Jマウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液を得る（マ
ウスは５〜７週令でなければならない）。

2.下記のとおり多量の細胞成長懸濁液をつくる。

CBA/J脾臓細胞２×10⁶細胞/ml 熱不活性化FCS 10％ポークウィードミトゲン（Gibco ＃670−5360） 0.333％（1:300）イスコベ（Iscove′ｓ）改良ダルベッコ培地＊＋3.024g NaHCO₃ （Gibco ＃78−5220）残量＊下記6.6.2.3の項に調製法を記載する 3.上記成分を混合したのち、この混合物50mlを50cm²の
組織培養フラスコに入れ、５％CO₂雰囲気下で37℃で７
日間培養する。

4.7日間後、調整された培地を集め、500×ｇまたはそれ
以上で４℃で10〜15分間遠心して細胞を除去する。

5.調整された培地を管から注意深く取り出し、0.45μｍ
のフィルターを通して該培地を濾過滅菌する。調整され
た培地を50mlのポリエチレン管内に−20℃で貯蔵する。

6.6.2. BFU−Ｅ−２およびBFU−Ｅ−1/CFU−GEMM検定 BFU−Ｅ−２およびBFU−Ｅ−1/CFU−GEMMを定量する
ために、下記の検定法が用いられた。BFU−Ｅ−１およ
びBFU−Ｅ−２は、操作上は定義できるが生理学的には
明確に区別できない赤血球系前駆細胞である。BFU−Ｅ
−１は、エリトロポエチン、ヘミン（任意）、およびバ
ースト促進因子により刺激されて半固体培地中で赤血球
系子孫細胞のコロニーを産生し得る初期赤血球系前駆細
胞として操作上定義される。BFU−Ｅ−２は、エリトロ
ポエチンおよびヘミン（任意）により刺激されて半固体
培地中で赤血球系子孫細胞のコロニーを産生し得る、よ
り成熟した赤血球系前駆物質として操作上定義される。
BFU−Ｅ−１コロニーは、BFU−Ｅ−２コロニーよりも大
きくなる傾向がある。

BFU−E/CFU−GEMM検定には、イスコベ改良ダルベッコ
培地（IMDM）が使用され、半固体支持培地としてメチル
セルロースを用いる。（これはCFU−GM検定と対照的で
あり、この場合はマッコイ培地が使用され、半固体支持
培地としてバクト寒天を用いる。）手順は、下記のとおりである。

1.適当なタイプの細胞の既知濃度の単一細胞懸濁液を得
る。

2.培養されるプレートの数により、培養混合物の容量は
変る。例として、本発明者らは、3mlの混合物を作る。
混合物の容量を増大させるために、成分の容量を比例的
に単に増加させる。17×100mmの管内で、下記の成分を
混合する。

3ml メチルセルロース（2.1％） 1.4ml グルタミン（200mM,Gibco） 30μ（2mM）２−メルカプトエタノール（10^-2M） 10μ（５×10
^-5M）（７μを10mlのマッコイ5Aへ）＊ヘミン（4mM） 75μ（0.1mM）＊＊エリトロポエチン（20単位/ml） 0.15ml（１単位/m
l） FCS（非熱不活性化） 0.9ml（30％）細胞（少なくとも10×必要） 0.3ml ＊＊＊イスコベ改良ダルベッコ培地（IMDM） 0.135ml ＊＊＊GM刺激剤（必要により） 0.01ml ＊調製法は下記およびLu,L.and Broxmeyer,H.F.,1983,E
xp.Hematol.11（８）:721−729に記載される。

＊＊使用可能な異なるタイプのエリトロポエチンがあ
ることに注意。例えば、ハイクロン（Hyclone）エリト
ロポエチンは、ネズミ細胞検定に使用され、またトーヨ
ーボー（Toyobo）エリトロポエチンはヒト細胞検定に使
用される。精製遺伝子組み換え体エリトロポイエチンは
市販品として入手でき（例えば、Amgen,Thousand,C
A）、かつ使用できる。

＊＊＊GM刺激剤としては、CFU−GM検定について記載
したように、コロニー刺激について試験し得る種々の因
子があるが、これらのみに限定されるものではない。GM
刺激剤の容量およびIMDMの量は、使用される刺激剤のタ
イプにより変わる（例えばマウス＝PWMSCM;ヒト＝5637C
MまたはPHALCM）。また、IMDMは厳密には3mlの残存量の
補償であることに注意すべきである。

3.管のボルテックス混合および反転により懸濁液を完全
に混合する。

4.該混合物から泡を発生させたのち、1mlの混合物を、
必要によりエリトロポエチン、ヘミンおよびコロニー刺
激因子を含む２個の10×35mmの培養プレートのそれぞれ
に入れる。該混合物がプレートの表面をおおうようにプ
レートを回転させる。

5.これら２個のプレートを15×100mmの大きなペトリ皿
に、約1mlの水を含む10×35mmの給湿皿とともに入れ
る。大皿に再び蓋をする。

6.適当な培養器内にペトリ皿を14日間置く。培養の条件
は、6.6.1項のCFU−GM検定の記載と同じである。

7.プレートを培養器から取出し、倒立または立体鏡顕微
鏡でコロニーを観察しながら記録する。

一部の培養物において、GM刺激剤／バースト促進活性
（例えば5637細胞またはPHALCMで調整された培地）は省
き得る。このような条件下では、検定によってより成熟
した集団のBFU−Ｅ（BFU−Ｅ−２）細胞が検出され、CF
U−GEMM細胞はほとんどあるいは全く検出されない。

