BR102013033827A2 - concentrado multipotente e imunocompatível de células tronco, uso do concentrado, biofármaco, forma de dosagem, método de tratamento e processo de obtenção de concentrado de células tronco - Google Patents

Abstract

concentrado multipotente e imunocompatível de células tronco, uso do concentrado, biofármaco, forma de dosagem, método de tratamento e processo de obtenção de concentrado de células tronco. a presente invenção refere-se, em sua generalidade, a um concentrado de células tronco isolado a partir de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, biofármacos que contém tal concentrado, seu uso em terapias aplicadas em doenças de mamíferos.

Description

CONCENTRADO MULTIPOTENTE E IMUNOCOMPATÍVEL DE CÉLULAS TRONCO, USO DO CONCENTRADO, BIOFÁRMACO, FORMA DE DOSAGEM, MÉTODO DE TRATAMENTO E PROCESSO DE OBTENÇÃO DE CONCENTRADO

DE CÉLULAS TRONCO A presente invenção refere-se, em sua generalidade, a um concentrado de células tronco isolado a partir de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, através do método aqui descrito, biofármacos que contém tal concentrado, e seu uso em terapias aplicadas em doenças de mamiferos.

No contexto deste documento o termo "células tronco" é sinônimo de células tronco multipotentes, células tronco mesenquimais, células sinalizadoras medicinais, células mesenquimais estromais, e células tronco adultas.

Precedentes É sabido que células tronco têm a habilidade de se dividirem em cultura por periodos indefinidos, e originar células especializadas. Podem dar origem a muitos tipos de células diferenciadas, e ser utilizadas para tratar muitos tipos de doenças. É também conhecida a existência de células tronco adultas em tecido adiposo de mamiferos. Tais células já foram isoladas e cultivadas, para serem utilizadas em terapias celulares, como transplantes.

Entretanto, até o presente, os conhecimentos existentes sobre tais células tronco não resolveram vários inconvenientes. Entre eles, a pequena produtividade dos processos de multiplicação de tais células, frente às necessidades de seu uso assim como pouca compreensão quanto à composição das células tronco utilizadas nas terapias celulares. De uma forma geral, a fração das células tronco isoladas do tecido adiposo é denominada fração estromal vascular do tecido adiposo que deriva células perivasculares e que também tem propriedades de ação parácrina semelhante à células tronco mesenquimais.

Ainda, a grande quantidade de células tronco para obter eficácia nas várias terapias, tipicamente entre 2xl06 e 8xl06 células por quilo de peso do paciente.

Pode ainda ser mencionado que, mesmo multipotentes, as células tronco derivadas de tecido adiposo conhecidas no estado da técnica tem sido reportadas em casos limitados de uso no tratamento de certos tipos de doenças e tecidos.

Esses fatos fazem com que a utilização de células tronco derivadas de tecido adiposo em terapias celulares seja limitada e cara, independentemente do fato que tais células sejam mais abundantes do que aquelas obtidas de outras fontes. A presente invenção apresenta aprimoramentos e soluções a tais situações do estado da técnica, pois propicia: um processo de alta produtividade de células tronco multipotentes imunocompativeis, originadas de tecido adiposo vascularizado, incluindo cultivo e divisão celular, - um concentrado sinérgica de células imunocompativeis e multipotentes que permite a utilização de menor quantidade de células tronco em grande variedade de tratamentos terapêuticos de doenças em mamiferos (envolvendo, por exemplo, doenças osteoarticulares, musculares, neurológicas, hematológicas, oftalmológicas, do sistema urinário e muitas outras).

Breve descrição das figuras a figura 1 é um gráfico do aumento dos niveis do hematócrito após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; a figura 2 é um gráfico do aumento dos niveis dos leucócitos após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; - a figura 3 é um gráfico do aumento dos niveis das plaquetas após uma única aplicação do concentrado de células da invenção; - a figura 4 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal antes do tratamento com o concentrado de células da invenção; - a figura 5 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal após tratamento com o concentrado de células da invenção; - a figura 6 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal após o segundo transplante com o concentrado de células da invenção.

Descrição da invenção A presente invenção, em um primeiro aspecto, refere-se a um concentrado multipotente e imunocompatível de células tronco secretoras de moléculas medicinais, originado de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, compreendendo: células tronco imaturas (CTI), células tronco mesenquimais (CTM) e células perivasculares (pericitos) O concentrado de células tronco da invenção, isolado de mamíferos, é imunopositivo para ao menos para os marcadores CD146+, cx-SMA+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD13+, vimentinaf, nestinal, Nanog +, Oct3/4+, Sox2+ e imunonegativo ao menos para os marcadores: CD34-, CD45-, CD56-, CD144-, CD14-, CDllb- e CD31-. Adicionalmente, isolado de humanos, o concentrado de células tronco da invenção é imunopositivo para marcadores NG2+, PDGFR0+, CD271+ (P75), CD29+, S0X9+, S0X17+, F0X2+, CD140+ e negativo para KLF4-.

Tipicamente os teores das células tronco no concentrado da invenção são: - CTI: 1% a 20% - CTM: 70% a 100% - Pericitos: 10% a 30% A menção a "teores de células tronco" refere-se às quantidades de células que expressam os respectivos marcadores (respectivamente de CTI, de CTM ou de pericitos).

De forma particular, sem excluir qualquer outra, os concentrados da invenção têm teores de 5% de CTI, 100% CTM e 20% pericitos, ou valores próximos a esses.

Os teores de células tronco imaturas (CTI), células tronco mesenquimais (CTM) e pericitos obtidos dos múltiplos nichos de células tronco do tecido adiposo variam entre os pacientes, e variam ainda com o método de isolamento.

Assim, podem ser utilizadas misturas de concentrados obtidos de 2 ou mais doadores, para se atingir teores médios distintos dos individuais. Ainda alternativamente o concentrado de células tronco pode ser enriquecido com pericitos especificamente cultivados. A composição de células no concentrado da invenção é sinérgica, uma vez que a combinação dos efeitos das CTI, CTM e pericitos resulta, de forma imprevista, na utilização de menor quantidade de células em comparação com quantidades de células tronco atualmente utilizadas para se obter eficácia em tratamentos terapêuticos, como descrito mais adiante.

