JP2003523323A

JP2003523323A - 膵臓幹細胞および移植におけるその使用

Info

Publication number: JP2003523323A
Application number: JP2001541516A
Authority: JP
Inventors: アブラハム，エリザベス，ジェイ．; ファウストマン，デニス; ハベナー，ジョエル，エフ．; バレッジョ，マリオ; ツレヴスキ，ヘンリーク; トーマス，メリッサ，ケイ．
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2003-08-05
Also published as: AU778929B2; US20030031657A1; EP1257282A1; US20060062769A1; WO2001039784A1; US6866843B2; CN100475953C; US20050244386A1; US7438902B2; IL149933A0; CN1423563A; US20010046489A1; AU1817301A; IL149933A; US7537756B2; EP1257282A4; US6923959B2; US20070071730A1; CA2392615A1; US7544510B2

Abstract

(57)【要約】インスリン産生β細胞、ならびに肝細胞を含む、種々の膵島細胞に分化しうる新規に同定した幹細胞を用いた、Ｉ型インスリン依存性糖尿病および他の状態の治療のための方法および組成物が記載される。ネスチンは、膵臓肝細胞の分子マーカーとして同定され、一方、サイトケラチン−１９は、独特なクラスの島管細胞のマーカーとして働く。ネスチン陽性幹細胞を膵島から単離し、培養してさらなる幹細胞または偽島様構造体を得ることができる方法が記載される。膵臓幹細胞のエキソビボ分化のための方法が開示される。膵臓幹細胞を単離し、拡張し、それを必要とする患者に同種異系移植、同系移植または異種移植し、喪失または損傷したインスリン分泌細胞または他の細胞の置換物を提供する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野本発明は、幹細胞およびその分化の分野に関する。特に、本発明は、膵臓のラ
ンゲルハンス島のβ細胞、ネスチン陽性肝臓幹細胞およびその幹細胞または前駆
細胞からの分化、ならびに膵臓の幹細胞、前駆細胞、および分化したβ細胞また
はネスチン陽性肝臓幹細胞もしくは前駆細胞の移植における使用の分野に関する
。

【０００２】発明の背景本発明は、少なくとも一部は、国立衛生研究所から付与された米国政府資金、
助成金ＤＫ３０４５７およびＤＫ３０８３４を用いてなされた。したがって、米
国政府は、本発明において一定の権利を有しうる。

【０００３】膵島細胞の起源は、徹底的な研究にもかかわらず、胚発生期および成熟哺乳動
物のどちらにおいても、未だに不明である。ある種の管上皮細胞は、分化または
分化転換のいずれかによりβ細胞、および成熟島に見られる他の細胞型を構成す
ることができる（Bouwens, 1998 ）。単離された膵島由来の管細胞は、培養にお
いて増殖し得、動物に移植した場合は、機能性β細胞に分化しうる（Cornelius
ら、1997）。

【０００４】長期作用性(long-acting) のＧＬＰ−１アゴニストであるエキセンジン(exend
in) −４は、ラットに投与すると、管前駆細胞からβ−細胞への分化（新生）お
よびβ−細胞の増殖の両方を刺激することが示されている。部分膵切除術を施し
た２型糖尿病ラットモデルにおいて、膵切除術後、エキセンジン−４を毎日１０
日間投与すると、糖尿病の進展が減衰した。また、エキセンジン−４は、新生に
よる膵臓の再生ならびにβ−細胞塊の拡大(expansion) およびβ−細胞の拡張を
刺激することが示されている（Xuら、1999, Diabetes, 48: 2270-2276 ）。

【０００５】 Ramiyaらは、非肥満性糖尿病(non-obese diabetic)（ＮＯＤ）の糖尿病前症成
体マウスの膵管から単離した多能性幹細胞からインビトロで作製した島が、カプ
セル化して、またはカプセル化せずに糖尿病のＮＯＤマウスに移植すると分化し
、インスリン依存性糖尿病を逆転させうるグルコース応答性島を形成することを
示した（Ramiyaら、2000, Nature Med., 6:278-282）。

【０００６】腸により産生されるインスリン向性ホルモンであるグルカゴン様ペプチド（Ｇ
ＬＰ）−１は、膵臓の発生およびインスリン遺伝子の転写調節に重要なホメオド
メイン(homeodomain) 転写因子ＩＤＸ−１の膵臓での発現を増強する。付随して
、糖尿病マウスに投与したＧＬＰ−１は、インスリン分泌を刺激し、該マウスの
血糖値を効果的に低下させる。ＧＬＰ−１はまた、β−細胞新生および島サイズ
を増大させる（Stoffersら、2000, Diabetes, 49:741-748）。

【０００７】 Ferberらは、ＰＤＸ−１（ＩＤＸ−１としても知られる）移入遺伝子のマウス
肝臓へのアデノウイルス媒介性インビボ移入が、肝細胞サブポピュレーションの
β−細胞表現型へのトランスコンバージョン(transconversion) をもたらすこと
を示した。また、マウスにＰＤＸ−１アデノウイルスベクターを静脈内注入後、
肝細胞の６０％までがＰＤＸ−１を合成したことが示された。免疫反応性インス
リンの濃度は、処置したマウスの肝臓および血清において増加した。ＰＤＸ−１
で処置したマウスは、ストレプトゾトシン(streptozotocin)誘導性糖尿病に罹ら
ず、グリセミアを正常化することさえありうる（Ferberら、2000, Nature Med.,
6:568-572）。

【０００８】単離した島から得た管細胞培養物は、インスリン分泌細胞を生じうる細胞を含
むようであるが、それらの細胞が本当に幹細胞であるのか、あるいは分化転換を
行う管上皮細胞にすぎないのかは未だ不明である。かかる調製物が真の(genuine
) 幹細胞を含んでいるとしても、どの画分が幹細胞であり、どのような夾雑細胞
型が存在しうるのかは不明である。当該技術分野において、膵臓組織から特定の
細胞型を単離すること、分子マーカーを用いて幹細胞であると特徴付けられ、か
つ多能性で長期間増殖することが実証された細胞型の必要性がある。

【０００９】ニューロン組織およびグリア組織に分化することができる多能性幹細胞は、脳
において同定されている。神経幹細胞は、中間フィラメントタンパク質であるネ
スチンを特異的に発現する（Lendahl ら、1990; Dahlstrandら、1992）。ネスチ
ンは、発生中のＥ１１日目のラット胚の神経管において発現され、Ｅ１６日目に
大脳皮質において最高発現レベルに達するが、成体皮質では減少し、脳質上衣細
胞集団に限定されるようになる（Lendahl ら、1990）。発生中の神経細胞および
膵島細胞は、共通の細胞マーカーを特徴とする表現型類似性を示す。

【００１０】本発明は、神経幹細胞および肝臓幹細胞に類似し、かつ島のα−細胞（グルカ
ゴン）およびβ−細胞（インスリン）に分化する膵島幹／前駆細胞（ＩＰＣ）の
集団に関する。本発明はまた、ネスチン陽性の肝細胞に関する。本発明のＩＰＣ
は、免疫学的無症候性／免疫寛容(immunoprivileged)であり、移植レシピエンに
より自身であると認識される。本発明のＩＰＣは、同種異系移植片および異種移
植片の境界を超えて幹細胞を植え付ける(engraftment) ために使用しうる。

【００１１】当該技術分野において、同種異系移植片および異種移植片の境界を超えて幹細
胞を植え付ける方法の必要性がある。

【００１２】また、当該技術分野において、島、ネスチン陽性膵臓幹細胞またはネスチン陽
性肝臓幹細胞が、同種異系移植片または異種移植片の境界を超えてレシピエント
に移入され、かつ移植片拒絶が起こらない、Ｉ型糖尿病の治療方法の必要性があ
る。

【００１３】また、当該技術分野において、島、ネスチン陽性膵臓幹細胞またはネスチン陽
性肝臓幹細胞が、同種異系移植片または異種移植片の境界を超えてレシピエント
に移入され、かつ移植片拒絶が起こらない、哺乳動物への移植方法の必要性があ
る。

【００１４】発明の概要本発明の目的は、真性糖尿病および他の障害の治療に使用するための哺乳動物
の膵臓または肝臓の幹細胞を提供することである。本発明の目的はまた、膵臓幹
細胞を同定、局在化(localize)および単離するための方法を提供することである
。本発明のさらなる目的は、インスリンおよび他のホルモンを産生する細胞を得
るために膵臓幹細胞を分化させる方法を提供することである。本発明の目的はま
た、哺乳動物の膵臓幹細胞または肝臓幹細胞を利用する哺乳動物への移植方法を
提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載する１つ以
上の態様により提供される。

【００１５】本発明の一態様では、真性糖尿病患者の治療方法が提供される。ドナーの膵島
からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離する。該幹細胞を患者に移入し、ここで該幹
細胞がインスリン産生細胞に分化する。別の態様では、糖尿病患者の別の治療方
法が提供される。ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離し、エキソビ
ボで拡張(expand)させて前駆細胞を作製する。該前駆細胞を患者に移入し、ここ
で該前駆細胞がインスリン産生β細胞に分化する。別の態様では、糖尿病患者の
さらに別の治療方法が提供される。ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を
単離し、拡張させて前駆細胞を作製する。培養において該前駆細胞を分化させて
偽島(pseudo-islet)様凝集塊を形成させ、それを患者に移入する。

【００１６】別の態様では、真性糖尿病患者の別の治療方法が提供される。ドナーの膵島か
らネスチン陽性膵臓幹細胞を単離し、エキソビボで培養して前駆細胞を作製する
、該前駆細胞を患者に移入し、ここで該前駆細胞はインスリン産生β細胞に分化
する。

【００１７】これらの態様では、患者はまた、該膵島組織のドナーとなり得、細胞の同系移
植片または分化した組織を提供する。

【００１８】好ましい態様では、患者を該膵島組織のドナーとしない。

【００１９】別の好ましい態様では、患者がヒトであり、ドナーが非ヒト哺乳動物である。

【００２０】別の好ましい態様では、移入ステップの前に患者を免疫抑制剤で処置しない。

【００２１】別の好ましい態様では、移入ステップの前に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グル
コース(high glucose)、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４
、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン(betacelluli
n)、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる群より選ばれる薬剤で
幹細胞をエキソビボで処理する。

【００２２】別の好ましい態様では、移入ステップを内視鏡下の逆行性注入(endoscopic re
trograde injection) により行なう。

【００２３】別の好ましい態様では、該真性糖尿病患者の治療方法は、該患者を免疫抑制剤
で処置するステップをさらに含む。

【００２４】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤が免疫応答を妨げる。

【００２５】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる。

【００２６】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる。

【００２７】別の好ましい態様では、免疫応答が移植片拒絶である。

【００２８】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよ
びＧＡＤ６５抗体からなる群より選ばれる。

【００２９】別の態様では、膵ランゲルハンス島から幹細胞を単離する方法が提供される。
ドナーから膵島を取り出し、該膵島の細胞を培養する。培養物からネスチン陽性
幹細胞クローンを選択する。任意に、非島細胞と結合するコンカナバリンＡをコ
ートした容器内で培養することにより、最初に島から非島細胞を除去(purge) す
る。

【００３０】好ましい態様では、該幹細胞を単離する方法は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グ
ルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１
、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−
βおよびその組合せからなる群より選ばれる薬剤での処理によりネスチン陽性ク
ローンを拡張させるさらなるステップをさらに含む。

【００３１】さらなる態様では、膵臓前駆細胞へのネスチン陽性膵臓幹細胞の分化を誘導す
る方法が提供される。本明細書において使用される「分化」とは、細胞が特定の
細胞型、例えば特殊化(specialized) 細胞型への変化を行なうプロセスをいう。
ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、Ｉ
ＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ベータセルリ
ン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる群より選ばれる薬剤で
該幹細胞を処理する。該幹細胞は、その後、膵臓前駆細胞に分化する。

【００３２】好ましい態様では、膵臓前駆細胞が、その後、偽島様凝集塊を形成する。

【００３３】本発明の一態様では、哺乳動物への移植方法が提供される。ドナーの膵島から
ネスチン陽性膵臓幹細胞を単離する。該幹細胞を哺乳動物に移入し、ここで該幹
細胞がインスリン産生細胞に分化する。

【００３４】別の態様では、哺乳動物への別の移植方法が提供される。ドナーの膵島からネ
スチン陽性膵臓幹細胞を単離してエキソビボで拡張させ、前駆細胞を作製する。
該前駆細胞を哺乳動物に移入し、ここで該前駆細胞がインスリン産生β細胞に分
化する。別の態様では、哺乳動物へのさらに別の移植方法が提供される。ドナー
の膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離して拡張させ、前駆細胞を作製する。
培養において該前駆細胞を分化させて偽島様凝集塊を形成させ、それを哺乳動物
に移入する。

【００３５】別の態様では、哺乳動物への別の移植方法が提供される。ドナーの膵島からネ
スチン陽性膵臓幹細胞を単離してエキソビボで培養して前駆細胞を作製する。該
前駆細胞を哺乳動物に移入し、ここで該前駆細胞がインスリン産生β細胞に分化
する。

【００３６】これらの態様では、哺乳動物はまた、該膵島組織のドナーとなり得、細胞の同
系移植片または分化した組織を提供する。

【００３７】好ましい態様では、哺乳動物を該膵島組織のドナーとしない。

【００３８】別の好ましい態様では、哺乳動物がヒトであり、ドナーが非ヒト哺乳動物であ
る。

【００３９】別の好ましい態様では、移入ステップの前に哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い。

【００４０】別の好ましい態様では、移入ステップの前に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グル
コース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、
ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β
およびその組合せからなる群より選ばれる薬剤で幹細胞をエキソビボで処理する
。

【００４１】別の好ましい態様では、移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう。

【００４２】別の好ましい態様では、該哺乳動物への移植方法は、該哺乳動物を免疫抑制剤
で処置するステップをさらに含む。

【００４３】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答を妨げる。

【００４４】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の発現を遅滞させる。

【００４５】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の強度を低下させる。

【００４６】別の好ましい態様では、免疫応答は移植片拒絶である。

【００４７】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよ
びＧＡＤ６５抗体からなる群より選ばれる。

【００４８】さらに別の態様では、単離されたネスチン陽性ヒト膵臓幹細胞が提供される。
本態様の変形例において、該幹細胞は、β細胞、α細胞、偽島様凝集塊または肝
細胞のいずれかに分化する。本態様の変形例において、該幹細胞は免疫寛容であ
る。本態様の変形例において、該幹細胞はＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない。本
態様の変形例において、該幹細胞はＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現しない。本態様
の変形例において、該幹細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原もＭＨＣクラスＩ抗原も発
現しない。

【００４９】さらに別の態様では、膵細胞を幹細胞であると同定する方法が提供される。細
胞を、標識されたネスチン特異的抗体と接触させる。該細胞が該抗体で標識され
れば、該細胞を幹細胞であると同定する。任意の追加のステップには、細胞を、
サイトケラチン１９に対する抗体およびＩＶ型コラーゲンに対する抗体と接触さ
せることが挙げられ、該細胞がサイトケラチン１９抗体またはＩＶ型コラーゲン
抗体のいずれかで標識されなければ、該細胞を幹細胞であると同定する。

【００５０】別の態様では、肝細胞に分化するようネスチン陽性膵臓幹細胞を誘導する方法
が提供される。肝細胞に、または肝細胞に分化する前駆細胞に分化するよう幹細
胞を誘導する薬剤の有効量で、ネスチン陽性膵臓幹細胞を処理する。好ましい態
様では、該薬剤はシクロパミン(cyclopamine) である。

【００５１】さらに別の態様では、肝臓疾患患者の治療方法が提供される。ドナーの膵島か
らネスチン陽性膵臓幹細胞を単離して患者に移入し、ここで該幹細胞が肝細胞に
分化する。

【００５２】関連する態様では、該幹細胞を前駆細胞にエキソビボで拡張し、これは、患者
に移入すると、さらに肝細胞に分化する。

【００５３】別の関連する態様では、該幹細胞をエキソビボで分化させて前駆細胞を作製し
、これは、患者に移入すると、さらに肝細胞に分化する。別の関連する態様では
、該幹細胞を肝細胞にエキソビボで分化させ、これを患者に移植する。

【００５４】これらの態様では、患者はまた、該膵島組織のドナーとなり得、細胞の同系移
植片または分化した組織を提供する。

【００５５】好ましい態様では、患者を該膵島組織のドナーとしない。

【００５６】別の好ましい態様では、患者はヒトであり、ドナーは非ヒト哺乳動物である。

【００５７】別の好ましい態様では、移入ステップの前に患者を免疫抑制剤で処置しない。

【００５８】別の好ましい態様では、該肝臓疾患患者の治療方法は、該患者を免疫抑制剤で
処置することをさらに含む。

【００５９】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答を妨げる。

【００６０】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の発現を遅滞させる。

【００６１】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の強度を低下させる。

【００６２】別の好ましい態様では、免疫応答は移植片拒絶である。

【００６３】さらに別の態様では、哺乳動物への移植方法が提供される。ドナーの膵島から
ネスチン陽性膵臓幹細胞を単離して哺乳動物に移入し、ここで該幹細胞が肝細胞
に分化する。関連する態様では、該幹細胞を前駆細胞にエキソビボで拡張し、こ
れは、哺乳動物に移入すると、さらに肝細胞に分化する。

【００６４】別の関連する態様では、該幹細胞をエキソビボで分化させて前駆細胞を作製し
、これは、哺乳動物に移入すると、さらに肝細胞に分化する。別の関連する態様
では、該幹細胞を肝細胞にエキソビボで分化させ、これを哺乳動物に移植する。

