BR102013033827B1

BR102013033827B1 - Concentrado multipotente e imunocompatível de células-tronco e biofármaco e forma de dosagem que o compreendem

Info

Publication number: BR102013033827B1
Application number: BR102013033827-3A
Authority: BR
Inventors: Alexandre Kerkis; Cristiane Valverde Wenceslau; Michele Andrade De Barros; João Flávio Panattoni Martins
Original assignee: Regenera - Medicina Veterinária Avançada Ltda.
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2021-09-08
Also published as: EP3087176C0; US11020436B2; AU2014373637B2; CA2935211A1; BR102013033827A2; EP3087176B1; EP3087176A4; US20160324899A1; WO2015095947A1; AU2014373637A1; EP3087176A1; CA2935211C

Abstract

concentrado multipotente e imunocompatível de células tronco, uso do concentrado, biofármaco, forma de dosagem, método de tratamento e processo de obtenção de concentrado de células tronco. a presente invenção refere-se, em sua generalidade, a um concentrado de células tronco isolado a partir de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, biofármacos que contém tal concentrado, seu uso em terapias aplicadas em doenças de mamíferos.

Description

[001] A presente invenção se refere, em sua generalidade, a um concentrado de células-tronco isolado a partir de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, através do método aqui descrito, biofármacos que contém tal concentrado, e seu uso em terapias aplicadas em doenças de mamíferos.

[002] No contexto deste documento o termo “células-tronco” é sinônimo de células-tronco multipotentes, células-tronco mesenquimais, células sinalizadoras medicinais, células mesenquimais estromais e células-tronco adultas.

PRECEDENTES

[003] É sabido que células-tronco têm a habilidade de se dividirem em cultura por períodos indefinidos e originar células especializadas. Podem dar origem a muitos tipos de células diferenciadas e ser utilizadas para tratar muitos tipos de doenças.

[004] É também conhecida a existência de células-tronco adultas em tecido adiposo de mamíferos. Tais células já foram isoladas e cultivadas para serem utilizadas em terapias celulares, como transplantes.

[005] Entretanto, até o presente, os conhecimentos existentes sobre tais células-tronco não resolveram vários inconvenientes. Entre eles, a pequena produtividade dos processos de multiplicação de tais células frente às necessidades de seu uso, assim como pouca compreensão quanto à composição das células-tronco utilizadas nas terapias celulares. De uma forma geral, a fração das células-tronco isoladas do tecido adiposo é denominada fração estromal vascular do tecido adiposo que deriva de células perivasculares e que também tem propriedades de ação parácrina semelhante a células-tronco mesenquimais.

[006] Ainda, há grande quantidade de células-tronco para obter eficácia nas várias terapias, tipicamente entre 2x106e 8x106células por quilo de peso do paciente.

[007] Pode ainda ser mencionado que, mesmo multipotentes, as células- tronco derivadas de tecido adiposo conhecidas no estado da técnica têm sido reportadas em casos limitados de uso no tratamento de certos tipos de doenças e tecidos.

[008] Esses fatos fazem com que a utilização de células-tronco derivadas de tecido adiposo em terapias celulares seja limitada e cara, independentemente do fato de que tais células sejam mais abundantes do que aquelas obtidas de outras fontes.

[009] A presente invenção apresenta aprimoramentos e soluções a tais situações do estado da técnica, pois propicia: - um processo de alta produtividade de células-tronco multipotentes imunocompatíveis originadas de tecido adiposo vascularizado, incluindo cultivo e divisão celular, - um concentrado sinérgico de células imunocompatíveis e multipotentes que permite a utilização de menor quantidade de células-tronco em grande variedade de tratamentos terapêuticos de doenças em mamíferos (envolvendo, por exemplo, doenças osteoarticulares, musculares, neurológicas, hematológicas, oftalmológicas, do sistema urinário e muitas outras). BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS - a figura 1 é um gráfico do aumento dos níveis do hematócrito após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; - a figura 2 é um gráfico do aumento dos níveis dos leucócitos após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; - a figura 3 é um gráfico do aumento dos níveis das plaquetas após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; - a figura 4 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal antes do tratamento com o concentrado de células da invenção; - a figura 5 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal após tratamento com o concentrado de células da invenção; - a figura 6 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal após o segundo transplante com o concentrado de células da invenção.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[010] A presente invenção, em um primeiro aspecto, refere-se a um concentrado multipotente e imunocompatível de células-tronco secretoras de moléculas medicinais, originado de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, compreendendo: células-tronco imaturas (CTI), células-tronco mesenquimais (CTM) e células perivasculares (pericitos).

[011] O concentrado de células-tronco da invenção, isolado de mamíferos, é imunopositivo para ao menos para os marcadores CD146+, α- SMA+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD13+, vimentina+, nestina+, Nanog +, Oct3/4+, Sox2+ e imunonegativo ao menos para os marcadores: CD34-, CD45-, CD56-, CD144-, CD14-, CD11b- e CD31-. Adicionalmente, isolado de humanos, o concentrado de células-tronco da invenção é imunopositivo para marcadores NG2+, PDGFRβ+, CD271+ (P75), CD29+, SOX9+, SOX17+, FOX2+, CD140+ e negativo para KLF4-.

[012] Tipicamente os teores das células-tronco no concentrado da invenção são: - CTI: 1% a 20% - CTM: 70% a 100% - Pericitos: 10% a 30%

[013] A menção a “teores de células-tronco” refere-se às quantidades de células que expressam os respectivos marcadores (respectivamente de CTI, de CTM ou de pericitos).

[014] De forma particular, sem excluir qualquer outra, os concentrados da invenção têm teores de 5% de CTI, 100% CTM e 20% pericitos, ou valores próximos a esses.

[015] Os teores de células-tronco imaturas (CTI), células-tronco mesenquimais (CTM) e pericitos obtidos dos múltiplos nichos de células-tronco do tecido adiposo variam entre os pacientes, e variam ainda com o método de isolamento. Assim, podem ser utilizadas misturas de concentrados obtidos de 2 ou mais doadores, para se atingir teores médios distintos dos individuais. Ainda alternativamente o concentrado de células-tronco pode ser enriquecido com pericitos especificamente cultivados.