As variações da composição de células tronco do concentrado são também importantes, pois dependendo do tratamento da doença, trauma ou injúria, ou aspecto estético-dermatológico, essa composição pode ser purificada e/ou enriquecida com células que expressam os marcadores importantes para cada tipo de doença, trauma, injúria ou outro. Uma composição terapêutica pode ser ajustada para as necessidades do paciente em relação à proporção dos marcadores que se expressam pelas células do concentrado, assim como em relação à dosagem das células tronco, ou seja, propõe-se medicina personalizada.

As células do concentrado da invenção podem ser utilizadas no seu estado não diferenciado de células tronco, assim como as mesmas podem ser induzidas a produzir os precursores de uma linhagem especifica (por exemplo, células gliais) do interesse para o tratamento, que podem ser purificados e aplicados como população pura dos precursores que são comprometidos com a diferenciação célular de um único tipo, visando o beneficio do efeito autócrino destas células. Por outro lado, estas células têm efeitos parácrinos que são produzidos pelas células quando não são diferenciadas. Para um efeito terapêutico mais abrangente, a composição de células não diferenciadas pode ser aplicada junto com as células precursoras.

Estas células precursoras têm a capacidade de se diferenciar in vitro pelo menos em derivados de dois folhetos embrionários: mesoderma (osso, cartilagem, músculo, etc.) e ectoderma (células neurais). Porém a sua diferenciação não se limita somente a mesoderma e ectoderma, pois sob condições apropriadas, essas células podem também produzir os tipos celulares provenientes de endoderma, o que as caracteriza como células muitipotentes.

As células contidas no concentrado da invenção têm características fenotípicas e funcionais semelhantes, porém distintas em vários aspectos (divisão celular, expressão de alguns genes e proteínas, bem como a ação parácrina), daquelas que apresentam dentro do organismo do doador (in vivo) .

Existem diferenças significativas entre as linhagens celulares do concentrado da invenção e do tecido adiposo in vivo. Os níveis de pós-diferenciação de fatores secretados TNFa e leptina em cultura (in vitro) de células do tecido adiposo são muito mais baixos quando comparados com os do tecido in vivo. Além disso, um regulador importante precoce da transcrição da adipogênese, KLF4, tem a expressão significativamente mais elevada in vivo, do que in vitro.

Assim, não se trata de mero isolamento de células tronco, tal como se encontram no tecido do organismo do doador, mas trata-se de retirá-las, tratá-las e multiplicá-las de forma especifica para que adquiram as características aperfeiçoadas e adequadas à finalidades terapêuticas da invenção. O concentrado de células tronco da invenção não induz resposta imunológica, podendo ser utilizado em transplantes autogênico (o paciente é doador e receptor), alogênico (o doador é aparentado ou é da mesma espécie que o paciente) e xenogênico (células tronco provenientes de espécies diferentes, não aparentadas).

Ainda, a utilização do concentrado de células da invenção em tratamentos terapêuticos não gera efeitos colaterais, tais como os tipicamente observados em tratamentos terapêuticos tradicionais que utilizam compostos sintéticos, seja a curto ou longo prazo. O concentrado de células tronco da invenção é particularmente adequado a terapias celulares, particularmente transplantes celulares. O concentrado de células tronco da invenção pode derivar em amplo espectro de tecidos derivados dos três folhetos embrionários (mesoderma, ectoderma e endoderma).

Um aspecto particular da invenção refere-se à padronização que deve ser buscada em seus vários aspectos, para garantir o sucesso dos efeitos obtidos, seja quanto à grande produção de células a partir de tecido adiposo vascularizado, seja quanto à potência e eficiência terapêutica obtidos com utilização de menor quantidade de células em comparação com o estado da técnica.

Dentro de um aspecto importante da invenção está a qualidade do doador como fonte de tecido adiposo. Na área veterinária, o isolamento de células tronco de animais jovens e sadios propicia resultados efetivos quanto a alta produtividade, potência e eficiência terapêutica, em comparação com o isolamento de células de animais adultos e/ou idosos, ou com doenças já instaladas, que propiciam efeitos insatisfatórios. Dessa forma, para uma realização otimizada da invenção, a idade adequada do mamifero doador é entre 20% e 30% de sua vida total. De forma particular, para cachorros e gatos doadores de tecido adiposo vascularizado são adequadas como faixas otimizadas de idades do doador até 2-3 anos de vida. Para equinos, até 6-7 anos de vida.

Ainda na área veterinária, um local adequado de escolha para a biópsia de coleta de tecido adiposo é região lateral do flanco ou superfície lateral do membro posterior, porém a coleta não se limita a esta regiões, desde que elas permitam a coleta de tecido adiposo vascularizado. De forma vantajosa a coleta de tecido adiposo pode ser realizada durante procedimentos cirúrgicos eletivos em cães e gatos - por exemplo, castração de fêmeas (ovário salpingo esterectomia) e castração pré-escrotal e inguinal de machos. Evita-se com isso a necessidade de procedimento cirúrgico especifico para colher amostra, evitando mais dor e sofrimento do paciente. Para o processo de grande produtividade de obtenção do concentrado de células tronco da invenção basta a coleta de um pequeno fragmento de gordura visceral vascularizada, por exemplo, entre 0,1 e 0,3 cm3, como um fragmento de 0,5x0,5x0,5 cm. O pequeno tamanho da amostra coletada também facilita, quando necessário, o transporte da amostra até o laboratório (por exemplo, utilizando um kit adaptado a essa finalidade) e sua preservação até inicio de um procedimento de isolamento das células in vitro. O concentrado de células tronco da invenção pode ser crio-preservado, de forma conhecida do técnico no assunto, para ser estocado em vista de uso posterior, em que será submetido a procedimento de descongelamento, também conhecido do homem da técnica. Por exemplo, os concentrados de células tronco da invenção podem ser congelados na concentração de lxlO6 ou 2xl06 em criotubos e mantidas a - 80°C por três meses sendo então transferidas para o nitrogênio liquido a -196°C. 0 meio de cultivo utilizado para criopreservar as células as mantém viáveis e preserva seu potencial de diferenciação, por exemplo, composto por 45% de DMEM-h (Dulbecco's Modified Eagle Médium-high glicose) , 45% de soro fetal bovino e 10% de dimetilsulfoxido.