【００６５】これらの態様では、哺乳動物はまた、該膵島組織のドナーとなり得、細胞の同
系移植片または分化した組織を提供する。

【００６６】好ましい態様では、哺乳動物を該膵島組織のドナーとしない。

【００６７】別の好ましい態様では、哺乳動物はヒトであり、ドナーは非ヒト哺乳動物であ
る。

【００６８】別の好ましい態様では、移入ステップの前に哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い。

【００６９】別の好ましい態様では、該哺乳動物への移植方法は、該哺乳動物を免疫抑制剤
で処置するステップをさらに含む。

【００７０】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答を妨げる。

【００７１】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の発現を遅滞させる。

【００７２】別の好ましい態様では、該免疫抑制剤は免疫応答の強度を低下させる。

【００７３】別の好ましい態様では、免疫応答は移植片拒絶である。

【００７４】さらに別の態様では、単離されたネスチン陽性ヒト肝臓幹細胞が提供される。
本態様の変形例において、該幹細胞は免疫寛容である。本態様の変形例において
、該幹細胞はＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない。本態様の変形例において、該幹
細胞はＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現しない。本態様の変形例において、該幹細胞
は、ＭＨＣクラスＩ抗原もＭＨＣクラスＩ抗原も発現しない。

【００７５】さらに別の態様では、対宿主性移植片拒絶を引き起こすことなく動物に移植が
可能な、神経幹細胞でない、単離されたネスチン陽性のヒト幹細胞が提供される
。本態様の変形例において、該幹細胞は、主要組織適合性複合体のクラスＩ分子
拘束性でもクラスＩＩ分子拘束性でもない。

【００７６】本明細書中で使用される「幹細胞」は、インビボまたはエキソビボのいずれか
で本質的に無制限に増殖し得、他の細胞型に分化しうる未分化の細胞である。こ
れは、単離された組織中に存在する所定の分化し、約束づけられた（committed
）、未成熟の、前駆体、または成熟細胞型、または共通の前駆細胞に由来する劇
的に分化した細胞型、例えば、赤血球およびリンパ球、または幹細胞が得られる
組織とは全く異なる組織の任意の段階の細胞型になりうる。幹細胞が多能性であ
り、それらの環境に由来する適切なシグナルが与えられると、それらは身体の任
意の組織に分化しうるように、例えば、血液幹細胞は脳細胞または肝細胞になり
得、神経幹細胞は血液細胞になり得る。

【００７７】１つの態様では、本発明の「幹細胞」は、免疫学的に隠されている（blinded
）かまたは免疫寛容（immunoprivileged）である。本明細書中で使用される「免
疫学的に隠された」または「免疫寛容」は、免疫応答を誘発しない細胞をいう。
本明細書中で使用される「免疫応答」は、外来物質に対して、免疫系により行わ
れる応答をいう。本明細書中で使用される場合、免疫応答は、移植片または移植
片拒絶、抗体産生、炎症、および抗原に対する抗原特異的リンパ球の応答を含む
が、これらに限定されない。免疫応答は、例えば、移植される物質が、当該分野
で周知であり、本明細書中の標題「移植片拒絶の解析」のセクションに規定され
る方法により首尾良く移植されるか、または拒絶されるかを決定することにより
検出される。１つの態様では、本発明の「免疫学的に隠された幹細胞」または「
免疫寛容である幹細胞」は、移植片拒絶を伴うことなく同種異系移植または異種
移植され得、移植片レシピエントまたは宿主において自己として認識されうる。

【００７８】移植（transplant）または移植（graft ）される物質は、宿主が移植された物
質に対して免疫耐性でなければ、または免疫抑制剤が拒絶を防ぐために使用され
なければ、移植片レシピエントまたは宿主の免疫系により拒絶されうる。

【００７９】本明細書中で使用される「免疫耐性（immunotolerant）」である宿主は、本発
明によって、本明細書中に規定されるような免疫応答を惹起しない。１つの態様
では、「免疫寛容」である宿主は、移植された物質を拒絶も破壊もしない。１つ
の態様では、「免疫寛容」である宿主は、抗原に結合しうる抗体を産生すること
により抗原に応答しない。

【００８０】本明細書中で使用される「拒絶」は、宿主の免疫系による、移植された物質の
拒絶をいう。１つの態様では、「拒絶」は、宿主の免疫応答に応答した、移植さ
れた物質の９０％より多くの細胞または組織の壊死の発生を意味する。別の態様
では、「拒絶」は、移植された物質の生存度が、宿主の免疫応答に応答して、移
植前の移植される物質の生存度と比べて９０％以上減少するような生存度におけ
る減少を意味する。生存度における減少は、トリパンブルー排除染色を含むがこ
れに限定されない当該分野で周知の方法により測定されうる。別の態様では、「
拒絶」は、移植された物質が増殖できないことを意味する。増殖は、ヘマトキシ
リン／エオシン染色を含むがこれに限定されない当該分野で公知の方法により測
定されうる。移植片拒絶の発生および／または移植後に拒絶が生じる速度は、移
植される物質（すなわち、細胞型、または細胞数）または宿主（すなわち、宿主
が免疫寛容であるか否かおよび／または免疫抑制剤で処置されたかどうか）を含
むがこれらに限定されない因子に応じて変化する。本明細書中で使用される「対
宿主性移植片拒絶」または「対宿主性移植片応答」は、移植された物質のＴ細胞
が宿主の抗原と反応する細胞媒介反応をいう。

【００８１】本明細書中に使用される「対宿主性移植片拒絶」または「対宿主性移植片応答
」は、宿主免疫系の細胞が外来の移植（graft ）または移植（transplant）され
た物質を攻撃する細胞媒介反応をいう。

【００８２】本発明の別の態様では、特定の抗体（例えば、移植された物質上の抗原に特異
的に結合する抗体、または外来物質もしくは外来物質の産物に特異的に結合する
抗体）の産生が、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、免疫沈降およびウエスタンブロット分
析を含むがこれらに限定されない当該分野で周知の免疫学的方法により検出され
る場合、免疫応答が生じている。

【００８３】幹細胞は、細胞表面上に形態形成ホルモンまたは成長ホルモンのレセプターを
発現し、例えば損傷関連因子を感作し、次いで組織損傷の部位に局在し、定住す
るか、またはそれらの局在した微小環境を感作し、適切な細胞型に分化しうる。

【００８４】「本質的に無制限な増殖」は、細胞培養系における、例えば、少なくとも５０
、好ましくは１００、および２００までまたはそれ以上の細胞分裂により増殖さ
れる、単離された幹細胞の能力により決定されうる。幹細胞は、「全能性」であ
り得、生殖細胞に関しては生物の全ての細胞を生じうることを意味する。幹細胞
はまた、「多能性」であり得、生物の細胞の全てではないが多数の異なる細胞型
を生じ得ることを意味する。幹細胞が分化する場合、それは一般により成体の細
胞型を生じ、これは前駆細胞、分化した細胞、または末端まで分化した細胞のよ
うな部分的に分化された細胞であり得る。幹細胞は高度に運動性でありうる。

【００８５】「ネスチン」は、Genbank アクセス番号X65964に開示された配列を有する中間
フィラメントタンパク質をいう（図７）。

【００８６】「膵臓」の幹細胞は、膵臓組織から単離された幹細胞および／またはネスチン
陽性染色、ネスチン遺伝子発現、サイトケラチン−１９陰性染色、培養における
長期間の増殖、および培養における偽島（pseudo-islet）に分化する能力の全て
の特徴を有する細胞を意味する。

【００８７】「肝臓」の幹細胞は、肝臓組織から単離された幹細胞および／またはネスチン
陽性染色、ネスチン遺伝子発現、および培養における長期間の増殖の全ての特徴
を有する細胞を意味する。

【００８８】「前駆細胞」は、分化により幹細胞に由来する細胞であり、より成熟した細胞
型にさらに分化しうる。

【００８９】本明細書中で使用される用語「インスリン生産ベータ細胞」は、ヒト膵臓のラ
ンゲルハンス島のベータ細胞により産生および分泌されるのと同様の量でインス
リンを産生および分泌しうる任意の細胞をいう。好ましくは、インスリン産生ベ
ータ細胞によるインスリンの分泌はまた、インサイチュでヒトベータ細胞による
インスリン分泌の調節に類似した様式で調節される；例えば、インスリン分泌は
インスリン産生ベータ細胞を取り囲む溶液のグルコース濃度における増大により
刺激されるはずである。

【００９０】「偽島様」凝集体は、膵臓のランゲルハンス島の形態および機能において似て
いるインスリン分泌細胞の人工的な凝集体である。偽島様凝集体は、細胞培養条
件下でエキソビボで創出される。それらは、約５０〜１５０μｍの直径（イン
サイチュ島の１００μｍの平均直径と比較して）および球状の形態である。

【００９１】幹細胞を「単離する」は、組織サンプルから幹細胞を取り出し、組織の幹細胞
ではない他の細胞を取り除くプロセスをいう。単離された幹細胞は、一般に、他
の細胞型の混入を含まず、一般に、それが単離された組織の成熟細胞を生産する
ための増殖および分化の能力を有する。しかし、幹細胞の収集物、例えば、幹細
胞の培養物を扱う場合、１００％純粋である幹細胞の収集物を得ることは実際に
は不可能であることが理解される。それゆえ、単離された幹細胞は、他の、分化
した細胞型の分析または生産のための幹細胞の利用を妨げない他の細胞型の小画
分の存在において存在しうる。単離された細胞は、一般に、少なくとも３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、
または９９％純粋である。好ましくは、本発明の単離された幹細胞は、少なくと
も９８％または少なくとも９９％純粋である。

【００９２】幹細胞は、培養において増殖する場合「拡張」し、細胞分裂により他の幹細胞
および／または前駆細胞を生じる。幹細胞の拡張は、幹細胞が培養物中で増殖す
る場合、自発的に生じるか、または最小細胞密度、培養管表面における細胞コン
フルエンスなどの所定の増殖条件、または増殖因子、分化因子、もしくはシグナ
ル伝達因子などの化学因子の添加を必要とし得る。

【００９３】幹細胞、前駆細胞、または分化細胞は、培養容器から患者に移される場合、哺
乳動物に「移植」され、または「導入」される。本明細書中で使用される場合、
移植は、本発明の幹細胞を単離する工程および幹細胞を哺乳動物または患者に移
入する工程を含みうる。移植は、哺乳動物または患者への細胞懸濁物の注射、哺
乳動物または患者の組織または器官への細胞集団の外科的移植、または細胞懸濁
物での組織または器官の灌流により哺乳動物または患者に幹細胞を移入する工程
を含みうる。幹細胞を移入する経路または移植の経路は、特定の組織または器官
に定住する細胞の必要性により、ならびに見つけるおよび所望の標的組織または
器官により保持される細胞の能力により決定される。移植される細胞を特定の場
所に定住させる場合、それは外科的に組織または器官に配置されるか、または細
胞が所望の標的器官に移動する能力を有するならば、血流に単純に注射されうる
。

【００９４】本明細書中で使用される場合、移植は、本発明の幹細胞を単離する工程、なら
びに幹細胞を培養し、哺乳動物または患者に移入する工程を含みうる。本明細書
中で使用される場合、移植は、本発明の幹細胞を単離する工程、幹細胞を分化さ
せる工程、および幹細胞を哺乳動物または患者に移入する工程を含みうる。本明
細書中で使用される場合、移植は、本発明の幹細胞を単離する工程、幹細胞を分
化させ、拡張する工程、および幹細胞を哺乳動物または患者に移入する工程を含
みうる。

【００９５】本明細書中で使用される「移植片（transplant graft）」は、少なくとも１０ ⁵ 個の本発明の幹細胞、および１０⁸または１０⁹個までの幹細胞をいう。

【００９６】免疫抑制剤での治療は、所望の免疫応答、例えば、移植される細胞、組織また
は器官の拒絶などの発生を妨げるかもしくは遅らせるか、または強度を減少させ
る任意の薬剤を必要とする患者に投与することにより達成されうる。

【００９７】本明細書中で使用される「免疫抑制」は、本明細書中で規定されるような「
免疫応答」が検出できないような免疫応答の防止（例えば、本明細書中で規定さ
れるような「免疫抑制剤」の投与による）をいう。本明細書中で使用される、免
疫応答の「防止」は、免疫応答が検出できないことを意味する。免疫応答（例え
ば、移植片拒絶または抗体産生）は、当該分野で周知であり、本明細書中に規定
される方法により測定される。

【００９８】本発明による「免疫抑制」はまた、免疫抑制剤を与えられていない移植レシピ
エント、または本明細書に規定されるような「免疫学的に隠されて」もなく、「
免疫寛容」でもない物質を移植された移植レシピエントのいずれかと比べて、免
疫応答の発現を遅滞（delay ）させることを意味する。免疫応答の発現における
遅滞は、例えば、１時間〜１０日間、すなわち、１時間、２、５または１０日の
短い遅滞でありうる。免疫応答の発生における遅れはまた、例えば、１０日〜１
０年（すなわち、３０日、６０日、９０日、１８０日、１、２、５または１０年
）の長い遅滞でありうる。

【００９９】本発明による「免疫抑制」はまた、免疫応答の強度における減少を意味する。
本発明により、免疫応答の強度は、免疫抑制剤を与えられていない移植レシピエ
ントまたは本明細書中に規定される「免疫学的に隠されて」もなく、「免疫寛容
」でもない物質を移植された移植レシピエントのいずれかの免疫応答の強度の５
〜１００％、好ましくは２５〜１００％および最も好ましくは７５〜１００％未
満であるように減少されうる。免疫応答の強度は、移植される物質が拒絶される
時間点を決定することにより測定されうる。例えば、移植後１日目の移植された
物質の拒絶を含む免疫応答は、移植後３０日目の移植された物質の拒絶を含む免
疫応答よりも高い強度である。免疫応答の強度はまた、移植された物質に結合し
うる特定の抗体の量を定量することにより測定され得、ここで、抗体産生レベル
は、免疫応答の強度と直接相関する。あるいは、免疫応答の強度は、移植された
物質に結合しうる特定の抗体が検出される時間点を決定することにより測定され
うる。

【０１００】種々のストラテジーおよび薬剤が免疫抑制のために利用されうる。例えば、リ
ンパ球の増殖および活性は、例えば、ＦＫ−５０６、もしくはシクロスポリンま
たは他の免疫抑制剤などの薬剤で一般に阻害されうる。他の可能なストラテジー
は、抗ＧＡＤ６５モノクローナル抗体のような抗体、または移植された細胞上の
表面抗原をマスクし、それゆえ、細胞を宿主の免疫系に事実上見えなくする他の
化合物を投与することである。

【０１０１】「免疫抑制剤」は、宿主、特に移植された細胞において外来の細胞に対して免
疫反応を妨げるか、その発現を遅滞させるかまたはその強度を低下させる任意の
薬剤である。免疫系により非自己として同定される細胞に対して細胞媒介免疫応
答を抑制する免疫抑制剤が好ましい。免疫抑制剤の例としては、シクロスポリン
、シクロホスファミド、プレドニゾン、デキサメタゾン、メトトレキセート、ア
ザチオプリン、ミコフェノレート、サリドマイド、ＦＫ−５０６、全身性ステロ
イド、ならびに広範な抗体、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニスト
、および当業者に公知である他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【０１０２】「マイトジェン」は、薬剤が適用される細胞の有糸分裂および細胞増殖を刺激
する薬剤である。

【０１０３】「分化因子」は、幹細胞または前駆細胞を他の細胞型に分化させる任意の薬剤
である。分化は、通常、幹細胞または前駆細胞の１つまたはそれ以上の遺伝子の
発現を変化させることにより達成され、その構造および機能が変化した細胞を生
じる。

【０１０４】本明細書中で使用される「シグナル伝達因子」は、同一または異なる細胞にお
いて効果を有する細胞により分泌される薬剤である。例えば、シグナル伝達因子
は、それ自身、隣接する細胞、または生物において遠位にある細胞の成長、増殖
、または分化を阻害または誘導しうる。シグナル伝達因子は、例えば、組織にお
ける位置情報を伝達し、組織、パターン形成を媒介し、または種々の解剖学的構
造のサイズ、形状および機能に影響しうる。

【０１０５】本明細書中で使用される場合、哺乳動物は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、
サル、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ウマ、ウシまたはブタが挙げられるが、これ
らに限定されない。

【０１０６】本明細書中で使用される「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトではない任意の哺乳動
物をいう。

【０１０７】本明細書中で使用される「同種異系（allogeneic）」とは、同じ種の遺伝子学
的に異なるメンバーをいう。

【０１０８】本明細書中で使用される「同系（isogeneic ）」とは、同一の遺伝子構成をい
う。

【０１０９】本明細書中で使用される「異種（xenogeneic）」とは、異なる種のメンバーを
いう。

【０１１０】本明細書中で使用される「培養」とは、細胞の生存度または増殖を支持する環
境および条件下で一定期間インキュベートすることにより、細胞、細胞の収集物
、組織、または器官を増殖または養育することをいう。培養は、本発明の細胞、
細胞の収集物、組織、または器官を拡張および増殖する１つ以上の工程を含みう
る。

【０１１１】本発明はまた、生理学的に適合するキャリアーと混合した本発明の単離された
幹細胞を含む医薬組成物を提供する。

【０１１２】発明の詳細な説明本発明者らは、幹細胞の機能的特徴および分子特徴を有する哺乳動物の膵臓の
ランゲルハンス島に由来する管細胞の特殊なサブクラスを同定し、単離した。詳
細には、これらの新規に発見された膵臓の幹細胞は、ネスチン陽性染色、ネスチ
ン遺伝子発現、サイトケラチン−１９陰性染色、培養における長期間の増殖、お
よび培養において偽島に分化する能力のとりわけ１つまたはそれ以上（および好
ましくは全て）により特徴づけられる。本発明者らはまた、ネスチン陽性染色を
示す幹細胞を同定した。