[016] A composição de células no concentrado da invenção é sinérgica, uma vez que a combinação dos efeitos das CTI, CTM e pericitos resulta, de forma imprevista, na utilização de menor quantidade de células em comparação com quantidades de células-tronco atualmente utilizadas para se obter eficácia em tratamentos terapêuticos, como descrito mais adiante.

[017] As variações da composição de células-tronco do concentrado são também importantes, pois dependendo do tratamento da doença, trauma ou injúria ou aspecto estético-dermatológico, essa composição pode ser purificada e/ou enriquecida com células que expressam os marcadores importantes para cada tipo de doença, trauma, injúria ou outro. Uma composição terapêutica pode ser ajustada para as necessidades do paciente em relação à proporção dos marcadores que se expressam pelas células do concentrado, assim como em relação à dosagem das células-tronco, ou seja, propõe-se medicina personalizada.

[018] As células do concentrado da invenção podem ser utilizadas no seu estado não diferenciado de células-tronco, assim como as mesmas podem ser induzidas a produzir os precursores de uma linhagem específica (por exemplo, células gliais) do interesse para o tratamento, que podem ser purificados e aplicados como população pura dos precursores que são comprometidos com a diferenciação celular de um único tipo, visando o benefício do efeito autócrino destas células. Por outro lado, estas células têm efeitos parácrinos que são produzidos pelas células quando não são diferenciadas. Para um efeito terapêutico mais abrangente, a composição de células não diferenciadas pode ser aplicada junto com as células precursoras.

[019] Estas células precursoras têm a capacidade de se diferenciar in vitro pelo menos em derivados de dois folhetos embrionários: mesoderma (osso, cartilagem, músculo, etc.) e ectoderma (células neurais). Porém a sua diferenciação não se limita somente a mesoderma e ectoderma, pois sob condições apropriadas, essas células podem também produzir os tipos celulares provenientes de endoderma, o que as caracteriza como células multipotentes.

[020] As células contidas no concentrado da invenção têm características fenotípicas e funcionais semelhantes, porém distintas em vários aspectos (divisão celular, expressão de alguns genes e proteínas, bem como a ação parácrina), daquelas que apresentam dentro do organismo do doador (in vivo).

[021] Existem diferenças significativas entre as linhagens celulares do concentrado da invenção e do tecido adiposo in vivo. Os níveis de pós- diferenciação de fatores secretados TNFα e leptina em cultura (in vitro) de células do tecido adiposo são muito mais baixos quando comparados com os do tecido in vivo. Além disso, um regulador importante precoce da transcrição da adipogênese, KLF4, tem a expressão significativamente mais elevada in vivo, do que in vitro. Assim, não se trata de mero isolamento de células-tronco, tal como se encontram no tecido do organismo do doador, mas trata-se de retirá-las, tratá-las e multiplicá-las de forma específica para que adquiram as características aperfeiçoadas e adequadas a finalidades terapêuticas da invenção.

[022] O concentrado de células-tronco da invenção não induz resposta imunológica, podendo ser utilizado em transplantes autogênico (o paciente é doador e receptor), alogênico (o doador é aparentado ou é da mesma espécie que o paciente) e xenogênico (células-tronco provenientes de espécies diferentes, não aparentadas).

[023] Ainda, a utilização do concentrado de células da invenção em tratamentos terapêuticos não gera efeitos colaterais, tais como os tipicamente observados em tratamentos terapêuticos tradicionais que utilizam compostos sintéticos, seja a curto ou longo prazo.

[024] O concentrado de células-tronco da invenção é particularmente adequado a terapias celulares, particularmente transplantes celulares. O concentrado de células-tronco da invenção pode derivar em amplo espectro de tecidos derivados dos três folhetos embrionários (mesoderma, ectoderma e endoderma).

[025] Um aspecto particular da invenção se refere à padronização que deve ser buscada em seus vários aspectos para garantir o sucesso dos efeitos obtidos, seja quanto à grande produção de células a partir de tecido adiposo vascularizado, seja quanto à potência e à eficiência terapêutica obtidas com utilização de menor quantidade de células em comparação com o estado da técnica.

[026] Dentro de um aspecto importante da invenção está a qualidade do doador como fonte de tecido adiposo. Na área veterinária, o isolamento de células-tronco de animais jovens e sadios propicia resultados efetivos quanto a alta produtividade, potência e eficiência terapêutica, em comparação com o isolamento de células de animais adultos e/ou idosos, ou com doenças já instaladas, que propiciam efeitos insatisfatórios. Dessa forma, para uma realização otimizada da invenção, a idade adequada do mamífero doador é entre 20% e 30% de sua vida total. De forma particular, para cachorros e gatos doadores de tecido adiposo vascularizado são adequadas como faixas otimizadas de idades do doador até 2 - 3 anos de vida. Para equinos, até 6 - 7 anos de vida.

[027] Ainda na área veterinária, um local adequado de escolha para a biópsia de coleta de tecido adiposo é região lateral do flanco ou superfície lateral do membro posterior, porém a coleta não se limita a estas regiões, desde que elas permitam a coleta de tecido adiposo vascularizado. De forma vantajosa a coleta de tecido adiposo pode ser realizada durante procedimentos cirúrgicos eletivos em cães e gatos - por exemplo, castração de fêmeas (ovário salpingo histerectomia) e castração pré-escrotal e inguinal de machos. Evita-se com isso a necessidade de procedimento cirúrgico específico para colher amostra, evitando mais dor e sofrimento ao paciente. Para o processo de grande produtividade de obtenção do concentrado de células-tronco da invenção basta a coleta de um pequeno fragmento de gordura visceral vascularizada, por exemplo, entre 0,1 e 0,3 cm3, como um fragmento de 0,5x0,5x0,5 cm. O pequeno tamanho da amostra coletada também facilita, quando necessário, o transporte da amostra até o laboratório (por exemplo, utilizando um kit adaptado a essa finalidade) e sua preservação até início de um procedimento de isolamento das células in vitro.