Com relação à aplicação da invenção na área veterinária, sobre o aspecto da saúde do animal doador de tecido adiposo, é vantajoso, para garantir efeitos otimizados da invenção, que os animais (particularmente cães, gatos e cavalos) estejam em dia com a vermifugação para nematódeos e cestódeos, e com as seguintes vacinações: - cães: virus da cinomose, hepatite, parovirose, 4 cepas de leptospirose, coranivrose, parainfluenza, laringotraqueite, giardia, tosse dos canis e anti-rábica; - gatos: virus de rinotraqueite, calicivirose, panleucopenia, leucemia felina, clamidiose, antirábica. - cavalos: virus da raiva, influenza equina, encefalomielite.

Dentro de outro aspecto, a invenção refere-se ao uso do concentrado de células tronco da invenção caracterizado por ser na preparação de produtos úteis no tratamento de doenças, traumas, injúrias ou aspectos estético-dermatológicos com transplante de células. Sem excluir qualquer outro, exemplos de tais produtos são os biofármacos, soluções, comprimidos, formulações oftalmológicas, formulações para aplicação tópica e mucosal, etc.

Dentro de outro aspecto, a invenção refere-se a biofármacos, caracterizados pelo fato de compreender o referido concentrado de células tronco, e de um ou mais ingredientes biologicamente aceitáveis, por exemplo solução fisiológica, biomateriais (por exemplo biomateriais poliméricos), fatores de crescimento (por exemplo VEGF, TGF-beta, ITK) , células mono-nucleares, plasma rico em plaquetas, fibrina, hidroxiapatita, membranas de colágenos, moléculas bioativas (por exemplo, hormônios e mitôgenos).

De maneira típica, uma formulação para injeção compreende minimamente o concentrado de células tronco da invenção e solução fisiológica. A invenção beneficia-se de aspectos particulares do processo de obtenção do concentrado sinérgico de células tronco, por exemplo, o isolamento de uma maior quantidade de células tronco a partir dos múltiplos nichos de células adipóticas em um mesmo fragmento de tecido, que em cultura de explante libera in vitro quantidades ilimitadas de células tronco em cultivo. Assim, os fragmentos de tecido adiposo inicialmente plaqueados em garrafas de cultivo podem ser transferidos para novas garrafas de cultivo a fim de manter a liberação de novas células tronco.

Assim, sem excluir qualquer outro, um processo vantajoso de obtenção de composição sinérgica de células tronco da invenção compreende as seguintes etapas: A - obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado de mamífero, particularmente de mamífero jovem e sadio; Β - lavagem e limpeza da amostra de tecido, por exemplo, com solução fisiológica e antibiótico; C - fragmentação da amostra de tecido; D - digestão enzimática suave dos fragmentos do tecido adiposo, para eliminar adipócitos, até a inativação da enzima, por exemplo, colagenase tipo I ou IV; E - centrifugação para obter as células da fração vascular do tecido adiposo; F - cultivo de explante de tecido - particularmente 5-7 fragmentos de tecido por garrafa de 25 cm2 de material aderente, durante 3 a 5 dias, sem trocar o meio de cultivo; G - ao se atingir confluência entre 70 e 90%, dissociar via ação enzimática as colônias celulares migradas para fora do tecido; H - opcionalmente, o tecido separado na etapa E pode ser submetido a novo cultivo de explante, iniciando nova etapa F; I - expansão das células isoladas na etapa G, particularmente até no máximo 6 passagens para uso posterior em terapia celular.

Após a etapa A, a amostra do tecido colhido é preparada com limpeza e lavagem, podendo ser colocada em recipiente que serve de meio armazenagem temporária para transporte até outro local por até 48 horas. Há kits conhecidos no estado da técnica para essa finalidade.

Conforme já mencionado, para garantir resultados otimizados da invenção, o mamifero doador de tecido adiposo vascularizado deve ser jovem e sadio. De forma vantajosa, a idade do doador deve ser até no máximo 30% da sua vida total, preferencialmente até 20%. Sua saúde deve ser tal que exclua essencialmente qualquer doença. O processo utilizado permite evitar qualquer tipo de filtração do fluido celular, ou prescinde de qualquer tipo de seleção das células utilizando tamanho, granularidade ou marcadores específicos, por exemplo, miçangas magnéticas e anticorpos específicos.

Um aspecto da digestão enzimática do tecido adiposo na etapa D, é que não se descartam vasos ou gordura da amostra após a digestão. A enzima é adequada à digestão suave do tecido conjuntivo, por exemplo, colagenase tipo I ou tipo IV, como o produto GIBCO©, da empresa norte americana Life Technologies.

Se deseja enriquecer o concentrado de células tronco da invenção com pericitos, os vasos sanguíneos obtidos a partir da suave digestão são separados da amostra de tecido adiposo, e o cultivo de explante é realizado apenas com eles, conforme as etapas F, Ge I. Os pericitos obtidos são mais tarde podem ser adicionados ao concentrado que se deseja enriquecer.

Na etapa F, prefere-se que o meio de cultura não seja trocado durante 3-5 dias, podendo ser reposta quantidade equivalente ao meio evaporado. A manutenção do meio de cultura durante esse tempo propicia seleção somente das células que têm potencial de adesão ao plástico da garrafa de cultura, uma característica das células tronco mesenquimais. A confluência entre 70 e 90% permite isolar múltiplas colônias de células fusiformes, com morfologia mesenquimal, de tamanho substancialmente padronizado.

Para favorecer o bom desempenho do concentrado da invenção, o meio de cultivo na etapa F deve ser de alta qualidade, ou seja, padronizado, com um mínimo de variação de seus componentes pré-identifiçados. Um exemplo adequado de tal meio de cultivo, sem excluir qualquer outro, é DMEM- h (Dulbecco's Modified Eagle Médium-high glicose), comercializado pelo nome GIBCO© pela empresa norte- americana Life Technologies, suplementado com 15 % de soro fetal bovino da empresa norte-americana Hyclone, suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de mistura estreptomicina/penicilina para neutralizar a colagenase (todos ingredientes da empresa norte-americana Life Technologies) Na etapa Η, o fragmento do tecido adiposo em cultura pode ser transferido várias vezes na garrafa de cultivo, particularmente até 5 vezes, e continua liberando células.

Verifique-se que, na etapa I, a expansão das células até 6 passagens é voltada para utilização segura em terapia celular, evitando que sejam induzidas mudanças em seu cariótipo, proliferação ou estado indiferenciado. Para outras aplicações na ciência básica e aplicada o número de passagens pode ser superior à sexta passagem.