【０１１３】１つの態様では、本発明は、Ｉ型インスリン依存性糖尿病および他の型の糖尿
病ならびに種々の糖尿病状態、ホルモン異常、および遺伝子疾患または状態、例
えば、特定の生理的状態または病理的状態との多型の関連性などの発症および進
行を研究するための研究ツールの開発を含むがこれらに限定されない、種々の適
用のための幹細胞を提供する。本発明の幹細胞はまた、同系移植、同種異系移植
または異種移植で内分泌膵臓または他の組織の遺伝子治療を行うために使用され
うる。さらに、本明細書中に記載される幹細胞は、培養において、組換え細胞、
人工組織、および置換器官を産生するのに使用され得る。それらはまた、インス
リンおよび他のホルモンのエキソビボ産生に使用されうる。本発明者らにより発
見された膵臓の幹細胞の分子特徴、例えば、ネスチン陽性およびサイトケラチン
−１９陰性染色または肝臓の幹細胞、例えば、ネスチン陽性染色は、患者または
実験動物から組織中の幹細胞を同定、局在化、および定量化するための種々の診
断、病理学的、または研究手順において使用され得る。

【０１１４】膵島中の幹細胞の同定以前の研究者らは、島内分泌細胞の新生のための幹細胞の可能な供給源として
膵島または外分泌組織の管上皮細胞に焦点を当てていた。ネスチンは、Ｒ．４０
１と称されたモノクローナル抗体を用いてＥ１５ラット胚由来のｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることによりクローニングされた中間フィラメントタ
ンパク質である（Hockfield & McKay, 1985; Lendahlら、1990）。ネスチンは、
神経上皮幹細胞において主として見られ、発達中の中枢神経系において発現され
る。Ｅ１６のラット胚で最大レベルが達成された後に、ネスチン発現は、成体大
脳皮質でほとんど検出できないレベルまで減少し、これは、初期のネスチン発現
前駆細胞の末端の分化と一致する（Lendahl ら、1990）。ネスチンは、最初、胚
の発達中の脳および骨格筋の幹細胞で独占的に見出された（Lendahl ら、1990）
。より後期の研究により、成体哺乳動物の前脳の上衣下層においてネスチン陽性
神経幹細胞が同定された（Morsheadら、1994）。ネスチン陽性幹細胞は、成体の
マウスまたはラットの脳から単離された場合でさえ、多能性であることが示され
た。例えば、ネスチン陽性幹細胞は、培養において神経細胞の３つの主要なクラ
ス：ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞の全てを生じうる（Reynolds＆
Weiss, 1996）。ネスチン陽性神経幹細胞は、星状細胞に分化し、瘢痕形成に参
加し（Johansson ら、1999）、放射線照射されたマウスへの注入の後に、骨髄の
造血細胞を保存する遊走細胞の増殖および変性による脊髄損傷に応答する（Bjor
nsonら、1999）。

【０１１５】幹細胞の特徴付け本発明の幹細胞は、例えば、ＦＡＣＳ、免疫細胞学染色、ＲＴ−ＰＣＲ、サザ
ン、ノザンおよびウェスタンブロット解析、および当業者に公知である細胞同定
の技術により、ネスチンの発現により同定されうる。

【０１１６】免疫細胞学染色は、例えば、以下の方法により行われる。膵臓または肝臓、な
らびに細胞から調製された凍結切片（６μＭ）は、ホスフェート中の４％パラホ
ルムアミドで固定化される。細胞は、最初に、３％の通常のロバ（donkey）血清
で室温で３０分間ブロックされ、４℃で一晩目的のタンパク質に対する一次抗血
清とともにインキュベートされる。抗血清は、ＰＢＳでリンスされ、適切に蛍光
標識された二次抗血清とともに室温で１時間インキュベートされる。次いで、ス
ライドは、ＰＢＳで洗浄され、蛍光マウント媒体（fluorescent mounting mediu
m ）でカバーガラスがかけられる（KirkegaardおよびPerry Labs, Gaithersburg
, MD）。蛍光イメージは、IP Lab Spectrum 分析ソフトウェア（Signal Analyti
cs Corp, Vienna, VA ）がインストールされたPowerMac 7100 と接続したOptron
ics TEC-470 CCD カメラを備えたZeiss Epifluorescence 顕微鏡（Optronics En
gineering, Goleta, CA ）を用いて得られる。

【０１１７】本発明の有用な抗血清としては、ヒトサイトケラチン１９に対するマウスモノ
クローナル抗体（クローンK4.62 、Sigma,St.Louis,MO ）、ラットネスチンおよ
びＩＤＸ−１に対するウサギポリクローナル抗血清（それぞれ、精製したＧＳＴ
−ネスチン融合タンパク質またはラットＩＤＸ−１の最後の１２個のアミノ酸で
ウサギの免疫化により調製した）（McManus ら、1999,J.Neurosci.,19:9004-901
5 ）、Linco,St.Charles,MO から得られたモルモット抗インスリンおよび抗膵臓
ポリペプチド抗血清、およびSigma （St.Louis,MO ）およびDAKO（Carpinteria,
CA ）、それぞれから購入したマウス抗グルカゴンおよびウサギ抗ソマトスタチ
ン抗血清、マウス抗ヒトガラニン（Peninsula Laboratories, Belmont,CA）、コ
ラーゲンＩＶ抗血清（Caltag Laboratories, San Francisco,CA ）、マウス抗ラ
ットＭＨＣクラスＩ血清（Seroteck）、および抗ラットＭＨＣクラスＩＩ血清が
挙げられる。本発明は、かかるマーカーに対する他の抗血清が入手可能であるか
、または開発されることを意図する。かかる他の抗血清は、本発明の範囲内にあ
ると考えられる。

【０１１８】ＲＴ−ＰＣＴおよびサザンブロット分析は、以下の方法により行われる。ラッ
トまたはヒトの島から調製された全細胞ＲＮＡは、以前に記載されたように（Da
nielら、1998, Endocrinology, 139:3721-3729）、逆転写され、所望の程度の増
幅に応じて約３５サイクルＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲのためのプライマー
またはアンプリマーおよび引き続くサザンブロットハイブリダイゼーションのた
めのプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは以下の通りである：

【０１１９】他のかかる配列も可能であり、かかる配列は当該分野の範囲内にあると考えら
れる。一般的なガイドとして、プライマーは２つの異なるエキソンから選択され
、少なくとも１つのイントロン配列を含む。さらに、ＲＴマイナス制御を大部分
のサンプルについて実行する。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分、続いて９４℃で１
０秒、５８／５６℃で１０秒、７２℃で１分、３５サイクル、および７２℃で２
分で首尾良く行われる。アニーリング温度は、ラットネスチンについては５８℃
であり、残りのプライマーペアについては５６℃である。

【０１２０】ラットでもヒトでもない哺乳動物から単離されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにつ
いては、解析される哺乳動物種から増幅された核酸に特異的であるオリゴヌクレ
オチドが調製される。かかるプライマーの選択および使用は、当業者に公知であ
る。

【０１２１】サザンハイブリダイゼーションについて、オリゴヌクレオチドプローブは、従
来技術を用いてγ³²ＰＡＴＰなどの適切な放射性核種で標識される。放射標識し
たプローブは、ナイロン膜に移されたＰＣＲ産物と３７℃で１時間ハイブリダイ
ズされ、次いで１ｘＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳで５５℃にて１０〜２０分間、また
はヒトＰＣＲ産物については０．５ｘＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳで４２℃にて洗浄
する。

【０１２２】膵臓幹細胞のマーカーとしてのネスチン本発明者らは、いまやヒトを含む成体哺乳動物の膵臓が、ネスチンを発現する
細胞を含むことを意外なことに発見した。重要なことに、膵臓におけるネスチン
陽性細胞の分布は、ホルモン産生細胞の分布に一致しない。例えば、蛍光標識さ
れた抗体は、島のインスリンまたはグルカゴン標識ベータおよびアルファ細胞、
それぞれと特異的に反応性であるが、本発明者らは、マウス、ラット、およびヒ
トにおいて、蛍光標識ネスチン抗体が小管上皮の特定の細胞にのみ局在化し、膵
臓の島のアルファ、ベータ、デルタ、および膵臓のペプチド産生細胞に局在化し
ないことを観察した（図１）。本発明者らはまた、コラーゲンＩＶに特異的な抗
体、血管内皮細胞のマーカー、ガラニン、神経終末のマーカー、およびサイトケ
ラチン１９、管細胞のマーカーは、ネスチン抗体と共存しないことを確認した。
さらに、本発明者らは、ネスチン陽性島細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマ
トスタチン、または膵臓のポリペプチドに対する抗体で共標識しないことを見出
した（図１）。これは、これらのネスチン含有細胞が内分泌細胞、管細胞、神経
細胞、または血管内皮細胞ではなく、以前には記載されなかった島内の真に独特
な細胞型を示しうることを示唆する。本発明者らは、島において、ならびに膵臓
管の局在化した領域、および外分泌膵臓の房心領域内でネスチン陽性細胞を見出
した。

【０１２３】単離された島におけるネスチンｍＲＮＡの発現を、単離されたラット島由来の
ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを用いて検出した（図２）。ネスチン陽性膵臓細胞
の機能的特性を、両方とも下記に記載されている、細胞培養技術を用いて、およ
び島からのネスチン陽性細胞の単離により調査した。

【０１２４】本発明者らはまた、ラットの肝臓がネスチンを発現する細胞を含むことを発見
した（図１３）。

【０１２５】管上皮細胞の独特な集団のマーカーとしてのサイトケラチン−１９サイトケラチン−１９（ＣＫ−１９）は、別の中間フィラメントタンパク質で
ある。ＣＫ−１９および関連するサイトケラチンは、膵臓管細胞において発現さ
れることが以前に見出された（Bouwens ら、1994）。しかし、本発明者らは、Ｃ
Ｋ−１９発現が実際には小管に限定され、一方、ＣＫ−１９に特異的な蛍光抗体
はネスチン特異的抗体で標識されたものとは異なる管細胞を標識することを考察
した。これは、島におけるネスチン陽性細胞が、ＣＫ−１９陽性細胞とは異なる
細胞型の管細胞であり得ることを示唆する。

【０１２６】膵島から単離された幹細胞およびそれらの使用幹細胞は、膵臓の組織の調製物、例えば、糖尿病患者に由来する組織のバイオ
プシーサンプルから得られた島から単離されうる。次いで、幹細胞は、エキソビ
ボで拡張され、得られた細胞は同系移植片としてドナーに戻し移植されうる。ド
ナー内で、それらは分化し、ベータ細胞などのインスリン分泌細胞を提供し、糖
尿病を引き起こした自己免疫攻撃により失われたベータ細胞にとって替わる。こ
のアプローチは、組織、例えば、ドナーとして貢献し得る他の個体に由来する島
の移植から生じる免疫拒絶の問題を克服しうる。本発明の１つの態様では、同系
移植された幹細胞の使用は、免疫拒絶を避ける試みにおいて行われる別の技術、
すなわち、それらをＩ型糖尿病を有する個体に存在する自己免疫などの免疫攻撃
に対して耐性にする、移植された細胞の遺伝子治療を可能にする。全島にわたる
幹細胞を使用することのさらなる利点は、移植された幹細胞が、インサイチュで
分化し、宿主環境に良好に適合し、例えば、適切な微小循環および宿主の生理学
的要求に応答する異なる島細胞型の補体を提供しうる。本発明の別の態様は、例
えば、前駆細胞（これは引き続いて宿主に移植され、さらに宿主内で任意に分化
が起こる）を形成するための、エキソビボで部分的に分化した幹細胞の使用を意
図する。幹細胞、前駆細胞、または偽島の同系移植片の使用が好ましいが、別の
態様は、別の個体または別の種の哺乳動物から得られた幹細胞、前駆細胞、また
は偽島の同種異系の移植片の使用を意図する。

【０１２７】本発明のさらに別の態様では、幹細胞は、免疫学的に隠されているかまたは免
疫寛容である。本発明のこの局面の態様では、免疫寛容な幹細胞は、宿主からの
免疫応答を惹起するのに充分な量のクラスＩおよび／またはクラスＩＩ主要組織
適合性抗原（ａ．ｋ．ａ．ＨＬＡまたはヒト白血球抗原）を発現しない。例えば
、同種異系または異種の供給源から得られたこれらの幹細胞は、免疫応答性移植
片レシピエントにおいて宿主対移植片応答を開始しない。

【０１２８】本発明のこの局面の別の態様では、免疫免除された幹細胞は、クラスＩＭＨＣ
抗原および／またはクラスＩＩＭＨＣ抗原を発現しない。同種異系および異種の
供給源から得られたこれらの幹細胞は、免疫応答性移植片レシピエントにおいて
宿主対移植片応答を開始しない。

【０１２９】本発明の別の態様では、幹細胞を含むヒト組織移植片は、ヒト特異的クラスＩ
およびクラスＩＩＭＨＣ抗原の両方を発現するが、免疫応答性マウスにより自己
として認識され、宿主対移植片拒絶を受けない。同種異系または異種の供給源か
ら得られたこれらの幹細胞は、免疫応答性移植片レシピエントにおいて宿主対移
植片応答を開始しない。

【０１３０】本発明はまた、異種ドナーから幹細胞を単離し、および得られた細胞を別の種
の哺乳動物（例えば、マウス幹細胞をヒト、例えば、糖尿病のヒト患者に移植す
る）に異種移植片として移植する方法を提供する。

【０１３１】本発明は、ネスチン陽性幹細胞の同系、同種異系、または異種の移植を行う方
法を提供し、ここで幹細胞は、移植の前に一定期間、例えば、２〜４時間、４〜
５時間、５〜１０時間または１〜３日培養される。

【０１３２】本発明はまた、ネスチン陽性幹細胞の同系、同種異系または異種の移植を行う
方法を提供し、ここで、幹細胞は、細胞分裂により他の幹細胞または前駆細胞が
生じるように移植の前に一定期間、例えば、２〜４時間、４〜５時間、５〜１０
時間または１〜３日間拡張される。

【０１３３】本発明はまた、幹細胞の同系、同種異系または異種の移植を行う方法を提供し
、ここで、ネスチン陽性幹細胞は、移植の前に一定期間、例えば、２〜４時間、
４〜５時間、５〜１０時間または１〜３日間、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコ
ース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、
ＧＬＰ−１、エキセンジン（exendin ）−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、
ＴＧＦ−βおよびその組み合わせからなる群より選択された薬剤での処理により
前駆細胞に分化するよう誘導される。膵臓幹細胞の場合には、幹細胞は引き続い
て膵臓前駆細胞に分化する。

【０１３４】本発明は、同系、同種異系または異種の移植を行う方法を提供し、ここで、ネ
スチン陽性幹細胞は、移植の前に培養、拡張、または分化されないか、またはこ
こで、ネスチン陽性幹細胞は、移植の前に、培養および／または拡張および／ま
たは分化される。

【０１３５】単離された膵島に由来するネスチン陽性細胞は、培養において増殖され、引き
続いて単離されて、本質的に無制限に増殖しうる幹細胞株を形成しうる。

【０１３６】本発明者らは、ネスチン発現細胞が培養された島から生じ、培養約４日目ほど
の初期に島の周囲に増殖が観察されうることを発見した。これらの細胞は、ニュ
ーロン様形態を有し（図３）、ネスチン陽性染色を示し、ネスチンｍＲＮＡを発
現する。ネスチン陽性細胞を含む島は、コンカナバリンＡに島の懸濁物を曝露す
ることにより培養された島から増殖する他の細胞、例えば、線維芽細胞から分離
され得る。ネスチン陽性幹細胞を含む島は、コンカナバリンＡを被覆した培養容
器に付着せず、例えば、他の細胞型を容器に付着したまま島を簡単にデカントす
ることができる。次いで、島は、コンカナバリンＡ被覆を有さないウェルにプレ
ーティングされ、ここでそれらは付着する。ラット細胞に関する培養の詳細およ
び単離手順の詳細は、下記の実施例１に記載する。類似した結果がヒト細胞で得
られた。

【０１３７】培養における偽島および管構造の形成本発明の１つの態様は、ホルモン治療なしに生理学的制御を維持するには不充
分な島細胞集団が患者に移植されうる偽島様凝集体を形成させることにより幹細
胞または前駆細胞の移植に代わるものを提供する。島由来幹細胞は、上記に示す
ような培養島から調製され、幹細胞株を増殖させることから得られうる。次いで
、幹細胞は、種々の成長因子に曝されることにより分化するよう誘導されうる。
このプロセスは、実施例２および３に説明される。

【０１３８】島細胞への幹細胞または前駆細胞の分化膵臓の幹細胞の分化を誘導し得る成長因子としては、ＥＧＦ−２、塩基性ＦＧ
Ｆ，高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ベ
ータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β、およびその組み合わせが挙げられる
がこれらに限定されない。ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド−１を意味する
。高グルコースは、幹細胞培養で通常使用される濃度よりも高いグルコース濃度
を意味する。例えば、幹細胞は、約５．６ｍＭグルコースで通常培養され、増殖
させられ得、高グルコース濃度は５．６ｍＭより高い別の濃度をいう。好ましい
態様では、１６．７ｍＭの濃度が意図される。実施例２では、１つの考えられう
る成長因子療法は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および上皮成長因子
（ＥＧＦ）を用いて記載されている。