[028] O concentrado de células-tronco da invenção pode ser crio- preservado de forma conhecida do técnico no assunto, para ser estocado em vista de uso posterior, em que será submetido a procedimento de descongelamento, também conhecido do homem da técnica. Por exemplo, os concentrados de células-tronco da invenção podem ser congelados na concentração de 1x106ou 2x106em criotubos e mantidas a -80oC por três meses, sendo então transferidas para o nitrogênio líquido a -196oC. O meio de cultivo utilizado para criopreservar as células as mantêm viáveis e preserva seu potencial de diferenciação, por exemplo, composto por 45% de DMEM-h (Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glicose), 45% de soro fetal bovino e 10% de dimetilsulfóxido.

[029] Com relação à aplicação da invenção na área veterinária, sobre o aspecto da saúde do animal doador de tecido adiposo, é vantajoso, para garantir efeitos otimizados da invenção, que os animais (particularmente cães, gatos e cavalos) estejam em dia com a vermifugação para nematódeos e cestódeos, e com as seguintes vacinações: - cães: vírus da cinomose, hepatite, parvovirose, 4 cepas de leptospirose, coranivrose, parainfluenza, laringotraqueíte, giardia, tosse dos canis e anti- rábica; - gatos: vírus de rinotraqueíte, calicivirose, panleucopenia, leucemia felina, clamidiose, antirábica. - cavalos: vírus da raiva, influenza equina, encefalomielite.

[030] Dentro de outro aspecto, a invenção se refere ao uso do concentrado de células-tronco da invenção caracterizado por ser na preparação de produtos úteis no tratamento de doenças, traumas, injúrias ou aspectos estético-dermatológicos com transplante de células. Sem excluir qualquer outro, exemplos de tais produtos são os biofármacos, soluções, comprimidos, formulações oftalmológicas, formulações para aplicação tópica e mucosal, etc.

[031] Dentro de outro aspecto, a invenção se refere a biofármacos, caracterizados pelo fato de compreender o referido concentrado de células- tronco e um ou mais ingredientes biologicamente aceitáveis, por exemplo solução fisiológica, biomateriais (por exemplo biomateriais poliméricos), fatores de crescimento (por exemplo VEGF, TGF-beta, ITK), células mononucleares, plasma rico em plaquetas, fibrina, hidroxiapatita, membranas de colágenos, moléculas bioativas (por exemplo, hormônios e mitôgenos). De maneira típica, uma formulação para injeção compreende minimamente o concentrado de células-tronco da invenção e solução fisiológica.

[032] A invenção se beneficia de aspectos particulares do processo de obtenção do concentrado sinérgico de células-tronco, por exemplo, o isolamento de uma maior quantidade de células-tronco a partir dos múltiplos nichos de células adiposas em um mesmo fragmento de tecido, que em cultura de explante libera in vitro quantidades ilimitadas de células-tronco em cultivo. Assim, os fragmentos de tecido adiposo inicialmente plaqueados em garrafas de cultivo podem ser transferidos para novas garrafas de cultivo a fim de manter a liberação de novas células-tronco.

[033] Assim, sem excluir qualquer outro, um processo vantajoso de obtenção de composição sinérgica de células-tronco da invenção compreende as seguintes etapas: A - obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado de mamífero, particularmente de mamífero jovem e sadio; B - lavagem e limpeza da amostra de tecido, por exemplo, com solução fisiológica e antibiótico; C - fragmentação da amostra de tecido; D - digestão enzimática suave dos fragmentos do tecido adiposo, para eliminar adipócitos, até a inativação da enzima, por exemplo, colagenase tipo I ou IV; E - centrifugação para obter as células da fração vascular do tecido adiposo; F - cultivo de explante de tecido - particularmente 5-7 fragmentos de tecido por garrafa de 25 cm2de material aderente, durante 3 a 5 dias, sem trocar o meio de cultivo; G - ao se atingir confluência entre 70 e 90%, dissociar via ação enzimática as colônias celulares migradas para fora do tecido; H - opcionalmente, o tecido separado na etapa E pode ser submetido a novo cultivo de explante, iniciando nova etapa F; I - expansão das células isoladas na etapa G, particularmente até no máximo 6 passagens para uso posterior em terapia celular.

[034] Após a etapa A, a amostra do tecido colhido é preparada com limpeza e lavagem, podendo ser colocada em recipiente que serve de meio armazenagem temporária para transporte até outro local por até 48 horas. Há kits conhecidos no estado da técnica para essa finalidade.

[035] Conforme já mencionado, para garantir resultados otimizados da invenção, o mamífero doador de tecido adiposo vascularizado deve ser jovem e sadio. De forma vantajosa, a idade do doador deve ser até no máximo 30% da sua vida total, preferencialmente até 20%. Sua saúde deve ser tal que exclua essencialmente qualquer doença.

[036] O processo utilizado permite evitar qualquer tipo de filtração do fluido celular ou prescinde de qualquer tipo de seleção das células utilizando tamanho, granularidade ou marcadores específicos, por exemplo, miçangas magnéticas e anticorpos específicos.

[037] Um aspecto da digestão enzimática do tecido adiposo na etapa D, é que não se descartam vasos ou gordura da amostra após a digestão. A enzima é adequada à digestão suave do tecido conjuntivo, por exemplo, colagenase tipo I ou tipo IV, como o produto GIBCO©, da empresa norte americana Life Technologies.

[038] Se deseja enriquecer o concentrado de células-tronco da invenção com pericitos, os vasos sanguíneos obtidos a partir da suave digestão são separados da amostra de tecido adiposo, e o cultivo de explante é realizado apenas com eles, conforme as etapas F, G e I. Os pericitos obtidos podem mais tarde ser adicionados ao concentrado que se deseja enriquecer.