Dentro de mais um aspecto, a invenção refere-se aos concentrados de células tronco descritos, caracterizados por ser para uso em terapia médica, veterinária ou cosmética.

Dentro de mais um aspecto, a invenção refere-se a uso do concentrado de células tronco da invenção em terapias (autólogas, heterólogas e em xenotransplantes) de tratamento de doenças de mamíferos, como doenças articulares, neurológicas, hematológicas, oftalmológicas, doença renal aguda e crônica, doença músculo-esqueléticas, diabetes, lesão medular espinal aguda.

Em particular na área veterinária, podem ainda ser citadas, sem excluir quaisquer outras, terapias de patologias como: - doenças hematopoiéticas (aplasia e hipoplasia medular) doenças articulares (displasia coxofemoral, osteoartrite, processo degenerativo) - fissuras, falhas e fraturas ósseas - laceração de tendão e ligamentos - ceratoconjuntivite seca, úlcera de córnea - sequela neurológica derivada do virus da cinomose - doença renal aguda e crônica - miosite mastigatória - diabetes tipo I - para cães: sequelas neurológicas da cinomose e outras doenças neurodegenerativas, displasia coxofemural, miosite mastigatória; - para cães e gatos: aplasia e hipoplasia medular; fraturas ósseas; doenças osteoarticulares degenerativas, lesão medular espinal aguda, doença renal aguda e crônica, doenças oculares (por exemplo, degeneração retiniana, cerato conjuntivite seca), diabetes; - para cavalos: lesão tendineas e ligamentares, sequela neurológica promovida pelo virus da encefalomielite, osteoartrite e laminites.

Dentro de mais um aspecto, a presente invenção refere- se a formas de dosagem para o tratamento de doenças de mamíferos, sendo que de forma particular a quantidade de células do concentrado de células tronco varia, por exemplo, entre lxlO6 a 10 xlO7 de células tronco.

Avaliação De Potencial Tumorogênico A avaliação de potencial tumorigênico do concentrado de células da invenção foi feito de forma conhecida do técnico no assunto, por exemplo, a partir das informações contidas em Cell Cycle (2009). 15;8(16), 2608-2612 e "Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research", in www.stembook.org. O concentrado celular da invenção com 2xl06 de células foi injetado no membro pélvico de 5 camundongos da linhagem nude. Os camundongos foram mantidos em condições normais por um período de 60 dias. Após tal período foram eutanasiados, não tendo sido observada nenhuma massa neoformada no músculo e outro órgão.

Exemplos São dados a seguir exemplos de realização da presente invenção. Tais exemplos devem ser apreciados apenas como ilustrativos de realizações particulares da invenção, sem que imponham limites, de qualquer forma que seja, além das contidas nas reivindicações anexas.

Exemplo 1 - Isolamento das células tronco inventivas do tecido adiposo de cães e gatos.

Nos exemplos dados mais além, a obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado seguiu o procedimento abaixo.

Primeiramente a região de escolha, lateral do membro posterior do animal, foi bem lavada com água e sabão. Em seguida raspou-se a pele utilizando lâmina de barbear ou navalha, limpando a região novamente com água e sabão. Em seguida limpou-se a área com gaze umedecida em clorexidina degermante (solução de digliconato de clorexidina degermante 2% Riohex, comercializada pela empresa brasileira Rioquimica). Este procedimento foi realizado duas vezes. Em seguida foram aplicados 5 ml do anestésico lidocaina na região de coleta. Essa região foi primeiramente isolada com panos de campos estéreis para em seguida realizar a incisão na pele com auxilio de um bisturi de 2 a 3 cm de extensão. Retirou-se o fragmento de gordura, com cerca de 0,5x0,5x0,5 cm utilizando bisturi e pinça-allis, de forma a garantir a presença de vasos sanguíneos na amostra. Realizada a coleta, foi limpado o local com gaze estéril de forma a secar os possíveis sangramentos e suturar a pele (fio), seguindo-se desinfecção após a sutura, por exemplo como rifocina. O tecido adiposo coletado foi primeiramente lavado em solução de tampão fosfato-salino (PBS) com 5% de estreptomicina/penicilina para a retirada de sangue, debris e possíveis contaminantes eventualmente presentes na amostra. O procedimento de lavagem foi repetido 5 vezes. Em seguida utilizou-se uma gaze estéril para retirar o excesso de PBS contido na amostra. O tecido foi transferido para uma placa de petri de 60 mm de diâmetro para realizar a fragmentação do tecido com auxílio de uma lamina de bisturi n° 22 para obter vários fragmentos de dimensões menores. Em seguida foram adicionado na placa de cultivo 2 ml de colagenase tipo I ou tipo IV (Gibco®) a 0,075%, diluído em PBS, a 37°C. Os fragmentos juntamente com a colagenase foram mantidos entre 2 e 4 horas a 37°C, sob atmosfera de 5% de CO2. Durante a incubação com colagenase, pelo menos a cada 2 horas se homogeneizou a amostra com auxilio de uma pipeta graduada de 1000 μΐ.

Passado este período foram adicionados 5 ml do seguinte meio de cultivo: DMEM suplementado com 15 % de soro fetal bovino da empresa norte-americana Hyclone, suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de mistura estreptomicina/penicilina para neutralizar a colagenase (todos ingredientes da empresa norte-americana Life Technologies). O conteúdo foi transferido para um tubo tipo cônico de 15 ml, e centrifugado durante 5 minutos a 200g. Este procedimento foi realizado duas vezes para a completa inativação da colagenase. Na última centrifugação as células foram ressuspendidas em 1000 μΐ do meio de cultivo já descrito e contadas em câmara de Neubauer. Em torno de 2xl06 de células foram transferidas para uma garrafa de cultivo de 25 cm2 previamente preenchida com 4.000 μΐ do mesmo meio de cultivo.

As células foram mantidas a 37°C em 5% C02. Após a adesão das células no período de 3 a 5 dias o meio de cultivo foi desprezado e meio de cultivo novo foi adicionado na garrafa. Após um período de 3 a 5 dias as primeiras colônias de células fibroblastóides fusiformes se formaram (contado como passagem zero). Em um período entre 7 e 9 dias as colônias atingiram entre 70% e 90% de confluência. Nesta fase foi realizado o primeiro repique celular de tal forma que o conteúdo de uma garrafa de 25 cm2 foi transferido para quatro garrafas de 25 cm2 - iniciando-se a primeira passagem - que foram então repicados ao atingirem confluência entre 70 e 90%, sendo expandidas ex vivo até a passagem 6 (a partir da qual foi observado declínio na taxa de proliferação celular). 0 cumprimento desses passos garantiu o isolamento do concentrado de células da invenção.