【０１３９】培養細胞の培地に添加した成長因子に加えて、幹細胞が動物またはヒトに移植
される場合には、さらなる成長因子が分化に貢献しうる。この状況では、既知で
あるか未知である多くの成長因子が、内因性細胞により分泌され、インサイチュ
で幹細胞に曝され得る。移植された幹細胞は、所望の結果、すなわち、形成され
る最終的に分化した細胞型（単数または複数）および解剖学的構造（例えば、
組織または器官）と適合する内因性および外因的に投与された成長因子の任意の
組み合わせにより分化するよう誘導されうる。

【０１４０】１つの態様は、分化を刺激するため、すなわち、成長因子の下流のエフェクタ
ーを投与するため、またはかかるエフェクターをコードする核酸分子で幹細胞ま
たは前駆細胞をトランスフェクトするためのアプローチを提供する。１つの例は
、ＩＤＸ−１であり、これはＧＬＰ−１またはエキセンジン−４により誘導され
る転写因子である。ＩＤＸ−１などのエフェクターを導入することにより、分化
を引き起こし、内分泌島細胞を形成させることができる。

【０１４１】移植片拒絶の解析本発明は、移植物質の生存を評価するためのインビボ手順を提供する。実験的
移植拒絶は、本発明の幹細胞または偽−島様凝集体を免疫抑制または非免疫抑制
哺乳動物に移植することにより解析される。

【０１４２】例えば、本発明のヒト幹細胞が非−免疫抑制Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植され
る（例えば、腎臓被膜の下）。移植レシピエントを屠殺して生存度について染色
することにより、または移植後の適切な時点で、移植物質の部位（すなわち、移
植物質の部位に存在する器官または組織）で免疫細胞化学染色を行なうことによ
り、移植片拒絶が解析される。移植物質の部位の染色（例えば、ヘマトキシリン
／エオシンまたは免疫染色）が行なわれる時点は、例えば、移植された哺乳動物
の平均生存時間、また予期された生存時間にしたがって変化しうる。移植片の部
位は、例えば、移植後１日〜１０年（すなわち、１日、５日、１０日、３０日、
１００日以上、１年、２年、５年、または１０年）、好ましくは、移植後１０日
〜１年、最も好ましくは、移植後１０日〜１００日の染色により解析される。例
えば、移植物質がマウスの腎臓被膜の下に導入される場合、移植されたマウスの
腎臓が検査される。移植物質がまだ検出可能である、および／または移植物質が
組織集団に増殖している場合、移植物質はうまく植え付けられている（すなわち
、拒絶されない）。

【０１４３】移植物質の検出および移植物質の増殖は、例えば、移植部位（すなわち、腎臓
）から調製される凍結切片のヘマトキシリン／エオシン染色、および移植レシピ
エント由来でない（すなわち、宿主腎臓由来でない）新しい増殖の検出により決
定される。異種移植の場合、当該分野で既知であり、本明細書に記載される免疫
細胞化学的染色方法にしたがって、移植物質が由来する種からの抗原に特異的な
抗血清との特異的な免疫染色が、陽性細胞を同定するなら、移植物質がうまく植
え付けられている。代替的には、異種移植が行なわれる態様において、移植種（
すなわち、移植物質が由来する種）に由来する分子（すなわち、タンパク質また
は抗原）が、移植レシピエントの血液で検出されるなら、移植物質がうまく植え
付けられている。

【０１４４】本明細書で使用される場合、「拒絶」は、宿主の免疫システムによる移植物質
の拒絶のことをいう。１つの態様において、「拒絶は、宿主の免疫応答に応じた
、移植物質の９０％をこえる細胞または組織の壊死の発生を意味する。もう１つ
の態様において、「拒絶」は、宿主の免疫応答に応じて、移植前の移植物質の生
存度と比較したとき、移植物質の生存度が９０％以上減少するような、生存度の
減少を意味する。生存度の減少は、限定されないが、トリパンブルー排除染色を
含む当該分野で周知の方法により決定されうる。もう１つの態様において、「拒
絶」は、移植物質が増殖できないことを意味する。増殖は、限定されないが、ヘ
マトキシリン／エオシン染色を含む当該分野で既知の方法により測定されうる。
移植拒絶の発生および／または移植後に拒絶が生じる速度は、限定されないが、
移植物質（すなわち、細胞型または細胞数）または宿主（すなわち、宿主が免疫
寛容であるおよび／または免疫抑制剤で処置されているか否か）を含む因子に依
存して変化する。

【０１４５】移植方法本発明は、哺乳動物への移植方法を提供する。幹細胞、前駆細胞または分化細
胞は、培養容器から患者に移される時、哺乳動物に「移植」または「導入」され
る。

【０１４６】本発明の移植は、本発明の幹細胞を単離する工程および幹細胞を哺乳動物また
は患者に移す工程を含みうる。本発明の移植は、細胞懸濁液の哺乳動物または患
者への注射、哺乳動物または患者の組織または器官への細胞集団の外科的な埋め
込み、あるいは組織または器官の細胞懸濁液での灌流により、幹細胞を哺乳動物
または患者に移すことを含みうる。幹細胞を移すまたは移植する経路は、細胞が
特定の組織または器官で存在するための必要性、および所望の標的組織または器
官により見出され、保持される細胞の能力により決定される。移植細胞が特定の
場所に存在すべき場合、それは、組織または器官に外科的に配置されうるか、ま
たは細胞が所望の標的器官に移動する能力を有しているなら単に血流に注射され
うる。本発明の移植は、本発明の幹細胞を単離する工程、および該幹細胞を培養
して哺乳動物または患者に移す工程を含みうる。もう１つの態様において、移植
は、本明細書で使用される場合、本発明の幹細胞を単離する工程、該幹細胞を分
化する工程および該幹細胞を哺乳動物または患者に移す工程を含みうる。移植は
、本明細書で使用される場合、本発明の幹細胞を単離する工程、該幹細胞を分化
および拡張する工程、ならびに該幹細胞を哺乳動物または患者に移す工程を含み
うる。

【０１４７】膵臓幹細胞を用いるインスリン依存性糖尿病の治療方法Ｉ型糖尿病患者由来の損失β細胞を取り替えるまたはＩＩ型糖尿病患者におけ
るβ細胞の総数を増加させるのに、幹細胞が有用である。糖尿病患者は、好まし
くは、幹細胞、前駆細胞、または偽−島様凝集体を産生するのに使用される膵臓
組織のドナーとして役に立つ。幹細胞は、成体膵臓島ならびに膵臓管内に存在す
る。糖尿病患者が膵臓バイオプシーを受けた後、島がバイオプシー組織から単離
され、好ましくは２４時間以内にエキソビボ培養のために調製される。幹細胞は
２〜３週間以内に前記方法により増殖され、かつ単離されうる。幹細胞は、単離
直後または成長因子により導入される分化の期間の後、患者に移植して戻されう
る。島は、実施例２に記載のように、継代培養により産生されうる。外科的膵臓
バイオプシーおよび移植の全プロセスは、約３０日の期間内に行なわれうる。

【０１４８】本発明の１つの態様において、多能性の幹細胞が使用される。これらの細胞は
、同種異系または異種移植において、それらがレシピエントにより自己として認
識され、クラスＩまたはクラスＩＩ抗原により制限されるＭＨＣでないように、
免疫学的に隠されているまたは免疫学的に寛容である（immunoloprivileged）。
本発明のこの態様の１つの局面において、これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩおよ
び／またはクラスＩＩ抗原を発現しない。

【０１４９】本発明のもう１つの態様において、移植のレシピエントは、他の移植細胞の対
宿主性移植片拒絶を明らかにし、それは、本明細書に記載の１つ以上の免疫抑制
剤の投与により、または自己免疫拒絶を妨げるまたは改善するために当該分野で
既知のいずれかの方法により、例えば、ＧＡＤ６５等の自己抗原に対してブロッ
クする抗体の投与によりコンバート（combat）されうる。

【０１５０】代替的には、本発明の非−ヒト哺乳動物から単離された幹細胞は、ヒト糖尿病
患者に移植される。移植工程前に、幹細胞は培養され、および／または拡張され
および／または分化されうる。

【０１５１】肝臓疾患を罹患する患者を膵臓幹細胞を用いて治療する方法膵臓幹細胞または前駆細胞が分化転換して肝細胞を形成する能力は周知である
（BisgaardおよびThorgeirsson, 1991）。本発明の膵臓幹細胞は、肝臓組織の機
能集団が減少している肝硬変（cirrosis）、肝炎または肝臓癌等の肝臓疾患を罹
患している患者に肝細胞を提供するのに使用されうる。本発明の幹細胞はまた、
遺伝子欠損を修正するために遺伝子療法により治療され、肝臓機能を回復させる
ために患者に導入されうる。ネスチン陽性幹細胞は、１つ以上の成長因子を適用
することにより、または核酸分子でのトランスフェクション等の他の処置により
、培養またはインビボのどちらかで分化され、幹細胞の肝細胞への分化を生じう
る。１つの態様において、本発明は、例えば、ハリネズミ（sonic hedgehog）が
肝細胞形成を生じるのを抑制するシクロパミン（cyclopamine ）の使用を考慮す
る。本発明のもう１つの態様において、幹細胞はエキソビボ処置なしで移殖され
得、適切な成長因子はインサイチュで患者の体内に提供されうる。さらにもう１
つの態様において、幹細胞は、成長因子または他の薬剤とエキソビボで処置され
得、その後部分的に分化した状態または末端まで分化した状態で患者に移植され
うる。本発明の他の局面は、幹細胞または前駆細胞をトランスフェクトする方法
、投与量および投与経路、医薬組成物、ドナー−同種移植片プロトコル、ならび
に免疫抑制法を含み、膵臓組織への分化に関する限りでは、肝細胞への分化転換
が行なわれうる。

【０１５２】本発明は、同系、同種異系または異種の幹細胞、またはそのいずれかの組合せ
の患者への移殖を特に考慮する。

【０１５３】幹細胞トランスフェクションの方法種々の方法が、膵臓幹細胞への遺伝子移入に適している。リン酸カルシウム沈
殿ＤＮＡが使用されているが、特に非付着細胞に対して、低効率の形質転換が提
供される。さらにリン酸カルシウム沈澱ＤＮＡ法は、しばしば多数のタンデムリ
ピートの挿入を生じ、内因性または外因性のいずれかのＤＮＡの遺伝子機能を妨
害する見込みを増加する（Boggs,1990）。カチオン性脂質の使用はまた、例えば
、リポソームの形態において、真核細胞をトランスフェクトするためにＤＮＡを
パッケージングする有効な方法であり、いくつかの市販のカチオン性脂質の調製
物が入手できる。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウムプロトコルより
も改良された形質転換効率を提供する。それは、ゲノムにおいて単一部位で単一
コピー挿入を提供する利点を有する。ＤＮＡの細胞核への直接のマイクロインジ
ェクションは、遺伝子伝達のさらに他の方法である。それは、短期トランスフェ
クションに対してほぼ１００％、および安定なＤＮＡ組込みに対して２０％の効
率を提供することが示されている。マイクロインジェクションは、細胞質を介し
て、外因性ＤＮＡの時々問題のある細胞輸送をバイパス形成する。このプロトコ
ルは、小容量の物質を必要とする。それは、細胞当たり既知の量のＤＮＡの導入
を可能とする。幹細胞の実質的に純粋な集団を得る能力は、膵臓幹細胞の標的遺
伝子改変に対するマイクロインジェクションアプローチの可能性を改良する。マ
イクロインジェクションは、しかしながら、単調で長い、高度に分化したプロト
コルである。プロトコルのこの性質は、所定の時間で注射しうる細胞数を制限し
、大きなスケールでの生産における使用を制限する。レトロウイルス法を用いる
膵臓幹細胞への遺伝子挿入は、好ましい方法である。レトロウイルスは、非常に
高いトランスフェクション効率で、ランダムで、単一コピーの、単一部位挿入を
提供する。他のかかるトランスフェクション法が、当業者に既知であり、本発明
の範囲内にあるとみなされる。

【０１５４】膵臓幹細胞のレトロウイルス形質転換膵臓細胞に対する遺伝子伝達プロトコルは、「ヘルパーウイルス」（すなわち
、目的の外来遺伝子を保有するが完全なウイルス粒子を形成できないキャプシド
に包まれた欠損ウイルスゲノム）としてレトロウイルスベクターを伴いうる。Ｄ
ＮＡ媒介伝達、アデノウイルス、ＳＶ４０、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペ
ス単一ウイルスベクター等の他のキャリアーも使用されうる。感染に対する適切
なベクターを選択する場合、いくつかの因子が考慮されうる。スプライスされた
サブゲノム（subgenomic）ＲＮＡに頼るよりも、ウイルスの長い末端リピートま
たは強い内部プロモーターを使用して外来遺伝子を発現するのが、時には好まし
い。

【０１５５】幹細胞形質転換の２つの主な方法は、同時培養および上清感染である。上清感
染は、幹細胞のウイルス上清への繰り返される曝露を伴う。同時培養は、２４〜
４８時間の間、幹細胞と感染された「パッケージ細胞株」（下記）との混合を伴
う。同時培養は、典型的には、上清感染よりも幹細胞形質転換に対して効率が良
い。同時培養後、感染された幹細胞は、長期培養物（ＬＴＣ）を確立するために
しばしばさらに培養される。

【０１５６】ヘルパーウイルスを含む細胞株は、バッケージ細胞株と呼ばれる。種々のパッ
ケージ細胞株が、一般に入手できる。パッケージ細胞株の重要な特徴は、複製−
コンピテントヘルパーウイルスを生産しないことである。

【０１５７】本発明の１つの態様において、幹細胞が採取される動物または患者が、摘出前
に５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処置されうる。５−ＦＵ処置された幹細
胞は、未処置細胞よりもレトロウイルス感染に対してより感受性が強い。しかし
ながら、５−ＦＵ幹細胞は、クローン原性（clonogenic）前駆体の数を劇的に低
減する。

【０１５８】もう１つの態様において、採取された幹細胞は、膵臓幹細胞の増殖または分化
を促進するために使用するものなどの種々の成長因子に曝露されうる。成長因子
は、感染前、感染中または感染後に、細胞複製および形質導入を改良するために
培養物に導入されうる。この研究は、成長因子の使用が、形質転換効率を３０か
ら８０％に増加することを報告する。

【０１５９】典型的なレトロウイルス形質転換プロトコル哺乳動物の膵臓幹細胞のエキソビボ形質導入、および子孫細胞を含む種々の組
織での有意な植え付けおよび遺伝子発現を得るために十分な非切断（nonablated
）レシピエントへの次の移植が、マウスで示される。レシピエントへ注射する前
に、目的の遺伝子を含む適切なベクターの存在下で標的細胞を２〜４日間培養す
る。

【０１６０】具体的には、雄ドナー（４〜８週齢）ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒマウス（国立
癌研究所、癌治療動物プログラム部、Frederick, MD ）から骨髄幹細胞を採取し
た。細胞を１〜２×１０⁷細胞／１０ｃｍ皿の密度でプレーティングし、１０％
熱不活性化ウシ胎仔血清、グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１００Ｕ／ｍｌの
インターロイキン−６（ＩＬ−６）および細胞成長を刺激するための幹細胞因子
（ＳＣＦ；Immunex, Seattle, WA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）で４８時間培養した（Schiffmannら、1995）。

【０１６１】同時に、ウイルスパッケージ細胞株を２４時間培養した。Schiffmannらにより
使用されたパッケージ細胞株は、ＧＰ＋Ｅ８６であり、ウイルスベクターは、レ
トロウイルスベクターのＬＮ系に基づくＬＧレトロウイルスベクターであった。

【０１６２】適切なインキュベーション期間後、１〜２×１０⁷幹細胞をウイルスパッケー
ジ細胞を含む１０ｃｍ皿上にプレートし、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下お
よびドナー幹細胞と同じ成長因子刺激条件下で４８時間同時培養した。次に、幹
細胞を採取し、成長培地を洗浄し、多数の注射に対して２×１０⁷細胞／注射の
用量でレシピエントマウスに注射した（毎日または毎週のいずれかで全部で５回
の注射）。

【０１６３】成功した幹細胞形質導入および幹細胞の植え付けは、例えば、ＰＣＲ解析、免
疫細胞化学染色、サザン、ノーザンまたはウエスタンブロッティングを介して、
または当業者に既知の他のかかる技術により、決定されうる。

【０１６４】哺乳動物本発明の有用な哺乳動物としては、いずれもの哺乳動物が挙げられる（例えば
、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、サル、ウマ、ハムスター、ブ
タまたはウシ）。本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒトではないいずれもの哺乳動物
であり、限定されないが、マウス、ラット、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、サル、ウマ
、ハムスター、ブタまたはウシが挙げられる。

【０１６５】投与量および投与形態例として、本明細書に記載される膵臓幹細胞を必要とする患者を、以下のよう
に治療しうる。本発明の細胞は、摂取、注射、吸入またはいくつもの他の方法に
より、好ましくは、生物学的適合性溶液または薬学的に許容されうる送達ビヒク
ル中で、患者に投与されうる。好ましい方法は、内視鏡的逆方向注射である。も
う１つの好ましい方法は、腎臓被膜下の空間への細胞もしくは偽−島様凝集体の
注射または配置である。投与量は、患者から患者で変化する；「治療有効量」が
、例えば、限定されないが、機能の増加レベル（例えば、インスリン産生または
血漿グルコースレベル）により決定されうる。幹細胞導入レベル、かかる移動に
より影響を及ぼされた一定の遺伝子の発現レベル、および／またはコードされた
産物の存在またはレベルをモニターすることにより、当業者が投与量を選択およ
び調節することがまた可能となる。一般的に、幹細胞を含む組成物は、ｋｇ体重
当たり１０⁵〜１０⁸細胞の範囲、好ましくはｋｇ体重当たり１０⁶〜１０⁷細
胞の範囲の単回用量で投与されうる。この用量は、毎日、毎週、毎月、毎年、ま
たは治療している医師により適切であるとみなされるように繰り返されうる。本
発明は、細胞集団がまた、患者から取り出されるかまたは別な方法で提供され、
エキソビボで拡大され、所望であれば治療用遺伝子を含むプラスミドで形質導入
され、次いで患者に再導入されうることを提供する。