[039] Na etapa F, prefere-se que o meio de cultura não seja trocado durante 3-5 dias, podendo ser reposta quantidade equivalente ao meio evaporado. A manutenção do meio de cultura durante esse tempo propicia seleção somente das células que têm potencial de adesão ao plástico da garrafa de cultura, uma característica das células-tronco mesenquimais. A confluência entre 70 e 90% permite isolar múltiplas colônias de células fusiformes, com morfologia mesenquimal, de tamanho substancialmente padronizado.

[040] Para favorecer o bom desempenho do concentrado da invenção, o meio de cultivo na etapa F deve ser de alta qualidade, ou seja, padronizado, com um mínimo de variação de seus componentes pré-identificados. Um exemplo adequado de tal meio de cultivo, sem excluir qualquer outro, é DMEM-h (Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glicose), comercializado pelo nome GIBCO©pela empresa norte-americana Life Technologies, suplementado com 15% de soro fetal bovino da empresa norte-americana Hyclone, suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de mistura estreptomicina/penicilina para neutralizar a colagenase (todos ingredientes da empresa norte-americana Life Technologies).

[041] Na etapa H, o fragmento do tecido adiposo em cultura pode ser transferido várias vezes na garrafa de cultivo, particularmente até 5 vezes, e continua liberando células.

[042] Verifique-se que, na etapa I, a expansão das células até 6 passagens é voltada para utilização segura em terapia celular, evitando que sejam induzidas mudanças em seu cariótipo, proliferação ou estado indiferenciado. Para outras aplicações na ciência básica e aplicada o número de passagens pode ser superior à sexta passagem.

[043] Dentro de mais um aspecto, a invenção se refere aos concentrados de células-tronco descritos, caracterizados por ser para uso em terapia médica, veterinária ou cosmética.

[044] Dentro de mais um aspecto, a invenção se refere ao uso do concentrado de células-tronco da invenção em terapias (autólogas, heterólogas e em xenotransplantes) de tratamento de doenças de mamíferos, como doenças articulares, neurológicas, hematológicas, oftalmológicas, doença renal aguda e crônica, doença, diabetes e lesão medular espinal aguda.

[045] Em particular, na área veterinária, podem ainda ser citadas, sem excluir quaisquer outras, terapias de patologias como: - doenças hematopoiéticas (aplasia e hipoplasia medular) - doenças articulares (displasia coxofemoral, osteoartrite, processo degenerativo) - fissuras, falhas e fraturas ósseas - laceração de tendão e ligamentos - ceratoconjuntivite seca, úlcera de córnea - sequela neurológica derivada do vírus da cinomose - doença renal aguda e crônica - miosite mastigatória - diabetes tipo I - para cães: sequelas neurológicas da cinomose e outras doenças neurodegenerativas, displasia coxofemural, miosite mastigatória; - para cães e gatos: aplasia e hipoplasia medular; fraturas ósseas; doenças osteoarticulares degenerativas, lesão medular espinal aguda, doença renal aguda e crônica, doenças oculares (por exemplo, degeneração retiniana, ceratoconjuntivite seca), diabetes; - para cavalos: lesão tendíneas e ligamentares, sequela neurológica promovida pelo vírus da encefalomielite, osteoartrite e laminites.

[046] Dentro de mais um aspecto, a presente invenção refere-se a formas de dosagem para o tratamento de doenças de mamíferos, sendo que de forma particular a quantidade de células do concentrado de células-tronco varia, por exemplo, entre 1x106a 10 x107de células-tronco.

Avaliação De Potencial Tumorigênico

[047] A avaliação de potencial tumorigênico do concentrado de células da invenção foi feito de forma conhecida do técnico no assunto, por exemplo, a partir das informações contidas em Cell Cycle(2009). 15;8(16), 2608-2612 e “Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research”, em www.stembook.org.

[048] O concentrado celular da invenção com 2x106de células foi injetado no membro pélvico de 5 camundongos da linhagem nude. Os camundongos foram mantidos em condições normais por um período de 60 dias. Após tal período foram eutanasiados, não tendo sido observada nenhuma massa neoformada no músculo e outro órgão.

Exemplos

[049] São dados a seguir exemplos de realização da presente invenção. Tais exemplos devem ser apreciados apenas como ilustrativos de realizações particulares da invenção, sem que imponham limites, de qualquer forma que seja, além das contidas nas reivindicações anexas.

Exemplo 1 - Isolamento das células-tronco inventivas do tecido adiposo de cães e gatos

[050] Nos exemplos dados mais além, a obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado seguiu o procedimento abaixo.

[051] Primeiramente a região de escolha, lateral do membro posterior do animal, foi bem lavada com água e sabão. Em seguida raspou-se a pele utilizando lâmina de barbear ou navalha, limpando a região novamente com água e sabão. Em seguida limpou-se a área com gaze umedecida em clorexidina degermante (solução de digliconato de clorexidina degermante 2% Riohex, comercializada pela empresa brasileira Rioquimica). Este procedimento foi realizado duas vezes. Em seguida foram aplicados 5 ml do anestésico lidocaína na região de coleta. Essa região foi primeiramente isolada com panos de campos estéreis para em seguida realizar a incisão na pele com auxílio de um bisturi de 2 a 3 cm de extensão. Retirou-se o fragmento de gordura, com cerca de 0,5x0,5x0,5 cm utilizando bisturi e pinça-allis, de forma a garantir a presença de vasos sanguíneos na amostra. Realizada a coleta, foi limpado o local com gaze estéril de forma a secar os possíveis sangramentos e suturar a pele (fio), seguindo-se desinfecção após a sutura, por exemplo como rifocina.