Nos exemplos a seguir o concentrado de células da invenção utilizado, foi obtido segundo o procedimento acima, contendo teores aproximados de 5% de CTI, 100% CTM e 20% pericitos, obtidos pela mistura de concentrados de 3 doadores distintos, e enriquecidos com pericitos especificamente cultivados (a obtenção e isolamento de pericitos é feito com procedimento conhecido do técnico no assunto).

Nos exemplos com equinos, a amostra de tecido adiposo foi retirada da cauda ou cernelha dos animais.

Exemplo 2 - Cinomose Canina 2.1 Animais utilizados Os cães utilizados neste experimento foram machos e fêmeas de diferentes raça, com idades variando de 1 a 6 anos. Todos os animais apresentavam manifestações clinicas neurológicas ocasionadas pela instalação do vírus da cinomose no sistema nervoso central, como mioclonias, paraplegia, tetraplegia, paraparesia, convulsão e incapacidade de se manter em estação e caminhar, conforme tabela I mais adiante. Todos os cães utilizados haviam sido previamente submetidos a tratamento convencional para combater os sintomas manifestados na fase virêmica (respiratório e digestório) e não cursavam manifestações clinicas do sistema gastrointestinal e respiratório. Foram realizados transplantes com intervalo de 30 dias entre cada aplicação. 2.2 Avaliação clinica pré-transplante Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existêncía de neoplasias. 2.3 Transplante Foi realizado transplante do concentrado da invenção via endovenosa nos pacientes com sequelas neurológicas da cinomose. O número de células variou com o peso do animal (tabela I) . Os pacientes receberam em média três transplantes do concentrado de células da invenção em um intervalo de 30 dias entre cada um. Para isto foi realizado o acesso endovenoso com auxilio de um cateter e o animal foi mantido em fluidoterapia com solução fisiológica a 0,9 %. As células previamente criopreservadas foram descongeladas de acordo o procedimento adequado, e foram ressuspendidas em 2 ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão de células tronco foi realizada lentamente.

Tabela I - manifestações clinicas neurológicas dos pacientes (*) SRD: sem raça definida 2.4 Avaliação clinica pós-transplante Após o tratamento os animais foram monitorados por 1 hora pelo veterinário para observar possíveis reações anafiláticas. Nenhum paciente manifestou sintomas de rejeição após o transplante do concentrado de células da invenção. Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após a aplicação das CT e o intervalo entre uma aplicação e outra foi de 30 dias. A maioria dos animais teve redução dos sinais clínicos neurológicos e voltou a caminhar - os resultados foram menos positivos foram nos animais mais velhos e com mais tempo de sequelas. A tabela II a seguir mostra a evolução da redução das sequelas neurológicas.

Tabela II. Evolução da redução das sequelas neurológicas da cinomose após o tratamento com as células do concentrado da invenção. DO- sintomas neurológicos antes do transplante. Io transplante.

Dl- sintomas neurológicos após o Io transplante (30 dias) D2- sintomas neurológicos após o 2o transplante (60 dias) D3- sintomas neurológicos após o 3o transplante (90 dias) MT-membro torácico MP-membro pélvico Exemplo 3 - Hipoplasia e aplasia de medula óssea 3.1 Animais utilizados Cão macho de 30 kg, da raça labrador com 1 ano de idade, apresentava fraqueza, falta de apetite e ao realizar o hemograma constatou anemia grave. O paciente havia sido previamente submetido a transfusões sanguíneas mensais por um periodo de 5 meses e estava sendo medicado com eritropoietina exógena na tentativa de manter seu hematócrito a niveis aceitáveis para a espécie canina. 3.2 Avaliação clinica pré-transplante Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existência de neoplasias. A biopsia medular diagnosticou hipoplasia de série eritróide, granulocitica e aplasia megacariocitica. 3.3 Transplante Foi realizado um único transplante de 8x 106 de células do concentrado da invenção via intra-óssea no osso fêmur. O animal foi previamente sedado com a medicação pré- anestésica cloridrato de tramadol 4 mg/kg IM, seguido de indução ao efeito de propofol (2,6-diisopropilfenol) 8 mg/kg IV e de manutenção com Isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano) ao efeito. Em seguida realizou-se a tricotomia ampla da região lombo- sacra e anti-sepsia com clorexidine 2%. Após foi realizado o acesso da crista femoral com agulha própria para a biopsia medular. Células criopreservadas foram descongeladas, ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%, e infusão de células tronco foi realizada lentamente. 3.4 Avaliação clinica pós-transplante Os retornos clinicos foram realizados com coleta de sangue periférico para controle do hematócrito, além do exame fisico geral, com intervalos de aproximadamente 30 dias. O paciente não manifestou sintomas de rejeição apos o transplante das células da invenção. Após um único transplante com o concentrado de células da invenção o cão não necessitou receber transfusão sanguinea durante um ano - após esse ano o exame de aspirado da medula óssea revelou uma medula óssea hematopoieticamente ativa, com série eritróide discretamente aumentada, com morfologia, maturação completa e ordenada e predomínio de formas maduras, enquanto que a série mielóide apresentou-se discretamente diminuída, com morfologia normal, maturação completa e ordenada e predomínio de formas maduras. O animal permaneceu bem sem receber transfusão desde então (até o depósito deste pedido de patente).

Os gráficos representados nas figuras 1, 2 e 3 apresentam o significativo aumento dos níveis do hematócrito (figura 1), leucócitos (figura 2) e plaquetas (figura 3) após uma única aplicação das células inventivas.

Os exames sanguíneos foram realizados em intervalos aproximados de 30 dias.

