ES2313805A1

ES2313805A1 - Identificacion y aislamiento de celulas multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral.

Info

Publication number: ES2313805A1
Application number: ES200402355A
Authority: ES
Inventors: Antonio Bernad Miana; Rosa Ana Garcia Castro; Miguel Angel Gonzalez De La Peña; Gema Fernandez Miguel; Mariano Garcia Arranz; Damian Garcia-Olmo
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid; Cellerix SA
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2024-10-04
Also published as: WO2006037649A1; PT2292736E; US10729726B2; CY1116198T1; ES2535042T3; EP1812558A1; EP3342857A1; EP2862925A1; SG158853A1; HUE025155T2; EP2292736A2; CN101056974A; US20070248580A1; EP2292736A3; CA2583151A1; JP2013013411A; PL2292736T3; EP3165601A1; IL182441A0; AU2005291353A1

Abstract

Esta invención se refiere a la identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral. En concreto se refiere a una célula adulta multipotente aislada o una población o composición celular comprendiendo dicha célula, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral, caracterizada por ser positiva a los siguientes marcadores: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y por carecer de la expresión de los siguientes marcadores: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Description

Identificación y aislamiento de células multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral.

Antecedentes de la invención

Las células madre presentan como características diferenciales el ser células capaces de automantenerse y de diferenciarse a uno o más tipos celulares. Aunque las investigaciones sobre las células madre y sus aplicaciones se encuentran en una fase inicial, las células madre adultas presentes en la médula ósea han sido utilizadas en transplantes durante más de 30 años. No obstante, en los últimos años la tecnología de las células madre ha experimentado un importante desarrollo que ha hecho que, en la actualidad, sean consideradas como una prometedora fuente de tejidos y órganos, presentando un importante potencial terapéutico en la reparación y regeneración de tejidos.

El uso de células madre constituye una terapia alternativa para diversas patologías humanas, en especial, en aquellas en que existe una pérdida de células funcionales, incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades neurodegenerativas, rechazo inmunológico, enfermedades cardíacas y desórdenes de la piel (ver patentes US 5.811.094, 5.958.767, 6.328.960, 6.379.953, 6.497.875).

Además de las aplicaciones en terapia celular, las células madre presentan potenciales aplicaciones en la investigación y desarrollo de nuevos fármacos. Por una parte, el estudio de los mecanismos implicados en la proliferación y diferenciación de las células madre tiene un gran valor en el proceso de búsqueda y caracterización de nuevos genes involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular y los procesos neoplásicos (Phillips et al., 2000; Ramalho-Santos et al., 2002; Ivanova et al., 2002). Por otra parte, la tecnología de las células madre permite la generación de tipos celulares especializados y el desarrollo de modelos celulares de enfermedades humanas y animales, en los que poder determinar la eficacia y toxicidad de nuevos principios activos en fase preclínica (ver patente US 6.294.346).

Una célula madre somática adulta es una célula indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado y que presenta capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o más tipos celulares. Las células madre adultas están presentes en diversos tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su presencia en médula ósea, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo esquelético, pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y piel (stem cell book, 2001). Por su naturaleza, las células madre adultas autólogas son inmunocompatibles y su uso no presenta impedimentos de tipo ético.

Una célula madre adulta debe ser capaz de dar lugar a células totalmente diferenciadas que presenten fenotipos maduros y se integren en el tejido en el que se encuentran, siendo capaces de realizar aquellas funciones especializadas propias de dicho tejido. El término fenotipo, se refiere a las características observables de la célula: morfología característica, interacciones con otras células y con la matriz extracelular, proteínas de la superficie celular (marcadores de superficie) y funciones características. (stem cell book, 2001).

Se han descrito diversas poblaciones de células madre adultas capaces de contribuir a la reparación de distintos tejidos. Entre dichas poblaciones, las de origen mesodérmico tienen un especial interés, pues ofrecen la posibilidad teórica de regenerar un gran número de tejidos conectivos clínicamente muy relevantes, tales como: hueso, cartílago, tendones, músculo esquelético, músculo cardiaco, endotelio vascular, grasa subdérmica y estroma medular. La primera población celular aislada de este tipo fueron las llamadas células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells, MSC), contenidas en el estroma de la médula ósea (Friedenstein et al., 1976; Caplan et al., 1991; Pittenger et al., 1999). Estas células han sido extensamente caracterizadas y estudios realizados en las mismas han demostrado que pueden diferenciarse a distintos linajes celulares mesenquimales, tales como: adipocitos (Beresford et al., 1992), condrocitos (Johnstone et al., 1998), mioblastos (Wakitani et al., 1995) y osteoblastos (Haynesworth et al., 1992). Asimismo, presentan también capacidad de diferenciación a neuronas (Sanchez-Ramos et al., 2000).

