WO2020230832A1 - 神経堤細胞または角膜上皮細胞の純化方法 - Google Patents

神経堤細胞または角膜上皮細胞の純化方法 Download PDF

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和雅 高橋
小西　敦
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    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying neural crest cells and the like, and more particularly to a method for purifying neural crest cells using laminin 211 and the like. In another aspect, the present invention relates to a method for purifying corneal epithelial cells using laminin 332 and the like.
  • Neural crest cells which have a wide range of pluripotency and are therefore also referred to as the "fourth germ layer,” are attracting attention as one of the cells that can be suitably used for cell transplantation therapy.
  • Non-Patent Document 1 iPS cell differentiation is induced in the presence of a TGF- ⁇ signal inhibitor, a Wnt signal activator, etc., a cell population containing neural crest cells is prepared, and the cell sorter is used. A method of collecting only neural crest cells from a cell population and expanding the cells is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 describes that ES cell differentiation is induced in the presence of FGF2 and TGF ⁇ signal inhibitors, a cell population containing neural crest cells is prepared, and the cell population is further inhibited by FGF2 and TGF- ⁇ . It is disclosed that relatively high-purity neural crest cells can be prepared by long-term culture in a gelatin-containing medium in the presence of an agent.
  • corneal epithelial cells are also one of the cells that are attracting attention.
  • Corneal epithelial cells are cells that constitute the surface of the cornea and have the function of protecting the cornea from the outside world and the function of taking oxygen into the cornea.
  • Many disorders of corneal epithelial cells lead to poor visual acuity and significantly reduce the patient's quality of life. Therefore, there is a great need to construct a method for efficiently producing transplantable corneal epithelial cells for treating such disorders.
  • corneal epithelial cells As a method for preparing corneal epithelial cells, for example, differentiation of corneal epithelial cells is induced by culturing pluripotent stem cells in a serum-free medium containing no BMP for a certain period of time in the presence of stromal cells or sheep membrane-derived factors. A method has been reported (Patent Document 1).
  • Neural crest cells can be prepared by using the methods disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2.
  • the step of collecting neural crest cells by a cell sorter is indispensable, but in using the cell sorter, for example, the yield, purity, viability, and functional deterioration of the preparative target cells are deteriorated.
  • the yield, purity, viability, and functional deterioration of the preparative target cells are deteriorated.
  • problems and costs for purchasing and maintaining cell sorters there are challenges.
  • the method of Non-Patent Document 2 does not involve the use of a cell sorter, continuous passage is required to obtain high-purity neural crest cells, and its preparation requires a relatively long period of time, resulting in high efficiency. There are challenges.
  • corneal epithelial cells can be prepared by using the method disclosed in Patent Document 1.
  • corneal epithelial cells are obtained from a cell population containing the induced corneal epithelial cells using a cell sorter or the like. It requires a sorting process, and there is a problem in efficiency.
  • the present inventors expanded and cultured a cell population containing neural crest cells using laminin 211 as a scaffold, without sorting neural crest cells using a cell sorter or the like. , Found that neural crest cells can be purified. The present inventors have also found that the neural crest cells can be purified in an extremely short period of time by using this method as compared with the conventional purification method. Furthermore, the present inventors expand and culture a cell population containing more than a certain percentage of corneal epithelial cells using laminin 332 as a scaffold to obtain corneal epithelial cells without sorting the corneal epithelial cells with a cell sorter or the like. The present invention was completed by finding that it can be purified and further researching based on such findings. That is, the present invention is as follows.
  • Step 1) A step of obtaining a cell population containing neural crest cells, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • Step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • Step 2) The method according to [1], wherein the cell population containing the neural crest cells obtained in step 1 is subjected to step 2 without being subjected to the sorting treatment of the neural crest cells.
  • step 3 The method according to [1] or [2], wherein the culture period of step 2 is 1 to 21 days.
  • Step 1) A step of obtaining a cell population containing neural crest cells, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • Step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • Step 1) A step of obtaining a cell population in which the proportion of corneal epithelial cells is 25% or more, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 332 as a scaffold.
  • Step 1) A step of obtaining a cell population in which the proportion of corneal epithelial cells is 25% or more, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 332 as a scaffold.
  • Step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 332 as a scaffold.
  • neural crest cells can be purified from a cell population containing neural crest cells very easily and in a short period of time. Further, according to the present invention, high-purity neural crest cells can be prepared very easily and in a short period of time. Furthermore, according to the present invention, corneal epithelial cells can be purified from a cell population containing corneal epithelial cells very easily. Further, according to the present invention, high-purity corneal epithelial cells can be prepared very easily.
  • the present invention provides a method for purifying neural crest cells (hereinafter, may be referred to as "purification method 1 of the present invention"), which comprises the following steps: Step 1) A step of preparing a cell population containing neural crest cells, and Step 2) A step of expanding and culturing the cell population obtained in Step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • Neural crest cell (also called” NCC ") is deepithelialized from the structure of the neural crest that is temporarily formed between the epidermal ectoderm and the neural crest during early development of vertebrates. It means cells that are induced to various parts of the embryo body after conversion from ectoderm to mesenchyme.
  • the term "neural crest cell” in the present specification includes not only cells collected from a living body but also neural crest cells derived from pluripotent stem cells and cells that have passaged them.
  • the origin of neural crest cells is not particularly limited and may be of any vertebrate, but mammalian-derived neural crest cells are preferable. Such mammals include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, and humans.
  • a tissue derived from the neural crest in the living body for example, bone marrow.
  • Spinal posterior neural crest, heart, corneal crest, iris, pulp, and olfactory mucosa can be prepared by collecting cell populations.
  • a plurality of preparation methods are known, and as an example, a TGF ⁇ inhibitor and a GSK-3 ⁇ inhibitor are contained.
  • a method of culturing pluripotent stem cells in a culture medium is exemplified.
  • iPS cells are self-formed ectodermal autonomous with multi-band regions composed of various cell lineages of the eye.
  • SEAM may contain neural crest cells.
  • Whether or not the cell population thus obtained contains neural crest cells can be determined by confirming the expression of one or more neural crest cell-specific marker genes such as TFAP2a, SOX9, SOX10, TWISTI, and PAX3 by a method known per se. Good.
  • proteins present on the cell surface of neural crest cells such as the CD271 protein (also referred to as "p75 (NTR)" can be used as a neural crest cell-specific marker.
  • the cell population containing neural crest cells used in the purification method 1 of the present invention is preferably derived from pluripotent stem cells, and more preferably iPS cells.
  • the pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency capable of differentiating into many cells existing in a living body and also having proliferative ability, and is an intermediate used in the present invention. Includes any cells that are induced into mesoderm cells.
  • the pluripotent stem cells are not particularly limited, but are, for example, embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation, sperm stem cells (GS cells), and embryonic germ cells. (EG cells), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells) are included.
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells, more preferably human iPS cells, from the viewpoint that they can be obtained without destroying embryos, eggs, etc. in the production process.
  • the method for producing iPS cells is known in the art, and can be produced by introducing a reprogramming factor into any body cell.
  • the reprogramming factors are, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15.
  • Genes or gene products such as -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Is also good.
  • the combinations of reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010/102267
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells. , Passed cells, and established cells are all included.
  • somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, and (3) blood cells (peripheral).
  • Blood cells umbilical cord blood cells, etc.
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells) Etc.
  • differentiated cells such as brain cells, lung cells, renal cells and fat cells are exemplified.
  • the mammal from which the body cells are collected is not particularly limited, but is preferably human.
  • the proportion of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells can change significantly depending on the collected tissue and differentiation-inducing conditions.
  • the proportion of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells is, for example, 1 to 95%, 1 to 90%, 1 to 85%, 1 to 80%, 1 to 1. 75%, 1-70%, 1-65%, 1-60%, 1-55%, 1-50%, 1-45%, 1-40%, 1-35%, 1-30%, 1- It can be, but is not limited to, 25%, 1-20%, 1-15%, or 1-10%.
  • the proportion of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells is, for example, 25-95%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%. It can be, but is not limited to, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 25-55%, 25-50%, 25-45%, 25-40%, or 25-35%.
  • the proportion of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells is, for example, 50-95%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%. It can be, but is not limited to, 50-70%, 50-65%, or 50-60%.
  • the proportion of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells can be, but is not limited to, for example, 75-95%, 75-90%, or 75-85%.