[052] O tecido adiposo coletado foi primeiramente lavado em solução de tampão fosfato-salino (PBS) com 5% de estreptomicina/penicilina para a retirada de sangue, debris e possíveis contaminantes eventualmente presentes na amostra. O procedimento de lavagem foi repetido 5 vezes. Em seguida utilizou- se uma gaze estéril para retirar o excesso de PBS contido na amostra. O tecido foi transferido para uma placa de petri de 60 mm de diâmetro para realizar a fragmentação do tecido com auxílio de uma lâmina de bisturi n° 22 para obter vários fragmentos de dimensões menores. Em seguida foram adicionados na placa de cultivo 2 ml de colagenase tipo I ou tipo IV (Gibco®) a 0,075%, diluído em PBS, a 37oC. Os fragmentos juntamente com a colagenase foram mantidos entre 2 e 4 horas a 37oC, sob atmosfera de 5% de CO2. Durante a incubação com colagenase, pelo menos a cada 2 horas se homogeneizou a amostra com auxílio de uma pipeta graduada de 1000 μl.

[053] Passado este período foram adicionados 5 ml do seguinte meio de cultivo: DMEM suplementado com 15% de soro fetal bovino da empresa norte- americana Hyclone, suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de mistura estreptomicina/penicilina para neutralizar a colagenase (todos ingredientes da empresa norte-americana Life Technologies). O conteúdo foi transferido para um tubo tipo cônico de 15 ml, e centrifugado durante 5 minutos a 200g. Este procedimento foi realizado duas vezes para a completa inativação da colagenase. Na última centrifugação as células foram ressuspendidas em 1000 μl do meio de cultivo já descrito e contadas em câmara de Neubauer. Em torno de 2x106de células foram transferidas para uma garrafa de cultivo de 25 cm2previamente preenchida com 4.000 μl do mesmo meio de cultivo.

[054] As células foram mantidas a 37oC em 5% CO2. Após a adesão das células no período de 3 a 5 dias o meio de cultivo foi desprezado e meio de cultivo novo foi adicionado na garrafa. Após um período de 3 a 5 dias as primeiras colônias de células fibroblastoides fusiformes se formaram (contado como passagem zero). Em um período entre 7 e 9 dias as colônias atingiram entre 70% e 90% de confluência. Nesta fase foi realizado o primeiro repique celular de tal forma que o conteúdo de uma garrafa de 25 cm2foi transferido para quatro garrafas de 25 cm2- iniciando-se a primeira passagem - que foram então repicados ao atingirem confluência entre 70 e 90%, sendo expandidas ex vivo até a passagem 6 (a partir da qual foi observado declínio na taxa de proliferação celular). O cumprimento desses passos garantiu o isolamento do concentrado de células da invenção.

[055] Nos exemplos a seguir o concentrado de células da invenção utilizado, foi obtido segundo o procedimento acima, contendo teores aproximados de 5% de CTI, 100% CTM e 20% pericitos, obtidos pela mistura de concentrados de 3 doadores distintos, e enriquecidos com pericitos especificamente cultivados (a obtenção e isolamento de pericitos é feito com procedimento conhecido do técnico no assunto).

[056] Nos exemplos com equinos, a amostra de tecido adiposo foi retirada da cauda ou cernelha dos animais.

Exemplo 2 - Cinomose Canina 2.1 Animais utilizados

[057] Os cães utilizados neste experimento foram machos e fêmeas de diferentes raças, com idades variando de 1 a 6 anos. Todos os animais apresentavam manifestações clínicas neurológicas ocasionadas pela instalação do vírus da cinomose no sistema nervoso central, como mioclonias, paraplegia, tetraplegia, paraparesia, convulsão e incapacidade de se manter em estação e caminhar, conforme tabela I mais adiante. Todos os cães utilizados haviam sido previamente submetidos a tratamento convencional para combater os sintomas manifestados na fase virêmica (respiratório e digestório) e não cursavam manifestações clínicas do sistema gastrointestinal e respiratório. Foram realizados transplantes com intervalo de 30 dias entre cada aplicação.

2.2 Avaliação clínica pré-transplante

[058] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias.

2.3 Transplante

[059] Foi realizado transplante do concentrado da invenção via endovenosa nos pacientes com sequelas neurológicas da cinomose. O número de células variou com o peso do animal (tabela I). Os pacientes receberam em média três transplantes do concentrado de células da invenção em um intervalo de 30 dias entre cada um. Para isto foi realizado o acesso endovenoso com auxílio de um cateter e o animal foi mantido em fluidoterapia com solução fisiológica a 0,9%. As células previamente criopreservadas foram descongeladas de acordo o procedimento adequado, e foram ressuspendidas em 2 ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão de células-tronco foi realizada lentamente. Tabela I - manifestações clínicas neurológicas dos pacientes

(*) SRD: sem raça definida

2.4 Avaliação clínica pós-transplante

[060] Após o tratamento os animais foram monitorados por 1 hora pelo veterinário para observar possíveis reações anafiláticas. Nenhum paciente manifestou sintomas de rejeição após o transplante do concentrado de células da invenção. Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após a aplicação das CT e o intervalo entre uma aplicação e outra foi de 30 dias. A maioria dos animais teve redução dos sinais clínicos neurológicos e voltou a caminhar - os resultados foram menos positivos foram nos animais mais velhos e com mais tempo de sequelas.

[061] A tabela II a seguir mostra a evolução da redução das sequelas neurológicas. Tabela II. Evolução da redução das sequelas neurológicas da cinomose após o tratamento com as células do concentrado da invenção.

D0- sintomas neurológicos antes do transplante. 1º transplante. D1- sintomas neurológicos após o 1º transplante (30 dias) D2- sintomas neurológicos após o 2º transplante (60 dias) D3- sintomas neurológicos após o 3º transplante (90 dias) MT-membro torácico MP-membro pélvico

Exemplo 3 - Hipoplasia e aplasia de medula óssea 3.1 Animais utilizados

[062] Cão macho de 30 kg, da raça labrador com 1 ano de idade, apresentava fraqueza, falta de apetite e ao realizar o hemograma constatou anemia grave. O paciente havia sido previamente submetido a transfusões sanguíneas mensais por um período de 5 meses e estava sendo medicado com eritropoietina exógena na tentativa de manter seu hematócrito a níveis aceitáveis para a espécie canina.

3.2 Avaliação clínica pré-transplante

[063] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias. A biopsia medular diagnosticou hipoplasia de série eritroide, granulocítica e aplasia megacariocítica.