La fuente ideal de células madre adultas es aquella en que el proceso de obtención es fácil, no invasivo y permite el aislamiento de un número de células suficientemente alto. En particular, una fuente de células madre que permita que puedan ser fácilmente aisladas de un sujeto vivo sin que esto implique riesgos o molestias significativas y que permita obtener un rendimiento elevado con una contaminación mínima por otros tipos celulares, sin que el coste del aislamiento y cultivo sea excesivo.

El proceso de obtención de médula ósea es doloroso y el rendimiento es muy bajo, siendo necesario un incremento importante del número de células, mediante su expansión ex vivo, para obtener una cantidad clínicamente relevante. Dicho paso implica un coste, a nivel económico y de tiempo, así como un mayor riesgo de contaminación y de pérdida de material. Por estas razones, seria muy deseable el poder aislar células multipotentes a partir de tejidos mesenquimales distintos de la médula ósea. En particular, dada su accesibilidad quirúrgica, sería muy conveniente aislar dichas células a partir de tejidos mesodérmicos no osteocondrales, tales como, pero sin limitarse a: dermis, grasa y músculo esquelético. En la presente invención, nos referiremos a dichos tejidos mesodérmicos no osteocondrales como "tejidos blandos".

La presencia de diversas poblaciones de células madre multipotentes en tejidos blandos derivados del mesodermo embrionario, ha sido descrita por varios autores. Así, por ejemplo, se ha descrito la obtención de células multipotentes a partir de músculo esquelético y otros tejidos conectivos de mamíferos (Young et al. 1993, Rogers et al. 1995). También han sido obtenidas células multipotentes a partir de lipoaspirados humanos (Zuk et al., 2001). Otro ejemplo de células multipotentes aisladas de tejidos conectivos adultos, lo constituyen las llamadas MAPC (Multipotent Adult Progenitor Cells) obtenidas a partir de médula ósea (Verfaillie et al., 2002). En principio, todas estas poblaciones celulares aisladas podrían ser utilizadas en la reparación y regeneración de tejidos conectivos de forma similar a las MSC de médula ósea (Caplan et al., 2001). Sin embargo, salvo las MAPC, ninguna de estas poblaciones ha sido, hasta la fecha, suficientemente caracterizada a nivel fenotípico. Por tanto, aunque ha sido descrita la presencia de células madre multipotentes en diversos tejidos conectivos, en el estado actual de la técnica no es posible identificar y distinguir entre sí de manera inequívoca distintos tipos de poblaciones celulares multipotentes obtenidas a partir de tejidos blandos, ni obtener una población sustancialmente pura.

En la actualidad, la caracterización fenotípica de células madre comprende la determinación de marcadores, tales como receptores de la superficie celular, entre otros; y la determinación de su capacidad de diferenciación en cultivo in vitro. Cada tipo celular presenta una determinada combinación de marcadores en su superficie, es decir, presenta un perfil de expresión determinado que caracteriza dicho tipo celular distinguiéndolo de otros.

Diferentes combinaciones de marcadores de superficie han sido utilizados para aislar poblaciones sustancialmente puras de células madre hematopoyéticas de médula ósea de ratones, como: [Lin^{neg/low}, Thy1.1^{low}, c-Kit^{high}, Sca-1^{+}], [Lin^{-}, Thy1.1^{low}, Sca-1^{+}, rhodamine 123^{low}] (Morrison, S.J. et al., 1995) o [Lin^{-}, CD34^{-/int}, c-Kit^{+}, Sca-1^{+}] (Osawa, M. et al., 1996). Asimismo, combinaciones similares de marcadores se han utilizado para enriquecer poblaciones de células madre hematopoyéticas humanas [Lin^{-}, Thy1^{+}, CD34^{+}, CD38^{neg/low}] (Morrison, S.J. et al., 1995).

Actualmente, no se conoce cuantos marcadores asociados con células comprometidas y diferenciadas se encuentran también presentes en las distintas poblaciones de células madre mesenquimales. Por ejemplo, un marcador comúnmente utilizado en el enriquecimiento en células madre mesenquimales es CD44 (receptor del ácido hialurónico). No obstante, CD44 se encuentra también presente en diversos tipos celulares comprometidos y diferenciados. La incertidumbre de cuales son los marcadores asociados a células madre que permiten distinguirlas de aquellas células que presentan un mayor grado de diferenciación, junto con el bajo porcentaje de células madre presentes en tejidos adultos, han hecho difícil la identificación y purificación de poblaciones de células madre adultas mesenquimales.