  • purification in the purification method 1 of the present invention means that the cell population containing the neural crest cells prepared in step 1 was subjected to step 2, and as a result, the proportion of neural crest cells in the cell population was prepared in step 1. It means that it will be higher than the ratio at the time when it was done.
  • the proportion of neural crest cells in the cell population after purification by the purification method 1 of the present invention is 90-100%, 91-100%, 92-100%, 93-100%, 94-100%, 95. -100%, 96-100%, 97-100%, 98-100%, 99-100%, or 100%, but not limited to these.
  • the cell population containing neural crest cells prepared in step 1 of the purification method 1 of the present invention is subjected to mechanical dispersion treatment, dispersion treatment with an enzyme such as collagenase or trypsin, and / or chelation such as EDTA, if necessary. It may be in a single cell state by being subjected to dispersion treatment with an agent or the like.
  • a ROCK inhibitor may be added for the purpose of suppressing cell death.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK), and examples thereof include Y-27632, Fasudil / HA1077, H-1152, Wf-536, and derivatives thereof. Be done.
  • ROCK inhibitor for example, US Patent Application Publication No. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508,. , 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and International Publication 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 No., 2004/039796).
  • the cell population prepared in step 1 may be subjected to step 2 after being subjected to the sorting treatment of neural crest cells, but is preferably subjected to step 2 without being subjected to the sorting treatment of neural crest cells. ..
  • As the sorting treatment of neural crest cells for example, sorting with a cell sorter using a fluorescently labeled CD271-specific antibody, sorting with magnetic beads to which a CD271-specific antibody is bound, and solidification of a CD271-specific antibody are performed. Sorting processing such as sorting by the affinity column that has been performed can be mentioned, but is not limited thereto.
  • step 2 of the purification method 1 of the present invention the cell population obtained in step 1 is subjected to expanded culture.
  • expanded culture is a concept including a culture which maintains and / or proliferates a desired cell, and may be preferably a culture which proliferates a desired cell.
  • the purpose of the purification method 1 of the present invention is to purify neural crest cells
  • conditions suitable for maintenance and / or proliferation of neural crest cells can be used as culture conditions.
  • the culture conditions for expanding the neural crest cells are not particularly limited as long as the neural crest cells can be expanded and cultured, and the culture conditions known per se can be used.
  • a method of culturing in a culture medium containing a TGF ⁇ inhibitor, EGF (epidermal growth factor) and FGF2 (fibroblast growth factor 2) is exemplified.
  • the medium used for the expansion culture of neural crest cells can be prepared using the medium used for the culture of animal cells as the basal medium.
  • the basal medium includes, for example, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, StemPro34.
  • RPMI-base medium, StemFit® AK03N medium, and a mixed medium thereof are included. In this step, StemFit® AK03N medium is preferably used.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferase, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen. It may contain one or more serum substitutes such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, serum, buffers, inorganic salts and the like.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the signal transduction of TGF ⁇ from binding to a receptor to SMAD, a substance that inhibits binding to the ALK family of receptors, or SMAD by the ALK family.
  • the substance is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits phosphorylation.
  • the TGF ⁇ inhibitor is, for example, Lefty-1 (for example, NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor used for the expansion culture of neural crest cells can preferably be SB431542.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor such as SB431542 in the culture solution is not particularly limited as long as it inhibits ALK5, but is preferably 1 nM to 50 ⁇ M, for example, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500. nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, It is 50 ⁇ M, but is not limited to these. More preferably, it is 10 ⁇ M.
  • the concentration of EGF in the medium is preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 30 ng / ml, 40. ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / ml, 70 ng / ml, 80 ng / ml, 90 ng / ml, 100 ng / ml, but not limited to these. More preferably, it is 20 ng / ml.
  • the concentration of FGF2 in the medium is preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, for example, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 20 ng / ml, 30 ng / ml, 40. ng / ml, 50 ng / ml, 60 ng / ml, 70 ng / ml, 80 ng / ml, 90 ng / ml, 100 ng / ml, but not limited to these. More preferably, it is 20 ng / ml.
  • components other than the above can be added to the medium as long as the expanded culture of neural crest cells can be achieved.
  • the expansion culture of neural crest cells in step 2 may be either adhesive culture or suspension culture, but is preferably performed by adhesive culture.
  • the purification method 1 of the present invention is characterized in that laminin 211 is used to achieve purification of neural crest cells.
  • Laminin is a glycoprotein that is the main constituent molecule of the basement membrane. Laminin is known to be involved in various cell functions such as cell adhesion, cell proliferation, metastasis, and differentiation. Laminin is composed of a heterotrimer having one ⁇ , ⁇ , and ⁇ subunit chain each. Currently 5 types of ⁇ subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5), 3 types of ⁇ subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3), and 3 types of ⁇ subunit chains ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3) Is known to exist, and the existence of 15 types of laminin isoforms is currently confirmed in humans, depending on the combination of these subunit chains.
  • the laminin 211 used in the purification method of the present invention is a laminin composed of subunit chains of ⁇ 2 chain, ⁇ 1 chain, and ⁇ 1 chain.
  • the origin of laminin is preferably matched to the organism from which the neural crest cells are derived (for example, when human-derived neural crest cells are used, human-derived laminin 211 is preferably used). It is known that the laminin E8 fragment, which is composed only of the integrin binding site, has stronger cell adhesion activity than the full-length laminin (Miyazaki T. et al., Nat Communi.
  • the laminin 211 used in the purification method of the present invention is not a fragment but a laminin 211 full length protein.
  • Laminin 211 may be prepared using a gene recombination technique known per se, or may be commercially available.
  • laminin 211 may be added to the medium so that the suspension cells can use this as a scaffold.
  • the suspension culture can be carried out by a method known per se. As an example, there is a method of expanding and culturing a cell population in a suspension culture in a medium to which laminin 211 is added while stirring the medium using a spinner flask or the like.
  • the cell population can be expanded and cultured in suspension culture by using laminin 211 in combination with a polysaccharide (for example, methyl cellulose, xanthan gum, gellan gum, etc.) that has the effect of suspending cells by adding to the medium.
  • a polysaccharide for example, methyl cellulose, xanthan gum, gellan gum, etc.
  • the concentration at which laminin is added may be appropriately set in consideration of various conditions such as the seeding density of the cell population and the concentration of the polysaccharide used in combination.
  • the suspension culture means a culture method in which cells are performed without cell adhesion to the surface of a culture vessel. Suspension culture may or may not be accompanied by physical agitation. Further, the cells to be cultured may be uniformly dispersed in the medium or may be unevenly dispersed.
  • step 2 when the cell population is expanded and cultured in adhesive culture, laminin 211 is coated on the surface of the culture vessel.
  • the coating amount of laminin 211 is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, and a generally recommended coating amount may be used.
  • the coating amount of laminin 211 0.1 ng / cm 2 ⁇ 1000 ng / cm 2, preferably from 0.5 ng / cm 2 ⁇ 500 ng / cm 2, more preferably 1 ng / cm 2 ⁇ 250 ng / cm 2 , more preferably 2 ng / cm 2 to 100 ng / cm 2 , but not limited to these.
  • the culture period in step 2 may vary depending on the culture conditions, the culture method, the proportion of neural crest cells contained in the cell population, etc., the purification of neural crest cells is achieved in a relatively short period of time.
  • the culture period 1 to 21 days, 1 to 20 days, 1 to 19 days, 1 to 18 days, 1 to 17 days, 1 to 16 days, 1 to 15 days, 1 to 14 days, 1 to 13 Days, 1-12 days, 1-11 days, 1-10 days, 1-9 days, 1-8 days, 1-7 days, 1-6 days, 1-5 days, 1-4 days, or 1- 3 days, but not limited to these.
  • the culture temperature in step 2 is not particularly limited as long as the neural crest cells can be cultured, but is 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration during culturing in step 2 is not particularly limited as long as the neural crest cells can be cultivated, but is 2 to 5%, preferably about 5%.
  • the present invention also provides a method for producing purified neural crest cells (hereinafter, may be referred to as "production method 1 of the present invention"), which comprises the following steps: Step 1) A step of preparing a cell population containing neural crest cells, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in Step 1 using laminin 211 as a scaffold.
  • the present invention provides a method for purifying corneal epithelial cells (hereinafter, may be referred to as "purification method 2 of the present invention"), which comprises the following steps: Step 1) A step of obtaining a cell population having a proportion of corneal epithelial cells of 25% or more, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 332 as a scaffold.