6.6.2.1. 2.1％メチルセルロースの調製 BFU−E/CPU−GEMM検定に使用される2.1％のメチルセ
ルロースは、次のようにして調製される。

ストック溶液 2.1％メトセル（Methocel）（Dow Chemical Co.） 21g 沸とう水 500ml ２×IMDM 500ml 手順グラム重量のメチルセルロースを、大型の磁気撹拌機
上に滅菌された磁気片が入っている（滅菌栓を備えた）
滅菌された３リットルのエルレンマイヤーフラスコに入
れる。泡をできるだけ少なくするために、500mlの滅菌
沸とう水をフラスコの側面にゆっくり注入しながら撹拌
を開始する。フラスコが徐々に冷却されるまで（これは
１時間を要する）室温で撹拌を続ける。フラスコがもは
や触っても熱くなくなったら、室温に至らせた500mlの
２×IMDMを泡が出ないようにしながらフラスコに添加す
る。フラスコを密栓し、冷室（４℃）に移し、48時間撹
拌を続ける。ついで、この溶液を滅菌された100mlのビ
ンに滅菌的に分注する。このビンは、（光から保護され
て）最高６ケ月間凍結保存される。

6.6.2.2. ヘミンの調製 BFU−E/CFU−GEMM検定に使用されるヘミン（hemin）
は、次のようにして調製される。

260mg ヘミン（Eastman Kodak ＃2203） 4ml 0.5M NaOH 5ml トリス緩衝液、1M、pH7.8、（約9.5部の酸対３
部の塩基）２回蒸留した水で100mlにする。

1.トリス緩衝液および水を添加する前にヘミンをNaOHに
完全に溶解させる。

2.容量を100mlに調整したのち、0.45μｍのフィルター
を通して濾過滅菌し、２〜3mlに分注して−20℃で貯蔵
する。

6.6.2.3. イスコベ改良ダルベッコ培地の調製 BFU−E/CFU−GEMM検定に使用される１×イスコベ改良
ダルベッコ培地（IMDM）は、次のようにして調製され
る。

1.できるだけ最終容量に近い混合容器を用いて、所望の
全容量の培地よりも５％少ない水（脱イオン水、蒸溜
水）を計り取る。

2.粉末培地（Gibco Laboratories,Formula No.78−522
0）を、室温でゆっくり撹拌しながら水に加える（水を
加熱しない）。

3.パッケージの内側を洗浄し、残存の粉末をすべて除
く。

4.培地１当り3.024gのNaHCO₃を加える。

5.所望の容量に水で希釈する。溶解するまで撹拌する。

6.pHは調整しない。培地を濾過するまで容器を閉じてお
く。

7.ナルゲン（Nalgene）濾過により直ちに滅菌する。

１リットルの２×液体培地を調製するたに、１包みの
代わりに２包みの粉末および6.048gのNaHCO₃を使用した
以外は上記方法を行なう。

6.6.3. 幹細胞コロニー形成単位検定幹細胞（Ｓ−細胞）の定量に使用される検定は、自己
複製を直接的には検出しないが、その代わり再プレーテ
ィングにおいて二次的多系統コロニーを発生する能力を
検出する。この検定は、14日後（BFU−ＥおよびCFU−GE
MMの場合）よりもむしろ21〜28日間の培養後に培養物を
記録する以外は、BFU−E/CFU−GEMM検定と実質的に同一
に行なわれる。薬剤４−ヒドロパーオキシシクロ−ホス
ファミド（4HC）は、成熟前駆細胞を犠牲にして未成熟
な前駆細胞を残すようであり、したがって検定前に細胞
を予備処理するのに有用であると思われる。インビトロ
でＳ−細胞の自己複製能を増大させる（したがって検定
効果を高める）ことについて試験される因子としては、
ヘミン、酸素圧（Smith,S.and Broxmeyer,H.E.,1986,Br
it.J.Haematol.63:29−34）、スーパーオキシドジスム
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、IL−３、GM−CSF、
Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、エリトロポエチン、IL−１、IL−４
等があるが、これらに限定されるものではない。

6.6.4. 幹および前駆細胞の増殖状態の検定幹および前駆細胞の増殖状態の検定は、次のようにし
て行なわれる高比活性トリチウム化チミジン（³HTdr）
殺生（または自殺）法により測定される。

1.2個の小さい12×75mmのポリスチレン管に、プレーテ
ィングに必要な細胞の数の２〜３倍を含む適当量のスト
ック細胞懸濁液を入れる（骨髄では２〜３×10⁶細胞、
また脾臓では15〜20×10⁶細胞、臍帯血液では２〜３×1
0⁶（約）細胞）。これらにａおよびｂのラベルを付け
る。

2.200〜400×ｇかつ４℃で10分遠心して細胞をペレット
化する。

3.上澄液を注意深く除去し、捨てる。

4.上記6.6.1.1の項に記載したように補給したマッコイ5
A培地0.5mlを10％V/VのFCSとともに加える。

5.管ｂに50Ciの³HTdr（New England Nuelear,＃NET−02
7Xチミジン、［メチル−³H］−20.0Ci/ミリモル:5.0mCi
/5.0mlH₂O）を加える。対照として、管ａに50μのマ
ッコイ5A培地を加える。

6.管にキャップをかぶせ、再び細胞を懸濁させるために
ゆっくりボルテックス混合する。

7.該管を水を含むトレー中に入れ、培養器内で５％のCO
₂雰囲気中で37℃の温度で20分間載置する。

8.0.5ml（2.5mg）の氷冷（４℃）「冷却」（非放射性）
チミジン（Sigma ＃Ｔ−9250）を5mg/mlで各管に加え、
僅かにボルテックス混合する。2mlの氷冷マッコイ5A培
地を各管に加える。

9.細胞を200〜400×ｇでかつ４℃で10分間遠心分離して
ペレット化する。

10.上澄液を適当な容器（放射性廃棄物用容器）に吸引
し、2mlの冷却培地で細胞を再び懸濁させる。ステップ
＃10を繰り返す。

11.上澄液を適当な容器に吸引する。10％のFCSを含有す
るマッコイ5Aで、細胞濃度がプレーティング濃度より少
なくとも10倍は大きい容量に再懸濁させる。

12.プレーティングが準備できるまで細胞を氷上に保持
する。

13.6.6.1〜6.6.3の項に記載したようにプレートし、コ
ロニー形成アッセイを行う。

6.7. 臍帯血液から導かれたヒト造血前駆細胞の凍結−
融解後の回収凍結−融解後のヒト臍帯血液からの造血前駆細胞の回
収を評価するために、凍結−融解後の前駆細胞検定の結
果を、凍結−融解前に得られた同一検定の結果と比較し
た。6.1の項に記載したようにして得られる、８個の臍
帯血液のサンプルをフィコル−ハイパキュー（Ficoll−
Hypaque）を使用して分離し、分析した。結果を表５に
示す。