Una desventaja importante del uso de las células madre adultas consiste en que la mayoría de las actuales fuentes de obtención de células madre están contaminadas con otros tipos celulares, complicando el proceso de identificación, aislamiento y caracterización de las poblaciones de células madre cuyo objetivo es ser utilizadas con fines terapéuticos u otros usos. De aquí el interés de obtener una población de células madre multipotentes aisladas en una forma sustancialmente pura.

La caracterización de una población de células madre multipotentes adultas procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral, permitirá el diseño de un método de identificación y aislamiento, así como también la identificación de factores de crecimiento asociados con su autorregeneración. Además, puede que existan factores de crecimiento asociados con las primeras fases de diferenciación, cuyo conocimiento permitiría una diferenciación más eficiente in vivo y ex vivo, así como ejercer un control sobre la proliferación de las células madre.

La presente invención proporciona una población de células madre multipotentes adultas procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral, preferentemente de tejido adiposo, aisladas y caracterizadas en detalle mediante marcadores inmunofenotípicos presentes en la superficie celular, demostrando además su multipotencialidad.

Asimismo, la presente invención proporciona un método para la identificación y aislamiento de una población de células madre multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral, en función de un patrón de marcadores inmunofenotípicos característicos, permitiendo la obtención de una composición de células madre multipotentes sustancialmente homogénea.

Breve descripción de la invención

Un primer aspecto de invención se refiere a una célula adulta multipotente aislada, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral, caracterizada por ser positiva a los siguientes marcadores: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y por carecer de la expresión de los siguientes marcadores: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Un aspecto preferido de la invención se refiere a una célula adulta multipotente aislada, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral obtenida por un método que comprende:

a.: recolección del tejido mesenquimal no osteocondral:

b.: obtención de una suspensión celular mediante digestión enzimática;

c.: sedimentación de las células y resuspensión en medio de cultivo adecuado;

d.: cultivo de las células y eliminación de aquellas que no presentan adhesión.

Donde dicha célula está caracterizada por ser positiva a los siguientes marcadores: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y por carecer de la expresión de los siguientes marcadores: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

En un aspecto más preferido de la invención, el tejido mesenquimal no osteocondral es tejido conectivo, preferentemente tejido adiposo.

En un aspecto aún mas preferido de la invención, las células objeto de la presente invención pueden estar genéticamente modificadas.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a aquella(s) célula(s) que exprese(n),al menos, una característica propia de una célula especializada, derivada de una célula madre adulta multipotente aislada objeto de la presente invención. Donde preferentemente dicha célula expresa al menos una característica propia de célula epitelial o de célula endotelial o de adipocito o de miocito o de condrocito o de osteocito o de neurona o de astrocito o de oligodendrocito o de hepatocito o de cardiomiocito o de célula pancreática.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una población aislada que comprenda células procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral caracterizadas por ser positivas a los siguientes marcadores: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y por carecer de la expresión de los siguientes marcadores: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método de identificación de una población de células adultas multipotentes, donde dicha población consiste de células aisladas objeto de la presente invención, que comprende:

1): incubar las células con compuestos de unión específicos marcados, dirigidos frente a uno o más de los marcadores que caracterizan dicha población; preferentemente dichos compuestos de unión específicos son anticuerpos.

2): detectar presencia o ausencia de unión a dichos compuestos de unión específicos.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de aislamiento de una población de células adultas multipotentes objeto de la presente invención o de una célula objeto de la presente invención, que comprende:

1): recolección del tejido mesenquimal no osteocondral;

2): obtención de una suspensión celular mediante digestión enzimática;

3): incubar dicha suspensión celular con compuestos marcados que se unan específicamente a uno o más de los marcadores de superficie cuya presencia o ausencia caracteriza dichas células;

4): seleccionar aquellas células que presentan un perfil de expresión de marcadores característico de la o de las células objeto de la presente invención.

En un aspecto preferido de la invención dicho método de aislamiento consiste en que se realiza una selección negativa, excluyendo aquellas células que presentan unión a compuestos marcados que se unen específicamente a CD11b o CD14 o CD15 o CD16 o CD31 o CD34 o CD45 o CD49f o CD102 o CD104 o CD106 o CD133 y una posterior selección positiva de aquellas células que presentan unión a compuestos marcados que se unen específicamente a CD9 o CD10 o CD13 o CD29 o CD44 o CD49a o CD51 o CD54 o CD55 o CD58 o CD59 o CD90 o CD105.

