KR20070085294A - 비골연골성 중간엽 조직으로부터 다능성 세포의 동정 및단리 - Google Patents
비골연골성 중간엽 조직으로부터 다능성 세포의 동정 및단리 Download PDFInfo
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Abstract
비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 세포의 동정 및 단리. 본 발명은 비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 세포의 동정 및 단리에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리된, 성체 다능성 세포 또는 상기 세포를 함유하는 세포군 또는 조성물에 관한 것으로, 다음의 마커들에 대해 양성을 나타냄을 특징으로 하고: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105, 다음의 마커들은 발현하지 않는다: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133.
Description
본 발명은 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리되고, 일련의 세포 표면 마커들의 존재 및 부재에 의해 특징되는 단리된 다능성 성체 세포들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세포들의 군의 동정 및 단리 방법, 및 그의 적용 예로서 조직 복구 및 재생용 약학 조성물의 제조에서의 적용에 관한 것이다.
줄기 세포들은, 그들 자신을 유지(sustain)할 수 있고, 하나 이상의 세포 유형으로 분화될 수 있다는 차별되는 특징을 나타낸다. 비록 줄기 세포들 및 그의 적용에 대한 연구는 여전히 초기 단계에 있으나, 골수 내의 성체 줄기 세포들은 30 년 넘게 이식에 사용되어 왔다. 그럼에도불구하고, 최근 몇 년, 줄기 세포 기술이 크게 진보되어 줄기 세포들은 현재, 조직의 복구 및 재생에 대한 중요한 치료능을 갖는, 조직 및 기관의 유망한 공급원으로서 여겨지고 있다.
줄기 세포들의 이용은 몇몇 인간 질병들, 구체적으로 기능성 세포들의 손실이 있는 질병들에 대한 대체 요법으로, 상기 질병들은 연골, 골 및 근육 손상들, 신경퇴행성 질환들, 면역학적 거부반응, 심장병 및 피부 질환들을 포함한다 (미국 특허번호 US 5,811,094, US 5,958,767, US 6,328,960, US 6,379,953, US 6,497,875 참조)
세포 요법 적용들에 추가로, 줄기 세포들은 신약의 연구 및 개발에 잠재적인 적용성을 갖는다. 한편, 줄기 세포들의 증식 및 분화에 연루된 메커니즘의 연구는, 세포 발달 및 분화를 포함한 광범위한 생물학적 과정들, 및 종양 과정들에 관련된 새로운 유전자들에 대한 검색 및 특징화 과정에서 큰 가치를 갖는다 (Phillips 등, 2000; Ramalho-Santos 등, 2002; Ivanova 등, 2002). 다른 한편, 줄기 세포 기술은 특수화된(specialized) 세포들이 생성되도록 하고, 인간 및 동물 질병들에 대한 세포 모델들을 발전시키며, 여기에서 새로운 유효 성분들의 효능 및 독성은 임상 전(preclinical) 단계에서 결정될 수 있다 (U.S. 6,294,346).
성체 체세포 줄기 세포는 분화된 조직에서 발견되고 하나 이상의 세포 유형들로 증식 및 분화되는 능력을 갖는 미분화된(undifferentiated) 세포이다. 성체 줄기 세포들은 상이한 성체 조직에 존재하며, 그들의 존재는 골수, 혈액, 각막, 망막, 뇌, 근육, 골격, 치수(dental pulp), 위장내 상피, 간 및 피부에서 광범위하게 보고되어 있다 (Jiang 등, 2002). 이러한 성질로, 성체 줄기 세포들은 자가조직 세팅(setting)에 사용될 수 있으며, 그에 따라 이들은 면역학적으로 적합하며 이들의 사용은 어떤 윤리학적인 염려도 일으키지 않는다.
성체 줄기 세포는, 그들이 발견되는 조직 내로 통합되고 그 소정 조직의 특수화된 기능들을 수행할 수 있는 성숙한 표현형들을 갖는 완전히 분화된 세포들로 될 수 있어야 한다. "표현형"이라는 용어는, 특징적 형태학, 다른 세포들 및 세포 외 기질과의 상호작용, 세포 표면 단백질들 (표면 마커들) 및 특징적 기능들과 같이, 세포의 관찰될 수 있는 특징을 의미한다.
상이한 조직들의 복구에 기여할 수 있는 성체 줄기 세포들의 다른 군들이 기재되어 왔다. 이들 군들 중, 중배엽성(mesodermic) 기원의 것들이 특히 관심대상이 되는데, 이는 그들이 뼈, 연골 조직, 힘줄, 골격근, 심근, 혈관 내피, 진피하 (sub-dermal) 지방 및 골수 간질(bone marrow stroma)과 같이, 다수의 임상적으로 매우 관련된 결합 조직들을 재생하는 이론적 가능성을 제공하기 때문이다. 단리된 이러한 유형의 최초의 세포군은 소위 중간엽 줄기 세포 (MSC)로, 이는 골수 간질에서 발견된다 (Friedenstein 등, 1976; Caplan 등, 1991; Pittenger 등, 1999). 이들 세포들은 광범위하게 특징화되어 왔으며, 이들 세포들을 사용하여 수행된 연구들은 그들이 지방세포들 (Beresford 등, 1992), 연골세포들 (Johnstone 등, 1998), 근육모세포들 (Wakitani 등, 1995) 및 골아세포들 (Haynesworth 등, 1992)와 같이 상이한 중간엽 세포주들로 분화될 수 있음을 보여주었다. 유사하게, 그들은 뉴런으로 분화될 수 있는 능력도 갖는다 (Sanchez-Ramos 등, 2000).
성체 줄기 세포들의 이상적인 공급원은, 그들이 쉬운 비침습적(non-invasive) 과정에 의해 수득될 수 있는 것, 및 충분한 수의 세포들을 단리시킬 수 있는 것이다. 구체적으로, 공급원은 현저한 위험 및 불편함 없이 살아있는 대상으로부터 쉽게 단리될 수 있는 줄기 세포들을 공급하여야 하며, 상기 공급원은 과도한 단리 및 배양 비용 없이 기타 세포 유형들로 인한 오염을 최소로 하여 고수율이 수득되도록 하여야 한다.
골수 채취 과정은 고통스러우며, 그 수율은 매우 낮아, 임상적으로 적절한 양을 수득하기 위해서는 생체 외 증대(expansion)에 의해 세포들의 수를 실질적으로 증가시키는 것이 필요하다. 이러한 단계는 비용을 증가시키며, 처리 시간을 소비할 뿐만 아니라, 오염 및 물질 손실의 위험을 증가시킨다. 이러한 이유들로 인해, 골수 외의 중간엽 조직들로부터 다능성 세포들을 단리할 수 있는 것은 매우 바람직할 것이다. 구체적으로, 그들의 외과적 접근성이 주어지면, 이에 제한되지는 않지만, 피부, 지방 및 근육 조직들과 같은 비-골연골성 중배엽 조직들로부터 세포들을 단리할 수 있는 것이 편리할 것이다.
배아 중배엽으로부터 유도된 연조직들(soft tissues)에서 다능성 성체 세포들의 상이한 군들의 존재가 몇몇 저자들에 의해 보고되었다. 예로서, 다능성 세포들이 포유류의 골격근 및 기타 결합 조직으로부터 수득될 수 있다는 것이 보고되었다 (Young 등, 1993, Rogers 등 1995). 다능성 세포들은 인간의 지방흡입(lipoaspirated) 조직으로부터도 수득되어져 왔다 (Zuk 등, 2001). 성체 결합 조직으로부터 단리된 다능성 세포들의 또 다른 예로는, 골수로부터 수득된, 소위 다능성 성체 전구세포들 (Multipotent Adult Progenitor Cells: MAPC)이 있다 (Jiang 등, 2002). 원칙적으로, 이들 단리된 세포군들 모두 골수의 MSC 와 유사한 방식으로 결합 조직의 복구 및 재생에 사용될 수 있을 것이다 (Caplan 등, 2001). 그러나, MAPC 를 제외하고, 현재까지는 이들 세포군들 중 어떤 것도 표현형 수준으로 충분히 특징화되지 않았다. 따라서, 다능성 성체 세포들의 존재가 상이한 결합 조직들에서 기재되어 왔지만, 현재 기술 수준에서는, 연조직으로부터 수득된 상이 한 다능성 세포 유형들을 동정하고, 이들을 명백히 구분하거나 또는 실질적으로 순수한 군을 수득하는 것은 불가능하다.
현재, 줄기 세포들의 표현형 특징화는 다른 것들 중, 세포 표면 수용체들과 같은 마커들의 결정; 및 시험관 내 배양에서 그들의 분화에 대한 능력의 결정을 포함한다. 각 세포 유형은 표면 마커들의 특정 조합을 가지며, 즉 이는 다른 것들과 구분되는, 특정 세포 유형을 특징화하는 어떤 발현 프로파일 (profile)을 갖는다는 것이다.