表５に示すように、凍結−融解後の平均生存率（％）
は、有核細胞、７日目のCFU−GM、14日目のCFU−GM、BF
U−Ｅ−２、BFU−Ｅ−１およびCFU−GEMMについてそれ
ぞれ36.1、65.6、65.4、45.8、44.6および30.5であっ
た。回収率において、変動幅があった。

表５に示されるデータは、フィコル−ハイパキュー分離
中およびDMSO分離工程中（本発明の好ましい実施態様に
おいては省略されている２工程）（注:DMSOは、必要に
より行なわれる場合には、コロニー検定前に分離しなけ
ればならない）に生じる細胞損失を反映している。

6.8. 臍帯血液の再構成能力の計算下記の議論は、（6.1の項に記載されているように）
臍帯血液の個々の採取物が個体の造血系を再集団化する
のに充分な造血幹および前駆細胞を含むことを示してい
る。

刊行物の調査によると、ヒト患者における自己由来の
骨髄再構成のために注入されるCFU−GMの数が造血再構
成の成功の可能性を示すものとして信頼できることが報
じられている（Spitzer,G.ら、1980,Blood 55（２）:31
7〜323;Douayら、1986.Exp.Hematol.14:358〜365）。公
表されたデータを患者の体重により標準化しかつ患者の
体重を150ポンド（67.5kg）と仮定すると、自己由来骨
髄細胞を用いた造血再構成に必要なCFU−GMの計算数
は、２〜425×10⁴であり、10×10⁴CFU−GMより多く用い
るとより速い再生ができる。

前記表３に表されている81の臍帯血液採取物について
の14日目のCFU−GMカウント数のデータは、フィコル−
ハイパキュー分離した個々の血液採取物当り０〜109×1
0⁴CFU−GMであることを示している。70の試料は２×10⁴
CFU−GMと同等またはそれ以上を含むが、30の試料は10
×10⁴CFU−GMと同等またはそれ以上を含んでいた。この
データは、臍帯からの重力排出法または分娩胎盤からの
ニードルアスピレーションにより得られたフィコル−ハ
イパキュー分離細胞から導かれるものであることは強調
されるべきである。全血が治療用に凍結および注入され
る本発明の好ましい実施態様において、フィコル−ハイ
パキュー分離による損失は避けることができる（フィコ
ル−ハイパキュー分離中に生じる細胞損失に関するデー
タについては前記6.3.1項と表４を参照のこと）。さら
に、前記6.1の項で述べたように、最近の血液採取にお
いて、本発明者らは、第２図に示すようにあるいは表３
に記載したように、胎盤基部の分娩胎盤と拡張した表面
静脈内からニードルアスピレーションを用い、かつ臍帯
排液法と組合わせて約２倍の容量を得ることができる。
また、分娩時に即時臍帯結紮を行なう採血プロトコール
の調整は、より大きい血液採取容量の結果となるべきで
ある（Yao、A.C.ら、1969年10月25日、Lancet:871〜87
3、ここで採取された新生児の血液は臍帯からおよび分
娩胎盤から排出法で得られ、臍帯が出生後５秒以内に結
紮される場合には平均126.6ml容量である）。かくし
て、表３のデータ分析は、凍結−解凍時に予想される損
失が調整されるべきではあるが（しかしながら、その損
失は35％を越えるべきではない）、造血再構成を上首尾
で行うためには採取物当り充分な臍帯幹及び前駆細胞量
であるといえよう。

また、臍帯造血細胞の再構成能力は、同数の骨髄細胞
の再構成能力よりも高い。臍帯血液細胞から得られるコ
ロニーは、通常成人骨髄から得られるコロニーよりもサ
イズが大きい。

6.9. 造血幹および前駆細胞のインビトロ培養条件ヒト臍帯血液からの造血前駆細胞のインビトロ増殖用
培養条件は、Smith,S and Broxmeyer,H.E,1986,British
Journal of Hematology,Vol.63,PP.29−34に記載され
ており、これはその全文が参考として本願明細書に引用
される。培地はつぎの成分から構成されている。

RPMI1640培地（Gibco Laboratories,Grand Island,NY） 10^-6Mハイドロコーチゾン（Sigma、セントルイス、ミズ
リー州）５μg/mlビタミンD₃（U.S.Biochemical Corp.,クリーブ
ランド、オハイオ州） 20％牛胎児血清、熱不活性化（Hyclone Laboratories,
ローガン、ユタ州） 2g/ NaHCO₃（Fisher Scientific Co.,フェアロー
ン、ニュージャージー州） 100U/mlペニシリン 100μg/mlストレプトマイシン 0.25μg/mlフンギゾン（Fungizone）インビトロで幹細胞の自己再生能力を増大させる効果に
ついて種々の条件および因子が試験できる。これらは、
酸素圧（ここに参考として引用されるSmithおよびBroxm
eyer,1986,Br.J.Hematol.63:29−34参照）、スーパーオ
キシドジスムターゼ（Sigma Chemical Co.,セントルイ
ス、ミズリー州）、グルコースオキシダーゼ（Sigma Ch
emical Co.）および種々のコロニー刺激因子、すなわち
インターロイキン−３（IL−３）、顆粒球−マクロファ
ージ（GM）−コロニー刺激因子（CSF）、顆粒球（Ｇ）
−CSF、マクロファージ（Ｍ）−CSF（CSF−１）、エリ
トロポエチン、IL−１およびIL−４（Ｂ細胞成長因子）
の組合せ等を含むものであるが、これらにのみ限定され
るものではない。

6.10. マウス解剖プロトコールマウス骨髄および脾臓は、本発明のヒト新生児幹細胞
および前駆細胞とともに使用される新規および／または
改良させたプロトコールを試験するモデル実験のための
ネズミ造血幹および前駆細胞の有用な供給源である。マ
ウス骨髄および脾臓の解剖については、6.10.1および6.
10.2の項にそれぞれ記載されている。