Un aspecto preferido de la invención se refiere a una población de células madre adultas multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral obtenidas según un método de aislamiento de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a una composición celular sustancialmente homogénea que comprenda una célula o población celular objeto de la presente invención. Adicionalmente dicha composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto preferido de la presente invención comprende una composición farmacéutica objeto de la invención para su uso en terapia. En un aspecto adicional dicha composición farmacéutica se utiliza para la reparación y regeneración de tejidos.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para evaluar in vitro o in vivo la respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, que comprende:

1): aislar una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14 a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de los mismos;

2): diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto;

3): expandir las células en cultivo;

4): diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto;

5): poner en contacto el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con una biblioteca combinatorial de dichos agentes

6): evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del cultivo.

Descripción de las figuras

Las figuras 1a-1d muestran los histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie obtenidos a partir de células aisladas de lipoaspirados de un donante sano. Los resultados muestran la evolución de los marcadores estudiados a lo largo del tiempo en cultivo y se indica en cada caso a qué momento del periodo de cultivo pertenecen las células analizadas. La figura 1 a muestra la expresión de marcadores realizados a día 0. La figura 1b muestra la expresión de marcadores a día 7 en cultivo. La figura 1c muestra la expresión de marcadores a las 4 semanas en cultivo y la figura 1d muestra la expresión de marcadores a los 3 meses en cultivo.

Las figuras 2a-2d muestran los histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie obtenidos a partir de células aisladas de lipoaspirados de un segundo donante sano. Los resultados muestran la evolución de los marcadores estudiados a lo largo del tiempo en cultivo y se indica en cada caso a qué momento del periodo de cultivo pertenecen las células analizadas. La figura 2a muestra la expresión de marcadores realizados a día 0. La figura 2b muestra la expresión de marcadores a día 7 en cultivo. La figura 2c muestra la expresión de marcadores a las 4 semanas en cultivo y la figura 2d muestra la expresión de marcadores a los 3 meses en cultivo.

Las figuras 3a-3d muestran los histogramas de inmunocitometría de fluorescencia correspondientes al perfil de marcadores de superficie obtenidos a partir de células aisladas de lipoaspirados de un tercer donante sano. Los resultados muestran la evolución de los marcadores estudiados a lo largo del tiempo en cultivo y se indica en cada caso a qué momento del periodo de cultivo pertenecen las células analizadas. La figura 3a muestra la expresión de marcadores realizados a día 0. La figura 3b muestra la expresión de marcadores a día 8 en cultivo y la figura 3c muestra la expresión de marcadores a las 4 semanas en cultivo y la figura 2d muestra la expresión de marcadores a los 3 meses en cultivo.

Las figuras 4a-4d muestran microfotografías de las células incubadas en medio osteoinductor durante tres semanas. La figura 4a muestra células madre mesenquimales de médula ósea humana (control positivo). La figura 4b muestra las células incubadas en medio osteoinductor durante la primera semana. La figura 4c muestra las células incubadas en medio osteoinductor durante la segunda semana. La figura 4d muestra las células incubadas en medio osteoinductor durante la tercera semana.

Explicación de la invención

Con el objetivo de diseñar un método de identificación y aislamiento que permita obtener una población definida de células madre multipotentes procedentes de tejidos blandos, se realizó la caracterización fenotípica de células mesenquimales humanas obtenidas a partir de tejido adiposo subdérmico y se estudió su evolución a lo largo de la expansión en cultivos in vitro, así como su capacidad de diferenciación a distintos linajes celulares.

En primer lugar, se monitorizó mediante citometría de flujo la expresión de una serie de marcadores de superficie en las células madre adultas procedentes de tejido adiposo subdérmico, recién aisladas y a lo largo del desarrollo del cultivo in vitro. Para ello, se analizaron una serie de marcadores comúnmente utilizados en la identificación de células madre, así como en la caracterización de células diferenciadas, incluyendo pero sin limitarse a: integrinas, marcadores hematopoyéticos, receptores de factores de crecimiento y receptores de matriz extracelular (Ejemplo 1).

La caracterización de las células madre adultas multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral mediante la determinación de su perfil inmunofenotípico, nos permite definir dicha población en función de la presencia o ausencia de un conjunto determinado de marcadores de superficie. Dichos marcadores, son epítopos que pueden ser identificados mediante anticuerpos específicos, constituyendo una valiosa herramienta que nos permite identificar la población, así como diseñar una estrategia de aislamiento o purificación de la misma.