3.3 Transplante

[064] Foi realizado um único transplante de 8x 106de células do concentrado da invenção via intraóssea no osso fêmur. O animal foi previamente sedado com a medicação pré-anestésica cloridrato de tramadol 4 mg/kg IM, seguido de indução ao efeito de propofol (2,6-diisopropilfenol) 8 mg/kg IV e de manutenção com Isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano) ao efeito. Em seguida realizou-se a tricotomia ampla da região lombo-sacra e antissepsia com clorexidine 2%. Após foi realizado o acesso da crista femoral com agulha própria para a biopsia medular. Células criopreservadas foram descongeladas, ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%, e infusão de células-tronco foi realizada lentamente.

3.4 Avaliação clínica pós-transplante

[065] Os retornos clínicos foram realizados com coleta de sangue periférico para controle do hematócrito, além do exame físico geral, com intervalos de aproximadamente 30 dias. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante das células da invenção. Após um único transplante com o concentrado de células da invenção o cão não necessitou receber transfusão sanguínea durante um ano - após esse ano o exame de aspirado da medula óssea revelou uma medula óssea hematopoieticamente ativa, com série eritroide discretamente aumentada, com morfologia, maturação completa e ordenada e predomínio de formas maduras, enquanto que a série mieloide apresentou-se discretamente diminuída, com morfologia normal, maturação completa e ordenada e predomínio de formas maduras. O animal permaneceu bem sem receber transfusão desde então (até o depósito deste pedido de patente).

[066] Os gráficos representados nas figuras 1, 2 e 3 apresentam o significativo aumento dos níveis do hematócrito (figura 1), leucócitos (figura 2) e plaquetas (figura 3) após uma única aplicação das células inventivas. Os exames sanguíneos foram realizados em intervalos aproximados de 30 dias.

Exemplo 4 - Diabetes Tipo I 4.1 Animal utilizado

[067] Cão, fêmea de 2 anos, 8 quilos, apresentava altos níveis de glicemia, e foi precocemente diagnosticado com diabetes tipo I.

4.2 Avaliação clínica pré-transplante

[068] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias. O teste glicêmico foi realizado diariamente, duas vezes ao dia, confirmando o diabetes tipo I. Para reduzir os níveis glicêmicos foram administrados de 3 a 6 unidades ao dia de insulina no paciente diariamente.

4.3 Transplante

[069] Foram realizados quatro transplantes de 4x106de células do concentrado da invenção via endovenosa com intervalos de 30 dias entre cada transplante. Para isto as células criopreservadas foram descongeladas e foram ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão endovenosa das células-tronco foi realizada lentamente.

4.4 Avaliação clínica pós-transplante

[070] Após o transplante, o teste de glicêmico foi realizado diariamente durante duas vezes ao dia por 60 dias a fim de acompanhar a redução do nível glicêmico. Os resultados demonstraram a redução dos níveis glicêmicos e redução da dose de insulina.

[071] Nas figuras 4, 5 e 6 a letra “T” significa data do transplante.

[072] A figura 4 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal antes do tratamento com células-tronco. A cor cinza indica o dia que o paciente não precisou receber insulina, a cor cinza escuro indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades insulina por dia, a cor branca indica que o paciente recebeu 6 unidades de insulina uma vez ao dia.

[073] A figura 5 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal após tratamento com células-tronco. Nota-se a redução do número de dias sem administração de insulina e da dose. A cor cinza claro indica dia em que o paciente não precisou receber insulina, a cor cinza escuro indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades de insulina, a cor branca indica que o paciente recebeu 6 unidades de insulina uma vez ao dia. Nota-se que os dias sem insulina aumentaram, bem como a redução dos dias que o cão precisou receber 6 unidades de insulina.

[074] A figura 6 é um gráfico da variação do nível glicêmico do animal após o segundo transplante com células-tronco. Nota-se a redução do número a grande de dias sem administração de insulina e da dose. A cor cinza indica o dia que o paciente não recebeu insulina, a cor branca indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades de insulina.

[075] Nota-se que após o segundo transplante o cão reduziu a dose de insulina diária de 6 unidades por quilo para 3 unidades a quilo. E, além disso, espaçou-se o número de dias sem precisar tomar insulina

Exemplo 5 - Miosite Mastigatória 5.1 Animal utilizado

[076] Cão, macho, labrador de 11 anos apresentava incapacidade de abrir a boca, com inchaço e dificuldade de se alimentar.

5.2 Avaliação clínica pré-transplante

[077] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias. A biopsia dos músculos mastigatórios revelou miosite dos músculos mastigatórios. A capacidade de abertura da maxila do animal era de 2,7mm. O cão havia sido medicado com corticoide, porém não se adaptou a esse tratamento.

5.3 Transplante

[078] Foram realizados três transplantes de 8x106de células-tronco do concentrado da invenção, via endovenosa, com intervalo de 30 dias entre cada transplante. Para isso as células criopreservadas foram descongeladas, ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%, e infusão endovenosa das células-tronco realizada lentamente.

5.4 Avaliação clínica pós-transplante

[079] Após o transplante o animal se mostrou mais disposto, com habilidade de alimentar-se sozinho e capacidade de utilizar a boca para apanhar objetos, atividade que era impossível ser realizada anteriormente. A capacidade da abertura da maxila foi ampliada para 4,7mm.

Exemplo 6 - Lesão Tendínea de Cavalos Atletas 6.1 Animais utilizados

[080] Três cavalos machos de idades variando entre 16 a 28 anos apresentavam lesões focais no tendão extensor digital superficial. As lesões foram diagnosticadas com auxílio de aparelho de ultrassom, sendo classificadas de acordo com a perda do padrão linear da fibra tendínea como proposto por Nixon et al., (Nixon AJ, Goodrich LR, Scimeca MS, Witte TH, Schnabel LV, Watts AE, et al. Gene therapy in musculoskeletal repair. Ann N Y Acad Sci 2007; 1117:310-327) em uma escala de 1 a 4. A perda linear do padrão da fibra tendínea correspondente a 10 a 20% foi classificado como grau 1, enquanto lesões entre 25 a 50% foi classificado como grau 2.