6.10.1. 骨髄解剖ネズミの骨髄細胞懸濁液を得るために下記の手順が用
いられる。

1.規定どおり頚部−胸部転位によりマスウを犠牲にす
る。

2.実験室のフード内で、マウスを70％のエタノールに浸
漬して（微生物汚染を避けるため）、完全に毛皮を濡ら
す。

3.皮を切断し、かつ70％エタノールに浸漬した鉗子また
は指で足を保持して皮を臀部まで剥離し、その皮を鉗子
で引張る。

4.滅菌した（アルコール処理した）鉗子およびはさみで
大腿がさらされるように筋肉組織をできるだけ切断す
る。

5.脛軟骨／関節を通して切断して大腿から脛骨を除去す
る。脛骨を捨てる。

6.股関節の前方側にはさみの鋭利端をおき、はさみに対
して反対側に大腿を引張り、はさみが折れ目にフィット
するようにして大腿を胴体からはずす。関節を通して切
断する。

7.はさみで端部を切断することにより大腿の脛端をまず
取除く。大腿から同じ方法で臀部端を除去する。

8.5mlの培地（McCoys 5AlX）を含有する27ゲージ針のつ
いた10ccの注射器を用い、針を骨の臀部端を経由して骨
の空洞部内に置く。

9.骨および注射器を17×100mmのチューブ上に保持しな
がら、注射器を使って空洞部に培地を圧入することによ
り骨からの骨髄をあふれさせる。

10.両大腿骨が空になったら、23ゲージ針のついた10cc
の注射器で塊をくだく。

11.400×ｇ（Beckman TJ−6R ローターで1500rpm）で
４℃で10分間遠心して細胞をペレット化する。

12.上澄液を吸引してかつ廃棄する。

13.10mlのマッコイ5A培地およびピペットで細胞を再懸
濁させ、かつ11および12のステップを繰返す。

14.10mlのマッコイ5A培地およびピペットで細胞を再懸
濁させ、かつ細胞数を計数する（血球細胞計測器で）。

6.10.2. 脾臓解剖ネズミの脾臓細胞懸濁液を得るために、下記の手順が
用いられる。

1.前述のとおり頚部−胸部転位によりマウスを犠牲にす
る。

2.実験室のフード内で、マウスヲ70％のエタノールに浸
漬して（微生物汚染を避けるため）、完全に毛皮を濡ら
す。

3.マウスの腹を上にしておき、滅菌されたはさみおよび
鉗子で左側の皮を切開く。

4.鉗子で腹膜を引上げ、腹腔まで切断する。

5.脾臓が見えたらこれを取出し、５〜7mlの培地を含ん
でいる60×100mmの皿に入れる。

6.皿内の滅菌されたホモジナイジングスクリーン内に脾
臓を入れ、小片に切断する。

7.10ccの注射器のプランジャーを用いて、培地を含んで
いる皿に組織を静かにスクリーンを通して入れる。

8.細胞懸濁液を皿からチューブに移す。3mlの培地でプ
レートを洗浄し、集める。

9.チューブから10ccの注射器に細胞懸濁液を移し、かつ
23ゲージ針を２回通過させることにより小片を再懸濁さ
せる。

10.400×ｇ（1500rpm）で４℃で10分間遠心して細胞を
ペレット化する。

11.上澄液を吸引してかつ廃棄する。

12.10mlのマッコイ5A培地およびピペットで細胞を再懸
濁させ、かつ10および11のステップを繰返す。

13.10mlのマッコイ5A培地およびピペットで細胞を再懸
濁させ、かつ細胞数を計数する（血球細胞計測器で）。

6.11. 同系の胎児または新生児幹細胞による成長マウ
スの造血再構成下記実施例の項に記載されている実験例は、胎児また
は新生児血液の同系またはTla−類似遺伝子型幹細胞に
よる成体のマウスの造血再構成を示す。

造血不全からの100％死亡率をひき起すレベルでのマ
ウスおよび他のほ乳類の実験的照射および造血再構成
（骨髄細胞による）によるそのような死亡の回避の基準
についての動物モデル実験に使用されるキーとなる文献
および引例の源は、バルナー、エイチ（Balner,H.）のB
one Marrow Transplanation and Other Treatment afte
r Radiation Injury,Martinus Nijhoff Medical Divisi
on,The Hague,1977であり、これはここに参考文献とし
て引用されるものとする。

6.11.1. 誕生期近くの胎児の血液中の幹細胞による致
命的に照射されたマウスの造血再構成ここに記載されている実施例は、誕生期近くの胎児の血
液中の幹細胞が致命的に照射されたマウスの造血系を再
構成し得ることを示している。

照射されたマウスは10匹の（B6×Ａ−Tla^b）F₁ハイブ
リッド雄、７週令であった。

マウスは、¹³⁷Cs源により107.85ラド／分の照射量で8
62.8ラド照射される。この量は、LD100/30日、すなわ
ち、照射後30日以内に100％の致死を生じさせる最低量
またはそれに近い量である。30日の生存終点の使用が基
準であり、その理由は、造血再構成がその日数で充分と
なみされ、したがって、いかなる後日の致死も造血不全
以外の誘因によるものであるからである。

血液は、一匹の母マウスから帝王切開により分娩した５
匹の誕生期近くの（B6−Tla^a×Ａ）F₁ハイブリッド胎児
から採取した。この実験では、誕生期近くの胎児が無菌
を確実にするために新生児の代わりに使用された。ドナ
ーおよび受容体マウスの遺伝子学は、マーカー遺伝子Tl
aを有する染色体17のセグメントを除いて完全な組織適
合性を与える。全マウスは、予めかつずっと酸性化飲料
水を与えてシュードモナスおよび同様の感染性微生物を
撲滅するよう維持された。

回復処置として、眼窩周囲静脈に血管内注射により0.
17mlのヘパリン化胎児全血（ペニシリンおよびストレプ
トマイシンが添加されたM199培地を加えることにより全
容量を約0.2mlとする）を照射後２時間以内に３匹のマ
ウスに与えた。結果（表６）は、回復処置を施されなか
ったマウスの死亡とは対照的に、胎児血液幹細胞で再構
成されたマウスの生存を示すものである。