Las células de la presente invención están caracterizadas por ser positivas a los siguientes marcadores: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105 y por carecer de la expresión de los siguientes marcadores: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

Una vez caracterizadas, las células de la invención fueron inducidas a diferenciarse in vitro a células que expresen al menos una característica propia de una célula especializada, con el objetivo de demostrar su multipotencialidad. Los métodos que se pueden usar para inducir la diferenciación de las células madre de la presente invención a diversos tipos celulares concretos son conocidos por los expertos en la materia y algunos de ellos se explican en detalle en los Ejemplos 2, 3 y 4 de la patente.

La caracterización fenotípica de una población celular mediante marcadores de superficie puede realizarse bien mediante tinción individualizada de las células (citometría de flujo) o bien mediante cortes histológicos de la población in situ, realizados de acuerdo con los métodos habituales.

La determinación del perfil de expresión de marcadores de superficie mediante anticuerpos, caracterización inmunofenotípica, puede ser directa, utilizando un anticuerpo marcado o indirecta, utilizando un segundo anticuerpo marcado dirigido contra el anticuerpo primario específico del marcador celular, consiguiéndose una amplificación de la señal.

Por otra parte, la presencia o ausencia de unión al anticuerpo puede ser determinada por distintos métodos que incluyen pero no se limitan a microscopia de inmunofluorescencia y radiografía. Asimismo, se puede llevar a cabo la monitorización de los niveles de unión del anticuerpo mediante citometría de flujo, técnica que permite correlacionar los niveles de fluorocromo con la cantidad de antígenos presentes en la superficie celular unidos específicamente a los anticuerpos marcados.

La expresión diferencial de una serie de marcadores de superficie en una población celular proporciona un método de identificación y aislamiento de dicha población.

En los ensayos de identificación o aislamiento, la población celular se pone en contacto con un reactivo específico, marcado o no, en función de si el ensayo se realiza mediante un método de detección directa o indirecta, respectivamente. El término "reactivo específico" hace referencia a un miembro de una pareja específica de unión. Como miembros de una pareja específica de unión se incluyen además de parejas de unión compuestas por antígenos y anticuerpos, parejas compuestas por antígenos MHC y receptores de células T, secuencias nucleotídicas complementarias, así como parejas de ligandos peptídicos y su receptor. Las parejas de unión específicas incluyen análogos, fragmentos y derivados de un miembro específico de la pareja de unión.

Resulta de particular interés, el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. La producción de anticuerpos monoclonales específicos resultará evidente para cualquier experto medio en la materia. En experimentos de identificación o separación de poblaciones celulares, se procede al marcaje de los anticuerpos. Para ello, se utilizan etiquetas que incluyen pero no se limitan a: partículas magnéticas, biotina y fluorocromos que permitirán la identificación o separación de aquel tipo celular al que se haya unido el anticuerpo. Así por ejemplo, el análisis de la población celular mediante citometría de flujo permite utilizar en una misma muestra distintos anticuerpos marcados con fluorocromos que emiten a una longitud de onda distinta. De modo que podemos conocer el perfil específico de la población para esos marcadores de superficie, así como llevar a cabo una separación por el conjunto de marcadores utilizados.

La separación de las poblaciones que presentan el fenotipo de interés se puede llevar a cabo mediante técnicas de separación por afinidad, entre las que se incluyen: separación magnética (utilizando partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos), cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a anticuerpos monoclonales o usados junto a anticuerpos monoclonales, y "panning" con el anticuerpo asociado a un soporte sólido, así como mediante otras técnicas que resulten adecuadas. Una separación más precisa se obtendría mediante citometría de flujo, técnica que permite separar poblaciones celulares en función de la intensidad de la tinción, junto con otros parámetros como el tamaño celular y la complejidad celular.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar, pero no limitan la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de células madre procedentes de tejidos blandos y caracterización de marcadores de superficie

El aislamiento de células madres multipotentes a partir de tejido blando, se realizó mediante selección de aquellas células con capacidad de proliferación y diferenciación, caracterizadas por presentar adhesión al plástico de cultivo celular. A continuación, se procedió a su caracterización mediante la monitorización por citometría de flujo de la expresión de una serie de marcadores de superficie en las células recién aisladas y a lo largo del desarrollo del cultivo in vitro.