【０１６６】医薬組成物本発明は、生理学的適合性キャリアーと混合された、本発明の幹細胞を含有し
てなる組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「生理学的適合性キャリ
アー」は、水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水等の生理学的に許容さ
れうる希釈液のことをいい、さらにアジュバントを含みうる。不完全フロイント
アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンな
どのアジュバントは、当該分野で周知の物質である。

【０１６７】本発明はまた、医薬組成物を提供する。活性化成分に加えて、これらの医薬組
成物は、薬学的に使用されうる適切な薬学的に許容されうるキャリアー調製物を
含みうる。

【０１６８】経口投与のための医薬組成物は、当該分野で周知の薬学的に許容されうるキャ
リアーを用いて、経口投与に適切な用量で処方されうる。かかるキャリアーは、
医薬組成物が、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖剤、カプセル、液体、
ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方されるのを可能にする。

【０１６９】経口使用のための医薬調剤物が、固体の賦形剤と活性化合物の組み合わせを介
して、任意に、得られた混合物を砕き、所望の場合、錠剤または糖剤コアを得る
ために、適切な補助物を添加した後、顆粒の混合物を処置して得られうる。適切
な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む
糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン
；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウ
ムカルボキシメチルセルロース等のセルロース；アラビアおよびトラガカントを
含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲン等のタンパク質等の炭水化物また
はタンパク質の充填剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、
アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩等の崩壊剤または溶解
剤が添加されうる。

【０１７０】糖剤コアが、濃縮された糖溶液等の適切なコーティングを用いて提供され、そ
れはまたアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（carbop
ol）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶
液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含みうる。製造品同定のためまた
は活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けるために、染料または顔料が錠剤ま
たは糖剤コーティングに添加されうる。

【０１７１】経口使用されうる医薬調製物としては、ゼラチンから作製される押しばめ（pu
sh-fit）カプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトール等のコ
ーティングとから作製されるソフトな、シールされたカプセルが挙げられる。押
しばめカプセルは、ラクトースまたはデンプン等の充填剤または結合剤、タルク
またはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および、任意に安定剤と混合され
た活性成分を含みうる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物が、脂肪油、液体
パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の適切な液体中で、安定剤有
りまたは無しで、溶解または懸濁されうる。

【０１７２】非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射のために、
本発明の医薬組成物は、水溶液で、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、
または生理学的緩衝化生理食塩水等の生理学的適合性緩衝液で処方されうる。水
性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたは
デキストラン等の懸濁液の粘度を増加する物質を含みうる。さらに、活性化溶媒
またはビヒクルの懸濁液は、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルまたは
トリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。任意に、懸
濁液はまた、適切な安定化剤、または化合物の溶解性を増加する薬剤を含み、高
濃縮した溶液の調製を可能にする。

【０１７３】経鼻投与に対して、透過する特定の関門に適切な浸透剤が製剤に使用される。
かかる浸透剤は、当該分野で一般に既知である。

【０１７４】本発明の医薬組成物は、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖剤作製、空中浮
揚、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥処置により、当該分野で既知の方法
で、製造されうる。

【０１７５】医薬組成物は、塩として提供され得、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸と共に形成されうる。塩は、
対応する遊離塩基型である水性または他のプロトン化溶媒でより溶解する傾向が
ある。他の場合において、より好ましい調製物は、４．５〜５．５のＰｈ範囲で
の１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のスクロース、２％〜７％の
マンニトール中の凍結乾燥粉体であり得、使用前に緩衝液とあわせられる。

【０１７６】許容されうるキャリアーに処方された本発明の化合物を含有してなる医薬組成
物を調製した後、それらを適切な容器に入れ、投与の量、頻度および方法を含む
情報を用いて、示した条件の処置のためにラベルしうる。

【０１７７】上記開示は、一般に本発明を説明する。以下の具体的な例を参照することによ
り、さらに完全な理解がなされるであろう。それは、本明細書に、例証のみの目
的で提供され、本発明の範囲の限定を意図するものではない。

【０１７８】実施例１ラット膵臓由来のネスチン陽性幹細胞の単離 LacyおよびKostianovskyにより記載されたコラゲナーゼ消化法を用いて、ラッ
ト島を２〜３月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの膵臓から単離した。
コラゲナーゼ消化を用いて、糖尿病研究所（Diabetes Research Institute ）、
Miami, FL からヒト島を得た。コンカナバリンＡで被覆した１２−ウェルプレー
ト（Falcon 3043 プレート、Becton Dickinson, Lincoln Park,NJ ）中で３７℃
で９６時間島を培養した。培養培地は、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭのピルビン
酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、０．２５μｇ／ｍｌのアンホテリ
シンＢ（GIBCO BRL, Life Science Technology, Gaithersburg, MD）および７１
．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO）を補充したＲＰ
ＭＩ１６４０であった。

【０１７９】９６時間後、線維芽細胞および他の非−島細胞は、コンカナバリンＡが被覆さ
れたウェルの表面に付着し、島は浮いたままであった（表面に付着しなかった）
。この時に、島を含む培地を取り出し、遠心分離して沈ませ、パージした島をコ
ンカナバリンＡの被覆のない１２−ウェルプレート中に再プレートした。島を次
いで２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子−２および２０ｎｇ／ｍｌの表
皮性成長因子を補充したＲＰＭＩ１６４０培地上で培養した。

【０１８０】島はプレートの表面に付着し、細胞は増殖し、単層中の島から離れた。単層を
形成するこれらの細胞は、マサチューセッツ総合病院のMario Vallejo 博士によ
り開発されたウサギ抗ラットネスチン抗血清での免疫染色により、ネスチン−陽
性であった。他のネスチン抗体、例えば、上記Ｒ．４０１抗体またはＭＡＢ５３
３抗体が使用されうる。ラット胚脊髄ネスチンに特異的なモノクローナル抗体、
ＭＡＢ３５３、ＡＴＣＣ番号１０２３８８９；がJournal of Neuroscience 1996
; 16:1901-100 に記載されており；Chemicon International, Single Oakの Tem
ecula 博士、CA 92590 USAからまた入手できる。培養２週間後、数個（３〜５）
のネスチン陽性単層細胞を、キャピラリーチューブで摘むことにより取り出し（
シリンダークローニング）、１２−ウェルプレート上（コンカナバリンＡで被覆
されていない）に再プレートし、ｂＦＧＦ−２およびＥＧＦをさらに補充したＲ
ＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞は、高速で増殖し、培養６日後、コン
フルエンスに達した。培養１２日後、細胞単層は波を形成し、共直線（co-linea
r ）様式で重なり始めた。培養１５日後、細胞の波は、凝縮し、球状体への移動
を始め、１７日までに、ウェルの表面は、これらの球状体（直径約１００μｍ）
、空の空間、および少しの面積の残りの単層細胞を含んだ。いくつかのこれらの
単層細胞を、再び摘み、再クローニングし、上記のプロセスが、同じ時間順序で
正確に再び生じた。

【０１８１】実施例２島を形成するための膵臓幹細胞の分化１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地で、コンカナバリン−Ａ被覆１２−ウ
ェルプレートを用いてラット由来の膵臓島を最初に培養した。ウシ胎仔血清を与
えたより他は添加された成長因子の不在下で、島を３日間培養物中に維持した。
この期間後、この島が付着しなかった間に、島をコンカナバリンＡなしの新鮮な
プレートに移した。次に幹細胞を、２４日間、ｂＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）
およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）に曝露することにより刺激して、島から単層と
して増殖させた。２４日間の後、単層はコンフルエントであった。それらの１つ
は、島の周囲の細胞の集団であった。その集団由来の細胞を摘み、新しい１２−
ウェルプレートにサブクローニングし、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む培地中で再
び培養した。サブクローニングした細胞は、クローン様式で単層中に迅速に増殖
し、中心から周辺に拡大する。細胞は、６日でコンフルエントになり、次いで１
２日目にオーバーラップしている細胞の波を形成し始めた。１７日までに、細胞
は、島様構造（偽−島様凝集体）および管様構造（偽−管）に似ている球状構造
および管状構造にほとんど完全に移動した（図４）。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、偽−
島様凝集体が、ＮＣＡＭ（内分泌細胞に対するマーカー、図５を参照のこと）、
サイトケラチン１９（管細胞に対するマーカー、図５を参照のこと）、および転
写因子脳−４（ベータ細胞マーカー）を発現していることを示した。成熟した島
細胞への末端分化を達成するために、成長因子での処置を必要とする。

【０１８２】実施例３ヒトまたはラット膵臓島の単離および培養ヒト膵臓島を単離および培養した。細胞移植センター、糖尿病研究所、マイア
ミ医科大学および島移植のための若年型糖尿病財団センター、ハーバード医学校
、Boston, MAの島分布プログラムからヒト島組織を得た。徹底的に洗浄した島を
手で摘み、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビ
ン酸ナトリウム、１ｍＬ当たり１００ＵのペニシリンＧナトリウム、１ｍＬ当た
り１００μｇの硫酸ストレプトマイシン、１ｍＬ当たり０．２５ｎｇのアンホテ
リシンＢおよび７１．５μＭのβ−メルカプトエタノールを補充した改変ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（１１．１ｍＭグルコース）中で懸濁し、コンカナバリンＡ（
ＣｏｎＡ）で被覆したFalcon 3043 １２−ウェル組織培養プレートに添加した。
島調製物を９５％空気および５％ＣＯ₂と共に３７℃で９６時間インキュベート
した。これらの条件において、多くの島が懸濁液中に残り（浮かぶ）、一方、線
維芽細胞および他の非−島細胞が、下層に付着した。９６時間のインキュベーシ
ョン後、懸濁した島を含む培地を注意深く取り出し、島を手で摘み、今回さらに
各々２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および表皮性成長
因子（ＥＧＦ）を補充した改変ＲＰＭＩ１６４０培地中で再懸濁した。島懸濁
液（１ウェル当たり２０〜３０の島を含む）をＣｏｎＡで被覆していない１２−
ウェル組織培養プレートに添加した。島は直ちにプレートの表面に付着した。数
日以内に、細胞の単層が成長して島から離れるのが観察された。ある例において
、２．５ｍＭのグルコースと、アクチビン−Ａ（２ｎＭ）、肝細胞成長因子（１
００ｐＭ）、またはベータセルリン（５００ｐＭ）を含む数個の成長因子の組み
合わせとを含む改変ＰＲＭＩ培地でヒト由来の細胞を培養した。細胞が１０ｍＭ
のニコチンアミドでチャレンジする実験において、培地は血清または成長因子を
含まなかった。

【０１８３】実施例４膵臓幹細胞の分化におけるグルコースおよびＧＬＰ−１の影響血漿グルコース濃度の上昇は、膵臓島サイズの増加をもたらす。それゆえに、
培養培地におけるグルコース濃度の影響を、ネスチン陽性幹細胞を含む単離した
島を用いて調査した。高い（１６．７ｍＭ）グルコースまたは通常の（５．６ｍ
Ｍ）グルコースを含む培地中でラット膵臓島を培養した。４日後、ＲＴ−ＰＣＲ
を行なって、ネスチンｍＲＮＡのレベルを測定した。結果は、通常のグルコース
で培養した島と比較して、高いグルコースで培養した島においてネスチンｍＲＮ
Ａレベルの３倍の刺激を示した（図６）。

【０１８４】同様に、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のマウスへの注射により、
４８時間で島集団が２倍に増加することを見出した。ＧＬＰ−１レセプターに対
する崩壊遺伝子を有するノックアウトマウスを、膵臓島におけるネスチン発現に
対して試験した。ネキシン（nexin ）抗体を用いる免疫染色は、ＧＬＰ−１レセ
プターを有する通常のマウスと比較して、著しく低減されることを見出した。

【０１８５】真性糖尿病の動物モデル糖尿病の徴候を示す動物において、徴候の軽減を生じる真性糖尿病型の治療を
試験した。ヒトにおける糖尿病を治療するのに有用な薬剤および手順に対するモ
デルとしてこの動物が役に立つことが考慮される。糖尿病に対する潜在的治療は
、それゆえに、潜在的な治療薬を動物に投与し、かつその影響を観察すること、
および治療動物を未治療の対象と比較することにより、最初に動物モデルにおい
て試験されうる。

【０１８６】非−肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、Ｉ型またはインスリン依存性真性糖尿病
の重要なモデルであり、ヒト糖尿病に対する特に適切なモデルである（Kikutano
およびMakino, 1992, Adv. Immunol. 52:285および本明細書で引用される参考文
献、本明細書に参照により取り込まれる）。ＮＯＤマウスにおけるＩ型糖尿病の
発現は、いずれの外部刺激もなしに、自発的に、かつ突然生じる。ＮＯＤマウス
は糖尿病を発現するとき、慢性の自己免疫疾患により引き起こされるβ−細胞の
漸進性の破壊を受ける。ＮＯＤマウスにおけるインスリン依存性真性糖尿病の発
現は、およそ２段階：自己免疫インスリン炎の開始（膵臓島におけるリンパ球の
炎症）ならびに島破壊および明白な糖尿病の促進に分けられうる。糖尿病ＮＯＤ
マウスは、正常血糖、または通常血液グルコースレベルで生き始めるが、約１５
〜１６週齢までに、ＮＯＤマウスは、高血糖になり始め、膵臓β−細胞の大部分
が破壊され、それに対応して膵臓が十分なインスリンを産生できないことを示す
。インスリン欠乏および高血糖に加えて、糖尿病ＮＯＤマウスは、激しい糖尿、
多渇症、および多尿を経験し、迅速な体重損失を伴う。したがって、疾患の原因
および進行の両方は、インスリン依存性真性糖尿病を罹患したヒト患者と同様で
ある。ＮＯＤマウスにおいて自発的な緩和が観察されることはほとんどなく、こ
れらの糖尿病動物は、糖尿病の発症後インスリン療法を受けなければ、１〜２ヶ
月以内に死亡する。

【０１８７】本発明の幹細胞調製物を投与することによる、糖尿病の種々の治療方法の有効
性を試験するために、動物モデルとしてＮＯＤマウスを使用する。かかるように
、幹細胞の投与を介する治療を、Ｉ型糖尿病における効果についてＮＯＤマウス
で試験する。

【０１８８】ＮＯＤマウスに、典型的には腹腔内に、以下の投与量により幹細胞を投与する
。ＮＯＤマウスに、マウス１匹当たり約１×１０¹〜１×１０⁴細胞を投与する
。約４週齢のＮＯＤマウスで細胞の投与を開始し、８〜１０週間、例えば１週間
に３回で続ける。マウスを約１３週齢で始まる糖尿病に対してモニターし、以下
に記載した方法により１週間に２回試験した。治療ＮＯＤマウスと未治療ＮＯＤ
マウスとの比較により治療効果を測定した。

【０１８９】当業者に既知の方法、例えば、多渇症、多尿、糖尿、高血糖、およびインスリ
ン欠乏、または体重損失に対してＮＯＤマウスを試験することによりＮＯＤマウ
スの糖尿病に対してアッセイすることにより、ＮＯＤマウスの糖尿病における本
発明の治療方法の有効性をモニターした。例えば、尿グルコース（糖尿）のレベ
ルをＴｅｓｔａｐｅ（Eli Lilly, Indianapolis, IN.）を用いてモニターし得、
参照により本明細書に取り込まれるBurkly, 1999, 米国特許第５, ８８８, ５０
７号明細書に記載のように血漿グルコースレベルをＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ３血液
グルコースメーター（Miles. Inc., Elkhart, IN. ）を用いてモニターしうる。
これらの方法による尿グルコースおよび血漿グルコースレベルのモニタリングに
より、２つの連続した尿陽性テストが、＋１またはそれより高いＴｅｓｔａｐｅ
値または＞２５０ｍｇ／ｄＬの血漿グルコースレベル（Burkly, 1999, 上記）を
与えた後、ＮＯＤマウスを糖尿病であるとみなす。ＮＯＤマウスにおける糖尿病
を解析するもう１つの方法は、ＮＯＤマウスにおける膵臓インスリンレベルを試
験することである。例えば、膵臓インスリンレベルは、イムノアッセイにより試
験され、治療マウスと対照マウスの間で比較されうる（Yoon, 米国特許第５, ４
７０, ８７３号明細書、本明細書に参照により取り込まれる）。この場合、イン
スリンをマウスの膵臓から抽出し、その濃度を、標準としてのマウスインスリン
を用いるラジオイムノアッセイ技術による等の免疫反応性により決定する。