  • a “corneal epithelial cell (also referred to as” CEC ”)” is a cell that constitutes the outermost corneal epithelial layer of the cornea. Corneal epithelial cells are derived from the epidermal ectoderm. The term “corneal epithelial cell” as used herein includes not only cells collected from a living body but also corneal epithelial cells derived from pluripotent stem cells and cells that have passaged them. In the purification method 2 of the present invention, the origin of the corneal epithelial cells is not particularly limited and may be of any vertebrate, but mammalian-derived corneal epithelial cells are preferable.
  • Such mammals include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, and humans.
  • corneal epithelial cell as used herein is a concept that may include corneal epithelial stem cells and / or corneal epithelial progenitor cells.
  • the cell population is collected from the corneal epithelial layer.
  • a known preparation method can be adopted as described above.
  • the method shown in the examples of the present application and the method of culturing pluripotent stem cells in the presence of stromal cells or amniotic membrane-derived factors in a serum-free medium containing no BMP for a certain period of time are exemplified. ..
  • pluripotent stem cells eg, iPS cells
  • SEAM may include corneal epithelial cells.
  • Whether or not the cell population thus obtained contains corneal epithelial cells can be determined by confirming the expression of one or more corneal epithelial cell-specific marker genes such as PAX-6, Cytokeratin 12 or Cytokeratin 3 by a method known per se. Good.
  • the cell population containing the corneal epithelial cells used in the purification method 2 of the present invention is preferably derived from pluripotent stem cells, more preferably iPS cells.
  • the "pluripotent stem cells" in the present invention are as described above.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population including corneal epithelial cells can change significantly depending on the collected tissue and differentiation-inducing conditions.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population including corneal epithelial cells is, for example, 1 to 95%, 1 to 90%, 1 to 85%, 1 to 80%, 1 to 1. 75%, 1-70%, 1-65%, 1-60%, 1-55%, 1-50%, 1-45%, 1-40%, 1-35%, 1-30%, 1- It can be, but is not limited to, 25%, 1-20%, 1-15%, or 1-10%.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population including corneal epithelial cells is, for example, 25-95%, 25-90%, 25-85%, 25-80%, 25-75%. It can be, but is not limited to, 25-70%, 25-65%, 25-60%, 25-55%, 25-50%, 25-45%, 25-40%, or 25-35%.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population including corneal epithelial cells is, for example, 50-95%, 50-90%, 50-85%, 50-80%, 50-75%. It can be, but is not limited to, 50-70%, 50-65%, or 50-60%.
  • the proportion of corneal epithelial cells in a cell population containing corneal epithelial cells can be, but is not limited to, for example, 75-95%, 75-90%, or 75-85%.
  • a cell population with a corneal epithelial cell ratio of less than 25% can have a corneal epithelial cell ratio of 25% or more by performing a sorting treatment of the corneal epithelial cells.
  • the sorting treatment of corneal epithelial cells can be performed by a method known per se. One example is, but is not limited to, a method of confirming a marker specifically expressed on the surface of corneal epithelial cells and selecting a cell expressing the marker.
  • corneal epithelial cells can be purified by expanding and culturing a cell population in which the proportion of corneal epithelial cells is 25% or more using laminin 332 as a scaffold.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population is usually 25% or higher, preferably 30% or higher, 35% or higher, 40% or higher, 45% or higher, 50% or higher, 55% or higher, 60% or higher, 65% or higher, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more, but not limited to these.
  • “Purification” in the purification method 2 of the present invention means that the cell population containing the corneal epithelial cells prepared in step 1 was subjected to step 2, and as a result, the proportion of corneal epithelial cells in the cell population was prepared in step 1. It means that it will be higher than the ratio in.
  • the proportion of corneal epithelial cells in the cell population purified by the purification method 2 of the present invention is 90-100%, 91-100%, 92-100%, 93-100%, 94-100%, 95. -100%, 96-100%, 97-100%, 98-100%, 99-100%, or 100%, but not limited to these.
  • the cell population containing the corneal epithelial cells prepared in step 1 of the purification method 2 of the present invention is subjected to mechanical dispersion treatment, dispersion treatment with an enzyme such as collagenase or trypsin, and / or chelation such as EDTA, if necessary. It may be in a single cell state by being subjected to dispersion treatment with an agent or the like.
  • a ROCK inhibitor may be added for the purpose of suppressing cell death.
  • the ROCK inhibitor is as described above.
  • the cell population prepared in step 1 may be subjected to the sorting treatment of corneal epithelial cells and then to step 2, but is preferably subjected to step 2 without being subjected to the sorting treatment of corneal epithelial cells. ..
  • step 2 of the purification method 2 of the present invention the cell population obtained in step 1 is subjected to expanded culture.
  • expanded culture The meaning of "expanded culture" in the present specification is as described above.
  • the purpose of the purification method 2 of the present invention is to purify the corneal epithelial cells
  • conditions suitable for the maintenance and / or proliferation of the corneal epithelial cells can be used as the culture conditions.
  • the culture conditions for expanding and culturing the corneal epithelial cells are not particularly limited as long as the corneal epithelial cells can be expanded and cultured, and the culture conditions known per se can be used.
  • a method of culturing in a culture medium containing KGF (Keratinocyte growth factor) and a Rho kinase inhibitor is exemplified.
  • the medium used for the expansion culture of corneal epithelial cells can be prepared using the medium used for the culture of animal cells as the basal medium.
  • the basal medium includes, for example, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, StemPro34.
  • RPMI-base medium, StemFit® AK03N medium, and a mixed medium thereof are included. In this step, StemFit® AK03N medium is preferably used.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferase, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen. It may contain one or more serum substitutes such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol (2ME), thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, serum, buffers, inorganic salts and the like.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the concentration of KGF in the culture solution is not particularly limited as long as it allows the proliferation of corneal epithelial cells, but is preferably 0.1 to 200 ng / mL, for example, 0.1 ng / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, 20 ng / mL, 30 ng / mL, 40 ng / mL, 50 ng / mL, 60 ng / mL, 70 ng / mL, 80 ng / mL, 90 ng / mL, 100 ng / mL, 110 ng / mL, 120 ng / mL, 130 ng / mL, 140 ng / mL, 150 ng / mL, 160 ng / mL, 170 ng / mL, 180 ng / mL, 190 ng / mL, 200 ng / mL.
  • components other than the above can be added to the medium as long as the expanded culture of corneal epithelial cells can be achieved.
  • the expansion culture of corneal epithelial cells in step 2 may be either adhesive culture or suspension culture, but is preferably performed by adhesive culture.
  • the purification method 2 of the present invention is characterized in that laminin 332 is used as a scaffolding material in order to achieve purification of corneal epithelial cells.
  • the laminin 332 used in the purification method 2 of the present invention is not a fragment but a laminin 332 full-length protein.
  • Laminin 332 may be prepared by using a gene recombination technique known per se, or may be commercially available.
  • laminin 332 may be added to the medium so that the suspension cells can use this as a scaffold.
  • the method and conditions for suspension culture are as described above.
  • step 2 when the cell population is expanded and cultured in adhesive culture, laminin 332 is coated on the surface of the culture vessel.
  • the coating amount of laminin 332 is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, and a generally recommended coating amount may be used.
  • the culture period in step 2 may vary depending on the culture conditions, the culture method, the proportion of corneal epithelial cells contained in the cell population, and the like, and may be appropriately set.
  • the culture period 1 to 50 days, 1 to 40 days, 1 to 30 days, 1 to 20 days, 1 to 17 days, 1 to 16 days, 1 to 15 days, 1 to 14 days, 1 to 13 Days, 1-12 days, 1-11 days, 1-10 days, 1-9 days, 1-8 days, 1-7 days, 1-6 days, 1-5 days, 1-4 days, or 1- 3 days, but not limited to these.
  • the culture temperature in step 2 is not particularly limited as long as the corneal epithelial cells can be cultured, but is 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration during culturing in step 2 is not particularly limited as long as the corneal epithelial cells can be cultivated, but is 2 to 5%, preferably about 5%.
  • the present invention also provides a method for producing purified corneal epithelial cells (hereinafter, may be referred to as "production method 2 of the present invention"), which comprises the following steps: Step 1) A step of obtaining a cell population in which the proportion of corneal epithelial cells is 25% or more, and a step 2) a step of expanding and culturing the cell population obtained in step 1 using laminin 332 as a scaffold.
  • cell adhesion was evaluated by observing under a microscope at the time of the 5th day of culture.