Exemplo 4 -Diabetes Tipo I 4.1 Animal utilizado Cão, fêmea de 2 anos, 8 quilos , apresentava altos níveis de glicemia, e foi precocemente diagnosticado com diabetes tipo I. 4.2 Avaliação Clinica Pré-transplante Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existência de neoplasias. O teste glicêmico foi realizado diariamente, duas vezes ao dia, confirmando o diabetes tipo I. Para reduzir os níveis glicêmicos foram administrados de 3 a 6 unidades ao dia de insulina no paciente diariamente. 4.3 Transplante Foram realizados quatro transplantes de 4xl06 de células do concentrado da invenção via endovenosa com intervalos de 30 dias entre cada transplante. Para isto as células criopreservadas foram descongeladas e foram ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%. A infusão endovenosa das células tronco foi realizada lentamente. 4.4 Avaliação clinica pós-transplante Após o transplante, o teste de glicêmico foi realizado diariamente durante duas vezes ao dia por 60 dias a fim de acompanhar a redução do nivel glicêmico. Os resultados demonstraram a redução dos niveis glicêmicos e redução da dose de insulina.

Nas figuras 4, 5 e 6 a letra "T" significa data do transplante. A figura 4 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal antes do tratamento com células tronco. A cor cinza indica o dia que o paciente não precisou receber insulina, a cor cinza escuro indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades insulina por dia, a cor branco indica que o paciente recebeu 6 unidades de insulina uma vez ao dia. A figura 5 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal após tratamento com células tronco. Nota-se a redução do número de dias sem administração de insulina e da dose. A cor cinza claro indica dia em que o paciente não precisou receber insulina, a cor cinza escuro indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades de insulina, a cor branco indica que o paciente recebeu 6 unidades de insulina uma vez ao dia. Nota-se que os dias sem insulina aumentaram, bem como a redução dos dias que o cão precisou receber 6 unidades de insulina. A figura 6 é um gráfico da variação do nivel glicêmico do animal após o segundo transplante com células tronco.

Nota-se a redução do número a grande de dias sem administração de insulina e da dose. A cor cinza indica o dia que o paciente não recebeu insulina, a cor branca indica que o paciente recebeu insulina 3 unidades de insulina.

Nota-se que após o segundo transplante o cão reduziu a dose de insulina diária de 6 unidades por quilo para 3 unidades a quilo. E, além disso, espaçou-se o número de dias sem precisar tomar insulina Exemplo 5 - Miosite Mastigatória 5.1 Animal utilizado Cão, macho, labrador de 11 anos apresentava incapacidade de abrir a boca, com inchaço e dificuldade de se alimentar. 5.2 Avaliação clinica pré-transplante Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existência de neoplasias. A biopsia dos músculos mastigatórios revelou miosite dos músculos mastigatórios. A capacidade de abertura da maxila do animal era de 2,7mm. O cão havia sido medicado com corticóide, porém não se adaptou a esse tratamento. 5.3 Transplante Foram realizados três transplantes de 8xl06 de células tronco do concentrado da invenção, via endovenosa, com intervalo de 30 dias entre cada transplante. Para isso as células criopreservadas foram descongeladas, ressuspendidas em 1 ml de solução fisiológica a 0,9%, e infusão endovenosa das células tronco realizada lentamente. 5.4 Avaliação clinica pós-transplante Após o transplante o animal se mostrou mais disposto, com habilidade de alimentar-se sozinho e capacidade de utilizar a boca para apanhar objetos, atividade que era impossível ser realizada anteriormente. A capacidade da abertura da maxila foi ampliada para 4,7mm.

Exemplo 6 - Lesão Tendídea De Cavalos Atletas 6.1 Animais utilizados Três cavalos machos de idades variando entre 16 a 28 anos apresentavam lesões focais no tendão extensor digital superficial. As lesões foram diagnosticadas com auxílio de aparelho de ultrassom, sendo classificadas de acordo com a perda do padrão linear da fibra tendínea como proposto por Nixon et al. , (Nixon AJ, Goodrich LR, Scimeca MS, Witte TH, Schnabel LV, Watts AE, et al. Gene therapy in musculoskeletal repair. Ann N Y Acad Sei 2007; 1117:310- 327) em uma escala de 1 a 4. A perda linear do padrão da fibra tendínea correspondente a 10 a 20% foi classificado como grau 1, enquanto lesões entre 25 a 50% foi classificado como grau 2.

No quadro abaixo estão citados animais tratados com o concentrado de células da invenção, suas respectivas classificações quanto a escala do padrão linear da fibra tendínea e, conforme o grau de lesão tendínea número de célula utilizado no transplante.

Quadro 1. Animais submetidos a transplante com o concentrado das células tronco da invenção (conforme exemplo 1, sendo equinos os doadores do tecido adiposo), porcentagem de lesão e n° de células transplantadas. 6.2 Transplante Os animais foram submetidos a tricotomia seguida da anti-sepsia com iodo povedine, para posterior transplante das células do concentrado da invenção. A via de aplicação das células tronco foi no local da lesão, possivel com o auxilio do ultrassom que permitiu a identificação exata da lesão. Concentrado de células tronco da invenção (equinos foram os doadores de tecido adiposo) foi aplicado com auxilio de uma agulha 40 x 12 e seringa 3ml. Foi realizado um único transplante celular. 6.3 Avaliação clinica da lesão após transplante Após 15 dias foi realizada avaliação do transplante de células tronco do concentrado da invenção na área lesionada do tendão, com auxilio do ultrassom.

Constatou-se redução da extensão da lesão tecidual do tendão e organização das fibras colágenas. Ocorreu uma melhora significativa no padrão linear da fibras colágenas.

Exemplo 7. Doença renal aguda e crônica 7.1 Animal utilizado Cão, fêmea de 13 anos de idade da raça pinscher com histórico de inapetência e baixo peso. Exame bioquimico constatou niveis elevados de uréia 86 mg/dl e creatinina 2, 54 mg/dl. A paciente estava recebendo fluidoterapia duas vezes ao dia e soro oral 2 Ml, com dieta especial para paciente renal com Royal renal (patê e ração) e carne branca (frango). O protocolo de medicamentos utilizados era: Ketosteril (aminoácidos e análogos, comercializado pelo laboratorio brasileiro Fresenius), Glutamax (suplemento de glutamina, comercializado pelo laboratório brasileiro Vitafor), omeprazol, bromoprida e Hemolitan (suplemento vitaminico comercializado pelo laboratório brasileiro Vetnil). 7.2 Avaliação clinica pré-transpante Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existência de neoplasias. O exame bioquímico e urinálise também foram realizados, evidenciando doença renal crônica. 7.3 Transplante Foram realizados dois transplantes de 2xl06 de células do concentrado da invenção via endovenosa com intervalo de 30 dias. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em 2 ml de solução fisiológica a 0,9%. A

infusão de células da invenção foi realizada lentamente. O paciente permaneceu com o tratamento convencional para a doença durante o tratamento com células tronco. 7.4 Avaliação clinica pós-transplante Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após o transplante com o concentrado de células tronco da invenção e o intervalo entre uma aplicação e outra foram de 30 dias. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante das células da invenção. Os exames bioquímico e urinálise realizados evidenciaram a redução dos níveis sanguíneos de ureia e creatinina, cálcio ionizado e o aumento no hematócrito, conforme mostrado na tabela abaixo.