【０１９０】糖尿病に対してＮＯＤマウスを一般的にモニターすることに加えて、投与した
幹細胞を非相同遺伝子と形質転換またはトランスフェクトする場合、それにより
、非相同遺伝子の発現と糖尿病における効果との相関を得ることが可能になる遺
伝子特異的または遺伝子産物特異的効果に対しても本発明の治療方法の効果をま
たモニターする。例えば、非相同遺伝子産物の存在を、遺伝子産物およびインス
リンに対するＮＯＤマウスの膵臓β−細胞の免疫組織化学により試験しうる。パ
ッチ（patched ）および平滑（smoothened）遺伝子の発現を、ＮＯＤマウス島に
おいて、パッチおよび平滑レセプターに対するＲＮＡ転写の検出によりさらに試
験する。マウスのパッチまたは平滑ｃＤＮＡの断片を増幅するための既知の方法
により、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を行ない、標準法に
よるアガロースゲル電気泳動により解析する。パッチまたは平滑遺伝子に対する
放射能標識内部オリゴヌクレオチドプローブとの増幅した断片のハイブリダイゼ
ーションにより、または当業者に既知の他のかかる方法により、増幅したｃＤＮ
Ａ断片の同定を、パッチまたは平滑ＲＮＡに対応して確認する。

【０１９１】実施例５ネスチン陽性ヒトおよびラット膵臓幹細胞の免疫細胞化学的同定膵臓島をネスチン発現に対して解析した。島および幹細胞を上記のように単離
した。免疫細胞化学染色により、胚１６日目（Ｅ１６）のラット膵臓の発達中の
島クラスター内の細胞の個別の集団（図８Ａ）および成体膵臓の島（生後６０日
）（図８Ｂ）におけるネスチン発現を観察した。免疫細胞化学染色を以下のよう
にして行なった。

【０１９２】胚１６日目および成体（６０日）ラット膵臓ならびに細胞から調製した凍結切
片（６μＭ）をリン酸塩中４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を最初に
３％の通常のロバ血清で３０分間室温でブロックし、４℃で一晩一次抗血清とイ
ンキュベートした。抗血清をＰＢＳを用いてリンスし、それぞれＣｙ−３および
Ｃｙ−２で標識した二次抗血清と１時間室温でインキュベートした。スライドを
次いでＰＢＳを用いて洗浄し、蛍光マウント培地でカバーグラスした（Kirkegaa
rdおよびPerry 研究室, Gaithersburg, MD）。組織切片を一次抗血清と共に一晩
４℃でインキュベートした。次に、一次抗血清をＰＢＳを用いてリンスし、スラ
イドを３％の通常のロバ血清を用いて１０分間室温でブロックした後、ロバの抗
−Ｃｙ３（インドカルボシアニン）と、抗−モルモット（インスリン）、抗−マ
ウス（グルカゴン）、または抗−ヒツジ（ソマトスタチン）血清ＤＴＡＦ（Jack
son Immuno Research Laboratories, West Grove, PA）のいずれかと共に３０分
間室温でのインキュベーションを行なった。スライドを次いでＰＢＳを用いて洗
浄し、蛍光マウント培地でカバーグラスした（KirkegaardおよびPerry 研究室,
Gaithersburg, MD）。IP Labスペクトル解析ソフトウエア（Signal Analytics C
orp, Vienna, VA ）をインストールしたPowerMac 7100 と連結したOptronics TE
C-470 CCD カメラ（Optronics Engineering, Goleta, CA ）を備えたZeiss Epif
luorescence 顕微鏡を用いて、蛍光画像を得た。

【０１９３】ネスチン陽性細胞は、β−、α−、δ−およびＰＰ−細胞と性質が異なる。な
ぜなら、それらは、ホルモンインスリン（図８ＡおよびＢ）、グルカゴン、ソマ
トスタチン、または膵臓ポリペプチドに対する抗血清で同時染色されないためで
ある。ネスチン陽性細胞はまた、コラーゲンＩＶに対する抗血清、血管内皮細胞
に対するマーカー（図８Ｃ）でも、ガラニンに対する抗血清、神経細胞に対する
マーカーまたはサイトケラチン１９に対するモノクローナル抗体、管細胞に対す
る特異的なマーカー（図８）でも同時染色されない。ネスチン陽性染色は、核同
時染色によりはっきりと観察される島内の個別の細胞に関連する（図４Ｄ）。

【０１９４】実施例６ＲＴ−ＰＣＲによるネスチン陽性のヒト幹細胞およびラット幹細胞の同定膵島におけるネスチン発現の免疫細胞化学的な同定を確認するため、新たに分
離されたラット島およびヒト島組織から調製された全ＲＮＡを用いるネスチンｍ
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、以下の方法にしたがって行っ
た。

【０１９５】ラットまたはヒトの島から調製された全細胞性ＲＮＡを逆転写し、先〔ダニエ
ル（Ｄａｎｉｅｌ）ら，１９９８、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９：３７
２１−３７２９〕に記載したようにＰＣＲで３５サイクル増幅させた。ＰＣＲ用
のプライマーまたはアンプリマー(amplimer)としておよび続くサザンブロットハ
イブリダイゼーション用のプローブとして使用したオリゴヌクレオチドは：ラットネスチン：フォワード，５’ｇｃｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｇｔｇａｃｔａｃ３’；リバース，５’ａｇｇｃａａｇｇｇｇｇａａｇａｇａａｇｇａｔｇｔ３’；ハイブリダイゼーション，５’ａａｇｃｔｇａａｇｃｃｇａａｔｔｔｃｃｔｔｇ
ｇｇａｔａｃｃａｇａｇｇａ３’

【０１９６】ラットケラチン１９：フォワード，５’ａｃａｇｃｃａｇｔａｃｔｔｃａａｇａｃｃ３’；リバース，５’ｃｔｇｔｇｔｃａｇｃａｃｇｃａｃｇｔｔａ３’；ハイブリダイゼーション，５’ｔｇｇａｔｔｃｃａｃａｃｃａｇｇｃａｔｔｇａ
ｃｃａｔｇｃｃａ３’

【０１９７】ラットＮＣＡＭ：フォワード，５’ｃａｇｃｇｔｔｇｇａｇａｇｔｃｃａａａｔ３’；リバース，５’ｔｔａａａｃｔｃｃｔｇｔｇｇｇｇｔｔｇｇ３’；ハイブリダイゼーション，５’ａａａｃｃａｇｃａｇｃｇｇａｔｃｔｃａｇｔｇ
ｇｔｇｔｇｇａａｃｇａｔｇａｔ３’

【０１９８】ラットＩＤＸ−１フォワード，５’ａｔｃａｃｔｇｇａｇｃａｇｇｇａａｇｔ３’；リバース，５’ｇｃｔａｃｔａｃｇｔｔｔｃｔｔａｔｃｔ３’；ハイブリダイゼーション，５’ｇｃｇｔｇｇａａａａｇｃｃａｇｔｇｇｇ３’

【０１９９】ヒトネスチン：フォワード，５’ａｇａｇｇｇｇａａｔｔｃｃｔｇｇａｇ３’；リバース，５’ｃｔｇａｇｇａｃｃａｇｇａｃｔｃｔｃｔａ３’；ハイブリダイゼーション，５’ｔａｔｇａａｃｇｇｇｃｔｇｇａｇｃａｇｔｃｔ
ｇａｇｇａａａｇｔ３’

【０２００】ヒトケラチン：フォワード，５’ｃｔｔｔｔｃｇｃｇｃｇｃｃｃａｇｃａｔｔ３’；リバース，５’ｇａｔｃｔｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｃ３’ ハイブリダイゼーション，５’ａａｃｃａｔｇａｇｇａｇｇａａａｔｃａｇｔａ
ｃｇｃｔｇａｇｇ３’

【０２０１】ヒトグルカゴン：フォワード，５’ａｔｃｔｇｇａｃｔｃｃａｇｇｃｇｔｇｃｃ３’；リバース，５’ａｇｃａａｔｇａａｔｔｃｃｔｔｇｇｃａｇ３’；ハイブリダイゼーション，５’ｃａｃｇａｔｇａａｔｔｔｇａｇａｇａｃａｔｇ
ｃｔｇａａｇｇｇ３’

【０２０２】プライマーを２つの異なるエキソンから選択したところ、該プライマーは少な
くとも一つのイントロン配列を包含していた。また、ＲＴ負対照をほとんどの試
料について実施した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分間、次いで９４℃で１０
秒、５８／５６℃で１０秒、７２℃で１分間を３５サイクルかつ７２℃で２分間
であった。アニーリング温度は、ラットネスチンについては５８℃、残りのプラ
イマー対については５６℃であった。

【０２０３】サザンハイブリダイゼーションのために、オリゴヌクレオチドプローブをＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ³²ＰＡＴＰで放射標識した。放射標識した
プローブを、ナイロン膜に３７℃で１時間移しておいたＰＣＲ産物にハイブリダ
イズさせた。次いで１×ＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳ中、５５℃で１０〜２０分間ま
たはヒトＰＣＲ産物については０．５×ＳＣＣ＋０．５％ＳＤＳ中、４２℃で洗
浄した。

【０２０４】ＲＴ−ＰＣＲは正確に予期される大きさの産物を生じ（図８Ｅ、上パネル）、
サザンブロッティング（図８Ｅ、下パネル）および産物のＤＮＡシーケンスによ
りによって確認した。これらのデータは、ネスチンを発現し、中枢神経系のネス
チン陽性幹細胞に似た島多能性幹細胞であるかもしれない新しい細胞型の膵島の
同定を示唆している。

【０２０５】実施例７ネスチン陽性幹細胞のインビトロ増殖ネスチン陽性幹細胞のインビトロでの増殖能を測定した。６０日齢ラットまたは健常な成人ヒトから調製した島を初めにコンカナバリン
−Ａ被覆皿に入れ、１０％ウシ胎仔血清を含有する改変ＲＰＭＩ１６４０培地
中で４日間培養し、ＣｏｎＡ被覆プレートに接着した線維芽細胞及び他の非島細
胞の島調製物を取り除いた。この培養条件下で前記プレートに接着しなかった島
を回収し、ｂＦＧＦおよびＥＧＦ（それぞれ２０ｎｇ／ｍＬ）を新たにさらに補
足した同じ改変ＲＰＭＩ１６４０培地を含む１２ウェルプレート（ＣｏｎＡ被
覆なし）に移した。成長因子であるｂＦＧＦおよびＥＧＦを共に選択したのは、
これらが脳の上衣由来の神経幹細胞の増殖を刺激することが知られているからで
ある〔レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）とヴェイス（Ｗｅｉｓｓ）、１９９６、
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１７５：１−１３〕。前記島は前記プレートに付着し、細
胞は単層として島からゆっくりと成長した（ヒト細胞における推定細胞倍増時間
は４０〜４５時間）。成長しすぎた単層の細胞は、表現型が同種のものであり（
図９Ａ、パネル１）、ネスチンを発現した（図９Ａ、パネル２）。ラット細胞を
単層から採集し（少なくとも２０〜３０個の細胞のバッチ）、１２ウェルプレー
ト内でサブクローニングし、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含む改変ＲＰＭＩ１６４
０培地（１１．１ｍＭグルコース）と共にインキュベートした。サブクローニ
ングした細胞は、急速に成長し、６日でコンフルエントになり、推定細胞倍増時
間は１２〜１５時間であり（図９Ａ、パネル３）、１２日までに波状の構造を形
成した。培養１５〜１７日後、前記細胞は島状クラスター（ＩＬＣ）を形成した
（図９Ａ、パネル４）。同種の細胞をヒトの島からクローニングした（図９Ｂ）
。コンフルエントに達すると（図９Ｂ、パネル１）、ヒト細胞は移動して皿中に
おいて大きな空胞のある構造を形成した（図９Ｂ、パネル２と３）。次いで、大
きな空胞に沿って並んでいる細胞は形態を変え、球状になり、そして互いに凝集
して三次元のＩＬＣを形成した（図９Ｂ、パネル４〜６）。

【０２０６】これらのＩＬＣを形成したこれらのネスチン陽性島前駆細胞（ＮＩＰ）の分化
の指標をＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロットによってキャラクタライズし、これ
らが内分泌マーカーであるＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）〔シルリー（Ｃｉｒｕ
ｌｌｉ）ら，１９９４，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１０７：１４２９−３６）（
図９Ｃ、右パネル）および管(ductal)細胞マーカーＣＫ１９（サイトケラチン１
９）〔ボウエンス（Ｂｏｕｗｅｎｓ）ら，１９９８，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８
４：２３４−９；ボウエンスら，１９９５，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ．，４３：２４５−５３；ボウエンスら，１９９４，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
，４３：１２７９−９３〕（図９Ｃ、左パネル）を発現していることがわかった
。この研究段階では、ＮＩＰがコンフルエントになり、凝集して島様細胞クラス
ターになったとき、ＮＩＰは膵臓遺伝子（ＮＣＡＭとＣＫ１９）の発現を開始す
るが、内分泌細胞への分化に不可欠な成長因子を欠くため島遺伝子の発現につい
ては制限されると結論づけられた。また、前駆細胞集団の分化は典型的には、ま
ず増殖相を、次いで分化特異的モルフォゲン(morphogen) 成長因子の存在下で増
殖の休止を必要とすることが認められた。したがって、いくつかの場合において
１１．１ｍＭグルコース、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含有する、細胞の増殖を誘
導する培地を、より低濃度のグルコース（２．５ｍＭ）（これはあまり増殖性で
ない）ならびに因子ＨＧＦ／スキャッターファクター(Scatter Factor)またはベ
ータセルリンおよびアクチビンＡを含有する培地と取り替えることで培養条件を
改変した。グルコースは脾臓島β細胞に対する既知の増殖因子であり〔スヴェン
（Ｓｗｅｎｎｅ），１９９２，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３５：１９３−２０
１；ボナー−ヴィア（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ），１９８９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
，３８：４９−５３〕、ＨＧＦ／スカッターファクターとアクチビンＡはともに
膵臓管細胞株ＡＲ４２Ｊをインスリン、グルカゴン、および他の膵臓内分泌細胞
タンパク質を産生する内分泌表現型に分化させることが示されている〔マシマ（
Ｍａｓｈｉｍａ）ら，１９９６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：３９６
９−７６；マシマら，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１６４
７−５４〕。

【０２０７】ＩＬＣを含有する培養物は、免疫細胞化学（図１０Ａ、上パネル）、ＲＴ−Ｐ
ＣＲおよびサザンブロット（図１０Ｂ）、ならびにウエスタン免疫ブロット（図
１０Ｃ）により膵臓特異的ホメオドメインタンパク質ＩＤＸ−１を発現した。ま
た、ＩＬＣは、ＲＴ−ＰＣＲ（図１０Ｄ）からわかるように、プログルカゴンを
コードしているｍＲＮＡを発現し、免疫反応性グルカゴン、グルカゴン様ペプチ
ド−１およびインスリンを産生した。いくつかのウェル中の島様クラスターの７
２〜９６時間培養後に得られた培地のラジオイムノアッセイでは、４０〜８０ｐ
ｇ／ｍｌのＧＬＰ−１、３０〜７０ｐｇ／ｍｌのグルカゴン、２９〜４４ｐｇ／
ｍｌのインスリンの値を得た。ラジオイムノアッセイは以下のようにして行なっ
た。

【０２０８】培養培地中インスリンおよびグルカゴンの濃度をリンコ・リサーチ社（Ｌｉｎ
ｃｏＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．）とＤＰＣ社それぞれから購入した高感度ラ
ジオイムノアッセイキットにより決定した。それぞれのキットに供給された抗血
清はモルモット抗ヒトインスリンおよびウサギ抗ヒトグルカゴンである。ＧＬＰ
−１分泌を、スカシガイのヘモシアニンとコンジュゲートした合成ペプチドＣＦ
ＩＡＷＬＶＫＧＲアミドを用いるウサギの免疫で生じた抗ヒトＧＬＰ−１（７〜
３６）アミドウサギポリクローナル抗血清で測定した。抗血清はＧＬＰ−１（７
〜３６）アミドの検出に対して高特異的であり、プログルカゴンをわずかに弱く
検出する。これらのアッセイに関する感度レベルは、それぞれ６ｐｇ／ｍＬ、１
３ｐｇ／ｍＬおよび１０．２ｐｇ／ｍＬである。

【０２０９】ラミヤ（Ｒａｍｉｙａ）らが記載しているように〔ラミヤら，２０００，Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ．，６：２７８−２８２〕、１０ｍＭニコチンアミド中での７日間
のＩＬＣのインキュベーションにより、インスリンの分泌が２〜３倍増加した。

【０２１０】図１５に示すように、いくつかのさらなる膵臓マーカーが、グルコーストラン
スポーター−２〔ワン（Ｗａｎｇ）ら，１９９８〕、シナプトフィシン(synapto
physin) 、およびＨＧＦ〔メンケ（Ｍｅｎｋｅ）ら，１９９９〕などの分化され
たＮＩＰにおいて発現された。分化しているＮＩＰが膵臓外分泌組織の特性を有
するかどうかを決定するため、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、アミラーゼおよびプロカ
ルボキシペプチダーゼの発現を検出した（図１５）。

【０２１１】幹細胞を含むＮＩＰのいくつかの培養物も、ＲＴ−ＰＣＲにより見られるよう
にプログルカゴンおよびインスリンをコードするｍＲＮＡを発現した（図１６Ａ
およびＢ）。

【０２１２】ＩＤＸ−１の発現は、膵臓発生のマスター・レギュレーターであり、インスリ
ンを産生する膵臓島β細胞の成熟と機能に特に必要とされると認められるため、
特に重要である〔ストッファース（Ｓｔｏｆｆｅｒｓ）ら，１９９７，Ｔｒｅｎ
ｄｓＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８：１４５−１５１〕。