  • cell proliferation was evaluated by determining colony formation at each time point by observing under a microscope at the time points of 0th day and 5th day of culture, and comparing them. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 Preparation of neural crest cells from iPS cells (Materials and methods) 1. Induction of differentiation from iPS cells to neural crest cells 201B7 (iPS portal) was used as the iPS cell line. IPS cells were seeded at 6500 cells / well on a 6-well plate coated with a laminin 511-E8 fragment (iMatrix511, Nippi) and placed in StemFit® AK03N (Ajinomoto Co., Inc.) medium at 37 ° C. , 5% CO 2 for 5 days.
  • iMatrix511, Nippi a laminin 511-E8 fragment
  • the medium was added to StemFit AK03N (solution A + solution B) with SB431542 (Stemgent, Inc., 10 ⁇ M) and CHIR99021 (Wako, 0.3 ⁇ M (condition 1) or 0.9 ⁇ M (condition 2)).
  • SB431542 Stemgent, Inc., 10 ⁇ M
  • CHIR99021 Woodo, 0.3 ⁇ M (condition 1) or 0.9 ⁇ M (condition 2)).
  • Differentiation into neural crest cells was induced for 14 days at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the proportion of neural crest cells at the end of induction was calculated by determining the proportion of CD271 protein-expressing cells using FACS.
  • the gene expression status of neural crest cell markers was examined by RT-PCR. The primers used in the RT-PCR method are shown below.
  • the cell population (SEAM) containing neural crest cells prepared in 1. above was single-celled using TrypLE Select (Thermo Fisher).
  • the single-celled cell population was seeded on a 6-well plate coated with various scaffolding materials, and cultured under culture conditions suitable for the expansion culture of neural crest cells. More specifically, a medium obtained by adding SB431542 (10 ⁇ M), Epithelium growth factor (Sigma Chemical, 20 ng / mL) and StemFit AK03N C solution (Ajinomoto Co., Inc., 0.08%) to StemFit AK03N (A solution + B solution). Incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 9 to 10 days. After culturing for 9 to 10 days, when the confluency reached about 90%, the proportion of neural crest cells and the expression status of neural crest cell gene markers in the cell population cultured in each scaffold material were described in 1. above. It was determined by the same method as.
  • the following scaffolding materials were used. (1) Laminin 511-E8 fragments (Nippi, 31.3 ng / cm 2 and 312.5 ng / cm 2 ) (2) Laminin 211 (Biolamina, 6.3 ng / cm 2 and 62.5 ng / cm 2 ) (3) Vitronectin (Life Technologies, 31.3 ng / cm 2 and 312.5 ng / cm 2 ) (4) Fibronectin (Sigma Chemical, 1562.5 ng / cm 2 and 3125.0 ng / cm 2 ) Each scaffold material (1) to (3) was coated on the surface of a 6-well plate by directly suspending it in a culture medium. The scaffold material of (4) was dissolved in 1 mL of PBS (-), added to the wells, and allowed to stand at room temperature for 1 hour to coat the surface of the 6-well plate.
  • PBS PBS
  • Example 2 Cell proliferation test Purified neural crest cells obtained by expanding culture (9 days) of the cell population under differentiation induction condition 2 in Example 1 using each scaffold material were collected, and each The cells were re-seeded on a 6-well plate coated with a scaffold material, and cultured for another 5 days under the culture conditions used in the purification step of Example 1. At 5 days after culturing, cells were single-celled using TrypLE Select and the number of cells was counted. The results are shown in Table 4.
  • iPS cells adhered and proliferated at any coat amount in the Laminin 511-E8 fragment.
  • Laminin 332 iPS cells adhered and proliferated at a coating amount of 0.50 ⁇ g / cm 2 or more.
  • Example 3 Preparation of corneal epithelial cells from iPS cells (materials and methods) 1.
  • Induction of corneal epithelial cells from iPS cells 201B7 (iPS portal) was used as the iPS cell line.
  • the seeds were cultivated in StemFit® AK03N medium at 37 ° C. under 5% CO 2 for 5 days.
  • the medium was switched to a medium obtained by adding SB431542 (Stemgent, Inc., 10 ⁇ M) and CHIR99021 (Wako, 0.6 ⁇ M) to StemFit AK03N (solution A + solution B) at 37 ° C. under 5% CO 2 for 15 days.
  • SB431542 Stemgent, Inc., 10 ⁇ M
  • CHIR99021 Wi-Fit AK03N
  • solution A + solution B solution A + solution B
  • Differentiation of corneal epithelial cells was induced.
  • the proportion of cells expressing the corneal epithelial cell markers PAX-6 and Cytokeratin12 protein was evaluated by FACS. Table 6 shows the proportion of corneal epithelial cells obtained at the end of induction.
  • the cell population (SEAM) containing the corneal epithelial cells prepared in 1 was single-celled using TrypLE Select (Thermo Fisher). A single-celled cell population was seeded on a 6-well plate coated with Laminin 332 at a concentration of 0.06 ⁇ g / cm 2 and seeded to 2 ⁇ 10 5 cells / well, suitable for expanded culture of corneal epithelial cells. The cells were cultured under the same culture conditions.
  • the cells did not grow sufficiently under the condition that the ratio of PAX-6 and Cytokeratin12 positive cells (that is, CEC) at the end of induction was less than 25%.
  • the ratio of PAX-6 and Cytokeratin12 positive cells at the end of induction was 25% or more, the ratio of PAX-6 and Cytokeratin12 positive cells improved under all conditions.
  • neural crest cells can be purified from a cell population containing neural crest cells easily and in a very short period of time. Further, according to the present invention, high-purity neural crest cells can be easily produced in a very short period of time. Furthermore, according to the present invention, corneal epithelial cells can be easily purified from a cell population containing corneal epithelial cells. Further, according to the present invention, high-purity corneal epithelial cells can be easily produced. Therefore, the present invention is extremely useful, for example, in the field of regenerative medicine.

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Abstract

本発明は、神経堤細胞または角膜上皮細胞を純化する方法を提供する。

Description

神経堤細胞または角膜上皮細胞の純化方法
　本発明は、神経堤細胞の純化方法等に関し、詳細には、ラミニン211を用いた神経堤細胞の純化方法等に関する。また、別態様において、本発明は、ラミニン332を用いた角膜上皮細胞の純化方法等に関する。
　近年、iPS細胞の確立により細胞移植を伴う疾患の新規治療法の開発が大きく進展しつつある。細胞移植治療に好適に用い得る細胞の一つとして、広範な多分化能を有し、それ故「第4の胚葉」とも称される神経堤細胞が注目されている。
　神経堤細胞を調製するための方法は複数報告されている。例えば、非特許文献1には、TGF-βシグナル阻害剤及びWntシグナル活性化剤等の存在下でiPS細胞の分化を誘導し、神経堤細胞を含む細胞集団を調製し、セルソーターを用いて該細胞集団から神経堤細胞のみを回収し、これを拡大培養するとの方法が開示されている。また、非特許文献2には、FGF2およびTGFβシグナル阻害剤等の存在下でES細胞の分化を誘導し、神経堤細胞を含む細胞集団を調製し、更に該細胞集団をFGF2及びTGF-β阻害剤の存在下で、ゼラチン含有培地において長期間培養することにより、比較的純度の高い神経堤細胞を調製できることが開示されている。
　また、細胞移植治療の分野においては、角膜上皮細胞も注目を集める細胞の一つである。角膜上皮細胞は角膜の表面を構成し、角膜を外界から守るバリアとしての働きや角膜へ酸素を取り入れる働きを有する細胞である。角膜上皮細胞の障害の多くは視力の低下に繋がり、患者のQOLを著しく低下させる。従って、かかる障害を治療するための移植可能な角膜上皮細胞を効率よく製造するための方法の構築には高いニーズが存在する。
　角膜上皮細胞を調製する方法としては、例えば、多能性幹細胞をストローマ細胞又は羊膜由来因子の存在下において、一定期間の間BMPを含まない無血清培地で培養することによる角膜上皮細胞の分化誘導方法が報告されている（特許文献1）。
特許第5759536号公報
Fukuta M. et al., PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112291. Serrano F. et al., Stem Cells Dev. 2019 Jan 15;28(2):81-100.