표면 마커들의 다른 조합들은 마우스들의 골수로부터의 조혈모세포들 (hematopoietic stem cells)의 실질적으로 순수한 군들, 예로서 [Linneg/low, Thy1.1low, c-Kithigh , Sca-1+], [Lin-, Thy1.1low, Sca-1+, 로다민(rhodamine) 123low] (Morrison, S.J. 등, 1995) 또는 [Lin-, CD34-/ int, c-Kit+, Sca-1+] (Osawa, M. 등, 1996)을 동정 및 단리하는데 사용되어 왔다. 유사하게, 마커들의 유사한 조합들이 인간 조혈모세포들의 군을 풍부화하는데 사용되어 왔다 [Lin-, Thy1+, CD34+, CD38neg/low] (Morrison, S.J. 등, 1995).
현재, 절충(compromised) 및 분화된 세포들에 관련된 마커들이, 상이한 다능성 성체 중간엽 세포군들에도 얼마나 많이 존재하는지는 알려지지 않았다. 예로서, 다능성 성체 중간엽 세포들을 풍부화하기 위해 흔히 사용되는 마커는 CD44 (히알루론산 수용체)이다. 하지만, CD44는 절충 및 분화된 세포 유형들의 상이한 유 형들에도 존재한다. 성체 세포들에 존재하는 낮은 퍼센트의 줄기 세포들과 더불어, 어떤 마커들이 줄기 세포들에 관련되어 그들을 보다 큰 정도의 분화를 나타내는 세포들로부터 구분짓도록 하는가에 대한 불확실성은, 다능성 성체 중간엽 세포들의 군들을 동정 및 정제하는 것을 어렵게 만든다.
다능성 성체 세포들을 사용하는데 있어 현저한 단점은, 다능성 성체 세포들을 수득하기 위한 현재 공급원들의 대부분이 다른 세포 유형들로 오염되어 있어, 치료 또는 다른 목적들에 사용하려는 목적을 가지고, 다능성 성체 세포들의 군을 동정, 단리 및 특징화하는 과정이 복잡하게 된다는 사실에 있다. 따라서, 실질적으로 순수한 형태로 단리된 다능성 성체 세포들의 군을 수득하는 것에 대한 관심이 있다.
비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 성체 세포군의 특징화는 동정 및 단리 방법을 설계할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 자가-재생과 관련된 성장 인자들의 동정도 가능하게 한다. 또한, 분화의 초기 단계들과 관련된 성장 인자들이 있을 것이며, 이에 대한 지식은 보다 효율적인 생체 내 및 생체 외 분화를 가능하게 할 뿐만 아니라, 줄기 세포들의 증식에 대한 제어를 실시하는 것을 가능하게 할 것이다.
본 발명은 비골연골성 중간엽 조직으로부터의, 바람직하게는 지방 조직으로부터의, 세포 표면 상에 존재하는 면역표현형 마커들에 의해 단리 및 특징화된, 다능성 성질을 나타내는 다능성 성체 세포군을 제공한다.
유사하게, 본 발명은, 특징적인 면역표현형 마커들의 패턴에 따라 상이한, 비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 성체 세포들의 군의 동정 및 단리 방법을 제공하여, 실질적으로 균질한 다능성 줄기 세포 마커들의 조성물이 수득되도록 한다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 단리된 다능성 성체 세포에 관한 것으로, 이후 본 발명의 다능성 성체 세포로서 언급되며, 이는 (a) 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리되고; (b) CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49a<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> 및 CD105<+>를 발현하며; 그리고 (c) CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133은 발현하지 않는다. 본 발명의 다능성 성체 세포들은 증식 및 다른 세포 계통들(cell lineages)로 분화될 수 있는 능력을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 뼈 표현형 세포들, 근육 표현형 세포들 및 신경성 표현형 세포들로 분화될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다능성 성체 세포들을 함유하거나 또는 이들로 이루어지는 단리된 세포군에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 세포군은 거의, 즉 실질적으로 균질하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군을 함유하는 실질적으로 균질한 세포 조성물에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 특수화된 세포의 적어도 한 특징을 발현하는 세 포에 관한 것으로, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포로부터 유도된다. 한 구현예에서, 본 발명은 특수화된 세포의 적어도 한 특징을 발현하는 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 하나 이상의 특징은 상피세포, 내피세포, 지방세포, 근세포, 연골세포, 골세포, 뉴런, 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte), 간세포(hepatocyte), 심장근육세포 및 췌장세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포의 특징이다. 특수화된 세포의 적어도 하나의 특징을 발현하는 상기 세포들을 함유하는 단리된 세포군은 본 발명의 추가의 측면을 구성하며, 여기에서 상기 세포들은 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포들로부터 유도된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포들을 수득하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계들을 포함한다:
(a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;
(b) 효소적 소화에 의해 세포 현탁액을 수득하는 단계;
(c) 상기 세포들을 침전시키고, 그 세포들을 적절한 배양 배지에 재현탁하는 단계; 및
(d) 상기 세포들을 배양하고, 부착을 나타내지 않는 세포들을 제거하는 단계.
상기 방법에 따라 수득 및 단리된 세포들은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 특징을 함유하며, 즉 이들은 (a) 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리되었으며; (b) 다음의 마커들에 대해 양성이고: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105; 그리고 (c) 다음의 마커들을 발현하지 않는다: CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133. 또한, 상기 세포들은 증식하여 다른 세포 계통들로 분화되는 능력을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 비골연골성 중간엽 조직은 결합 조직, 바람직하게는 지방 조직이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 유전학적으로 개질될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다능성 성체 세포들의 군의 동정 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 군은 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포들을 함유하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 방법은:
(a) 상기 군에 대한 하나 이상의 특징적인 마커들에 대한, 표지된 특이적 결합 화합물들과 함께 상기 세포들을 인큐베이션하고;
(b) 이들 특이적 결합 화합물들에 대한 상기 세포들에 의한 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 특이적 결합 화합물은 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군을 단리하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계들을 포함하는 방법:
(a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;
(b) 효소적 소화에 의해 상기 조직으로부터 세포 현탁액을 수득하는 단계;
(c) 상기 세포 현탁액을 상기 군에 대해 특징적인 하나 이상의 표면 마커들 에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
(d) 마커들의 발현 프로파일을 갖는 세포들을 선발하는 단계.
상기 표면 마커들의 존재 또는 부재는 상기 세포들을 특징지으며, 이에따라 상기 세포군에 대해 특징적이다. 본 발명의 다능성 세포들의 특징적인 마커들의 발현 프로파일을 갖는 세포들을 최종적으로 선발한다.
바람직한 구현예에서, 상기 단리 방법은 음성 선발(negative selection)을 수행하고, 이에 의해 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물에 결합을 나타내는 세포들은 제외되고, 이어서 양성 선발(positive selection)을 수행하는 것으로 이루어지며, 이에 의해 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물들에 결합하는 세포들이 선택된다. 바람직하게는, 특이적 결합의 표지된 화합물은 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료적 용도, 예로서 약제로서의 사용을 위한, 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은, 조직의 복구 및 재생에의 용도를 위한 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군에 관한 것이다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 약학 조성물은 조직의 복 구 및 재생에 유용하다.
또한, 또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군의, 조직의 복구 및 재생용 약학 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 다른 측면에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 치료 방법은 조직 복구 또는 재생을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 또는 약물학적 성분, 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리(combinatorial library)에 대한 시험관 내 또는 생체 내 세포 반응의 평가 방법에 관한 것으로, 하기 단계들을 포함한다:
a) 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군을 단리하는 단계, 여기에서 상기 세포들은 거의 균질하고;
b) 배양을 통해 상기 세포군을 증대시키는 단계;
c) 생물학적 또는 약물학적 성분 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리를 상기 세포군에 적용하고, 배양된 세포들에 대한 상기 성분들의 영향을 평가하는 단계.
한 구현예에서, 단계 (a)의 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군은 개별적인 또는 그의 통계학적으로 유의한 군으로부터 단리된다. 다른 구현예에서, 단계 (a)의 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군의 상기 세포들은 거의, 즉 실질적으로 균질하다. 또 다른 구현예에서, 단계 (c) 전에, 상기 세포들은 특이적 유형의 세 포들로 분화되도록 허용된다.