【０２１３】新たな島の新生は、特に新生児期の間（ラットとマウス）、しかしある程度は
成体期に膵臓の管における細胞の分化により生じることも知られているため〔ボ
ナー−ヴィア（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ）ら，１９９３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４
２：１７１５−１７２０；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、１９９５，
ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，４：３７１−３８３；ボウエンス（Ｂｏｕｗ
ｅｎｓ）ら，１９９６，ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈ．，４２７：５５３−５６
０〕、ネスチン発現を成体ラットの膵臓の管において分析した。ネスチンに対す
る抗血清および管上皮のマーカーであるサイトケラチン１９に対する抗血清を用
いた二重蛍光免疫細胞化学により、大きな管および小さな管の両方の局部領域、
並びに外分泌腺組織内のいくつかの小葉中心の(centrolobular) 管においてネス
チンは強く発現される（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。顕著には、管におけるネス
チン発現の局部領域は、抗ＣＫ１９抗血清でほとんど染色されない。さらに、管
におけるネスチン陽性細胞は、上皮細胞のものとは区別される形態を有すること
は明らかである。ネスチン陽性細胞は、凝集(nucleate)され、蛇行状になり、上
皮細胞の間または周囲の隙間に存するように見られるのに対し、上皮細胞は、立
方体様の、球状細胞の同種の群からなる（図１１Ｃ）。

【０２１４】したがって、ＣＫ１９は、ネスチンを発現する大部分の管細胞において発現さ
れないことは、膵臓の管内に位置（存在）するこれらのネスチン発現細胞が管上
皮細胞と区別される細胞のパッセンジャー群であり、管表現型または内分泌表現
型にまだ分化していない幹細胞であることを示唆する。膵臓の管内および成体ラ
ット膵島内のネスチン発現細胞の局在化集団の調査結果は、ラット膵臓の管が島
細胞の先祖である細胞を含むが（再生）、これらの先祖は管上皮細胞自体の亜集
団ではないという考えをさらに支持する。

【０２１５】実施例８真性糖尿病を持つヒト被験者におけるＩＤＸ−１を発現するように遺伝子操作し
た膵臓幹細胞の移植ブタまたはヒトドナーの膵臓から、あるいは最終的なヒト移植レシピエントの
膵臓生検から分離された島を幹細胞の生長を刺激する条件でエクスビボで培養す
る。次いで、幹細胞を島（クローン化した）から単離し、ｂＦＧＦ−２、ＥＧＦ
、および１１．１ｍＭグルコースを含有する増殖培地中インビトロで拡張させ
、転写因子ＩＤＸ−１をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェク
ト／インジェクトし、糖尿病のレシピエントに移植する。かわりに、遺伝子操作
した幹細胞のβ細胞への分化のプロセスを開始するために移植する前に、ＩＤＸ
−１トランスフェクト幹細胞をＧＬＰ−１、あるいは他のモルフォゲンまたは成
長因子で１〜３日間処理する。一つの態様において、幹細胞を、レシピエントへ
の投与前に拡張または分化させないか、あるいはレシピエントへの投与前に拡張
または分化のみさせる。一つの態様において、幹細胞の分化を刺激し継続的な植
付けを促進するために、移植中および移植後数日の間、ＧＬＰ−１をレシピエン
トに投与する。この方法にしたがって、異種移植（ブタ島）または同種異系移植
（レシピエントでないヒトドナー由来のヒト島）、並びに同系移植（レシピエン
ト由来の島）を行なう。ホストのレシピエントに移植すると、幹細胞の遺伝的レ
パートリーは、免疫不寛容、移植片拒絶、自己免疫による破壊（Ｉ型糖尿病）が
生じないように、（異種移植片または同種異系移植片の場合）ホストが幹細胞を
自身として認識するよう再プログラムされると仮定される。

【０２１６】実施例９真性糖尿病を持つヒト被験者におけるＩＤＸ−１の発現を刺激するために培養さ
れた膵臓幹細胞の移植上記のように分離された島を、まず該島内に存在する幹細胞の拡張（増殖）、
次いで転写因子ＩＤＸ−１の発現を刺激する条件下でエキソビボで数日培養する
。幹細胞の増殖は、ｂＦＧＦ−２、ＥＧＦ、および１１．１ｍＭグルコースを
含む培地中で島を培養することにより達成する。ＩＤＸ−１発現の誘導は、ＧＬ
Ｐ−１および２ｍＭグルコースの存在下でのインキュベーションにより達成さ
れる。記載のようにしてあらかじめ調整された島をホストレシピエントに移植す
る。さらに、ホストレシピエントに、移植中および移植後数日間、ＧＬＰ−１を
投与し、さらに幹細胞を拡張させてインスリン産生細胞に分化させ、植付けの成
功を高めてもよい。

【０２１７】この方法にしたがって、異種移植（ブタ島）、同種異系移植（レシピエントで
ないヒトドナー由来のヒト島）、ならびに同系移植（レシピエント由来の島）を
実施する。

【０２１８】実施例１０膵臓幹細胞の腎臓への異種移植ヒトネスチン陽性島前駆細胞（ＮＩＰＳ）を記載のように単離し、免疫抑制し
ていない８匹のＣ５７Ｂ１６マウスの腎線維膜下に移植した。移植したヒト細胞
はマウスレシピエントにより拒絶されなかった。最新の知見は、ヒト組織などの
異種移植片は５〜１０日以内にマウスにより拒絶されるおそれがある。最新の知
見に反して、われわれは、現在までのところ試験した８匹の非免疫抑制マウス中
８匹において、移植物の全てがうまく植え付けられ、増殖して約１０⁵〜１０⁶ 細胞の移植後１ヵ月（３０〜３８日）までに腎臓の極を包み込む大きな組織塊に
分化したことを発見した。

【０２１９】１匹のＣ５７Ｂ１６マウスを屠殺し、移植部位において大きな範囲の新規な増
殖があることを決定した。新しい組織を含む腎臓の切片を、２つの部分にわけた
。１方の部分を凍結切片組織学のために凍結させ、他方の部分をパラフィン切片
組織学のためにパラホルムアルデヒド中に固定した。凍結切片を調製し、ヘマト
キシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）と種々の島細胞抗原に対する抗血清とで染色した
。

【０２２０】Ｈ＆Ｅ染色した腎臓切片の検査は、肝臓成分、神経成分、管成分、脂肪組織成
分および造血（hematopoetic) 成分を含有する間充織組織および上皮組織の混合
物からなる多形性形態を示す、腎臓の一部分でない新たな増殖の存在を示唆した
。腎臓切片の顕微鏡写真は、新たな増殖が腎臓柔組織、および糸球体に侵入して
いると思われることを示唆した。ヒト特異的（マウスではない）抗血清を用いる
特異的な免疫染色は、ヒト特異的ケラチンであるビメンチン、およびヒト造血(h
ematapoetic)リンパ球に対して特異的なＣＤ４５白血球抗原について染色される
免疫陽性な細胞の帯を示した。２匹目のＣ５７Ｂ１６マウスの腎臓も、ＮＩＰ移
植部位で同じような外観の新たな増殖を有していた。

【０２２１】Ｃ５７Ｂ１６マウス（屠殺される最初のマウス）のＮＩＰを植え付けした腎臓
のパラフィン切片を調べた。調べた組織塊は、腎臓上部由来のものであり、外来
組織が腎臓柔組織内への「侵入」の痕跡なく腎線維膜下によく含まれることを示
した。特に、多形形態様移植組織の中でも、腎臓柔組織に似た領域であった。理
論に拘束されない１つの仮説は、移植片は分化しようとしている幹細胞からなり
、この幹細胞は「侵入」しておらず、単に移動し、増殖し、適所、即ち、間充織
の指示をまっているというものである。幹細胞は、腎臓から合図を受け取って、
腎臓へ分化しようとしているかもしれない。移植細胞は悪性のものではなく、そ
の機能を行なうよう試みる幹細胞でありうる。

【０２２２】実施例１１膵臓幹細胞の膵臓への異種移植ヒトネスチン陽性島前駆細胞（ＮＩＰＳ）を前記のように分離してマウスの膵
臓に移植する。該マウスは、免疫抑制せずに、（ａ）（ストレプトゾトシン誘導
性糖尿病をつくり出すため）ストレプトゾトシン処理により損傷させるか、また
は（ｂ）進行中の(ongoing) 島が存在する炎症を有しているＮＯＤマウスである
。

【０２２３】移植した動物の膵臓を調べて、ＮＩＰがそれらの適当な適所を見つけ、島領域
からの指示を受けて、島（β細胞）細胞へ分化するかを決定する。

【０２２４】実施例１２膵臓幹細胞の異種移植による糖尿病の処置ヒト島を上記のように分離し、インビトロで数日間培養して幹細胞群を拡張さ
せる。（肝臓への移植に関して当該技術分野において周知の日常的手段にしたが
って）ヒトＮＩＰＳを門脈を介して肝臓に移植する。

【０２２５】かわりに、ヒトＮＩＰ群（上記のように分離）を血流中に導入する。ある態様
において、ヒトＮＩＰＳを膵臓動脈を介して導入し、糖尿病の膵臓に指向させる
。

【０２２６】対照（非移植動物）群および移植動物群を、糖尿病の症状（例えば、血中グル
コースレベル、インスリンレベル、膵臓β細胞数）の改善について分析する。

【０２２７】実施例１３肝臓におけるネスチン陽性幹細胞の同定当該技術分野において公知であり本明細書に記載の方法にしたがって、ラット
の肝臓を分離し、凍結切片を調製した。

【０２２８】ラット肝臓の凍結切片（６μＭ）をウサギポリクローナル抗ネスチン血清で免
疫染色した。免疫蛍光シグナルを、発蛍光団、Ｃｙ３（黄−オレンジ色）で標識
された抗ロバＩｇＧ血清の反応により発現させた。かなり(possible)大きな胆汁
管の周囲にあるネスチン陽性細胞を図１３Ａに示す。いくつかの小さな胆汁管の
周囲にあるネスチン陽性細胞のクラスターを図１３Ｂに示す。

【０２２９】実施例１４肝臓表現型へのＮＩＰの分化肝臓幹細胞（卵型細胞）、肝臓星状細胞、および膵臓の前駆細胞の間での明ら
かな共通性質ならびにいくつかの損傷を受けた後、再生しつつある膵臓が肝臓化
生するという知見が報告されていることにより〔スラック（Ｓｌａｃｋ），１９
９５；レディ（Ｒｅｄｄｙ）ら，１９９１；ビスガード（Ｂｉｓｇａａｒｄ）ら
，１９９１；ラオ（Ｒａｏ）ら，１９９６〕、幹細胞における肝臓発現遺伝子を
検出するためにＲＴ−ＰＣＲを行なった。ＲＣＲ産物は、肝細胞発生に必要とさ
れる転写因子であるＸＢＰ−１〔レイモルド（Ｒｅｉｍｏｌｄ）ら，２０００〕
、および肝臓急性相タンパク質であるトランスサイレチンについて得られた。α
−フェトプロテイン〔ダベバ（Ｄａｂｅｖａ）ら，２０００〕、Ｅ−カドヘリン
〔スタマトグロウ（Ｓｔａｍａｔｏｇｌｏｕ）ら，１９９２〕、ｃ−ＭＥＴ〔イ
ケダ（Ｉｋｅｄａ）ら，１９９８〕、ＨＧＦ〔スクルチック（Ｓｋｒｔｉｃ）ら
，１９９９〕およびシナプトフィシン〔ワン（Ｗａｎｇ）ら，１９９８〕；図１
５を参照〕〕などのいくつかの他の肝臓マーカーも発現された。ＨＧＦやシナプ
トフィシンなどの膵臓および肝臓により共有されるタンパク質の発現は、胚の前
腸内胚葉からのそれらの共通の起源を反映し、膵臓表現型または肝臓表現型いず
れかへの分化を示しうる。

【０２３０】参考文献 Bisgaard, H.C.と Thorgeirsson, S.S. 1991. 『ラット肝臓および膵臓から単
離される始原上皮細胞の起源が共通の細胞であることの証明』 J. Cell Physiol
. 147:333-343. Bjornson, C.R.ら. 1999. 『脳から血液への変化：インビボの成体神経幹細胞
により採用される造血の発生運命』 Science 283:534-537. Bogss. S.S. 1990. 『幹細胞の遺伝子治療のための標的遺伝子の修飾』 Int J
. Cell Cloning 8:80-96. Bouwens, L. ら. 1994. 『新生児ラット膵臓における管細胞分化および島新生
のマーカーとしてのサイトケラチン』 Diabetes 43:1279-1283. Bouwens, L. 1998. 『膵臓における島β細胞の再生に関する分化転換対幹細胞
仮説』 Microsc. Res. Tech. 43:332-336. Cornelius, J.G.,ら. 1997. 『成体マウス膵臓由来の多能性幹細胞の長期培養
物における島のインビトロ発生』 Horm. Metab. Res. 29:271-277. Dahlstrand, J., ら. 1992. 『ヒトネスチン遺伝子のキャラクタライゼーショ
ンは、神経フィラメントとの密接な進化の関係を表す』 J. Cell Sci. 103:589-
597. Dabeva, M.D.ら, 2000. 『成体ラット肝臓内への移植後、胎仔肝臓上皮前駆細
胞の増殖と分化』 Am. J. Pathol. 156:2017-2031. Hockfield, S.,と McKay, R.D. 1985.『発生中の哺乳類神経系における主要細
胞クラスの同定』 J. Neurosci. 5:3310-3328. Ikeda ら, 1998. 『活性化ラット星状細胞はｃ−ｍｅｔを発現し、肝細胞成長
因子に応答して、形質転換成長因子β１発現およびＤＮＡ合成を促進する』Bioc
hem Biophys Res Commun 250:769-775. Johansson, C.B. ら. 1999. 『成体哺乳類中枢神経系における神経幹細胞の同
定』 Cell 96:25-34. Karlsson, S. 1991.『遺伝子導入による造血細胞機能における遺伝的欠陥の処
理』 Blood 78(10):2481-2492. Lendahl, U.,ら. 1990. 『ＣＮＳ幹細胞は新しいクラスの中間フィラメントタ
ンパク質を発現する』Cell 60:585-595. Miller, A.D. 1990.『レトロウイルス包装細胞』 Hum Gene Therapy 1:5. Morshead, C.M.ら. 1994. 『成体哺乳類前脳における神経幹細胞：上衣下細胞の
相対的静止期のサブポピュレーション』 Neuron 13:1071-1082. Rao. M.S. ら, 1996. 『転写因子および幹細胞因子の発現は、ラット膵臓にお
いて肝細胞分化より先に起こる』 Gene Expr 6:15-22. Reddy, J.K. ら, 1991. 『膵臓の肝細胞，成体ラットの膵臓における細胞系統
についてのインビボモデル』Dig. Dis. Sci. 36:502-509. Reimold, A.M. ら, 2000『転写因子ＸＢＰ−１に関する肝臓発生における主要
な役割』Genes Dev. 14:152-7. Reynolds, B.A.と Weiss, S. 1996.『クローン解析および集団分析はＥＧＦ応
答哺乳類胚ＣＮＳ前駆体が幹細胞であることを示す』Dev. Biol. 175:1-13. Schiffmann, ら. 1995. 『非除去(nonablated)レシピエントの造血幹細胞への
ヒトグルコセレブロシダーゼ遺伝子の導入：導入遺伝子の成功した植付けおよび
長期発現』Blood 86(3):1218-1227. Skrtic, S., ら, 1999. 『培養したラット肝臓星状細胞における肝細胞成長形
成（ＨＧＦ）の肝細胞刺激発現』 J. Hepatol. 30:115-124. Slack, J.M.W., 1995.『膵臓の発生生物学』 Development, 121:1569-1580. Stamatoglou, S.C. ら, 1992. 『肝臓発生および再生の間における接着分子の分
布の発現および時間的変化』 J. Cell. Biol. 116:1507-1515. Wang, Z.ら, 1998. 『膵島のＧＬＵＴ２：マウスにおける多数の低用量ストレ
プトゾトシンで誘導された糖尿病での重大な標的分子』Diabetes 47:50-56. Williams, D.A. 1990.『レトロウイルス媒介遺伝子導入後の造血細胞における
誘導された遺伝子配列の発現』Hum. Gene Therapy 1:229.