　非特許文献1および2に開示される方法を用いれば神経堤細胞を調製することはできる。しかし、これらの方法にも依然として課題が存在する。例えば、非特許文献1に開示される方法ではセルソーターによる神経堤細胞の回収工程が必須であるが、セルソーターの使用には、例えば、分取ターゲット細胞の収率、純度、生存率、機能低下の問題や、セルソーターの購入やメンテナンスにかかる費用等の種々の課題がある。また、非特許文献2の方法においては、セルソーターの使用を伴わないものの、純度の高い神経堤細胞を得るために連続継代を必要とし、その調製に比較的長期間を要することから効率性に課題がある。
　また、特許文献1に開示される方法を用いれば角膜上皮細胞を調製することはできる。しかし、上記の神経堤細胞の場合と同様に、当該方法を用いて純度の高い角膜上皮細胞を得るためには、セルソーター等を用いて、誘導した角膜上皮細胞を含む細胞集団から角膜上皮細胞を選別する工程を要し、効率性に課題がある。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、神経堤細胞を含む細胞集団を、ラミニン211を足場として拡大培養することにより、セルソーター等を用いて神経堤細胞をソーティングしなくても、神経堤細胞を純化することができることを見出した。また、本発明者らは、本方法を用いれば、従来の純化方法と比較して極めて短期間に神経堤細胞を純化できることをも見出した。さらに本発明者らは、一定割合を超える角膜上皮細胞を含む細胞集団を、ラミニン332を足場として拡大培養することにより、セルソーター等を用いて角膜上皮細胞をソーティングしなくても、角膜上皮細胞を純化できることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]以下の工程を含む、神経堤細胞を純化する方法：
工程1)神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、および
工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
[2]工程1で得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、[1]記載の方法。
[3]工程2の培養期間が、1～21日間である、[1]または[2]記載の方法。
[4]神経堤細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、[1]～[3]のいずれか記載の方法。
[5]多能性幹細胞がiPS細胞である、[4]記載の方法。
[6]以下の工程を含む、純化された神経堤細胞を生産する方法：
工程1)神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、および
工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
[7]工程1で得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、[6]記載の方法。
[8]工程2の培養期間が、1～21日間である、[6]または[7]記載の方法。
[9]神経堤細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、[6]～[8]のいずれか記載の方法。
[10]多能性幹細胞がiPS細胞である、[9]記載の方法。
[11]以下の工程を含む、角膜上皮細胞を純化する方法：
工程1)角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および
工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
[12]工程1で得られた角膜上皮細胞を含む細胞集団が、角膜上皮細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、[11]記載の方法。
[13]工程2の拡大培養において、足場として用いられるラミニン332のコート量が、0.01μg/cm2以上0.5μg/cm2未満である、[11]または[12]記載の方法。
[14]角膜上皮細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、[11]～[13]のいずれか記載の方法。
[15]多能性幹細胞がiPS細胞である、[14]記載の方法。
[16]以下の工程を含む、純化された角膜上皮細胞を生産する方法：
工程1)角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および
工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
[17]工程1で得られた角膜上皮細胞を含む細胞集団が、角膜上皮細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、[16]記載の方法。
[18]工程2の拡大培養において、足場として用いられるラミニン332のコート量が、0.01μg/cm2以上0.5μg/cm2未満である、[16]または[17]記載の方法。
[19]角膜上皮細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、[16]～[18]のいずれか記載の方法。
[20]多能性幹細胞がiPS細胞である、[19]記載の方法。
　本発明によれば、非常に簡便かつ短期間に、神経堤細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を純化することができる。また、本発明によれば、非常に簡便かつ短期間に、高純度の神経堤細胞を調製することができる。
　さらに、本発明によれば、非常に簡便に、角膜上皮細胞を含む細胞集団から角膜上皮細胞を純化することができる。また、本発明によれば、非常に簡便に、高純度の角膜上皮細胞を調製することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
1.神経堤細胞の純化方法
　本発明は、以下の工程を含む、神経堤細胞を純化する方法（以下、「本発明の純化方法1」と称することがある）を提供する：
工程1）神経堤細胞を含む細胞集団を調製する工程、および工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
　「神経堤細胞（Neural Crest Cell：「NCC」とも称される）」とは、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に一時的に形成される神経堤という構造から脱上皮化し、上皮から間葉への転換後に胚体内の様々な部位に誘導される細胞を意味する。本明細書における用語「神経堤細胞」には、生体より採取された細胞のみならず、多能性幹細胞由来の神経堤細胞や、それらを継代した細胞も含まれる。尚、本発明の純化方法において、神経堤細胞の由来は特に限定されず、いかなる脊椎動物のものであってもよいが、哺乳動物由来の神経堤細胞が好ましい。かかる哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の純化方法1の工程1における神経堤細胞を含む細胞集団を調製する方法としては、生体由来の神経堤細胞を含む細胞集団である場合は、生体における神経堤由来の組織（例えば、骨髄、脊髄後根神経節、心臓、角膜、虹彩、歯髄、および嗅粘膜等）中から細胞集団を採取することにより調製することができる。また、多能性幹細胞由来の神経堤細胞を含む細胞集団の場合は、前述した通り、複数の調製方法が公知となっており、一例としては、TGFβ阻害剤及びGSK-3β阻害剤を含有する培養液中で多能性幹細胞を培養する方法が例示される。iPS細胞をTGFβ阻害剤及びGSK-3β阻害剤を含有する培養液で分化誘導することにより、iPS細胞は、眼の種々の細胞系譜から構成される多帯状領域を有するコロニー(self-formed ectodermal autonomous multi-zone：SEAM)へと分化する。SEAMには神経堤細胞が含まれ得る。
　かくして得られた細胞集団に神経堤細胞が含まれるか否かは、TFAP2a、SOX9、SOX10、TWISTI、PAX3等の神経堤細胞特異的マーカー遺伝子の1以上の発現を自体公知の方法により確認すればよい。また、CD271タンパク質（「p75(NTR)」とも称される）等の神経堤細胞の細胞表面に存在するタンパク質を神経堤細胞特異的マーカーとして用いることもできる。本発明の純化方法1において用いられる神経堤細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞由来であることが好ましく、iPS細胞由来であることがより好ましい。
　尚、本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子又は遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　体細胞を採取する由来となる哺乳動物は特に限定されないが、好ましくはヒトである。
　神経堤細胞を含む細胞集団は、採取した組織や分化誘導条件により、神経堤細胞の割合が大きく変化し得る。本発明の純化方法1の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、1～95%、1～90%、1～85%、1～80%、1～75%、1～70%、1～65%、1～60%、1～55%、1～50%、1～45%、1～40%、1～35%、1～30%、1～25%、1～20%、1～15%、または1～10%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、25～95%、25～90%、25～85%、25～80%、25～75%、25～70%、25～65%、25～60%、25～55%、25～50%、25～45%、25～40%、または25～35%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、50～95%、50～90%、50～85%、50～80%、50～75%、50～70%、50～65%、または50～60%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、神経堤細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合は、例えば、75～95%、75～90%、または75～85%であり得るが、これらに限定されない。
　ここで、本発明の純化方法1における「純化」とは、工程1で調製された神経堤細胞を含む細胞集団を工程2に供した結果、細胞集団における神経堤細胞の割合が工程1で調製された時点での割合よりも高まることを意味する。一態様において、本発明の純化方法1により純化後の細胞集団の神経堤細胞の割合は、90～100％、91～100％、92～100％、93～100％、94～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％、または100％であるが、これらに限定されない。