도 1a-1d 는 건강한 공여자의 지방흡입 샘플들로부터 단리된 세포들에서 수득된 표면 마커들의 프로파일에 대응하는 형광 면역세포측정법(fluorescence immunocytometry)의 히스토그램들을 나타낸다. 결과들은 상기 세포 배양물들에서 연구된 마커들의 시간에 따른 전개를 보여주며, 각 경우에서 분석된 세포들이 속하는 특정 기간을 나타낸다. 도 1a는 0일에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 1b는 배양 7일째에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 1c는 배양 4 주 후 마커들의 발현을 나타내고, 도 1d는 배양 3 달 후의 마커들의 발현을 나타낸다.
도 2a-2d 는 제 2 의 건강한 공여자로부터의 지방흡입 샘플들로부터 단리된 세포들에서 수득된 표면 마커들의 프로파일에 대응하는 형광 면역세포측정법의 히스토그램들을 나타낸다. 그 결과들은 상기 세포 배양물들에서 연구된 마커들의 시간에 따른 전개를 보여주며, 각 경우에서 분석된 세포들이 속하는 특정 기간을 나타낸다. 도 2a는 0일에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 2b는 배양 7일째에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 2c는 배양 4 주 후 마커들의 발현을 나타내고, 도 2d는 배양 3 달 후의 마커들의 발현을 나타낸다.
도 3a-3d 는 제 3의 건강한 공여자로부터의 지방흡입 샘플들로부터 단리된 세포들에서 수득된 표면 마커들의 프로파일에 대응하는 형광 면역세포측정법의 히스토그램들을 나타낸다. 그 결과들은 상기 세포 배양물들에서 연구된 마커들의 시간에 따른 전개를 보여주며, 각 경우에서 분석된 세포들이 속하는 특정 기간을 나 타낸다. 도 3a는 0일에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 3b는 배양 7일째에서의 마커들의 발현을 나타낸다. 도 3c는 배양 4 주 후 마커들의 발현을 나타내고, 도 3d는 배양 3 달 후의 마커들의 발현을 나타낸다.
도 4a-4d 는 골원성 배지에서 3 주동안 인큐베이션된 세포들의 마이크로사진들을 나타낸다. 도 4a는 인간 골수로부터의 중간엽 줄기 세포들을 나타낸다 (양성 대조군). 도 4b는 본 발명의 세포들로, 첫 번째 주 동안 골원성 배지에 인큐베이션된 비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 성체 세포들을 나타낸다. 도 4c는, 두 번째 주 동안 골원성 배지에 인큐베이션된, 본 발명의 다능성 성체 세포들을 나타낸다. 도 4d는, 세 번째 주 동안 골원성 배지에 인큐베이션된, 본 발명의 다능성 성체 세포들을 나타낸다.
비골연골성 중간엽 조직(연조직)으로부터 다능성 성체 세포들의 정의된 군을 수득하는데 유용한 동정 및 단리 방법을 설계한다는 목적으로, 진피하 지방 조직으로부터 수득된 새로이(recently) 단리된 인간 중간엽 세포들의 표현형을 분석하고, 표면 마커들의 전개를, 세포들의 시험관 내 증대 동안 연구하였으며, 그들의 상이한 세포 계통들로 분화되는 능력도 연구되었다.
먼저, 진피하 지방 조직으로부터의 성체 세포들에서 일련의 표면 마커들의 발현을, 세포들이 새로이 단리되었을 때 및 시험관 내 배양물의 발전 동안 흐름 세포분석기(flow cytometry)로 모니터링하였다. 이를 실시하기 위해, 흔히 사용되는 일련의 마커들을 사용하여 줄기 세포들을 동정하고, 또한 분화된 세포들을 특징화하였으며, 마커들은 이에 제한되지는 않지만 인테그린(integrins), 조혈성 마커들, 성장인자 수용체들 및 세포외 기질 수용체들을 포함한다.(실시예 1)
그들의 면역표현형 프로파일을 결정함에 의한, 비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 성체 세포들의 특징화는 일련의 특정 표면 마커들의 존재 또는 부재 면에서, 상기 군을 정의하는 것을 가능하게 한다. 이들 마커들은 특이적 항체들을 사용하여 동정될 수 있는 에피토프들(epitopes)로, 상기 군을 동정하는 것 뿐만 아니라 그의 단리 또는 정제 방법을 설계하는 것을 가능하게 하는 귀중한 도구를 구성한다.
이어서, 일단 특징화된, 단리된 세포들은, 그들의 다능성 성질을 나타내는 목적으로, 분화 분석에 투입된다. 이의 실시를 위해, 단리되고 특징화된 세포들은 시험관 내 실험으로 유도되어, 특수화된 세포의 적어도 하나의 특징을 발현하는 세포들로 분화된다. 본 발명의 다능성 성체 세포들의, 상이한 특이적 세포 유형들로의 분화를 유도하는데 사용될 수 있는 방법들은 당업자에게 알려져 있으며, 이들 중 일부는 실시예들 2, 3 및 4에 상세히 설명되어 있으며, 여기에서 본 발명의 다능성 성체 세포들의 뼈 표현형 세포들, 근육 표현형 세포들 및 신경성 표현형 세포들로의시험관 내 분화를 각각 보여준다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은, 이후 본 발명의 다능성 성체 세포로서 언급되는, 단리된 다능성 성체 세포에 관한 것으로, 이는 (a) 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리되고; (b) CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49a<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> 및 CD105<+>를 발현하고; (c) CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 은 발현하지 않는다.
본 발명의 다능성 성체 세포들을 함유하거나 또는 이들로 이루어진 단리된 세포군은 본 발명의 추가의 측면을 구성한다. 특정 구현예에서, 상기 세포군은 거의, 즉 실질적으로 균질하다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리된다. "비골연골성 중간엽 조직" 이라는 용어는 연골조직 및 골수 외의 중간엽 조직을 의미한다. 비골연골성 중배엽성(mesodermal) 조직들은 본 기재에서 "연조직"으로서 언급되기도 한다. 비골연골성 중배엽성 조직들의 예시적이며 비제한적인 예들은 피부, 지방 및 근조직을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 진피하 지방 조직으로부터 단리된다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은, 인간을 포함하여 임의의 적합한 동물로부터 비골연골성 중간엽 조직의 임의의 적당한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일반적으로, 상기 세포들은 비병리학적 산후 포유류의 비골연골성 중간엽 조직들로부터 수득된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은, 진피하 지방 조직과 같은 비골연골성 중간엽 조직의 공급원으로부터 수득된다. 또한, 특정 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 포유류, 예로서 설치류, 영장류 등으로부터, 바람직하게는 인간으로부터 단리된다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 일련의 마커들의 존재 및 부재에 의해서도 특징화되며, 즉 상기 세포들은 그들이 (i) 일부 마커들 [CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49a<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> 및 CD105<+>]에 대해 양성이고, (ii) 일부 마커들 [CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133]에 대해 음성임을 특징으로 한다.
본 발명의 다능성 성체 세포들, 또는 상기 세포들을 함유하는 세포군의, 표면 마커들에 의한 표현형 특징화는, 상기 세포들의 개별적인 염색 (흐름 세포분석기)에 의해, 또는 상기 군의 현장(in situ)에서의 조직학적 절단부들을 만드는 것에 의해, 통상적인 방법에 따라 통상적으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들에 대한 상기 표면 마커들의 발현은 흐름 세포분석기에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 다능성 성체 세포들, 또는 상기 세포들을 함유 또는 이들로 이루어지는 세포군의, 그들의 면역 표현형 프로파일에 의한 특징화는, 일련의 특정 표면 마커들의 존재 또는 부재 면에서, 상기 세포들 또는 세포군을 정의하는데 사용될 수 있다. 이들 마커들은 특이적 항체들을 사용하여 동정될 수 있는 에피토프들이며, 이는 그 군을 동정 뿐 아니라, 그의 단리 또는 정제 방법을 설계하는 것을 가능하게 하는 귀중한 도구를 구성한다. 상기 표면 마커들에 대한 단일클론성 항체들은 본 발명의 다능성 성체 세포들을 동정하는데 사용될 수 있다.
항체들에 의한 표면 마커들의 프로파일의 결정은 (면역표현형 특징화), 표지된 항체를 사용하는 직접적 방식이거나, 또는 세포 마커의 일차적인 특이적 항체에 대한 제 2 의 표지된 항체를 사용하여 신호 확장을 달성하는 간접적 방식일 수 있다.
한편, 상기 항체의 결합의 존재 또는 부재는, 이에 제한되지는 않지만 면역형광 현미경 및 방사선 사진술을 포함하는 상이한 방법들에 의해 결정될 수 있다. 유사하게, 흐름 세포측정법에 의해 상기 항체의 결합 수준의 모니터링을 실시하는 것이 가능하며, 상기 흐름 세포측정법은 형광색소의 수준이, 표지된 항체들에 특이적으로 결합된 세포 표면에 존재하는 항원들의 양에 상관되도록 하는 기술이다.