El aislamiento de las células madres multipotentes se realizó a partir de tejido adiposo subdérmico, obtenido mediante liposucción de tres donantes sanos (donantes 1, 2 y 3).

En primer lugar, se procedió al lavado de la muestra de tejido adiposo subdérmico con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para conseguir la destrucción de la matriz extracelular y el aislamiento de las células, se realizó una digestión enzimática con colagenasa tipo II en solución salina (5 mg/ml) a 37º durante 30 minutos. Se inactivó la colagenasa por adición de un volumen equivalente de medio DMEM, con un 10% de suero bovino fetal. Dicha suspensión celular se centrifugó a 250 g durante 10 minutos obteniéndose un depósito de células. Se añadió NH_{4}Cl a una concentración final de 0.16M y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para inducir la lisis de los eritrocitos presentes. La suspensión fue centrifugada a 250-400 g y se resuspendió en DMEM-10% FBS con 1% ampicilina-estreptomicina. Finalmente, se plaquearon las células, inoculándose 20-30.000 células por cm^{2}.

Las células se mantuvieron en cultivo durante 20-24 horas a 37ºC, en atmósfera con 5% CO_{2}. Transcurridas 24 h, el cultivo fue lavado con PBS para eliminar las células y los restos de tejido en suspensión. Las células seleccionadas mediante adherencia se mantuvieron en cultivo en medio DMEM + 10% de suero fetal bovino (FBS).

Tras el aislamiento, se procedió a la caracterización de las células madre aisladas de cada uno de los donantes, en función de la presencia/ausencia de una serie de marcadores de superficie. Para ello, se monitorizó mediante citometría de flujo la expresión de los siguientes marcadores de superficie:

\bullet: Integrinas: CD11b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD61, CD104.

\sqbullet: Marcadores hematopoyéticos: CD3, CD9, CD10, CD13, CD14, CD16, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133, y glicoforina.

\sqbullet: Receptores de factores de crecimiento: CD105, NGFR

\sqbullet: Receptores de matriz extracelular: CD15, CD31, CD44, CD50, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, CD102, CD106, CD166

\sqbullet: Otros: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, \beta2-microglobulina.

La caracterización inmunofenotípica de las células se realizó sobre las células recién aisladas y también a día 7, a las 4 semanas y a los 3 meses en cultivo, de las muestras procedentes de los tres donantes sanos. Teniendo en cuenta que la selección se realiza por adherencia al plástico de cultivo, se considera como células recién aisladas, la fracción celular adherida tras menos de 24 h en cultivo desde el aislamiento.

Las células a caracterizar, fueron recogidas mediante digestión suave con tripsina, lavadas con PBS e incubadas durante 30 minutos a 4ºC con anticuerpos marcados con fluoresceína (FITC) ó ficoeritrina (PE), dirigidos frente a cada uno de los marcadores de superficie a analizar. Las células marcadas se lavaron y fueron inmediatamente analizadas usando un citómetro Epics-XL (Coulter). Como controles, se utilizaron células teñidas con anticuerpos inespecíficos de los correspondientes isotipos marcados con FITC o PE.

Las Figuras 1a-1d, 2a-2d y 3a-3d, muestran los histogramas agrupados por donante para una mejor observación de la evolución de los marcadores estudiados a lo largo del tiempo en cultivo, indicándose en cada caso, a qué momento del periodo en cultivo pertenecen las células analizadas.

El análisis de los marcadores de superficie a diferentes tiempos, permitió determinar la presencia/ausencia de los mismos, así como su comportamiento a lo largo del cultivo. Los resultados obtenidos, muestran que las poblaciones celulares aisladas procedentes de los distintos donantes sanos presentan un comportamiento homogéneo en su caracterización fenotípica.

A partir del análisis del perfil de expresión de marcadores de superficie (Figuras 1a-1d, 2a-2d y 3a-3d), se utilizaron 3 criterios para determinar cuales son aquellos marcadores que definen la población celular y permiten identificarla y diferenciarla frente a otros tipos celulares. Dichos criterios son:

1.: Descartar aquellos marcadores que varían entre muestras o con el tiempo de cultivo.

2.: Verificar que los que son positivos, lo son también a tiempo cero (células recién aisladas).

3.: Seleccionar en función de su relevancia biológica, descartando aquellos marcadores característicos de tipos celulares concretos (por ejemplo, CD3 que es un marcador exclusivo de linfocito).

Aplicando dichos criterios, la célula madre adulta multipotente aislada, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral, de la presente invención, se caracteriza por ser CD9<+>, CD10<+>, CD13 <+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> y CD105<+>; y por carecer de la expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.