Tabela. Valores da função renal antes e após o transplante. DO- dados laboratoriais antes do Io transplante.

Dl- dados laboratoriais após o Io transplante (30 dias) D2- dados laboratoriais após o 2o transplante (60 dias) 8.Tratamento Da Extrusão Do Disco Medular 8.1 Animal utilizado Cão, macho de 9 anos de idade da raça Doberman com 39 quilos apresentava ausência de dor profunda e paraplegia. 8.2 Avaliação clinica pré-tratamento Foi realizada anamnese do paciente e exames complementares de hemograma, raio-x de tórax e ultrassom abdominal para descartar a pré-existência de neoplasias e através da ressonância magnética observou a extrusão do disco medular na região toraco-lombar a nivel de T12-13 TI3-1. 8.3 Transplante Após 21 dias foi constatada a extrusão do disco medular na região toracolombar. Neste periodo (21 dias) foi realizado um único transplante de 4xl06 de células tronco do concentrado da invenção. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em lml de solução fisiológica a 0,9 % .A infusão de células tronco foi realizada lentamente no espaço epidural utilizando seringa de 3ml e agulha 20x5,5. Após a terapia com células tronco foi administrado tramai e dipirona por 5 dias e cefalexina por 14 dias. No 10° dia após o transplante o animal foi submetido a fisioterapia por um período de 60 dias por três vezes por semana e acunputura uma vez por semana. 8.4 Avaliação clinica pós-transplante Os retornos clínicos foram realizados em 48 horas, 7 dias e 21 dias após o transplante com o concentrado de células tronco da invenção. O paciente não manifestou sintomas de rejeição apos o transplante. Após 30 dias do transplante o animal mantinha a estação e caminhava com dificuldade e após 60 dias o animal já caminhava normalmente.

Exemplo 9. Laceração de tendão 9.1 Animal utilizado Cão, fêmea da raça pastor alemão de 42 quilos, com ferimento na pata esquerda ocasionada por trauma. O animal apresentou dificuldade de locomoção devido à incapacidade de apoiar a pata esquerda no chão. 9.2 Avaliação clínica pré-transplante Através do ultrassom foi observada ruptura do tendão calcâneo comum. 9.3 Transplante Após 28 dias da ruptura traumática do tendão foi realizada a tenorrafia e no momento da cirurgia aplicou-se o concentrado da invenção com 2xl06 de células tronco do concentrado da invenção. 9.4 Avaliação clinica pós-transplante Após 60 dias foi realizado ultrassom, observando-se completa organização das fibras tendineas, com o animal retomando a atividade motora. 10. Cerato Conjuntivite Seca 10.1 Animal utilizado Cão, macho de dois anos de idade, sem raça definida que apresentava deficiência de produção de lágrima olho esquerdo, durante 6 meses. 10.2 Avaliação clinica pré-tratamento Foi realizada anamnese do paciente e o teste de Schirmer revelou um nivel de produção de lágrimas de 5mm. 10.3 Transplante Foi realizado um único transplante do concentrado de células tronco da invenção via subconjuntival na glândula lacrimal principal e na glândula lacrimal da 3 pálpebra. Células criopreservadas foram descongeladas e ressuspendidas em 0,5 pL de solução fisiológica a 0,9 %, sendo que 0,3 pL foi transfundido na glândula principal e 0,2 pL na glândula da terceira pálpebra do paciente.

Durante o tratamento foi utilizada somente a lágrima comercial nos primeiros 7 dias após o inicio do transplante com células tronco. 10.4 Avaliação clinica pós-transplante Os retornos clinicos foram realizados 7 e 14 e 21 dias após o transplante com as células da invenção. O paciente não manifestou sintomas de rejeição após o transplante do concentrado das células tronco da invenção. Após 7 dias o paciente não utilizou mais lágrima artificial e o teste de schirmer foi de lOmm e após 14 e 21 dias de 15mm, valores considerados em níveis normais. 11. Ceratite Ulcerativa 11.1 Animal utilizado Cão, schnauzer, fêmea de oito anos de idade apresentava ceratite ulcerativa bolhosa de grande extensão no olho direito. 18.2 Avaliação clinica pré-tratamento Foi realizada anamnese do paciente, e na inspeção observou-se a ulceratite bolhosa de grande extensão no olho direito. Anterior ao tratamento com células tronco o paciente foi medicado com antibiótico por 7 dias. 11.3 Transplante Foram realizados cinco transplantes do concentrado de células tronco da invenção por 5 dias, diretamente na córnea ulcerada, de IxlO6 de células ressuspendidas em 5pL de solução fisiológica. Células criopreservadas foram descongeladas antes do uso. 18.2 Avaliação clinica pós-transplante Após um mês do tratamento com o concentrado de células tronco da invenção observou-se a manutenção da transparência da córnea. Ao realizar o teste de acuidade visual (o teste de ameaça) o animal manifestou reação sendo assim considerado positivo para o teste.

Com o auxilio das informações e exemplos aqui trazidos o homem da técnica pode realizar a invenção de formas equivalentes, ou seja, não expressamente descrita, mas cujas funções e resultados são da mesma natureza que as da invenção, portanto dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (31)

1. CONCENTRADO MULTIPOTENTE E IMUNOCOMPATÍVEL DE CÉLULAS TRONCO, caracterizado por ser originado de tecido adiposo vascularizado de mamíferos, compreendendo células tronco imaturas, células tronco mesenquimais e pericitos.

2 . CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que compreende teores de 1 a 20% de células tronco imaturas, de 70 a 100% de células tronco mesenquimais, e de 10 a 30% de pericitos.

3. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1, isolado de mamíferos, caracterizado pelo fato de que é imunopositivo para os marcadores CD146+, a-SMA+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD13+, vimentína+, nestína+, Nanog +, Oct3/4+ , Sox2+ e imunonegativo para os marcadores: CD34-, CD45-, CD56-, CD144-, CD14-, CDllb, CD31-.