동정 및 단리 분석에서, 상기 세포군은, 그 분석이 각각 직접 또는 간접 검출 방법에 의해 수행되는지의 여부에 따라, 표지되거나 또는 표지되지 않은 특이적 시약과 접촉된다. "특이적 시약"이라는 용어는 특이적 결합쌍의 구성원을 의미하며; 특이적 결합쌍의 구성원들은, 이에 제한되지는 않지만, 항원 및 항체의 결합쌍, MHC 항원 및 T-세포 수용체들을 함유하는 쌍, 상보적 뉴클레오티드 서열들, 또한 펩타이드 리간드들과 그들의 수용체의 쌍들을 포함한다. 상기 특이적 결합쌍들은, 그 결합쌍의 특이적 구성원의 유사체들, 단편들 및 유도체들을 포함한다.
항체들의 친화성을 가진 시약으로서의 이용이 특히 관심의 대상이 된다. 특이적 단일클론성 항체들의 생산은 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 세포 군들의 동정 또는 분리 실험들에서, 상기 항체들은 표지된다. 이러한 목적을 위해 사용되는 마커들은 이에 제한되지는 않지만 자성 입자들, 비오틴 및 형광색소들을 포함하며, 이는 그 항체가 결합되는 세포 유형의 동정 또는 단리를 가능하게 할 것이다. 따라서, 예로서 흐름 세포분석기에 의한 본 발명의 다능성 성체 세포들을 함유하는 세포군의 분석은, 다른 파장들에서 방출하는 형광색소들로 표지된 상이한 항체들이 동일한 샘플에서 사용되는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이들 표면 마커들에 대한 군의 특이적 프로파일을 아는 것 뿐만 아니라, 사용된 마커들의 세트의 분리를 실시하는 것이 가능하다.
관심 대상의 표현형을 제공하는 군들의 분리는, 자성 분리 (특이적 항체들로 코팅된 자석 입자들을 사용), 친화성 크로마토그래피, 단일클론성 항체들에 결합되거나 또는 단일클론성 항체들과 함께 사용되는 세포독성제들 및 고형 담체에 부착된 항체를 이용한 패닝(panning)을 포함하는 친화성 분리 기술들에 의해 실시될 수 있으며, 또한 적절한 다른 방법들에 의해 실시될 수 있다. 보다 정확한 분리는 세포 흐름 분석기에 의해 수득될 수 있을 것이며, 상기 기술은 세포 크기 및 세포 복합성과 같은 기타 파라미터들과 함께, 염색의 강도에 따라 세포군들의 분리를 가능하게 한다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 증식 및 상이한 세포 계통들로 분화될 수 있는 능력을 제공한다. 본 발명의 다능성 성체 세포들이 분화될 수 있는 세포 계통들의 예시적이며 비제한적인 예들은, 예로서 뼈 표현형 세포들, 근육 표현형 세포들 및 신경성 표현형 세포들을 포함한다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 기존 방법들에 의해 증식 및 다른 계통들의 세포들로 분화될 수 있다. 그들의 분화되지 않은 상대물들(counterparts)로부터 분화된 세포들을 동정하고 이어서 단리하는 방법들은 본 기술분야에 공지된 방법들에 의해 실시될 수도 있다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 생체 외에서 증대될 수도 있다. 즉, 단리 후, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 유지될 수 있으며, 배양 배지에서 생체 외 증식되는 것이 가능하다. 이러한 배지는 예로서, 둘베코 개량 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium:DMEM), 항생물질 및 글루타민을 함유하고, 일반적으로 2-20% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된다. 사용된 세포들에 대한 필요에 따라 매질 및/또는 매질 보충물들의 농도를 변경 또는 조정하는 것은 본 기술분야의 한 기술에 속한다. 혈청들은 종종 세포성 인자들 및 생존력 및 증대에 필요한 성분들을 함유한다. 혈청들의 예들은 FBS, 소 혈청(BS), 송아지 혈청(CS), 태아 소 혈청(FCS), 신생 송아지 혈청(NCS), 염소 혈청(GS), 말 혈청(HS), 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 래트 혈청 (RS), 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 다능성 성체 세포들이 인간 기원의 것인 경우, 바람직하게는 자가조직 기원의 인간 혈청으로 세포 배양 배지를 보충하는 것도 고려된다. 보체 반응(complement cascade)의 성분들을 불활성화하는데 필요한 것으로 여겨지는 경우, 혈청들을 55-65℃에서 열-불활성화할 수 있는 것으로 이해된다. 혈청 농도들의 조정, 배양 배지로부터 혈청의 회수도, 하나 이상의 바람직한 세포 유형들의 생존을 촉진하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 FBS 농도 약 2% 내지 약 25%에서 유리할 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 명확한 조성의 배양 배지에서 증대될 수 있으며, 여기에서 상기 혈청은 혈청 알부민, 혈청 트랜스페린(transferrin), 셀레늄 및 이에 제한되지는 않지만 인슐린, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF) 및 기본 섬유모세포 성장인자 (bFGF)를 포함하는 재조합 단백질들의 조합에 의해 치환된다.
많은 세포 배양 배지가 이미 아미노산들을 함유하고 있으나; 일부는 세포들을 배양하기 전에 보충을 필요로 한다. 그러한 아미노산들은, 이에 제한되지는 않지만, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신 등을 포함한다.
항균제들은 세균성, 마이코플라즈마성 (mycoplasmal) 및 진균성 오염을 완화하기 위해, 세포 배양에 전형적으로 사용된다. 전형적으로, 사용되는 항생제 또는 항진균성 화합물들은 페니실린/스트렙토마이신의 혼합물들이며, 이에 제한되지는 않지만 암포테리신(amphotericin) (Fungizone®), 암피실린, 젠타마이신(gentamicin), 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromacin), 카나마이신(kanamycin), 마이토마이신(mitomycin) 등을 포함한다.
호르몬류도 세포 배양에 유리하게 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만, D-알도스테론, 디에틸스틸베스트롤 (DES), 덱사메타손, b-에스트라디올, 하이드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로게스테론, 소마토스타틴/인간 성장 호르몬(HGH) 등을 포함한다.
본 발명의 다능성 성체 세포들의 유지 조건들은, 세포들이 미분화된 형태로 잔류하는 것을 허용하는 세포성 인자들을 함유할 수도 있다. 분화 전에, 세포 분화를 저해하는 보충물들이 배양 배지로부터 제거되어야만 함은 본 기술분야의 당업자에게 명백하다. 모든 세포들이 이들 인자들을 필요로 하지는 않을 것이라는 것 또한 명백하다. 사실, 이들 인자들은, 세포 유형에 따라, 원하지 않은 효과들을 끌어낼 수 있다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은, 관심 대상의 폴리펩티드를 적어도 하나 발현하도록 형질감염되거나 또는 유전공학적으로 처리될 수 있다. 한 구현예에서, 관심 대상의 폴리펩티드는 조직의 복구 또는 재생에 관련된 유전자들의 발현을 유도 또는 증가시킬 수 있는 산물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포들의 수득 방법에 관한 것이다:
a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;
b) 효소적 소화에 의해 세포 현탁액을 수득하는 단계;
c) 상기 세포들을 침전시키고, 그 세포들을 적절한 배지에 재현탁하는 단계; 및
d) 상기 세포들을 고체 표면에서 배양하고, 상기 고체 표면에 부착되지 않는 세포들을 제거하는 단계.
상기 방법에 따라 수득된 세포들은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 특징들을 함유한다.
여기 사용된 것과 같은, "고체 표면"이라는 표현은 본 발명의 다능성 성체 세포들이 부착되는 것을 허용하는 임의의 물질을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 물질은 포유류 세포들이 그의 표면에 부착되는 것을 촉진하도록 처리된 플라스틱 물질이다.
단계 a)-d)는 본 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 기술들에 의해 실시될 수 있다. 간략히는, 본 발명의 다능성 성체 세포들은, 인간을 포함하는 임의의 적절한 동물로부터의, 비골연골성 중간엽 조직의 임의의 적합한 공급원으로부터, 예로서 인간 지방 조직으로부터, 통상적인 수단에 의해 수득될 수 있다. 상기 동물은, 그 동물 내에서 비골연골성 중간엽 조직이 생존해 있는 한, 살아있거나 또는 죽은 것일 수 있다. 전형적으로, 인간 지방 세포들은, 외과적 또는 흡입 지방제거술과 같은 잘 인지된 프로토콜들(protocols)을 사용하여, 살아있는 공여자들로부터 얻어진다. 실제로, 지방흡입 절차는 매우 흔하기 때문에, 지방흡입 유출물은 그로부터 본 발명의 세포들이 유도될 수 있는 특히 바람직한 공급원이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 다능성 성체 세포들은 지방흡입에 의해 수득된 인간 진피하 지방 조직으로부터 얻은 것이다.