　本発明の純化方法1の工程1において調製される神経堤細胞を含む細胞集団は、必要に応じて、力学的な分散処理、コラゲナーゼやトリプシン等の酵素による分散処理、および／またはEDTA等のキレート剤による分散処理等に供して、シングルセルの状態としたものであってもよい。尚、細胞集団をシングルセル化する場合、細胞死を抑制する目的でROCK阻害剤を添加してもよい。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632、Fasudil/HA1077、H-1152、Wf-536、およびそれらの誘導体等が挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。
　工程1において調製された細胞集団は、神経堤細胞のソーティング処理に供した後に工程2に供してもよいが、好ましくは、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供される。尚、神経堤細胞のソーティング処理としては、例えば、蛍光標識されたCD271特異的抗体を用いたセルソーターによるソーティング、CD271特異的抗体を結合させた磁気ビーズによるソーティング、およびCD271特異的抗体を固層化したアフィニティカラムによるソーティング等のソーティング処理が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の純化方法1の工程2においては、工程1で得られた細胞集団を拡大培養に供する。尚、本明細書において「拡大培養」とは、所望の細胞を維持及び/又は増殖させる培養を包含する概念であり、好ましくは、所望の細胞を増殖させる培養であり得る。
　本発明の純化方法1では、神経堤細胞の純化が目的であることから、培養条件としては、神経堤細胞の維持及び/又は増殖に適した条件が用いられ得る。
　神経堤細胞を拡大培養するための培養条件は、神経堤細胞が拡大培養できる限り特に限定されず、自体公知の培養条件を用いることができる。一例としては、TGFβ阻害剤、EGF(epidermal growth factor)およびFGF2(fibroblast growth factor 2)を含有する培養液中で培養する方法が例示される。
　神経堤細胞の拡大培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、StemFit(登録商標)AK03N培地、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、StemFit(登録商標)AK03N培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
　本発明において、TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されない。本発明において、TGFβ阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009/146408) およびこれらの誘導体などが例示される。神経堤細胞の拡大培養に使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、SB431542であり得る。
　培養液中におけるSB431542などのTGFβ阻害剤の濃度は、ALK5を阻害する濃度であれば特に限定されないが、1 nM～50 μMが好ましく、例えば、1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、750 nM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10 μMである。
　また、培地中のEGFの濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　また、培地中のFGF2の濃度は、1 ng/ml～100 ng/mlが好ましく、例えば、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/mlであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mlである。
　また、神経堤細胞の拡大培養が達成され得る限り、培地中に上記以外の成分を添加することもできる。
　工程2における神経堤細胞の拡大培養は、接着培養および浮遊培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養によって行われる。
　本発明の純化方法1においては、神経堤細胞の純化を達成するためにラミニン211を用いることを特徴とする。
　ラミニンは基底膜の主要な構成分子である糖タンパク質である。ラミニンは、細胞接着、細胞増殖、転移、分化等の様々な細胞機能に関与することが知られている。ラミニンは、α、β、およびγサブユニット鎖をそれぞれ1本ずつ有するヘテロ3量体で構成される。現在5種類のαサブユニット鎖（α1、α2、α3、α4、α5）、3種類のβサブユニット鎖(β1、β2、β3)、および3種類のγサブユニット鎖(γ1、γ2、γ3)が存在することが知られており、これらのサブユニット鎖の組み合わせに応じて、現在ヒトにおいては15種類のラミニンアイソフォームの存在が確認されている。本発明の純化方法に用いられるラミニン211は、α2鎖、β1鎖、γ1鎖のサブユニット鎖から構成されるラミニンである。ラミニンの由来は神経堤細胞が由来する生物と一致させることが好ましい（例えば、ヒト由来の神経堤細胞を用いる場合は、ヒト由来のラミニン211を用いることが好ましい）。尚、ラミニンはインテグリン結合部位のみから構成されるラミニンE8断片の方が、全長ラミニンよりも細胞接着活性が強いことが知られているが(Miyazaki T. et al., Nat Commun. 2012;3:1236参照)、本発明の純化方法で用いられるラミニン211は、断片ではなくラミニン211全長タンパク質である。ラミニン211は自体公知の遺伝子組み換え技術を用いて調製してもよいし、市販されているものを用いてもよい。
　工程2において、細胞集団を浮遊培養において拡大培養する場合は、ラミニン211を培地中に添加して浮遊している細胞がこれを足場とできるようにすればよい。浮遊培養は、自体公知の方法により実施することができる。一例としては、スピナーフラスコ等を用いて培地を撹拌しながら、ラミニン211を添加した培地中で細胞集団を浮遊培養において拡大培養する方法が挙げられる。或いは、培地に添加することで細胞を浮遊させる効果を有する多糖類（例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、ジェランガム等）とラミニン211を併用することで、細胞集団を浮遊培養において拡大培養することもできる。ラミニンを添加する濃度等は細胞集団の播種密度や併用する多糖類の濃度等の各種条件を考慮の上、適宜設定すればよい。尚、本明細書において、浮遊培養とは、細胞が培養容器の表面に細胞接着することなく行われる培養方法を意味する。浮遊培養は、物理的な撹拌を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。また、培養される細胞が培地中に均一に分散していてもよいし、不均一に分散していてもよい。
　工程2において、細胞集団を接着培養において拡大培養する場合は、ラミニン211を培養容器の表面にコーティングする。ラミニン211のコーティング量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、通常推奨されるコーティング量を用いればよい。一例としては、ラミニン211のコーティング量は、0.1 ng/cm2～1000 ng/cm2、好ましくは0.5 ng/cm2～500 ng/cm2、より好ましくは1 ng/cm2～250 ng/cm2、さらに好ましくは2 ng/cm2～100 ng/cm2であるが、これらに限定されない。
　また、工程2における培養期間は、培養条件、培養方法、細胞集団に含まれる神経堤細胞の割合などにより変動し得るものの、比較的短期間で神経堤細胞の純化が達成される。培養期間の一例としては、1～21日間、1～20日間、1～19日間、1～18日間、1～17日間、1～16日間、1～15日間、1～14日間、1～13日間、1～12日間、1～11日間、1～10日間、1～9日間、1～8日間、1～7日間、1～6日間、1～5日間、1～4日間、または1～3日間であるが、これらに限定されない。
　工程2における培養温度としては、神経堤細胞が培養できる限り特に限定されないが、30～40℃、好ましくは約37℃である。また、工程2における培養時のCO2濃度としては、神経堤細胞が培養できる限り特に限定されないが、2～5％、好ましくは約5％である。
2．神経堤細胞の生産方法
　本発明はまた、以下の工程を含む、純化された神経堤細胞を生産する方法（以下、「本発明の生産方法1」と称することがある）を提供する：
工程1）神経堤細胞を含む細胞集団を調製する工程、および工程2）工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
　本発明の生産方法における各種条件は、本発明の純化方法1と同様である。
3.角膜上皮細胞の純化方法
　本発明は、以下の工程を含む、角膜上皮細胞を純化する方法（以下、「本発明の純化方法2」と称することがある）を提供する：
工程1)角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
　「角膜上皮細胞（corneal epithelial cell：「CEC」とも称される）」とは、角膜の一番外側の、角膜上皮層を構成する細胞である。角膜上皮細胞は表皮外胚葉に由来する。本明細書における用語「角膜上皮細胞」には、生体より採取された細胞のみならず、多能性幹細胞由来の角膜上皮細胞や、それらを継代した細胞も含まれる。尚、本発明の純化方法2において、角膜上皮細胞の由来は特に限定されず、いかなる脊椎動物のものであってもよいが、哺乳動物由来の角膜上皮細胞が好ましい。かかる哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、本明細書における用語「角膜上皮細胞」は、角膜上皮幹細胞及び/又は角膜上皮前駆細胞を含み得る概念である。
　本発明の純化方法2の工程1における角膜上皮細胞を含む細胞集団を調製する方法としては、生体由来の角膜上皮細胞を含む細胞集団である場合は、角膜上皮層から細胞集団を採取することにより調製することができる。また、多能性幹細胞由来の角膜上皮細胞を含む細胞集団の場合は、前述した通り、公知の調製方法を採用し得る。一例としては、例えば、本願実施例において示される方法や、多能性幹細胞をストローマ細胞又は羊膜由来因子の存在下において、一定期間の間BMPを含まない無血清培地で培養する方法が例示される。これらの方法により、多能性幹細胞（例、iPS細胞）はSEAMへと分化する。SEAMには角膜上皮細胞が含まれ得る。
　かくして得られた細胞集団に角膜上皮細胞が含まれるか否かは、PAX-6、Cytokeratin 12またはCytokeratin 3等の角膜上皮細胞特異的マーカー遺伝子の1以上の発現を自体公知の方法により確認すればよい。本発明の純化方法2において用いられる角膜上皮細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞由来であることが好ましく、iPS細胞由来であることがより好ましい。尚、本発明における「多能性幹細胞」は上記した通りである。