＊全ての30日生存マウスは、長期の観察期間にわたり一
般的に健康であるが、照射後の典型的な毛皮の灰色化を
示し、また同系または近同系の細胞ドナーによる再構成
を代表するように、ほぼ正常な寿命を疑いなく経験した
であろう。

＊＊胸線リンパ球の細胞毒性分析（Schlesinger,M.et a
l.,1965,Nature 206:1119−1121:Boyse,E.A.,et al.,19
64,Methods in Medical Research 10:39）によるTlaマ
ーカーのタイピング（型別）によって、注入された血液
のドナー細胞の再集団化が確認された。

6.11.2. 成体血液によるのではなく少量の誕生期に近
い胎児血液によるマウスの造血再構成ここに記載されている実施例は、誕生期に近い胎児血
液の所定量が十分な造血幹細胞を含んで致死的に照射さ
れたマウスの造血系を効果的に再構成し、一方、同一容
量の成体血液は再構成に有効でないことを示している。

照射されたマウスは、７週令の20匹の（B6×Ａ−Tl
a^b）F₁ハイブリッド雄および７週令の10匹の（B6×Ａ−
Tla^b）F₁雌であった。マウスは、¹³⁷Cs源により107.85
ラド／分の照射線量で８分間862.8ラドにさらされた（L
D100/30日）。

血液は、一匹の母マウスから帝王切開により分娩した
５匹の誕生期に近い（B6−Tla^b×Ａ）F₁ハイブリッド胎
児から採血した。この実験では、誕生期に近い胎児が無
菌を確実にするために新生児の代わりに使用された。ド
ナーおよび受容体マウスの遺伝子学は、マーカー遺伝子
Tlaを有する染色体17のセグメントを除いて完全な組織
適合性を与える。全マウスは、予めかつずっと酸性化飲
料水を与えてシュードモナスおよび同様の感染性微生物
を撲滅するよう維持された。

回復処置として、照射後２時間以内に眼窩周囲静脈に
血管内注射により10匹のマウスが0.02mlのヘパリン化胎
児全血（ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加さ
れたM199培地を加えることによって全容量を約0.22mlと
する）を受け、10匹のマウスが0.02mlの同様に処理され
た成体全血を受けた。対照のマウスには処置を施さなか
った。結果（表７）は、所定量の胎児血液中の幹細胞が
造血系を上首尾に再構成するが、一方、同一量の成体血
液中の細胞は再構成しないことを示すものである。

＊＊胸線リンプ球の細胞毒性分析（Schlesinger,M,ら,1
965,Nature 206:1119−1121:Boyse,E.A.ら164,Methods,
in Medical Research 10:39）によるTlaマーカーの型
別によって、注入された血液のドナー細胞の再集団化が
確認された。

6.11.3. 10μ程度の少容量の新生児マウスの血液に
よる造血再構成ここに記載の実施例は、10μ程度の少容量の新生児
血液の幹細胞が致命的に照射されたマウスの造血系を再
構成することを示している。

照射されたマウスは、８〜12週令の20匹の（B6×Ａ−
Tla^b）F₁ハイブリッド雄であった。このマウスは、¹³⁷C
s源により107.85ラド／分の照射線量で８分間862.8ラド
（LD100/30日）にさらされた。

血液は、24時間令未満の18匹の（B6−Tla^a×Ａ）F₁ハ
イブリッド新生児か頚部切開により採血された。回復処
置として、マウス当り0.04mlのヘパリン化新生児全血
（ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加されたM1
99倍地を加えることにより全容量を約0.2mlとする）を
５匹のマウスに与え（グループ１）、0.02mlをそれぞれ
５匹のマウスに与え（グループ２）、0.01mlをそれぞれ
５匹のマウスに与え（グループ３）および処置を行なわ
ない５匹のマウス（グループ４、照射対照）を準備し
た。処置は、眼窩周囲静脈に血管内注射により行なわれ
た。

ドナーおよび受容体マウスの遺伝子学は、マーカー遺
伝子Tlaを有する染色体17のセグメントを除いて完全な
組織適合性を与える。全マウスは、予めかつずっと酸性
化飲料水を与えてシュードモナスおよび同様の感染性微
生物を撲滅するよう維持された。

表８の結果は、極度に少量の新生児血液（下限10μ
）の幹細胞が造血系を再構成し得ることを示してい
る。

＊全ての30日生存マウスは、長期の観察期間にわたり一
般的に健康であるが、照射後の典型的な毛皮の灰色化を
示し、また同系または近同系の細胞ドナーによる再構成
を代表するように、ほぼ正常な寿命を疑いなく経験する
であろう。

＊＊胸線リンパ球の細胞毒性分析（Schlesinger,M,ら,1
965,Nature 206:1119−1121:Boyse,E.A.ら164,Methods,
in Medical Research 10:39）によるTlaマーカーの型
別によって、注入された血液のドナー細胞の再集団化が
確認された。

6.11.4. 10または15μ容量の新生児マウスの血液に
よる造血再構成ここに記載の実施例は、10または15μ容量ほどの新
生児マウスの血液中の幹細胞が致命的に照射されたマウ
スの造血系を再構成することを示している。

照射されたマウスは、10〜12週令の（B6×Ａ−Tla^b）
F₁ハイブリッド雄15匹と雌５匹であった。このマウス
は、¹³⁷Cs源により107.85ラド／分の照射線量で８分間8
62.8ラド（LD100/30日）にさらされた。

血液は、24時間令未満の14匹の（B6−Tla^b×Ａ）F₁ハ
イブリッド新生児から頚部切開により採血された。回復
処置として、マウス当り0.015mlのヘパリン化新生児全
血（ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された
M199培地を加えることにより全容量を約0.2mlとする）
を10匹のマウスに与え（グループ１）、0.01mlをそれぞ
れ５匹のマウスに与え（グループ２）、処置を行なわな
い５匹の雌マウス（グルーブ３、照射対照）を準備し
た。処置は眼窩周囲静脈への血管内注射により行った。
ドナーおよび受容体のマウスは遺伝子的には同一である
ので、完全な組織適合性を有している。全マウスは、予
めかつずっと酸性化飲料水を与えてシュードモナスおよ
び同様の感染性微生物を撲滅するように維持された。