비골연골성 중간엽 조직의 샘플은, 바람직하게는 가공되기 전에 세척된다. 프로토콜에서, 비골연골성 중간엽 조직 샘플은 생리학적으로 적합한 식염수 (예로서, 인산염 완충된 식염수 (PBS))로 세척된 후, 격렬히 진탕되고, 가라앉도록 두어, 루스 물질 (loose matter) (예로서, 손상된 조직, 혈액, 적혈구 등)을 조직으로부터 제거한다. 이에 따라, 상기 세척 및 침전 단계들은 일반적으로 상등액이 비교적 찌꺼기가 없을 때까지 반복된다. 잔류하는 세포들은 일반적으로 다양한 크기의 덩어리들로 존재할 것이며, 상기 프로토콜은 세포들 자체에의 손상을 최소화하는 한편 전체 구조를 분해하도록 맞추어진 단계들을 사용하여 진행된다. 이러한 목적을 달성하는 한 방법은 상기 세척된 세포들의 덩어리들을, 세포들 간의 결합을 약하게 하거나 또는 파괴하는 효소(예로서, 콜라겐 분해효소, 디스파제(dispase), 트립신 등)로 처리하는 것이다. 이러한 효소 처리의 양 및 기간은, 사용된 조건에 따라 변화할 것이지만, 이러한 효소들의 사용은 당 기술분야에 일반적으로 알려져 있다. 선택적으로, 또는 이러한 효소 처리와 함께, 상기 세포들의 덩어리들은, 기계적 진탕, 초음파 에너지, 열에너지 등과 같은 다른 처리들을 사용하여 분해될 수 있다. 효소적 방법들에 의해 분해를 달성한 경우, 상기 세포에의 해로운 영향을 최소화하기 위하여, 적절한 기간 후에 그 효소를 중화하는 것이 바람직하다.
상기 분해 단계는 응집된 세포들의 슬러리 또는 현탁액 및 일반적으로 자유로운 간질성(stromal) 세포들 (예로서, 적혈구들, 평활근 세포들, 내피 세포들, 섬유아세포들 및 줄기 세포들)을 함유하는 유체 분획을 전형적으로 생성한다. 분리 과정에서 다음 단계는 응집된 세포들을 본 발명의 세포들로부터 분리하는 것이다. 이는 원심분리에 의해 달성될 수 있으며, 이는 상기 세포들을 강제적으로 상등액에 의해 덮힌 펠렛으로 만든다. 상기 상등액은 그 후 버릴 수 있고, 펠렛은 생리학적으로 적합한 유체 중에 현탁된다. 또한, 상기 현탁된 세포들은 전형적으로 적혈구들을 포함하며, 대부분의 프로토콜들에서, 이들을 용해하는 것이 바람직하다. 적혈구들을 선택적으로 분해하는 방법들은 본 기술 분야에 알려져 있으며, 임의의 적합한 프로토콜을 사용할 수 있다 (예로서, 고장성(hypertonic) 또는 저장성(hypotonic) 매질 중에 인큐베이션, 염화암모늄을 사용한 용해 등). 물론, 적혈구가 용해되는 경우, 잔류하는 세포들은 그 후, 예로서 여과, 침강 또는 밀도 분획화에 의해 그 용해물로부터 분리되어야 한다.
적혈구들의 용해 여부에 상관없이, 현탁된 세포들은, 보다 높은 순도를 달성하기 위하여 1 회 이상 연속하여 세척되고, 재원심분리 및 재현탁될 수 있다. 선택적으로, 상기 세포들은 세포 표면 마커들 프로파일을 기초로 하여 또는 세포 크기 및 입도를 기초로 하여 분리될 수 있다.
최종 단리 및 재현탁 후, 상기 세포들을 배양할 수 있으며, 바람직한 경우, 수율을 평가하기 위해 수 및 생존력에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포들은 분화 없이, 적합한 세포 배양 배지를 사용하여, 적절한 세포 밀도 및 배양 조건으로, 고체 표면에서 배양될 것이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 세포들은, 페트리 접시 또는 세포 배양 플라스크와 같이 일반적으로 플라스틱 물질로 제조된 고체 표면 상에서, 적합한 세포 배양 배지 [예로서, 전형적으로 적합한 혈청, 예로서 태아 소 혈청 또는 인간 혈청의 5-15% (예로서, 10%)로 보충된 DMEM] 존재 하에 분화 없이 배양되고, 세포들이 상기 고체 표면에 부착되어 증식하는 것을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션 된다. 인큐베이션 후, 부착되지 않은 세포들 및세포 단편들을 제거하기 위하여 세포들을 세척한다. 상기 세포들을 동일한 배지 중에 동일한 조건 하에서, 세포 배양 배지를 필요한 경우 교체하면서, 세포들이 적당한 컨플루언스(confluence), 전형적으로 약 80%의 세포 컨플루언스에 도달할 때까지 배양을 유지시켰다. 바람직한 세포 컨플루언스에 도달한 후, 트립신과 같은 탈착제를 사용하고, 적절한 세포 밀도 (일반적으로 2,000-10,000 세포들/cm2)로 보다 큰 세포 배양 표면 상에 접종하는 연속적인 이행들(passages)에 의해 세포들을 증대시킬 수 있다. 세포들은 그들의 발생 표현형을 잃지 않고 수 회 이행될 수 있다. 전형적으로, 상기 세포들은 약 100 세포들/cm2 내지 약 100,000 세포들/cm2 사이 (예로서 약 500 세포들/cm2 내지 약 50,000 세포들/cm2, 또는 보다 구체적으로, 약 1,000 세포들/cm2 내지 약 20,000 세포들/cm2 사이)와 같이 바람직한 밀도로 플레이팅 된다(plated). 보다 낮은 밀도 (예로서, 약 300 세포들/cm2)로 플레이팅되는 경우, 상기 세포들은 보다 쉽게 클론적으로(clonally) 단리될 수 있다. 예로서, 며칠 후, 그러한 밀도로 플레이팅된 세포들은 균질한 군으로 증식할 것이다. 특정 구현예에서, 상기 세포 밀도는 2,000-10,000 세포들/cm2 이다.
고체 표면에 부착된 채로 남아있는 세포들을 선택하고, 아래에서 언급되는 것과 같이, 본 발명의 다능성 성체 세포들의 정체를 확인하기 위하여 통상적인 방법에 의해 그의 표현형을 분석한다. 고체 표면에 최종적으로 부착된 채로 남아있는 세포들은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 균질한 세포군을 구성한다. 실시예 1 은 인간 진피하 지방 조직으로부터의 본 발명의 다능성 성체 세포들의 단리를 상세하게 설명한다.
일반적으로, 고체 표면에 부착된 채로 남아있는 세포들은, 본 발명에 따라 사용될 수 있는지는 확인되어야 하지만, 바람직한 표현형을 나타낸다. 따라서, 고체 표면에의 세포들의 부착은 본 발명의 다능성 성체 세포들을 선발하는 기준을 구성한다. 관심 대상의 표현형의 확인은 통상적인 방법을 사용함에 의해 실시될 수 있다.
세포 표면 마커들은, 일반적으로 양성/음성 선발에 기초하여, 임의의 적합한 통상적인 기술에 의해 동정될 수 있다: 예로서, 세포들에서의 부재/존재가 확인되어야 하는, 세포 표면 마커들에 대한 단일클론성 항체들을 사용할 수 있다; 하지만, 다른 기술들도 사용될 수 있다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 선발된 세포들에서 상기 마커들의 부재를 확인하기 위하여, CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 에 대한 단일클론성 항체들이 사용되고; 선발된 세포들에서 상기 마커들의 부재를 확인하기 위하여 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 에 대한 단일클론성 항체들이 사용된다. 상기 단일클론성 항체들은 알려져 있으며, 본 기술분야의 당업자에 의해 통상적인 방법을 통해 수득될 수 있다.
선발된 세포들의 상이한 세포 계통들로 분화하는 능력은 이전에 개시된 것과 같은 통상적인 방법들에 의해 분석될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 본 발명의 다능성 성체 세포들 및 세포군들은, 바람직한 경우, 세포군들을 클로닝하는 적절한 방법을 사용하여, 클론적으로 증대될 수 있다. 예로서, 세포들의 증식된 군을 물리적으로 집어내어 별개의 플레이트 (또는 다수-웰 플레이트의 웰) 내로 접종할 수 있다. 선택적으로, 단일 세포를 각 웰 내에 배치하는 것을 용이하게 하기 위하여, 상기 세포들을 통계학적 비율(예로서, 약 0.1 내지 약 1 세포/웰 또는 약 0.25 내지 약 0.5 세포/웰, 예로서 0.5 세포/웰)로 다수-웰 플레이트 상에서 부클로닝시킬 수 있다(subcloned). 물론, 상기 세포들은 그들을 (예로서 페트리 접시 또는 다른 적합한 기질에) 저밀도로 플레이팅하고, 클로닝 고리들과 같은 장치들을 사용하여 다른 세포들로부터 그들을 단리함에 의해 클로닝될 수 있다. 클론 군의 제조는 임의의 적합한 배양 배지 중에서 증대될 수 있다. 임의의 경우, 상기 단리된 세포들은, 그들의 발생 표현형이 평가될 수 있는 적절한 시점으로 배양할 수 있다.