[081] Na Tabela III abaixo estão citados animais tratados com o concentrado de células da invenção, suas respectivas classificações quanto a escala do padrão linear da fibra tendínea e, conforme o grau de lesão tendínea número de célula utilizado no transplante. Tabela III. Animais submetidos a transplante com o concentrado das células-tronco da invenção (conforme exemplo 1, sendo equinos os doadores do tecido adiposo), porcentagem de lesão e node células transplantadas.

6.2 Transplante

[082] Os animais foram submetidos a tricotomia seguida da antissepsia com iodopovidona, para posterior transplante das células do concentrado da invenção. A via de aplicação das células-tronco foi no local da lesão, possível com o auxílio do ultrassom que permitiu a identificação exata da lesão. Concentrado de células-tronco da invenção (equinos foram os doadores de tecido adiposo) foi aplicado com auxílio de uma agulha 40 x 12 e seringa 3ml. Foi realizado um único transplante celular.

6.3 Avaliação clínica da lesão pós-transplante

[083] Após 15 dias foi realizada avaliação do transplante de células-tronco do concentrado da invenção na área lesionada do tendão, com auxílio do ultrassom.

[084] Constatou-se redução da extensão da lesão tecidual do tendão e organização das fibras colágenas. Ocorreu uma melhora significativa no padrão linear das fibras colágenas.

Exemplo 7. Doença renal aguda e crônica 7.1 Animal utilizado

[085] Cão, fêmea de 13 anos de idade da raça pinscher com histórico de inapetência e baixo peso. Exame bioquímico constatou níveis elevados de ureia 86 mg/dl e creatinina 2, 54 mg/dl. A paciente estava recebendo fluidoterapia duas vezes ao dia e soro oral 2 Ml, com dieta especial para paciente renal com Royal renal (patê e ração) e carne branca (frango). O protocolo de medicamentos utilizados era: Ketosteril (aminoácidos e análogos, comercializado pelo laboratório brasileiro Fresenius), Glutamax (suplemento de glutamina, comercializado pelo laboratório brasileiro Vitafor), omeprazol, bromoprida e Hemolitan (suplemento vitamínico comercializado pelo laboratório brasileiro Vetnil).

7.2 Avaliação clínica pré-transplante

[086] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias. O exame bioquímico e urinálise também foram realizados, evidenciando doença renal crônica.

7.3 Transplante

[087] Foram realizados dois transplantes de 2x106de células do concentrado da invenção via endovenosa com intervalo de 30 dias. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em 2 ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão de células da invenção foi realizada lentamente. O paciente permaneceu com o tratamento convencional para a doença durante o tratamento com células-tronco.

7.4 Avaliação clínica pós-transplante

[088] Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após o transplante com o concentrado de células-tronco da invenção e o intervalo entre uma aplicação e outra foram de 30 dias. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante das células da invenção. Os exames bioquímico e de urinálise realizados evidenciaram a redução dos níveis sanguíneos de ureia e creatinina, cálcio ionizado e o aumento no hematócrito, conforme mostrado na Tabela IV abaixo. Tabela IV. Valores da função renal antes e após o transplante.

D0- dados laboratoriais antes do 1° transplante. D1- dados laboratoriais após o 1° transplante (30 dias) D2- dados laboratoriais após o 2° transplante (60 dias)

8.Tratamento Da Extrusão Do Disco Medular 8.1 Animal utilizado

[089] Cão, macho de 9 anos de idade da raça Doberman com 39 quilos apresentava ausência de dor profunda e paraplegia.

8.2 Avaliação clínica pré-tratamento

[090] Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-X de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré- existência de neoplasias e através da ressonância magnética observou a extrusão do disco medular na região toracolombar a nível de T12-13 T13-l.

8.3 Transplante

[091] Após 21 dias foi constatada a extrusão do disco medular na região toracolombar. Neste período (21 dias) foi realizado um único transplante de 4x106de células-tronco do concentrado da invenção. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em 1ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão de células-tronco foi realizada lentamente no espaço epidural utilizando seringa de 3ml e agulha 20x5,5. Após a terapia com células-tronco foi administrado tramal e dipirona por 5 dias e cefalexina por 14 dias. No 10odia após o transplante o animal foi submetido a fisioterapia por um período de 60 dias por três vezes por semana e acupuntura uma vez por semana.

8.4 Avaliação clínica pós-transplante

[092] Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após o transplante com o concentrado de células-tronco da invenção. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante. Após 30 dias do transplante o animal mantinha a estação e caminhava com dificuldade e após 60 dias o animal já caminhava normalmente.

Exemplo 9. Laceração de tendão 9.1 Animal utilizado

[093] Cão, fêmea da raça pastor alemão de 42 quilos, com ferimento na pata esquerda ocasionada por trauma. O animal apresentou dificuldade de locomoção devido à incapacidade de apoiar a pata esquerda no chão.

9.2 Avaliação clínica pré-transplante

[094] Através do ultrassom foi observada ruptura do tendão calcâneo comum.

9.3 Transplante

[095] Após 28 dias da ruptura traumática do tendão foi realizada a tenorrafia e no momento da cirurgia aplicou-se o concentrado da invenção com 2x106de células-tronco do concentrado da invenção.

9.4 Avaliação clínica pós-transplante

[096] Após 60 dias foi realizado ultrassom, observando-se completa organização das fibras tendíneas, com o animal retomando a atividade motora.

10. Ceratoconjuntivite Seca 10.1 Animal utilizado

[097] Cão, macho de dois anos de idade, sem raça definida que apresentava deficiência de produção de lágrima olho esquerdo, durante 6 meses.

10.2 Avaliação clínica pré-tratamento

[098] Foi realizada anamnese do paciente e o teste de Schirmer revelou um nível de produção de lágrimas de 5mm.