表９の結果は、10または15マイクロリットル容量の新
生児血液の幹細胞および前駆細胞が造血系を再構成し得
ることを明らかにしている。

＊全ての30日生存マウスは、長期の観察期間にわたり一
般的に健康であるが、照射により外皮が典型的に灰色に
なり、また同系または近同系の細胞ドナーによる再構成
を代表するように、ほぼ正常な寿命を疑いなく経験した
であろう。

6.12. ファンコニ貧血症治療のための造血再構成ここに記載する実施例において、本発明者らは、遺伝
性貧血症ファンコニ症候群を治療するために、同種異系
末梢血液幹細胞注入により患者の造血再構成を行なう手
順を記載する。

患者は、ファンコニ貧血症の５才の白人男子であっ
た。患者は、最初24月令のとき汎血球減少症であること
が認められた。つづいて彼は、ジエポキシブタン誘導染
色体切断検定によりファンコニ貧血症であることが確認
された（Auerbach,A.D.ら、1979,Am.J.Hum.Genet.31
（１）:77−81）。患者は、ダナゾール投与以外は軽化
治療は受けていなかった。彼は、二度（１回は赤血球、
また１回は血小板）輸血を受けた。

造血再構成用の新生児の血液源は妹であり、彼女はHL
Aおよび赤血球抗原について患者と適合性を有してい
た。羊水穿刺により得られた子宮内の妹の線維芽細胞の
検討により、この妹は四つの抗原がマッチすることが見
出された。染色体切断試験（Auerback,A.D.ら、1979、A
m.J.Hum.Genet.31（１）:77−81）は、妹がファンコニ
貧血性にかかっていないことを示した。

約150mlの新生児血液を、誕生時の妹の胎盤および臍
帯から採血し、DMSOを含有する無菌の発熱物質不含生理
食塩水で1:1に希釈してDMSOの最終濃度を10％とした。
ついで、血液を夜行便により無菌状態で加工場に輸送
し、時間凍結装置内の移植バッグ内でゆっくり凍結し、
かつ液体窒素中に保存した。

凍結する前に希釈血液のサンプルを検定して前記6.6
の項に記載したように造血前駆細胞の数を計測した。そ
の結果は表10に示されている。

新生児血液（１ケ月凍結）のサンプルについて凍結−
解凍試験後、生存している造血前駆細胞の回収は、つぎ
のとおりであった（6.6.の項に記載したようにインビト
ロで造血前駆細胞コロニー検定により評価した）:100％
のCFU−GM、45％のBFU−Ｅおよび75％のCFU−GEMM。

化学放射線治療法の投与量を減少させた以外は、非構
成的な再生不良性貧血性（Gluckman,E.ら、1984,Aplast
ic Anaemia,Stem Cell Biology and Advances in Treat
ment,Young,N.S.ら編、Alan R.Liss,Inc.Ner York,pp3
25−333:ここに参考として引用される）を状態調整する
のに用いられているものと同様な方法で、患者は造血再
構成のために状態調整される。患者には、新生児血液注
入の６日、５日、４日および３日前に5mg/kg/日の投与
量かつ合計20mg/kgでチトキシン（登録商標）（シクロ
ホスファミド）が静脈投与される。注入１日前に、患者
は50ラドを胸及び腹部に照射され、シクロスポリンＡ
（Cyclosporin A）が投与される。

凍結血液サンプルは、液体窒素で冷却しながら患者の
治療場所に輸送され、ここで水浴中で解凍される。ほぼ
300mlの解凍血液サンプルが、ファンコニ貧血症の治療
のために患者に静脈注射された。

6.13. フローチャート：サービスの説明本発明の好ましい態様では、新生児造血幹及び前駆細
胞の単離や保存は、下記に掲げた段階を含み得る従来の
細胞ドナーに対し提供するサービスとして企てられてい
る。この記述は、例示のためのものであり、本発明の範
囲を限定するものではない。

1.接触最初の接触は、妊娠している母親（依頼人）とサービ
スを施す産科医との間で行なわれる。

2.血液の採取産室では、赤ん坊が生まれ、通常の方法で臍帯から分
離した後に、臍帯血が特別に設計された容器に臍帯から
取り出され、シールされる。この臍帯血は産科医達によ
って誕生の詳細な記録が与えられて完成したデータとと
もに、特製の輸送用容器に入れられる。

3.輸送１日１回、夜行輸送者が各産室から輸送用容器を集
め、次の日の午前10時半までに処理本部に輸送する。

4.登録本部での受け取りにより、各容器は分類登録される。
臍帯血は処理研究室に入る（任意）。

5.血液の処理（任意）細胞が分離され、幹及び前駆細胞を含む白血球が貯蔵
のために保管される。

6.試験分離された細胞に所定の試験（前述の5.1.2節参照）
を行なう。例外的な場合としては、特殊な試験を行な
い、その試料が例えば母親の血液によって汚染されてい
るか否かを調べる。試料は、汚染あるいは他の原因を理
由として廃棄されることがある。

7.梱包とラベル付け受け入れられた試料からの細胞は、標準的な凍結バイ
アル（クリューレ:cryule）に分配され、一定の、コン
ピュータ用文字でラベルが作られる。

１個体の細胞は、４つのクリューレに配分され、それ
らの内２つは１つの冷凍庫に貯蔵され、残りの２つは、
独立に設けられた別の冷凍庫に貯蔵される。５番目のク
リューレは治療が必要なときにとり出され、本人である
ことの同一性、生存力及び機能のテストのためにとって
おく細胞を含む。

ラベルは、特別のプリンタを用いるコンピュータによ
って、液体窒素中に入れても耐え得るシルクの上にプリ
ントされる。ラベルのデータは、機械読み及び人間が読
むことができる文字での登録番号、冷凍の日付、クリュ
ーレ番号（１−4,5）及び入れた冷凍庫（Ａ及びＢ）が
含まれる。