　角膜上皮細胞を含む細胞集団は、採取した組織や分化誘導条件により、角膜上皮細胞の割合が大きく変化し得る。本発明の純化方法2の一態様において、角膜上皮細胞を含む細胞集団における角膜上皮細胞の割合は、例えば、1～95%、1～90%、1～85%、1～80%、1～75%、1～70%、1～65%、1～60%、1～55%、1～50%、1～45%、1～40%、1～35%、1～30%、1～25%、1～20%、1～15%、または1～10%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、角膜上皮細胞を含む細胞集団における角膜上皮細胞の割合は、例えば、25～95%、25～90%、25～85%、25～80%、25～75%、25～70%、25～65%、25～60%、25～55%、25～50%、25～45%、25～40%、または25～35%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、角膜上皮細胞を含む細胞集団における角膜上皮細胞の割合は、例えば、50～95%、50～90%、50～85%、50～80%、50～75%、50～70%、50～65%、または50～60%であり得るが、これらに限定されない。また、別の一態様において、角膜上皮細胞を含む細胞集団における角膜上皮細胞の割合は、例えば、75～95%、75～90%、または75～85%であり得るが、これらに限定されない。
　角膜上皮細胞の割合が25%未満である細胞集団は、角膜上皮細胞のソーティング処理を行うことで、その角膜上皮細胞の割合を25％以上にすることができる。角膜上皮細胞のソーティング処理は自体公知の方法により行うことができる。一例としては、角膜上皮細胞の表面に特異的に発現しているマーカーを確認し、該マーカーを発現する細胞を選択する方法が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の純化方法2では、角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を、ラミニン332を足場として拡大培養することにより、角膜上皮細胞を純化することができる。細胞集団における角膜上皮細胞の割合は、通常25％以上、好ましくは、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、又は90％以上であるが、これらに限定されない。
　本発明の純化方法2における「純化」とは、工程1で調製された角膜上皮細胞を含む細胞集団を工程2に供した結果、細胞集団における角膜上皮細胞の割合が工程1で調製された時点での割合よりも高まることを意味する。一態様において、本発明の純化方法2により純化後の細胞集団の角膜上皮細胞の割合は、90～100％、91～100％、92～100％、93～100％、94～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％、または100％であるが、これらに限定されない。
　本発明の純化方法2の工程1において調製される角膜上皮細胞を含む細胞集団は、必要に応じて、力学的な分散処理、コラゲナーゼやトリプシン等の酵素による分散処理、および／またはEDTA等のキレート剤による分散処理等に供して、シングルセルの状態としたものであってもよい。尚、細胞集団をシングルセル化する場合、細胞死を抑制する目的でROCK阻害剤を添加してもよい。ROCK阻害剤は、上記した通りである。
　工程1において調製された細胞集団は、角膜上皮細胞のソーティング処理に供した後に工程2に供してもよいが、好ましくは、角膜上皮細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供される。
　本発明の純化方法2の工程2においては、工程1で得られた細胞集団を拡大培養に供する。尚、本明細書における「拡大培養」の意味は、上記した通りである。
　本発明の純化方法2では、角膜上皮細胞の純化が目的であることから、培養条件としては、角膜上皮細胞の維持及び/又は増殖に適した条件が用いられ得る。
　角膜上皮細胞を拡大培養するための培養条件は、角膜上皮細胞が拡大培養できる限り特に限定されず、自体公知の培養条件を用いることができる。一例としては、KGF(Keratinocyte growth factor)及びRhoキナーゼ阻害薬を含有する培養液中で培養する方法が例示される。
　角膜上皮細胞の拡大培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、RPMI-base medium、StemFit(登録商標)AK03N培地、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程において、好ましくは、StemFit(登録商標)AK03N培地が用いられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
　培養液中におけるKGFの濃度は、角膜上皮細胞の増殖を可能する濃度であれば特に限定されないが、0.1～200 ng/mLが好ましく、例えば、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL、70 ng/mL、80 ng/mL、90 ng/mL、100 ng/mL、110 ng/mL、120 ng/mL、130 ng/mL、140 ng/mL、150 ng/mL、160 ng/mL、170 ng/mL、180 ng/mL、190 ng/mL、200 ng/mLであるがこれらに限定されない。より好ましくは、20 ng/mLである。
　また、角膜上皮細胞の拡大培養が達成され得る限り、培地中に上記以外の成分を添加することもできる。
　工程2における角膜上皮細胞の拡大培養は、接着培養および浮遊培養のいずれであってもよいが、好ましくは接着培養によって行われる。
　本発明の純化方法2においては、角膜上皮細胞の純化を達成するために、ラミニン332を足場材として用いることを特徴とする。
　本発明の純化方法2で用いられるラミニン332は、断片ではなくラミニン332全長タンパク質である。ラミニン332は自体公知の遺伝子組み換え技術を用いて調製してもよいし、市販されているものを用いてもよい。
　工程2において、細胞集団を浮遊培養において拡大培養する場合は、ラミニン332を培地中に添加して浮遊している細胞がこれを足場とできるようにすればよい。浮遊培養の方法及び条件は上記した通りである。
　工程2において、細胞集団を接着培養において拡大培養する場合は、ラミニン332を培養容器の表面にコーティングする。ラミニン332のコーティング量は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、通常推奨されるコーティング量を用いればよい。一例としては、ラミニン332のコーティング量は、0.01μg/cm2以上0.5μg/cm2未満、好ましくは0.05μg/cm2以上0.4μg/cm2未満、より好ましくは0.05μg/cm2以上0.3μg/cm2未満、さらに好ましくは0.05μg/cm2以上0.25μg/cm2未満であるが、これらに限定されない。
　また、工程2における培養期間は、培養条件、培養方法、細胞集団に含まれる角膜上皮細胞の割合などにより変動し得るため、適宜設定すればよい。培養期間の一例としては、1～50日間、1～40日間、1～30日間、1～20日間、1～17日間、1～16日間、1～15日間、1～14日間、1～13日間、1～12日間、1～11日間、1～10日間、1～9日間、1～8日間、1～7日間、1～6日間、1～5日間、1～4日間、または1～3日間であるが、これらに限定されない。
　工程2における培養温度としては、角膜上皮細胞が培養できる限り特に限定されないが、30～40℃、好ましくは約37℃である。また、工程2における培養時のCO2濃度としては、角膜上皮細胞が培養できる限り特に限定されないが、2～5％、好ましくは約5％である。
4．角膜上皮細胞の生産方法
　本発明はまた、以下の工程を含む、純化された角膜上皮細胞を生産する方法（以下、「本発明の生産方法2」と称することがある）を提供する：
工程1）角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および工程2）工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
　本発明の生産方法2における各種条件は、本発明の純化方法2と同様である。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
[試験例1]iPS細胞培養に対するラミニン211の足場機能の評価
（材料と方法）
　iPS細胞株は201B7(iPS portal)を使用した。該細胞をラミニン511-E8フラグメント(iMatrix511、Nippi:0.26～6.58μg/cm2)、またはラミニン211(Biolamina:0.05～6.58μg/cm2)でコートした24ウェルプレートに、2300細胞/ウェルとなるように播種し、StemFit(登録商標)AK03N(味の素(株))培地中で、37℃、5%CO2下、5日間培養して細胞接着およびコロニー形成を評価した。また、細胞接着は、培養5日目の時点で、顕微鏡下にて観察することにより評価した。また、細胞増殖は、培養0日目および5日目の時点において、顕微鏡下にて観察することにより各時点のコロニー形成を決定し、これを比較することにより評価した。結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表1に示される通り、ラミニン511－E8フラグメントを足場として使用した場合は、コート量に関わらず良好な細胞接着およびコロニー形成を示した。一方で、ラミニン211を足場として使用した場合は、コート量に関わらず、陰性対象(non-coat)と同様に、細胞接着もコロニー形成も見られなかった。
[実施例1]iPS細胞からの神経堤細胞の作製
(材料と方法)
1.iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導
　iPS細胞株は201B7(iPS portal)を用いた。ラミニン511-E8フラグメント(iMatrix511、Nippi)でコートした6ウェルプレートに、iPS細胞を6500細胞/ウェルとなるように播種し、StemFit(登録商標)AK03N(味の素(株))培地中で、37℃、5%CO2下、5日間培養した。次いで、培地をStemFit AK03N(A液+B液)にSB431542(Stemgent, Inc.、10μM)およびCHIR99021(Wako、0.3μM（条件1）または0.9μM(条件2))を添加した培地中にて、37℃、5%CO2下で、14日間神経堤細胞への分化誘導を行った。誘導終了時の神経堤細胞の割合はCD271タンパク質高発現細胞の割合をFACSを用いて決定することにより算出した。加えて、神経堤細胞マーカーの遺伝子発現状況はRT-PCR法にて調べた。尚、RT-PCR法に用いたプライマーを以下に示す。
マーカー遺伝子　　Primer ID　　　　　Taqman Cat.No.