4 . CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que, isolado de humanos, é imunopositivo para os marcadores NG2+, ΡΏΘΕΚβ+, CD271+ (P75), CD29+, SOX9+, SOX17+, FOX2+, CD140+ e negativo para o marcador KLF4-.

5. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero doador de tecido adiposo vascularizado é jovem e saudável.

6. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mamífero doador de tecido adiposo vascularizado tem até entre 20% até 30% da idade máxima de vida de tal mamífero.

7 . CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que, quando o doador é um cão ou um gato, a idade é de até 2 a 3 anos.

8 . CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que, quando o doador é um equino, a idade é de até 6 a 7 anos.

9. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que o doador é substancialmente livre de doenças.

10. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, para cães ou gatos, o tecido adiposo vascularizado do doador é da região lateral do flanco ou da superfície lateral do membro posterior, e, para cavalos, da cernelha ou região da cauda.

11. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido adiposo vascularizado de cães ou gatos, é originado de castração pré-escrotal ou inguinal de machos, ou ovário salpingo esterectomia, a castração de fêmeas.

12. CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tecido adiposo vascularizado do mamifero doador é um fragmento de gordura visceral entre 0,1 e 0,3 cm3.

13. CONCENTRADO de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12 caracterizado pelo fato de que é crio-preservado.

14. CONCENTRADO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser originado de tecido adiposo vascularizado de dois, três ou mais mamíferos, opcionalmente enriquecido com pericitos.

15. CONCENTRADO conforme uma qualquer das reivindicações 1 a 14 caracterizado por ser para uso em terapia médica, veterinária ou cosmética.

16. USO DO CONCENTRADO definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser na preparação de produto útil no transplante de células para tratamento de doenças.

17. USO DO CONCENTRADO definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 15 caracterizado pelo fato de que ditos produtos são biofármacos, soluções, comprimidos, formulações oftalmológicas, formulações para aplicação tópica.

18. USO DO CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato de que dito produto seja para terapia autóloga, heteróloga ou xenotransplante.

19. USO DO CONCENTRADO de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato que dito produto visa aplicação via sistêmica ou local, tal como endovenosa, percutânea, intraóssea, tópica, tópica e intratecal.

20. USO DO CONCENTRADO acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato do produto ser um colírio.

21. USO DO CONCENTRADO definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 15 caracterizado por ser em terapias de tratamento de mamíferos sem neoplasia, que não estejam cursando essencialmente quaisquer doenças que não aquela que se visa tratar, se for o caso.

22 . USO DO CONCENTRADO definido uma qualquer das reivindicações 1 a 15 caracterizado por ser em terapias de tratamento de mamíferos dentre doenças articulares, neurológicas, hematológicas, oftalmológica, hematopoiéticas, doença renal aguda e crônica, doença músculo-esquelética, diabetes, lesão medular espinal aguda, laceração de tendão e ligamentos, sequela neurológica derivada do vírus da cinomose, miosite mastigatória, fissuras, falhas e fraturas ósseas, sequela neurológica promovida pelo vírus da encefalomielite.

23. BIOFÁRMACO caracterizado pelo fato de compreender o concentrado de células tronco de uma ou mais reivindicações 1 a 15 e um ou mais ingredientes biologicamente aceitáveis.

24. BIOFÁRMACO de acordo com a reivindicação 23 caracterizado pelo fato de que ditos ingredientes são um ou mais dentre solução fisiológica, biomateriais, fatores de crescimento, células mono-nucleares, plasma rico em plaquetas, fibrina, hidroxiapatita, membranas de colágenos, moléculas bioativas.

25. BIOFÁRMACO de acordo com a reivindicação 23 caracterizado pelo fato do dito ingrediente ser solução fisiológica.

26. FORMA DE DOSAGEM para tratamento de doenças, traumas, injúrias, ou aspectos estético-dermatológicos de mamíferos caracterizada por conter o concentrado de células de uma qualquer das reivindicações 1 a 15, com entre 1 x 106 e 1 x 107 de células do dito concentrado .

27. MÉTODO DE TRATAMENTO de doenças, traumas, injúrias ou aspectos estético-dermatológicos de mamíferos caracterizado por administrar a um paciente necessitado de tratamento uma ou mais quantidades do concentrado de células tronco de acordo com uma das reivindicações 1 a 15.

28. MÉTODO DE TRATAMENTO de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo fato da dita administração do dito concentrado para tratar aplasia de medula ser por injeção dentro da cavidade do osso.

29. MÉTODO DE TRATAMENTO de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo fato da dita administração do dito concentrado para tratamento de doenças oftalmológicas ser por gotejamento de colírio.

30. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE CONCENTRADO DE CÉLULAS TRONCO conforme uma qualquer das reivindicações 1 a 14 caracterizado por compreender as etapas de: A - obtenção de amostra de tecido adiposo vascularizado de mamífero; B - lavagem e limpeza da amostra de tecido; C - fragmentação da amostra de tecido; D - digestão enzimática suave da gordura do fragmento do tecido; E - centrifugação para separar o tecido; F - cultivo de explante de tecido; G - ao se atingir confluência entre 70 e 90%, dissociar as colônias de células migradas para fora do tecido; H - opcionalmente, o tecido separado na etapa E pode ser submetido a novo cultivo de explante, iniciando nova etapa F; I - expansão das células isoladas na etapa G.

31. PROCESSO de acordo com a reivindicação 30 caracterizado pelo fato de que uma ou mais das seguintes opções se aplica: na etapa A o mamífero doador é jovem e sadio; na etapa A a amostra de tecido adiposo tem entre 0,1 e 0,3 cm3; na etapa B a lavagem e limpeza é feita com solução fisiológica e antibiótico; na etapa D a digestão enzimática suave é feita com colagenase tipo I ou tipo IV; na etapa F o cultivo de explante do tecido é feito com 5 a 7 fragmentos de tecido por garrafa de 25 cm2 de material aderente, durante 3 a 5 dias, sem trocar o meio de cultivo; na etapa G a separação das colônias é feita via enzimáticas; na etapa Η, o fragmento do tecido adiposo em cultura pode ser transferido várias vezes na garrafa de cultivo; na etapa I, a expansão das células isoladas é realizada no máximo até 6 passagens.