8.冷凍と保存前記クリューレは、徐々に凍結させ別個に設けられた
２つの液体窒素冷凍庫に入れられる。

9.永久記録完全な調製の経過が低温保存モジュール内の位置を含
む永久記録として入力される。例えば、コンピュータ記
録として維持する各ドナーに関する入力データは、次の
ものを含む：登録番号名前性別誕生日誕生場所（病院の証明）誕生証明番号母親の名前細胞を受入れた日付冷凍した日付冷凍庫での位置産科のデータ（ａ）誕生の特別な状況（ｂ）もし双生児ならば、もう一方の双生児の登録番
号（ｃ）母親のあらゆる健康上の不調テスト結果（ａ）細胞数の差（ｂ）細菌の培養（ｃ）実施した他のテスト 10.依頼人への通知依頼人には、子供の記録とともに保存するために登録
番号が通知され、永久記録に含めるために、誕生の時点
では入手できなかった情報（与えられた名前、誕生番
号）を尋ねる。

11.臨床使用のための細胞の引き出し細胞ドナーの治療のため、細胞の要求が、そのドナー
に代わって適切な病院に関係している信頼された医師に
よって行なわれる。細胞は、細胞バンクから引き出さ
れ、そしてその受容者との同一性が確認される。そして
細胞は、また、生存力や細菌による汚染、幹及び前駆細
胞に関する定量、あるいは他のカテゴリがテストされ
る。他のテストも要求があれば行なわれる。細胞及びそ
れに付随した報告書は医師の指示する医療機関に引渡さ
れる。これに伴う注記が永久記録に入力される。