10.3 Transplante

[099] Foi realizado um único transplante do concentrado de células- tronco da invenção via subconjuntival na glândula lacrimal principal e na glândula lacrimal da 3 pálpebra. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em 0,5 μL de solução fisiológica a 0,9%, sendo que 0,3 μL foi transfundido na glândula principal e 0,2 μL na glândula da terceira pálpebra do paciente. Durante o tratamento foi utilizada somente a lágrima comercial nos primeiros 7 dias após o início do transplante com células-tronco.

10.4 Avaliação clínica pós-transplante

[0100] Os retornos clínicos foram realizados 7 e 14 e 21 dias após o transplante com as células da invenção. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante do concentrado das células-tronco da invenção. Após 7 dias o paciente não utilizou mais lágrima artificial e o teste de Schirmer foi de 10mm e após 14 e 21 dias de 15mm, valores considerados em níveis normais.

11. Ceratite Ulcerativa 11.1 Animal utilizado

[0101] Cão, schnauzer, fêmea de oito anos de idade apresentava ceratite ulcerativa bolhosa de grande extensão no olho direito.

11.2 Avaliação clínica pré-tratamento

[0102] Foi realizada anamnese do paciente, e na inspeção observou- se a ulceratite bolhosa de grande extensão no olho direito. Anterior ao tratamento com células-tronco o paciente foi medicado com antibiótico por 7 dias.

11.3 Transplante

[0103] Foram realizados cinco transplantes do concentrado de células-tronco da invenção por 5 dias, diretamente na córnea ulcerada, de 1x106 de células ressuspendidas em 5μL de solução fisiológica. Células criopreservadas foram descongeladas antes do uso.

18.2 Avaliação clínica pós-transplante

[0104] Após um mês do tratamento com o concentrado de células- tronco da invenção observou-se a manutenção da transparência da córnea. Ao realizar o teste de acuidade visual (o teste de ameaça) o animal manifestou reação sendo assim considerado positivo para o teste.

[0105] Com o auxílio das informações e exemplos aqui trazidos o homem da técnica pode realizar a invenção de formas equivalentes, ou seja, não expressamente descrita, mas cujas funções e resultados são da mesma natureza que as da invenção, portanto dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Concentrado multipotente e imunocompatível de células-tronco, caracterizado pelo fato de ser originado de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, e consistir em pericitos, células-tronco imaturas e células-tronco mesenquimais, em que: (a) 10 a 30% das células do concentrado são imunopositivas para os marcadores de pericitos CD146+, α-SMA+, NG2+, PDGFRβ+ (CD140b) e PDGFRα+ (CD140a); (b) 70 a 100% das células do concentrado são imunopositivas para os marcadores de células-tronco mesenquimais CD271+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD13+, vimentina+, nestina+ e CD29+, e imunonegativas para os marcadores CD34-, CD45-, CD56-, CD144-, CD14-, CD11b- e CD31-; e (c) 1 a 20% das células do concentrado são imunopositivas para os marcadores de células-tronco imaturas Nanog+, Oct3/4+, SOX2+, SOX9+, SOX17+ e FOX2+, e imunonegativas para o marcador KLF4-; em que o dito concentrado é obtido por um processo compreendendo as etapas de: A - obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado de um ou mais mamíferos jovens saudáveis; B - lavagem e limpeza da amostra de tecido; C - fragmentação da amostra de tecido; D - digestão enzimática suave da gordura do fragmento do tecido; E - centrifugação para separar o tecido; F - cultivo de explante de tecido durante 3 a 5 dias, sem trocar o meio de cultivo; G - ao se atingir confluência entre 70 e 90%, após 7 a 9 dias, dissociar as colônias de células migradas para fora do tecido; H - opcionalmente, submeter o tecido separado na etapa E a um novo cultivo de explante, iniciando nova etapa F; e I - expansão das células isoladas na etapa G.

2. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero doador de tecido adiposo vascularizado tem até entre 20% a 30% da idade máxima de vida e é saudável.

3. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o doador é substancialmente livre de doenças.

4. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido adiposo vascularizado do doador é, para cães ou gatos, escolhido da região lateral do flanco ou da superfície lateral do membro posterior, originado de castração pré-escrotal ou inguinal de machos, ou de castração por ovário salpingo histerectomia de fêmeas; para cavalos, o tecido adiposo vascularizado doador é escolhido da cernelha ou da região da cauda.

5. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser usado em terapia médica, veterinária ou cosmética.

6. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na preparação de produto útil no transplante de células para tratamento de doenças.

7. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de estar sob a forma de biofármacos, soluções, comprimidos, formulações oftalmológicas ou formulações para aplicação tópica.

8. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser formulado para aplicação via sistêmica ou local, tais como aplicação endovenosa, percutânea, intraóssea, tópica e intratecal.

9. Concentrado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de estar sob a forma de um colírio.

10. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapias de tratamento de mamíferos sem neoplasia, que não estejam cursando essencialmente quaisquer doenças que não aquela que se visa tratar, se for o caso.

11. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapias heteróloga ou xenotransplante para tratamento de doenças em mamíferos selecionadas a partir do grupo que compreende doenças articulares, doenças musculoesqueléticas, laceração de tendão e ligamentos, fissuras, falhas e fraturas ósseas.

12. Concentrado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapias para tratamento de mamíferos com doenças neurológicas, hematológicas, oftalmológicas, hematopoiéticas, doença renal aguda e crônica, diabetes, lesão medular espinal aguda, sequela neurológica causada pelo vírus da cinomose, miosite mastigatória ou sequela neurológica causada pelo vírus da encefalomielite.

13. Biofármaco, caracterizado pelo fato de que compreende o concentrado multipotente e imunocompatível de células-tronco definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um ou mais ingredientes biologicamente aceitáveis.

14. Forma de dosagem para tratamento de doenças, traumas, injúrias ou aspectos estético-dermatológicos de mamíferos, caracterizada pelo fato de que compreende o concentrado multipotente e imunocompatível de células- tronco definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, a uma concentração entre 1 x 106 e 1 x 107 de células do dito concentrado.