본 발명자들에 의해 추가로 실시된 분석들은, 본 발명의 세포들의 분화를 유도하지 않은 생체 외 증대가, 특수하게 스크리닝된 많은 적합한 혈청 (예로서, 태아 소 혈청 또는 인간 혈청)을 사용함에 의해 연장된 기간 동안 달성될 수 있음을 보여주였다. 생존률 및 수율의 측정 방법은 본 기술분야에 알려져 있다 (예로서, 트립판 블루 배제).
본 발명의 세포군의 세포들을 단리하기 위한 임의의 단계들 및 절차들은 바람직한 경우, 수동적으로(manually) 수행될 수 있다. 선택적으로, 그러한 세포들을 단리하기 위한 방법은 적절한 장치를 통해 용이화될 수 있으며, 이들 중 다수는 본 기술 분야에 알려져 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다능성 성체 세포들의 군을 동정하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 군은 본 발명의 다능성 성체 세포들을 함유하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 방법은:
(a) 상기 군에 대한 하나 이상의 특징적인 마커들에 대해, 표지된 특이적 결합 화합물들과 함께 상기 세포들을 인큐베이션하고;
(b) 이들 특이적 결합 화합물들에의 상기 세포들의 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
이 방법은 본 발명의 세포들의 면역표현형 특징화와 관련하여 이전에 언급된 것과 같이 실시할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 특이적 결합 화합물은 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군을 단리하는 방법에 관한 것이다:
(a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;
(b) 효소적 소화에 의해 상기 조직으로부터 세포 현탁액을 수득하는 단계;
(c) 상기 세포 현탁액을 상기 군에 대해 특징적인 하나 이상의 표면 마커들에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및
(d) 마커들의 발현의 프로파일을 갖는 세포들을 선발하는 단계.
상기 표면 마커들의 존재 또는 부재는 상기 세포들을 특징화하며, 이에 따라 상기 세포군에 대해 특징적이다. 본 발명의 다능성 성체 세포들의 특징적인 마커들의 발현 프로파일을 갖는 세포들이 최종적으로 선발된다.
바람직한 구현예에서, 상기 단리 방법은 음성 선발을 수행하고, 이에 의해 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133으로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물들에 결합하는 세포들이 제외되고, 이어서 양성 선발을 수행하는 것으로 이루어지며, 상기 양성 선발에 의해 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물들에 결합하는 세포들이 선택된다. 바람직하게는, 특이적 결합의 상기 표지된 화합물은 항체이다.
이 방법은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 수득 방법과 관련하여 이전에 언급된 것과 같이 실시될 수 있다.
본 발명의 다능성 성체 세포들, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군은 세포 조성물 중에 존재할 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군을 함유하는 실질적으로 균질한 세포 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다능성 성체 세포들은 조직들을 복구 및 재생하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 용도를 위한, 예로서 약제로서의 이용을 위한 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 조직의 복구 및 재생에의 이용을 위한, 본 발명의 다능성 성체 세포, 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 약학 조성물은 조직들의 복구 및 재생에 유용하다.
본 발명의 다능성 성체 세포들의 둘 이상의 유형의 조합들은 본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물들의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은, 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 특정 구현예에서, "약학적으로 허용가능한" 이라는 표현은, 연방 또는 주정부의 규율당국에 의해 인가되거나, 또는 US 약전 또는 유럽 약전 또는 동물, 특히 인간에의 사용에 대해 기타 일반적으로 알려진 약전에 열거된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는, 약제가 그와 함께 투여되는, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 운반체를 말한다. 바람직한 경우, 상기 조성물은 소량의 pH 완충제들도 함유할 수 있다. 적합한 약학 담체들의 예들이 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물들은, 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의, 정제된 형태의 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군과, 대상에게 투여하기 적합한 형태를 제공하기에 적합한 양의 담체를 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 방법에 적합하여야 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 약학 조성물들은 무균이며, 대상에게 투여하기에 적합한 형태이며, 상기 대상은 바람직하게는 동물이며, 보다 바람직하게는 포유류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예로서, 고체, 반고체 및 액체 투여 형태, 예로서 동결건조 제제들, 액체 용액 또는 현탁액, 주사가능한 및 주입가능한(infusible) 용액, 등을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방법 및 치료 적용에 따라 달라진다.
본 발명의 세포들 또는 세포군, 또는 그를 함유하는 약학 조성물의, 그를 필요로 하는 대상에의 투여는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포들 또는 세포군은, 상기 세포들을 시험관 내 또는 생체 내에서, 원하는 조직으로, 동물 조직으로 직접 운반하는 것을 포함하는 방법에 의해 대상에게 투여된다. 상기 세포들은 임의의 적절한 방법에 의해 원하는 조직으로 운반될 수 있으며, 상기 방법은 일반적으로 조직 유형에 따라 변화될 것이다. 예로서, 세포들은 조직 내의 바람직한 부위에 접종되어 군 등을 수립할 수 있다. 세포들은, 카테터(catherters), 투관침(trocars), 캐뉼러(cannulae), 스텐트(stents) (이는 세포들과 함께 접종될 수 있다) 등과 같은 장치들을 사용하여 생체 내 부위에 운반될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 병용 요법(combination therapy)에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 병용 요법은, 조직의 복구 또는 재생을 필요로 하는 환자와 같이, 치료를 필요로 하는 대상에게 적용된다. 한 구현예에서, 상기 병용 요법은 조직의 복구 또는 재생을 위한 기타 유형의 처리들과 함께 사용된다. 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 병용 요법들은 본 발명의 다능성 성체 세포들의 투여 전에, 동시에, 또는 그 후에 사용될 수 있다.
또한, 다른 측면에서, 본 발명은 조직 복구 및 재생용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명의 다능성 성체 세포 또는 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 나아가, 또 다른 측면에서, 상기 약학 조성물을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 치료 방법은 조직 복구 또는 재생을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 또는 약물학적 성분에 대한, 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리(combinatorial library)에 대한, 시험관 내 또는 생체 내 세포 반응의 평가 방법에 관한 것으로,:
(a) 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군을 단리하고, 여기에서 상기 세포들은 거의 균질하며;
(b) 배양을 통해 세포군을 증대시키고; 그리고
(c) 생물학적 또는 약물학적 성분 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리를 상기 세포군에 적용하고, 배양된 세포들에 대한 상기 성분들의 영향을 평가하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 단계 (a)의 본 발명의 다능성 성체 세포들의 군은 개별적인 군 또는 그의 통계학적으로 유의한 군으로부터 단리된다. 다른 구현예에서, 단계 (a)의 본 발명의 다능성 성체 세포들의 세포군의 세포들은 거의, 즉 실질적으로 균질하다. 또 다른 구현예에서, 단계 (c) 전에, 상기 세포들은 특이적 유형의 세포들로 분화된다.
또한, 다른 구현예에서, 본 발명은 특수화된 세포의 적어도 하나의 특징을 발현하는 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포로부터 유도된다. 이들 세포들은 또한 본 발명의 다능성 성체 세포들의 분화 단계보다 더 진보된 분화 단계를 갖는 다능성 성체 세포들이다. 한 구현예에서, 본 발명은 특수화된 세포의 적어도 하나의 특징을 발현하는 세포에 관한 것으로, 여기에서 상기 적어도 하나의 특징은 상피세포, 내피세포, 지방세포, 근세포, 연골세포, 골세포, 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포, 간세포, 심장근육세포 및 췌장세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포의 특징이다. 특수화된 세포의 적어도 하나의 특징을 발현하는 상기 세포들을 함유하는 단리된 세포군은 본 발명의 추가의 측면을 구성하고, 여기에서 상기 세포들은 본 발명의 단리된 다능성 성체 세포들로부터 유도된다.
하기 실시예들은 본 발명을 상술하기 위해 제시되지만, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예
1
연조직으로부터의
다능성
성체 세포들의 단리 및 표면
마커들의
특징화
연조직으로부터의 다능성 성체 세포들의 단리는, 세포 배양의 플라스틱 용기에 부착되는 것을 특징으로 하는, 증식 및 분화능을 갖는 세포들을 선발함에 의해 수행하였다. 그 후, 상기 세포들을 흐름 세포분석기로, 시험관 내 배양 발달의 과정 동안, 및 새로이 단리된 세포들 상에서의 일련의 표면 마커들의 발현을 모니터링 함에 의해 특징화하였다.