【０２３１】他の態様他の態様は、以下の特許請求の範囲に包含される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａおよび１Ｂは、出生後１６日目胚（図１Ａ）および出生後６０日目（
図１Ｂ）のラット膵島の二重蛍光免疫細胞化学染色を示す。ネスチンに対する抗
体での免疫染色は、白色（本来は赤色、蛍光団としてＣｙ３を用いる）で示され
、インスリンに対する抗体での免疫染色は、灰色（本来は緑色、蛍光団としてＣ
ｙ２を用いる）で示される。

【図２】図２は、５０のラット島から得られたｍＲＮＡを用いて行ったＲＴ−ＰＣＲの
結果を示す。フォワードプライマーおよびリバースプライマーが示される。８３
４ｂｐの単一のバンドは、配列決定され、ネスチンの配列として実質的に同定さ
れた。

【図３】図３は、培養されたラット島から増殖したネスチン陽性細胞を示す。

【図４】図４は、培養中の島様構造の発達を示す。

【図５】図５は、培養において生じた島様構造のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。ＮＣ
ＡＭおよびサイトケラチン−１９（ＣＫ１９）の発現を検出した。

【図６】図６は、高グルコースによるネスチンｍＲＮＡ発現の刺激を示す。ＡＰＲＴを
対照として調査した。

【図７】図７は、ネスチンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。

【図８】図８は、免疫細胞化学またはＲＴ−ＰＣＲにより決定された膵島内の個別の細
胞集団における神経幹細胞特異的マーカーネスチンの発現を示す。

【図９】図９は、免疫細胞化学およびＲＴ−ＰＣＲによる膵臓から単離された幹細胞に
おけるネスチンの特徴を示す。

【図１０】図１０は、ホメオドメインタンパク質ＩＤＸ−１の発現およびネスチン陽性島
前駆細胞（ＮＩＰ）から由来したヒト島様クラスターにおけるホメオドメインタ
ンパク質ＩＤＸ−１の発現を示す。

【図１１】図１１は、ラット膵臓の管の局在領域に対するネスチン陽性細胞の局在化を示
す。

【図１２】図１２は、島内分泌細胞の前駆体である膵臓の管細胞の起源に関する代替的な
モデルを示す。

【図１３】図１３ＡおよびＢは、ネスチン陽性肝臓幹細胞の免疫蛍光染色を示す。

【図１４】図１４は、マウスの内分泌膵臓の発達の間の転写因子の経時的な出現を示す。

【図１５】図１５は、幹細胞を含むヒトＮＩＰ培養における神経内分泌、外分泌の膵臓お
よび肝臓のマーカーの発現を示す。

【図１６】図１６は、ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたプログルカゴンおよびインスリンｍ
ＲＮＡの発現を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 43/00 １２１ 43/00 １２１Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/06 37/02 // Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (31)優先権主張番号６０／２３８，８８０ (32)優先日平成12年10月６日(2000．10．6) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ファウストマン，デニスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02193 ウェストン，パインクロフトロード 74 (72)発明者ハベナー，ジョエル，エフ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02161 ニュートン，プリマスロード 217 (72)発明者バレッジョ，マリオスペイン国マドリードイー−28014 ３デー，パスコインファンタイザベル 15 (72)発明者ツレヴスキ，ヘンリークスイス国ジュネーヴシーエイチ−1207 アヴェニューデラグレネード，19 (72)発明者トーマス，メリッサ，ケイ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02114 ボストン，アパートメント 2616，ワンロングフェロープレイス（番地なし) Ｆターム(参考） 4B065 AA91X AA93X AB10 AC20 BA30 BB01 BB34 BC01 BC50 CA43 CA44 4C084 AA13 AA14 AA16 BA44 MA02 NA14 ZB08 ZC75 4C085 AA14 CC03 CC04 DD61 DD62 EE03 4C086 AA01 AA02 CB25 MA02 ZB08 ZC35 4C087 AA01 AA02 BB64 BB65 CA04 CA10 MA02 NA14 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離す
るステップ、および（ｂ）該幹細胞を真性糖尿病患者に移入するステップ、ここで該幹細胞がイン
スリン産生細胞に分化する、を含む、真性糖尿病患者の治療方法。
【請求項２】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求項１
記載の方法。
【請求項３】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、請求項
１記載の方法。
【請求項４】該患者がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナーが非
ヒト哺乳動物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】ステップ（ｂ）の前に該患者を免疫抑制剤で処置しない、請
求項３または４記載の方法。
【請求項６】移入ステップの前に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース
、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ
−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよび
その組合せからなる群より選ばれる薬剤で幹細胞をエキソビボで処理する、請求
項１記載の方法。
【請求項７】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求項
１記載の方法。
【請求項８】（ｃ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項８
記載の方法。
【請求項１１】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項８
記載の方法。
【請求項１２】免疫応答が移植片拒絶である、請求項８、９、１０または
１１記載の方法。
【請求項１３】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項８記載の方法。
【請求項１４】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで培養するステップ、および（ｃ）前駆細胞を患者に移入するステップ、ここで該前駆細胞がインスリン産
生β細胞に分化する、を含む、真性糖尿病患者の治療方法。
【請求項１５】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張させて前駆細胞を作製するステップ、およ
び（ｃ）該前駆細胞を真性糖尿病患者に移入するステップ、ここで該前駆細胞が
インスリン産生β細胞に分化する、を含む、真性糖尿病患者の治療方法。
【請求項１６】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求項
１４または１５記載の方法。
【請求項１７】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、請求
項１４または１５記載の方法。
【請求項１８】該患者がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナーが
非ヒト哺乳動物である、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１９】ステップ（ｂ）の前に該患者を免疫抑制剤で処置しない、
請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／
ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核
酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる
群より選ばれる薬剤の存在下で該拡張ステップを行なう、請求項１５記載の方法
。
【請求項２１】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求
項１４または１５記載の方法。
【請求項２２】（ｄ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２３】（ｄ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項２２または２
３記載の方法。
【請求項２５】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項２
２または２３記載の方法。
【請求項２６】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項２
２または２３記載の方法。
【請求項２７】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項２４記載の方法
。
【請求項２８】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項２５記載の方法
。
【請求項２９】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項２６記載の方法
。
【請求項３０】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項３１】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞を拡張させて前駆細胞を作製するステップ、（ｃ）培養において該前駆細胞を分化させ、偽島様凝集塊を形成させるステッ
プ、および（ｄ）該偽島様凝集塊を患者に移入するステップを含む、真性糖尿病患者の治療方法。
【請求項３２】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求項
３１記載の方法。
【請求項３３】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、請求
項３１記載の方法。
【請求項３４】該患者がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナーが
非ヒト哺乳動物である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】ステップ（ｂ）の前に該患者を免疫抑制剤で処置しない、
請求項３３または３４記載の方法。
【請求項３６】移入ステップの前に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコー
ス、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤ
Ｘ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよ
びその組合せからなる群より選ばれる薬剤の存在下で該拡張ステップを行なう、
請求項３１記載の方法。
【請求項３７】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求
項３１記載の方法。
【請求項３８】（ｅ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項３８記載の方
法。
【請求項４０】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項３
８記載の方法。
【請求項４１】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項３
８記載の方法。
【請求項４２】免疫応答が移植片拒絶である、請求項３９、４０または４
１記載の方法。
【請求項４３】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】（ａ）ドナーから膵島を取り出すステップ、（ｂ）該膵島由来の細胞を培養するステップ、および（ｃ）培養物からネスチン陽性クローンを選択するステップを含む、膵ランゲルハンス島から幹細胞を単離する方法。
【請求項４５】培養を、最初はコンカナバリンＡをコートした容器内で行
い、次いで、コンカナバリンＡをコートしていない容器内で再度行う、請求項４
４記載の方法。
【請求項４６】（ｄ）ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、
ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコー
ドする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せ
からなる群より選ばれる薬剤での処理によりネスチン陽性クローンを拡張させる
、さらなるステップを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／
ＳＦ、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核酸分子、ＧＬＰ−１、エキセンジ
ン−４、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる
群より選ばれる薬剤でネスチン陽性膵臓幹細胞を処理するステップ、それにより
、該幹細胞が、その後、膵臓前駆細胞に分化する、を含む、膵臓前駆細胞へのネスチン陽性膵臓幹細胞の分化を誘導する方法。
【請求項４８】膵臓前駆細胞が、その後、偽島様凝集塊を形成する、請求
項４７記載の方法。
【請求項４９】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、および（ｂ）該幹細胞を哺乳動物に移入するステップ、ここで該幹細胞がインスリン
産生細胞に分化する、を含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項５０】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請
求項４９記載の方法。
【請求項５１】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、
請求項４９記載の方法。
【請求項５２】哺乳動物がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナー
が非ヒト哺乳動物である、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】ステップ（ｂ）の前に該哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い、請求項５１または５２記載の方法。
【請求項５４】移入ステップの前に、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコー
ス、ＫＧＦ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤ
Ｘ−１をコードする核酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよ
びその組合せからなる群より選ばれる薬剤で幹細胞をエキソビボで処理する、請
求項４９記載の方法。
【請求項５５】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求
項４９記載の方法。
【請求項５６】（ｃ）該哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５７】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項５６記載の方
法。
【請求項５８】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項５
６記載の方法。
【請求項５９】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項５
６記載の方法。
【請求項６０】免疫応答が移植片拒絶である、請求項５６、５７、５８ま
たは５９記載の方法。
【請求項６１】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項５６記載の方法。
【請求項６２】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで培養するステップ、および（ｃ）前駆細胞を哺乳動物に移入するステップ、ここで該前駆細胞がインスリ
ン産生β細胞に分化する、を含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項６３】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張させて前駆細胞を作製するステップ、およ
び（ｃ）該前駆細胞を哺乳動物に移入するステップ、ここで該前駆細胞がインス
リン産生β細胞に分化する、を含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項６４】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請
求項６２または６３記載の方法。
【請求項６５】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、
請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６６】哺乳動物がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナー
が非ヒト哺乳動物である、請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６７】ステップ（ｂ）の前に該哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】ステップ（ｂ）の前に該哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／
ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核
酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる
群より選ばれる薬剤の存在下で該拡張ステップを行なう、請求項６３記載の方法
。
【請求項７０】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求
項６２または６３記載の方法。
【請求項７１】（ｄ）該哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項６２記載の方法。
【請求項７２】（ｄ）該哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項７３】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項７１または７
２記載の方法。
【請求項７４】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項７
１または７２記載の方法。
【請求項７５】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項７
１または７２記載の方法。
【請求項７６】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項７３記載の方法
。
【請求項７７】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項７４記載の方法
。
【請求項７８】前記免疫応答が移植片拒絶である、請求項７５記載の方法
。
【請求項７９】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項７１または７２記載の方法。
【請求項８０】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単離
するステップ、（ｂ）該幹細胞を拡張させて前駆細胞を作製するステップ、（ｃ）該培養において該前駆細胞を分化させ、偽島様凝集塊を形成させるステ
ップ、および（ｄ）該偽島様凝集塊を哺乳動物に移入するステップを含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項８１】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請
求項８０記載の方法。
【請求項８２】該哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、
請求項８０記載の方法。
【請求項８３】哺乳動物がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナー
が非ヒト哺乳動物である、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】ステップ（ｂ）の前に該哺乳動物を免疫抑制剤で処置しな
い、請求項８２または８３記載の方法。
【請求項８５】ＥＧＦ、ｂＦＧＦ−２、高グルコース、ＫＧＦ、ＨＧＦ／
ＳＦ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＩＤＸ−１、ＩＤＸ−１をコードする核
酸分子、ベータセルリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−βおよびその組合せからなる
群より選ばれる薬剤の存在下で該拡張ステップを行なう、請求項８０記載の方法
。
【請求項８６】移入ステップを内視鏡下の逆行性注入により行なう、請求
項８０記載の方法。
【請求項８７】（ｅ）該哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８８】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項８７記載の方
法。
【請求項８９】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項８
７記載の方法。
【請求項９０】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項８
７記載の方法。
【請求項９１】免疫応答が移植片拒絶である、請求項８８、８９または９
０記載の方法。
【請求項９２】免疫抑制剤が、ＦＫ−５０６、シクロスポリンおよびＧＡ
Ｄ６５抗体からなる群より選ばれる、請求項８７記載の方法。
【請求項９３】神経幹細胞でない、単離されたネスチン陽性ヒト膵臓幹細
胞。
【請求項９４】分化してインスリン産生β細胞を形成する、請求項９３記
載の単離された幹細胞。
【請求項９５】分化してグルカゴン産生α細胞を形成する、請求項９３記
載の単離された幹細胞。
【請求項９６】分化して偽島様凝集塊を形成する、請求項９３記載の単離
された幹細胞。
【請求項９７】分化して肝細胞を形成する、請求項９３記載の単離された
幹細胞。
【請求項９８】免疫寛容である、請求項９３記載の単離された幹細胞。
【請求項９９】ＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない、請求項９３記載の単離
された幹細胞。
【請求項１００】ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現しない、請求項９３記載の
単離された幹細胞。
【請求項１０１】ＭＨＣクラスＩ抗原もＭＨＣクラスＩＩ抗原も発現しな
い、請求項９３記載の単離された幹細胞。
【請求項１０２】細胞を、標識されたネスチン特異的抗体と接触させるス
テップ、それにより、該細胞が該抗体で標識されれば、該細胞を幹細胞であると
同定する、を含む、膵細胞を幹細胞であると同定する方法。
【請求項１０３】細胞を、標識されたサイトケラチン−１９特異的抗体と
接触させるステップ、それにより、該細胞が該抗体で標識されなければ、該細胞
を幹細胞であると同定する、をさらに含む、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】細胞を、標識された第ＩＶコラーゲン特異的抗体と接触
させるステップ、それにより、該細胞が該抗体で標識されなければ、該細胞を幹
細胞であると同定する、をさらに含む、請求項１０２または１０３記載の方法。
【請求項１０５】肝細胞に分化するように、または肝細胞に分化する前駆
細胞に分化するようにネスチン陽性膵臓幹細胞を誘導する薬剤の有効量で、該幹
細胞を処理するステップを含む、ネスチン陽性膵臓幹細胞の肝細胞への分化を誘導する方法。
【請求項１０６】薬剤がシクロパミンである、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、および（ｂ）該幹細胞を患者に移入するステップ、ここで該幹細胞が肝細胞に分化す
る、を含む、肝臓疾患患者の治療方法。
【請求項１０８】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求
項１０７記載の方法。
【請求項１０９】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張させて前駆細胞を作製するステップ、およ
び（ｃ）該前駆細胞を患者に移入するステップ、ここで該前駆細胞は肝細胞に分
化する、を含む、肝臓疾患患者の治療方法。
【請求項１１０】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求
項１０９記載の方法。
【請求項１１１】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで分化させて肝細胞を作製するステップ、および
（ｃ）該肝細胞を患者に移入するステップを含む、肝臓疾患患者の治療方法。
【請求項１１２】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとする、請求
項１１１記載の方法。
【請求項１１３】該患者をステップａの前記幹細胞のドナーとしない、請
求項１０７、１０９または１１１記載の方法。
【請求項１１４】該患者がヒトであり、ステップａの前記幹細胞のドナー
が非ヒト哺乳動物である、請求項１０７、１０９または１１１記載の方法。
【請求項１１５】ステップ（ｂ）の前に該患者を免疫抑制剤で処置しない
、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１６】ステップ（ｂ）の前に該患者を免疫抑制剤で処置しない
、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】（ｃ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１８】（ｃ）該患者を免疫抑制剤で処置するステップをさらに含む、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１９】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項１１７記載
の方法。
【請求項１２０】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項
１１７記載の方法。
【請求項１２１】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項
１１７記載の方法。
【請求項１２２】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１１７記載の方法
。
【請求項１２３】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１１８記載の方法
。
【請求項１２４】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１１９記載の方法
。
【請求項１２５】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１２０記載の方法
。
【請求項１２６】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１２１記載の方法
。
【請求項１２７】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、および（ｂ）該幹細胞を前記哺乳動物に移入するステップ、ここで該幹細胞が肝細胞
に分化する、を含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項１２８】前記哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする
、請求項１２７記載の方法。
【請求項１２９】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで拡張させて前駆細胞を作製するステップ、およ
び（ｃ）該前駆細胞を前記哺乳動物に移入するステップ、ここで該前駆細胞が肝
細胞に分化する、を含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項１３０】前記哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする
、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】（ａ）ドナーの膵島からネスチン陽性膵臓幹細胞を単
離するステップ、（ｂ）該幹細胞をエキソビボで分化させて肝細胞を作製するステップ、および
（ｃ）該肝細胞を前記哺乳動物に移入するステップを含む、哺乳動物への移植方法。
【請求項１３２】前記哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとする
、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】前記哺乳動物をステップａの前記幹細胞のドナーとしな
い、請求項１２７、１２９または１３１記載の方法。
【請求項１３４】前記哺乳動物がヒトであり、ステップａの前記幹細胞の
ドナーが非ヒト哺乳動物である、請求項１２７、１２９または１３１記載の方法
。
【請求項１３５】ステップ（ｂ）の前に前記哺乳動物を免疫抑制剤で処置
しない、請求項１３３記載の方法。
【請求項１３６】ステップ（ｂ）の前に前記哺乳動物を免疫抑制剤で処置
しない、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３７】（ｃ）前記哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップ
をさらに含む、請求項１３３記載の方法。
【請求項１３８】（ｃ）前記哺乳動物を免疫抑制剤で処置するステップ
をさらに含む、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３９】前記免疫抑制剤が免疫応答を妨げる、請求項１３７記載
の方法。
【請求項１４０】前記免疫抑制剤が免疫応答の発現を遅滞させる、請求項
１３７記載の方法。
【請求項１４１】前記免疫抑制剤が免疫応答の強度を低下させる、請求項
１３７記載の方法。
【請求項１４２】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１３７記載の方法
。
【請求項１４３】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１３８記載の方法
。
【請求項１４４】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１３９記載の方法
。
【請求項１４５】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１４０記載の方法
。
【請求項１４６】免疫応答が移植片拒絶である、請求項１４１記載の方法
。
【請求項１４７】神経幹細胞でない、単離されたネスチン陽性ヒト肝臓幹
細胞。
【請求項１４８】免疫寛容である、請求項１４７記載の単離された幹細胞
。
【請求項１４９】ＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない、請求項１４７記載の
単離された幹細胞。
【請求項１５０】ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現しない、請求項１４７記載
の単離された幹細胞。
【請求項１５１】ＭＨＣクラスＩ抗原もＭＨＣクラスＩＩ抗原も発現しな
い、請求項１４７記載の単離された幹細胞。
【請求項１５２】対宿主性移植片拒絶を引き起こすことなく動物に移植が
可能な、神経幹細胞でない、単離されたネスチン陽性のヒト幹細胞。
【請求項１５３】主要組織適合性複合体のクラスＩ分子拘束性でもクラス
ＩＩ分子拘束性でもない、請求項１５２記載の単離されたネスチン陽性のヒト幹
細胞。
【請求項１５４】生理学的に適合性のある担体と混合された請求項９３記
載の単離された幹細胞を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５５】生理学的に適合性のある担体と混合された請求項１４７
記載の単離された幹細胞を含有してなる医薬組成物。
【請求項１５６】生理学的に適合性のある担体と混合された請求項１５２
記載の単離された幹細胞を含有してなる医薬組成物。