上述した本発明の応用例、変形例は、その精神および
範囲を逸脱することなくなし得ることが明らかである。
特に記載された実施例は例示されているのみで、本発明
は、添付した請求の範囲によってのみ限定されるもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 35/50 7431−4Ｃ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/06 (72)発明者ダグラス，ゴードン，ダブリュアメリカ合衆国ニューヨーク州 10022, ニューヨーク，サットンパレスサウス 50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）血液由来の多数の生存可能なヒト新
生児または胎児造血幹細胞；および（ｂ）凍結保存剤；を含む組成物。
【請求項２】生存可能なヒト新生児または胎児造血前駆
細胞をさらに含む、請求の範囲１記載の組成物。
【請求項３】新生児または胎児の全血をさらに含む、請
求の範囲１記載の組成物。
【請求項４】抗凝血剤をさらに含む、請求の範囲１記載
の組成物。
【請求項５】凍結保存剤がジメチルスルホキシドであ
る、請求の範囲１、２、３または４記載の組成物。
【請求項６】造血幹細胞がインビトロで顆粒球、エリト
ロイド、単球またはマクロファージの子孫のコロニーを
産生し得る能力を有することを特徴とする、請求の範囲
１記載の組成物。
【請求項７】前駆細胞がインビトロで顆粒球、エリトロ
イド、単球またはマクロファージの子孫のコロニーを産
生し得る能力を有することを特徴とする、請求の範囲２
記載の組成物。
【請求項８】造血幹細胞が、哺乳類に導入したときに、
脾臓に播種され、かつ子孫細胞のコロニーを産生し得る
能力を有することを特徴とする、請求の範囲１記載の組
成物。
【請求項９】造血幹細胞がそれを導入された宿主の造血
系を再構成する能力を有することを特徴とする、請求の
範囲第１記載の組成物。
【請求項１０】ヒトの病気または疾患の治療もしくは予
防に用いられる異種遺伝子配列が安定して組み込まれて
いる、血液由来のインビトロ・ヒト新生児または胎児造
血幹または前駆細胞であって、該異種遺伝子配列を発現
する子孫細胞を産生する能力を有する上記細胞。
【請求項１１】異種遺伝子配列がヘモグロビンをコード
する配列から成る、請求の範囲10記載の幹または前駆細
胞。
【請求項１２】異種遺伝子配列が病原性微生物の核酸に
相補的で、かつそれにハイブリダイズし得る核酸配列と
して発現される、請求の範囲10記載の幹また前駆細胞。
【請求項１３】病原性微生物がヒト免疫不全ウイルスで
ある、請求の範囲12記載の幹または前駆細胞。
【請求項１４】異種遺伝子配列が病原体に対して毒性の
産物として発現される、請求の範囲10記載の幹または前
駆細胞。
【請求項１５】異種遺伝子配列がヒト患者において欠
失、欠損または突然変異を起こしている遺伝子の機能的
な同等物である、請求の範囲10記載の幹または前駆細
胞。
【請求項１６】（ａ）造血幹または前駆細胞を含むヒト
新生児または胎児血液成分を分離し；（ｂ）該血液成分を凍結保存し；そして（ｃ）該血液成分を融解する；ことから成り、その結果該幹または前駆細胞が生存可能
である、ヒト新生児または胎児造血幹または前駆細胞を
得る方法。
【請求項１７】工程（ｃ）の後に凍結保存剤を除去する
工程をさらに含む、請求の範囲16記載の方法。
【請求項１８】インビトロで幹または前駆細胞を増殖さ
せる工程をさらに含む、請求の範囲16記載の方法。
【請求項１９】細胞分離法により幹および前駆細胞を富
化する工程をさらに含む、請求の範囲16記載の方法。
【請求項２０】血液成分が全血を含む、請求の範囲16記
載の方法。
【請求項２１】血液成分が臍帯からの採血により分離さ
れる、請求の範囲16または20記載の方法。
【請求項２２】血液成分が胎盤からの採血により分離さ
れる、請求の範囲16または20記載の方法。
【請求項２３】血液成分が同一個体の臍帯と胎盤の両方
からの採血により分離される、請求の範囲16または20記
載の方法。
【請求項２４】凍結保存が凍結保存剤の使用によるもの
である、請求の範囲16記載の方法。
【請求項２５】凍結保存剤がジメチルスルホキシドであ
る、請求の範囲24記載の方法。
【請求項２６】凍結保存が液体窒素の使用によるもので
ある、請求の範囲16記載の方法。
【請求項２７】凍結保存が液体窒素の使用をさらに含
む、請求の範囲24記載の方法。
【請求項２８】（ａ）ヒト新生児または胎児造血幹細胞
を含むヒト新生児または胎児血液成分を分離し；そして（ｂ）該幹細胞が存在した状態で存在するように該血液
成分を凍結保存する；ことから成る、血液由来の凍結保存されたヒト新生児ま
たは胎児造血幹細胞を得る方法。
【請求項２９】血液成分が全血を含む、請求の範囲28記
載の方法。
【請求項３０】ヒトの造血または免疫の再構成において
使用するための、血液由来の多数の生存可能な凍結保存
されたヒト新生児または胎児造血幹細胞を含む組成物。
【請求項３１】幹細胞がヒト自己由来であるか、ヒト同
系であるか、またはヒト同種異系である、請求の範囲30
記載の組成物。
【請求項３２】前記組成物が全血を含む、請求の範囲30
記載の組成物。
【請求項３３】臍帯から採血することから成る方法によ
って分離される、請求の範囲30記載の組成物。
【請求項３４】病気または疾患を有するヒトの治療に使
用するための、血液由来の多数の生存可能な凍結保存さ
れたヒト新生児または胎児造血幹細胞を含む組成物。
【請求項３５】ヒトが、おそらく病原性微生物による感
染のために、免疫不全症であるか；悪性固形腫瘍を有す
るか；貧血、おそらくファンコニ貧血、を有するか；低
増殖性幹細胞疾患を有するか；造血悪性、例えば白血病
またはリンパ腫、を有するか；自己免疫疾患を有する
か；溶血性疾患を有するか；あるいは遺伝子疾患を有す
る、請求の範囲30または34記載の組成物。
【請求項３６】ファンコニ貧血の治療用医薬を製造する
ための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生児または
胎児造血幹細胞を含む組成物の使用。
【請求項３７】ヒトの造血または免疫の再構成において
使用するための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生
児または胎児造血幹細胞を含む組成物であって、該幹細
胞がヒトの病気または疾患の治療もしくは予防に用いら
れる異種遺伝子配列を含み、該異種遺伝子配列が安定し
た状態で組み込まれかつ該幹細胞の子孫によって発現さ
れ得ることを特徴とする上記組成物。
【請求項３８】ヒトが遺伝子疾患を有する、請求の範囲
37記載の組成物。
【請求項３９】異種遺伝子配列がヘモグロビンをコード
する配列から成る、請求の範囲38記載の組成物。
【請求項４０】ヒトが地中海貧血、鎌状赤血球症または
貧血を有する、請求の範囲38記載の組成物。
【請求項４１】ヒトが、おそらく病原性微生物による感
染のために、免疫不全症である、請求の範囲35記載の組
成物。
【請求項４２】ヒトが病原性微生物に感染しており、該
異種遺伝子配列が病原性微生物に対して毒性であるがヒ
トに対して有意に毒性でない産物として発現される、請
求の範囲37記載の組成物。
【請求項４３】異種遺伝子配列が病原性微生物の核酸に
相補的で、かつそれにハイブリダイズし得る核酸配列と
して発現される、請求の範囲37記載の組成物。
【請求項４４】病原性微生物がヒト免疫不全ウイルスで
ある、請求の範囲43記載の組成物。
【請求項４５】ヒトの造血または免疫の再構成において
使用するための、血液由来の多数の生存可能な凍結保存
されたヒト新生児または胎児造血幹および前駆細胞を含
む組成物。
【請求項４６】幹および前駆細胞がヒト自己由来である
か、ヒト同系であるか、またはヒト同種異系である、請
求の範囲45記載の組成物。
【請求項４７】ヒトがファンコニ貧血を有する、請求の
範囲45記載の組成物。
【請求項４８】前記組成物が全血を含む、請求の範囲45
記載の組成物。
【請求項４９】臍帯から採血することから成る方法によ
って分離される、請求の範囲45記載の組成物。
【請求項５０】ファンコニ貧血の治療用医薬を製造する
ための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生児または
胎児造血幹および前駆細胞を含む組成物の使用であっ
て、該細胞が以前に凍結保存されていたものであること
を特徴とする使用。
【請求項５１】前記組成物が新生児または胎児の全血を
含む、請求の範囲36または50記載の組成物。
【請求項５２】ヒトの造血または免疫の再構成において
使用するための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生
児または胎児造血幹細胞を含む組成物であって、該幹細
胞が以前に凍結保存されていた細胞の子孫であることを
特徴とする組成物。
【請求項５３】ヒトの造血または免疫の再構成において
使用するための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生
児または胎児造血幹および前駆細胞を含む組成物であっ
て、該幹および前駆細胞がin vitroで増殖されたもので
あることを特徴とする組成物。
【請求項５４】病気または疾患を有するヒトの治療に使
用するための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生児
または胎児造血幹細胞および凍結保存剤を含む組成物。
【請求項５５】病気または疾患を有するヒトの治療に使
用するための、血液由来の多数の生存可能なヒト新生児
または胎児造血幹または前駆細胞を含む組成物であっ
て、該細胞が以前に凍結保存されていたものであること
を特徴とする組成物。
【請求項５６】ヒト患者における病気または疾患もしく
は予防に使用するための、血液由来のヒト新生児または
胎児造血幹または前駆細胞を含む組成物であって、ヒト
の病気または疾患の治療もしくは予防に用いられる異種
遺伝子配列が安定して組み込まれており、該細胞が異種
遺伝子配列を発現する子孫細胞を産生する能力を有する
ことを特徴とする上記組成物。
【請求項５７】異種遺伝子配列が病原性微生物の核酸に
相補的で、かつそれにハイブリダイズし得る核酸配列と
して発現される、請求の範囲56記載の組成物。
【請求項５８】異種遺伝子配列が病原体に対して毒性の
産物として発現される、請求の範囲56記載の組成物。
【請求項５９】異種遺伝子配列がヒト患者において欠
失、欠損または突然変異を起こしている遺伝子の機能的
な同等物である、請求の範囲56記載の組成物。