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Ejemplo 2 Diferenciación in vitro de células madre multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral humano a células de fenotipo óseo

En el ensayo de diferenciación, se utilizaron células humanas aisladas caracterizadas procedentes de las tres muestras de lipoaspirado analizadas, correspondientes cada una a un donante sano, así como una muestra de células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells, MSC) de médula ósea humana, que fue utilizada como control positivo.

Las células aisladas se sembraron a una densidad de 10.000 células/cm^{2} en placas de 6 pocillos (una placa por muestra), y se incubaron en medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS, LGlutamina 2 mM y antibiótico). Tras dos días de cultivo, se reemplaza el medio de cultivo de uno de los pocillos (control) por medio fresco, y el de los restantes pocillos por medio inductor de osteogénesis, que contiene el medio de cultivo estándar al que se ha añadido:

-: Dexametasona 100 nM.

-: Ácido ascórbico 50 \muM.

-: \beta-Glicerofosfato 10 mM.

Las células se mantienen en cultivo durante 3 semanas en las condiciones habituales, cambiando el medio cada 2-3 días. A las tres semanas, se puede observar la presencia de depósitos mineralizados de fosfato cálcico, lo que indica la presencia de nódulos óseos. Tales nódulos se detectan mediante una tinción con Rojo Alizarin (Standford et al., 1995) como se detalla a continuación: se elimina el medio, las células se lavan dos veces con PBS y se fijan con etanol 70% frío durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se lavan con PBS los pocillos fijados y se tiñen con Rojo Alizarin (40 mM, pH 4,1) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células teñidas se lavan abundantemente con agua, y se visualizan al microscopio los precipitados de fosfato cálcico, que aparecen fuertemente teñidos de rojo.

Las figuras 4a-4d muestran microfotografías de las células osteoinducidas teñidas con Rojo Alizarin. Aunque la formación de fosfato cálcico es más rápida en la muestra correspondiente a MSC de médula ósea que actúa como control positivo (figura 4a), en las tres muestras procedentes de tejido adiposo se aprecia la formación de grandes cantidades de matriz ósea, si bien con diferente intensidad en cada una de las muestras. Todos aquellos pocillos en los que fue inducida la osteogénesis exhibieron el mismo comportamiento y en los pocillos control (no sometidos a estímulos osteoinductores) no se detectó formación de matriz ósea. No se observó relación alguna entre la cantidad de matriz ósea formada y el tiempo que cada muestra llevaba en cultivo tras su aislamiento del tejido (entre 3 y 9 semanas).

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Ejemplo 3 Diferenciación in vitro de células madre multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral humano a células de fenotipo muscular

Las células aisladas se sembraron a una densidad de 10.000 células/cm^{2} en medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS, LGlutamina 2 mM y antibiótico). Tras dos días de cultivo, se reemplaza el medio de cultivo de uno de los pocillos (control) por medio fresco, y el de los restantes pocillos por medio inductor de miogénesis (Wakitani et al., 1995), que contiene el medio de cultivo estándar al que se ha añadido:

- Ascorbato-2-fosfato 0,1 mM

- Dexametasona 0,01 \muM

- ITS+1 (Sigma-Aldrich)

- 5-Azacitidina 3 \muM

Tras 24 horas, se remplaza el medio por medio de cultivo estándar. y se mantienen las células en cultivo durante 2-3 semanas, cambiando el medio cada 2-3 días. Tras ese tiempo, las células adquieren un fenotipo alargado, forman estructuras fibrilares y pueden observarse algunas fusiones celulares. Para detectar el fenotipo de mioblasto, las células obtenidas se fijan con paraformaldehído (PFA) al 4% y se incuban con un anticuerpo frente a la cadena pesada de la miosina, que es un antígeno específico de músculo.

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Ejemplo 4 Diferenciación in vitro de células madre multipotentes procedentes de tejido mesenquimal no osteocondral humano a células de fenotipo neuronal

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Las células aisladas se sembraron a baja densidad en medio de cultivo estándar (DMEM, 10% FBS, LGlutamina 2 mM y antibiótico), suplementado con 10 ng/ml bFGF y se incuba durante 24-36 horas de modo que se alcanza una alta confluencia celular. A continuación se lava y se añade medio neuroinductor (Black y Woodbury, 2001), compuesto por:

- \alphaMEM

- BHA 200 \muM

- Penicilina/streptomicina

- L-Glutamina 2 mM

- Foskolina 10 \muM

- 2% DMSO

- Hidrocortisona 1 \muM

- Insulina 5 \mug/ml

- CIK 25 mM

- Ácido Valproico 2 mM

A las pocas horas de la inducción se puede observar un cambio morfológico, las células adquieren un cuerpo celular redondeado y muy refringente, y unas prolongaciones que se asemejan a los axones y las dendritas de las células nerviosas. Tras 3 días, las células obtenidas se fijan con PFA al 4% y se incuban con anticuerpos frente a los antígenos específicos de neuronas NF-200 y TuJ1.