3 명의 건강한 인간 공여자들 (공여자 1, 2 및 3)로부터의 지방흡입에 의해 수득된 진피하 지방 조직으로부터, 다능성 성체 세포들의 단리를 실시하였다. 먼저, 상기 진피하 지방 조직으로부터의 샘플을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하였다. 세포외 기질의 파괴 및 세포들의 단리를 달성하기 위하여, 식염수 (5 mg/ml) 중의 유형 II 콜라게나아제를 사용하여 37℃ 에서 30 분 동안 효소적 소화를 수행하였다. 동일 부피의 DMEM 배지를 10% 태아 소 혈청과 함께 첨가함에 의해 상기 콜라게나아제를 불활성시켰다. 이 세포 현탁액을 250 g 에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 퇴적물(deposit)을 수득하였다.
NH4Cl 을 종말 농도 0.16 M 로 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여, 존재하는 적혈구의 용해를 유도하였다. 상기 현탁액을 250-400 g 에서 원심분리하고, 1% 암피실린-스트렙토마이신과 함께 DMEM-10% FBS 에 재현탁시켰다. 최종적으로, 세포들을 cm2 당 2x104-3x104 세포들로 접종하여 플레이팅하였다.
상기 세포들을 5% CO2 분위기 하에서, 37℃ 에서 20-24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 상기 배양물을 PBS 로 세척하여 세포들 및 현탁액 중의 조직 잔여물들을 제거하였다. 플라스틱 용기에의 부착에 의해 선택된 세포들을 DMEM + 10% 태아 소 혈청 (FBS) 중에서 배양하였다.
단리 후, 공여자들 중 하나로부터의 단리된 다능성 성체 세포들을 일련의 표면 마커들의 존재/부재의 기능면에서 특징화하였다. 이를 실시하기 위하여, 다음의 표면 마커들의 발현을 흐름 세포측정기로 모니터링하였다:
- 인테그린: CD11 b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD61, CD104.
- 조혈성 마커들: CD3, CD9, CD10, CD13, CD14, CD16, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133 및 글리코포린.
- 성장 인자 수용체들: CD105, NGFR.
- 세포외 기질 수용체들: CD15, CD31, CD44, CD50, CD54, CD62E, CD62L, CD62P, CD102, CD106, CD166.
- 기타: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, β2-마이크로글로불린.
세포들의 면역표현형 특징화는, 3 명의 건강한 인간 공여자들로부터의 샘플들의, 새로이 단리된 세포들 상에서, 또한 배양 7일 째, 4주 후 및 3 달 후에 수행되었다. 상기 선발이 세포 배양물의 플라스틱 용기에의 부착에 의해 수행된다는 것을 고려하여, 단리 이후 배양물 중에서 24 시간 미만의 시간 후에 부착된 세포 분획물로부터의 세포들은, "새로이 단리된 세포들"로서 간주된다.
특징화되는 세포들을 트립신을 이용하여 적당히(gentle) 소화시켜 수집하고, PBS 로 세척하고, 분석될 세포 표면 마커들 각각에 대해 플루오레세인(fluorescein: FITC) 또는 피코에리트린(phycoerythrin:PE) 표지된 항체들과 함께 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포 마커들을 세척하고 에픽스-XL 세포분석기 (Epics-XL cytometer) (Coulter)를 사용하여 즉시 분석하였다. 대조군으로서, 비특이적 FITC 또는 PE 표지된, 대응하는 아이소타입들(isotypes)의 항체들로 염색된 세포들을 사용하였다.
도 1a-1d, 2a-2d 및 3a-3d 는 배양 동안 연구된 마커들의 전개를 보다 잘 명시화하기 위해, 공여자 별로 그룹화한 히스토그램들을 나타내며, 각 경우에서 분석된 세포들이 배양 기간 중 어떤 시기에 속하는 지를 나타내었다.
상이한 시간들에서의 표면 마커들의 분석은 그들의 존재 또는 부재 뿐 아니 라 배양 과정 동안 그들의 거동도 결정할 수 있도록 하였다. 수득된 결과들은 상이한 건강한 공여자들로부터 단리된 세포군들이 그들의 표현형 특징화에서 균질한 거동을 나타낸다는 것을 보여준다.
표면 마커들의 발현 프로파일의 분석으로부터 (도 1a-1d, 2a-2d 및 3a-3d), 3 개의 기준들을 사용하여 어떤 마커들이 그 세포군을 규정하는 지를 결정하고, 세포군들의 다른 유형들에 대해, 그것이 동정 및 분화되도록 하였다. 이들 기준들은 다음과 같았다:
1. 서로 다른 샘플들에 따라 또는 배양 동안 시간에 걸쳐 변화하는 마커들은 폐기한다.
2. 양성인 것들이 시간 0에서도 (새로이 단리된 세포들) 양성인지를 확인한다.
3. 그들의 생물학적 관련성의 함수로서 마커들을 선발하고, 특이적 세포 유형들에 특징적인 마커들을 폐기한다 (예로서, CD3 는 림프구에 한정적인 마커이다).
이들 기준들을 적용함에 의해, 본 발명에 의해 제공되는 비골연골성 중간엽 조직으로부터 단리된 다능성 성체 세포들은 CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> 및 CD105<+>에 대해 양성이고; CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 의 발현은 하지 못하는 것에 의해 특징지어진다.
실시예
2
인간 비골연골성 중간엽 조직으로부터의 다능성 성체 세포들의 골 표현형 세포들로의 시험관 내 분화
본 분화 분석에서는, 특징화된 본 발명의 인간 다능성 성체 세포들을 사용하였다. 건강한 공여자에 각각 대응하는, 3 개의 분석된 지방흡입물 샘플들로부터 상기 세포들을 단리하였다 (실시예 1). 실시예 1 에서 언급된 것과 같이, 다능성 성체 세포들을 단리하고 특징화하였다. 인간 골수의 중간엽 줄기 세포들 (MSC) 샘플을 양성 대조군으로서 사용하였다.
단리된 세포들을 6-웰 플레이트들 상에 10,000 세포들/cm2 의 밀도로 접종하고 (샘플 당 한 플레이트), 표준 배양 매질 (DMEM, 10% FBS, L-글루타민 2 mM 및 항생물질) 중에서 인큐베이션 하였다. 배양 2 일 후, 웰들 중 하나 (대조군)의 배양 배지를 신선한 배지로 교체하고, 남은 웰들은 골형성 유도 배지로 교체하였으며, 상기 골형성 유도 배지는 하기가 첨가된 표준 배양 배지를 함유한다:
- 덱사메타손 100 M
- 아스코르브산 50 μM
- p-글리세로포스페이트 10 mM.
2-3일 마다 배지를 교환하면서, 세포들을 일반적인 조건에서 3 주 동안 배양하였다. 3 주 후, 인산칼슘의 미네랄화된 퇴적물들의 존재를 볼 수 있으며, 이는 골 단괴들(nodules)의 존재를 나타낸다. 이들 단괴들은 알리자린 레드 (Alizarin red)로 염색함에 의해 검출할 수 있다 (Standford 등, 1995). 구체적으로, 상기 배지를 제거하고, 상기 세포들을 PBS 로 2 회 세척하고 70% 의 차가운 에탄올로 30 분 동안 실온에서 고정하였다. 고정된 웰들을 PBS 로 세척하고, 알리자린 레드 (40 mM, pH 4.1)로 10 분 동안 실온에서 염색하였다. 염색된 세포들을 많은 물로 세척하고, 붉은 색으로 진하게 염색된 것으로 나타나는 인산칼슘의 침전물들을 현미경 하에 관찰하였다.
도 4a-4d 는 알리자린 레드로 염색된 골-유도된 세포들의 현미경 사진을 나타낸다. 양성 대조군으로서 제공되는, 골수로부터의 MSC 에 대응하는 샘플에서 인산칼슘의 형성이 더 빨랐고 (도 4a), 비록 각 샘플들에서 그 강도가 상이하기는 하지만, 상기 지방 조직으로부터의 3 개의 샘플들에서 다량의 골 기질의 형성을 발견할 수 있다. 골형성이 유도된 모든 웰들은 동일한 거동을 나타냈으며, 대조군 웰들 (골형성성 자극을 받지 않음)에서는 골 기질의 형성이 검출되지 않았다. 형성된 골 기질의 양과, 조직으로부터의 단리 후 각 샘플이 배양된 시간 (3 주 내지 9 주) 사이에는 관련이 없는 것으로 나타났다.