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Claims

```
\global\parskip0.930000\baselineskip
```
1. Célula adulta multipotente aislada, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral, caracterizada por:

a.

ser positiva a los siguientes marcadores: CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> y CD105<+>; y

b.

por carecer de la expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.
2. Célula adulta multipotente aislada obtenible mediante un método que comprende:

\sqbullet recolección del tejido mesenquimal no osteocondral;

\sqbullet obtención de una suspensión celular mediante digestión enzimática;

\sqbullet sedimentación de las células y resuspensión en medio de cultivo adecuado;

\sqbullet cultivo de las células y eliminación de aquellas que no presentan adhesión;

caracterizada por:

a.

ser CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> y CD105<+>; y

b.

por carecer de la expresión de CD1lb, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133.
3. Célula adulta multipotente aislada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho tejido mesenquimal no osteocondral es tejido conectivo.
4. Célula adulta multipotente aislada, según la reivindicación anterior, donde dicho tejido conectivo es tejido adiposo.
5. Célula adulta multipotente aislada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, genéticamente modificada.
6. Célula que exprese, al menos, una característica propia de una célula especializada, derivada de una célula madre adulta multipotente aislada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Célula, según la reivindicación anterior, que exprese al menos una característica propia de célula epitelial o de célula endotelial o de adipocito o de miocito o de condrocito o de osteocito o de neurona o de astrocito o de oligodendrocito o de hepatocito o de cardiomiocito o de célula pancreática.
8. Población celular aislada, que comprende células según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Método de identificación de una población de células adultas multipotentes, donde dicha población consiste en células aisladas, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende:

1)

incubar las células con compuestos de unión específicos marcados, dirigidos frente a uno o más de los marcadores que caracterizan dicha población;

2)

detectar presencia o ausencia de unión a dichos compuestos de unión específicos.
10. Método, según la reivindicación anterior, donde dichos compuestos de unión específicos son anticuerpos.
11. Método de aislamiento de una población de células adultas multipotentes, donde dicha población consiste en células aisladas, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende:

1)

recolección del tejido mesenquimal no osteocondral;

2)

obtención de una suspensión celular mediante digestión enzimática;

3)

incubar dicha suspensión celular con compuestos marcados que se unan específicamente a uno o más de los marcadores de superficie cuya presencia o ausencia caracteriza dichas células;

4)

seleccionar aquellas células que presentan un perfil de expresión de marcadores, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
12. Método de aislamiento, según la reivindicación anterior, en que se realiza una selección negativa, excluyendo aquellas células que presentan unión a compuestos marcados que se unen específicamente a CD11b o CD14 o CD15 o CD16 o CD31 o CD34 o CD45 o CD49f o CD102 o CD104 o CD106 o CD133 y una posterior selección positiva de aquellas células que presentan unión a compuestos marcados que se unen específicamente a CD9 o CD10 o CD13 o CD29 o CD44 o CD49a o CD51 o CD54 o CD55 o CD58 o CD59 o CD90 o CD105.
13. Método de aislamiento, según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, donde dichos compuestos de unión específicos marcados son anticuerpos.
14. Población de células madre adultas multipotentes, procedente de tejido mesenquimal no osteocondral, obtenida según el método de aislamiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizada por:

1)

ser CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> y CD105<+>; y

2)

por carecer de la expresión de CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y CD133;
15. Composición celular sustancialmente homogénea, que comprende una población celular, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14.
16. Composición farmacéutica que comprende una población celular, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Población celular aislada, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14, para su uso en terapia.
18. Población celular aislada, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14, para su uso en reparación y regeneración de tejidos.
19. Uso de una población celular aislada, según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14 para la elaboración de una composición farmacéutica para reparación y regeneración de tejidos.
20. Método para evaluar in vitro la respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, que comprende:

1)

aislar una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 14 a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de los mismos;

2)

diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto;

3)

expandir las células en cultivo;

4)

diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto;

5)

poner en contacto el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con una biblioteca combinatorial de dichos agentes; y evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del cultivo.