실시예 3
인간
비골연골성
중간엽
조직으로부터의
다능성
성체 세포들의 근육 표현형 세포들로의 시험관 내 분화
본 분화 분석에서, 특징화된 본 발명의 인간 다능성 성체 세포들을 사용하였다. 건강한 공여자에 각각 대응하는, 3 개의 분석된 지방흡입물 샘플들로부터 상기 세포들을 단리하였다 (실시예 1). 실시예 1 에서 언급된 것과 같이, 다능성 성체 세포들을 단리하고 특징화하였다. 인간 골수의 MSC 샘플을 양성 대조군으로서 사용하였다.
단리된 세포들을, 표준 배양 매질 (DMEM, 10% FBS, L-글루타민 2 mM 및 항생물질) 내로, 10,000 세포들/cm2 의 밀도로 접종하였다. 배양 2 일 후, 웰들 중 하나 (대조군)의 배양 배지를 신선한 배지로 교체하고, 남은 웰들은 근형성 유도 배지 (Wakitani 등, 1995)로 교체하였으며, 상기 근형성 유도 배지는 하기가 첨가된 표준 배양 배지를 함유한다:
- 아스코르베이트-2-포스페이트 0.1 mM
- 덱사메타손 0.01 μM
- ITS+1 (시그마-알드리치)
- 5-아자시티딘 3 μM.
24 시간 후, 상기 배지를 표준 배양 배지로 교체하고, 배지를 2-3일 마다 교환하면서 세포들을 2-3 주 동안 배양하였다. 이 기간 후, 상기 세포들은 연장된 표현형을 획득하여, 섬유성 구조를 형성하였으며, 일부 세포 융합물들을 볼 수 있었다. 근아세포 표현형을 검출하기 위하여, 수득된 세포들을 4% 의 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고, 근육에 대한 특이적 항원인 미오신의 중쇄에 대한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 결과, 본 발명의 인간 다능성 세포들의 근육 표현형 세포들로의 분화를 확인하였다.
실시예 4
인간
비골연골성
중간엽
조직으로부터의
다능성
성체 세포들의 신경성 표현 형 세포들로의 시험관 내 분화
본 분화 분석에서, 특징화된 본 발명의 인간 다능성 성체 세포들을 사용하였다. 건강한 공여자에 각각 대응하는, 3 개의 분석된 지방흡입물 샘플들로부터 상기 세포들을 단리하였다 (실시예 1). 실시예 1 에서 언급된 것과 같이, 다능성 성체 세포들을 단리하고 특징화하였다. 인간 골수의 MSC 샘플을 양성 대조군으로서 사용하였다.
단리된 세포들을, 10 ng/ml bFGF 로 보충된 표준 배양 매질 (DMEM, 10% FBS, L-글루타민 2 mM 및 항생물질) 내로, 3x103 세포들/cm2 의 낮은 밀도로 접종하고, 24-36 시간 동안 인큐베이션하여 다수의 세포들을 산출하였다. 웰들을 그 후 세척하고, 하기를 함유하는 뉴런 유도 배지를 첨가하였다 (Black and Woodbury, 2001):
- αMEM
- BHA 200 μM
- 페니실린/스트렙토마이신
- L-글루타민 2 mM
- 포르스콜린(Forskolin) 10 μM
- 2% DMSO
- 하이드로코르티손 1 μM
- 인슐린 5 ㎍/ml
- CIK 25 mM
- 밸프로산 (Valproic acid) 2 mM.
유도한 지 몇 시간 후, 형태학적 변화를 관찰할 수 있었다; 상기 세포들은 둥근 형태 및 강한 굴절성을 획득하였으며, 신경 세포들의 축색돌기들 (axons) 및 수지상 돌기들(dendrites)과 유사한 외관의 연장부들을 가졌다. 3 일 후, 수득된 세포들을 4% 의 PFA 로 고정시키고, 뉴런 특이적 항원들인 NF-200 및 TuJ1 에 대한 항체들과 함께 인큐베이션하였다. 그 결과, 본 발명의 인간 다능성 성체 세포들의 근육 표현형 세포들로의 분화를 확인하였다.
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Claims (24)
- (a) 비골연골성(non-osteochondral) 중간엽 조직으로부터 단리되고;(b) CD9<+>, CD10<+>, CD13<+>, CD29<+>, CD44<+>, CD49A<+>, CD51<+>, CD54<+>, CD55<+>, CD58<+>, CD59<+>, CD90<+> 및 CD105<+>을 발현하고; 및(c) CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133 은 발현하지 않는 단리된 다능성 (multipotent) 성체 세포.
- 제 1 항에 있어서, 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 단리된 다능성 성체 세포:(a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;(b) 효소적 소화에 의해 세포 현탁액을 수득하는 단계;(c) 상기 세포들을 침전시키고, 배양 배지에 재현탁하는 단계; 및(d) 상기 세포들을 고체 표면 상에 배양하고, 상기 고체 표면에 부착을 나타내지 않는 세포들을 제거하는 단계.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 비골연골성 중간엽 조직이 결합 조직인, 단리된 다능성 성체 세포.
- 제 3 항에 있어서, 상기 결합 조직이 지방 조직인, 단리된 다능성 성체 세 포.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 유전적으로 개질된 세포인, 단리된 다능성 성체 세포.
- 특수화된 세포의 하나 이상의 특징을 발현하는 세포로, 상기 세포가 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 다능성 성체 세포로부터 유도된 세포.
- 제 6 항에 있어서, 하나 이상의 특징이 상피세포, 내피세포, 지방세포, 근세포, 연골세포, 골세포, 뉴런, 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte), 간세포(hepatocyte), 심장근육세포 및 췌장세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포의 특징인 세포.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 세포들을 함유하는 단리된 세포군.
- 제 8 항에 있어서, 상기 세포군이 거의 균질한 것인 단리된 세포군.
- 다능성 성체 세포들의 군의 동정 방법으로, 상기 군은 제 1 항에 따른 단리된 세포들을 함유하며, 상기 방법이: (a) 상기 군에 대한 하나 이상의 특징적인 마 커들에 대해, 표지된 특이적 결합 화합물들과 함께 상기 세포들을 인큐베이션하고; (b) 이들 특이적 결합 화합물들에 대한 상기 세포들의 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 특이적 결합 화합물이 항체인 동정 방법.
- 하기 단계들을 포함하는, 제 1 항에 따른 다능성 성체 세포들의 군의 단리 방법:(a) 비골연골성 중간엽 조직을 수집하는 단계;(b) 효소적 소화에 의해 상기 조직으로부터 세포 현탁액을 수득하는 단계;(c) 상기 세포 현탁액을 상기 다능성 성체 세포들의 하나 이상의 표면 마커들에 특이적으로 결합하는 표지된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및(d) 마커들의 바람직한 발현 프로파일을 갖는 세포들을 선발하는 단계.
- 제 12 항에 있어서, 음성 선발(negative selection)이 수행되며, 이에 의해 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 및 CD133으로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는, 표지된 화합물들에 결합하는 세포들이 제외되는 단리 방법.
- 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 양성 선발(positive selection)이 수행되 며, 이에 의해 CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 및 CD105 로 이루어지는 군으로부터 선택된 마커에 특이적으로 결합하는, 표지된 화합물들에 결합하는 세포들이 선택되는 단리 방법.
- 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 결합의 표지된 화합물이 항체인 단리 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 다능성 성체 세포 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 세포군을 함유하는 실질적으로 균질한 세포 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 다능성 성체 세포 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 따르거나, 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포군, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물.
- 치료에의 용도를 위한, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 다능성 성체 세포, 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 따르거나, 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포군.
- 조직 복구 및 재생에의 용도를 위한, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 다능성 성체 세포, 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 따르거나, 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포군.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 다능성 성체 세포, 또는 제 8 항 또는 제 9 항에 따르거나, 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포군의, 조직 복구 및 재생용 약학 조성물의 제조를 위한 용도.
- 제 17 항에 따른 약학 조성물을, 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 치료방법이 조직 복구 또는 재생 방법.
- 생물학적 또는 약물학적 성분에 대한, 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리(combinatorial library)에 대한, 시험관 내 세포 반응의 평가 방법으로, 하기 단계들을 포함하는 방법:a) 제 8 항 또는 제 9 항에 따르거나, 또는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포군을 단리하는 단계;b) 배양을 통해 세포군을 증대(expansion)시키는 단계, 및c) 생물학적 또는 약물학적 성분 또는 상기 성분들의 조합 라이브러리를 상기 세포군에 적용하고, 배양된 세포들에 대한 상기 성분들의 영향을 평가하는 단 계.
- 제 23 항에 있어서, (c) 단계 전에 세포들이 특이적 유형의 세포들로 분화되도록 허용되는 평가 방법.
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