TFAP2a　　　　　　Hs00271528_CE　　　A15629
SOX9　　　　　　　Hs01001343_g1　　　4331182
TWIST1　　　　　　Hs01675818_s1　　　4331182　　　 
(βactinをレファレンス遺伝子として使用（Hs01101944_s1、4331182）)
2.神経堤細胞の選択的増殖
　上記1.で調製した神経堤細胞を含む細胞集団（SEAM）をTrypLE Select（Thermo Fisher）を用いてシングルセル化した。シングルセル化した細胞集団を、各種足場材でコートした6ウェルプレート上に播種し、神経堤細胞の拡大培養に適した培養条件において培養した。より具体的には、StemFit AK03N(A液＋B液)にSB431542(10μM)、Epithelium growth factor(Sigma Chemical、20 ng/mL)およびStemFit AK03N C液(味の素(株)、0.08%)を添加した培地で、37℃、5%CO2下、9～10日間培養した。9～10日間培養後、コンフルエンシーが約90％となった時点で、各足場材で培養した細胞集団の神経堤細胞の割合および神経堤細胞遺伝子マーカーの発現状況を上記1．と同様の方法により決定した。
　足場材は以下を用いた。
(1) ラミニン511-E8フラグメント(Nippi、31.3 ng/cm2および312.5 ng/cm2)
(2) ラミニン211(Biolamina、6.3 ng/cm2および62.5 ng/cm2)
(3) Vitronectin (Life Technologies、31.3 ng/cm2および312.5 ng/cm2)
(4) Fibronectin (Sigma Chemical、1562.5 ng/cm2および3125.0 ng/cm2)
　尚、(1)～（3）の各足場材は、培養培地に直接懸濁することにより6ウェルプレート表面上にコーティングした。(4)の足場材は、1 mLのPBS（-）に溶解し、ウェルに添加して室温下1時間静置することにより6ウェルプレート表面上にコーティングした。
　結果を表2および3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表2に示される通り、iPS細胞から分化させた神経堤細胞を含む細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養すれば、拡大培養に供する細胞集団中の神経堤細胞の割合や培養容器の表面へのラミニン211のコーティング量に関わらず、該細胞集団の神経堤細胞の割合を顕著に高めることができた。
[実施例2]細胞増殖試験
　実施例1における、分化誘導条件2の細胞集団を各足場材を用いて拡大培養（9日間）することにより得られた純化された神経堤細胞を回収し、各足場材にてコーティングした6ウェルプレート上に再播種し、実施例1の純化工程において用いた培養条件下、更に5日間培養した。培養5日後の時点で、TrypLE Selectを用いて細胞をシングルセル化し、細胞数を計測した。結果を表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表4に示される通り、ラミニン211を足場として用いて純化された神経堤細胞の細胞増殖活性は良好であった。上記表2に示される通り、ラミニン211を足場として用いて純化された神経堤細胞は非常に高い純度を有していることを合わせて考慮すると、純度の高い神経堤細胞の生産においては、ラミニン211を用いての拡大培養が極めて好ましいことが示唆される。
[試験例2]iPS細胞培養に対するラミニン332の足場機能の評価
（材料と方法）
　iPS細胞株である201B7(iPS portal)を2500細胞/ウェルとなるようにLaminin511-E8フラグメント（iMatrix511、Nippi:0.05～5.00μg/cm2）あるいはLaminin332(Biolamina:0.05～5.00μg/cm2）コートした12ウェルプレートに播種し、5日間培養して細胞接着及び増殖を評価した。播種翌日から培養5日目の細胞接着及び培養5日目の細胞増殖の結果を表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表5に示される通り、Laminin511-E8フラグメントではどのコート量でもiPS細胞は接着し、増殖した。一方、Laminin332では0.50μg/cm2以上のコート量でiPS細胞は接着し、増殖した。
[実施例3]iPS細胞からの角膜上皮細胞の作製
（材料と方法）
1．iPS細胞からの角膜上皮細胞の誘導
　iPS細胞株は201B7(iPS portal)を用いた。Laminin511-E8フラグメント(iMatrix511、Nippi:0.25、0.50、または5.00μg/cm2）またはLaminin332(Biolamina:0.5または5.00μg/cm2）でコートした12ウェルプレートに、iPS細胞を2500細胞/ウェルとなるように播種し、StemFit(登録商標)AK03N 培地中で、37℃、5%CO2下、5日間培養した。次いで、培地をStemFit AK03N（A液+B液）にSB431542(Stemgent， Inc．、10μM）及びCHIR99021（Wako、0.6μM）を添加した培地に切り替え、37℃、5%CO2下で15日間、角膜上皮細胞の分化誘導を行った。角膜上皮細胞の分化誘導率は、角膜上皮細胞マーカーであるPAX-6及びCytokeratin12タンパク発現細胞の割合をFACSにて評価した。誘導終了時に得られた角膜上皮細胞の割合を表6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
2．角膜上皮細胞の選択的増殖
　上記1．で調製した角膜上皮細胞を含む細胞集団(SEAM)をTrypLE Select(Thermo Fisher)を用いてシングルセル化した。シングルセル化した細胞集団を、0.06μg/cm2の濃度のLaminin332でコートした6ウェルプレート上に播種し、2×105細胞/ウェルとなるように播種し、角膜上皮細胞の拡大培養に適した培養条件において培養した。より具体的には、StemFit AK03N（A液+B液）にKeratinocyte growth factor(Peprotech、20ng/mL)及びY-27632(Wako、10μM）を添加した培地中にて、37℃、5%CO2下で培養した。純化培養1継代時の角膜上皮細胞の割合は、上記1.と同様に、角膜上皮細胞マーカーであるPAX-6及びCytokeratin12タンパク発現細胞の割合をFACSで評価することにより決定した。結果を表7に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　純化培養１継代の時点において、誘導終了時のPAX-6及びCytokeratin12陽性細胞（即ち、CEC）の割合が25%未満の条件では、細胞が十分に生育しなかった。しかしながら、誘導終了時のPAX-6及びCytokeratin12陽性細胞割合が25%以上だった条件においては、全ての条件においてPAX-6及びCytokeratin12陽性細胞割合が向上した。
　本発明によれば、簡便に、且つ、非常に短期間に、神経堤細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を純化することができる。また、本発明によれば、簡便に、且つ、非常に短期間に、高純度の神経堤細胞を生産することができる。さらに、本発明によれば、簡便に角膜上皮細胞を含む細胞集団から角膜上皮細胞を純化することができる。また、本発明によれば、簡便に高純度の角膜上皮細胞を生産することができる。従って、本発明は例えば再生医療分野において極めて有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－０９１９８８（出願日：２０１９年５月１５日）、および、特願２０１９－１８６２８０（出願日：２０１９年１０月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (20)

  1. 　以下の工程を含む、神経堤細胞を純化する方法：
    工程1)神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、および
    工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
  2. 　工程1で得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
  3. 　工程2の培養期間が、1～21日間である、請求項1または2記載の方法。
  4. 　神経堤細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項4記載の方法。
  6. 　以下の工程を含む、純化された神経堤細胞を生産する方法：
    工程1)神経堤細胞を含む細胞集団を得る工程、および
    工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン211を足場として用いて拡大培養する工程。
  7. 　工程1で得られた神経堤細胞を含む細胞集団が、神経堤細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、請求項6記載の方法。
  8. 　工程2の培養期間が、1～21日間である、請求項6または7記載の方法。
  9. 　神経堤細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項6～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項9記載の方法。
  11. 　以下の工程を含む、角膜上皮細胞を純化する方法：
    工程1)角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および
    工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
  12. 　工程1で得られた角膜上皮細胞を含む細胞集団が、角膜上皮細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、請求項11記載の方法。
  13. 　工程2の拡大培養において、足場として用いられるラミニン332のコート量が、0.01μg/cm2以上0.5μg/cm2未満である、請求項11または12記載の方法。
  14. 　角膜上皮細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項11～13のいずれか一項記載の方法。
  15. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項14記載の方法。
  16. 　以下の工程を含む、純化された角膜上皮細胞を生産する方法：
    工程1)角膜上皮細胞の割合が25%以上である細胞集団を得る工程、および
    工程2)工程1で得られた細胞集団を、ラミニン332を足場として用いて拡大培養する工程。
  17. 　工程1で得られた角膜上皮細胞を含む細胞集団が、角膜上皮細胞のソーティング処理に供されることなく工程2に供されることを特徴とする、請求項16記載の方法。
  18. 　工程2の拡大培養において、足場として用いられるラミニン332のコート量が、0.01μg/cm2以上0.5μg/cm2未満である、請求項16または17記載の方法。
  19. 　角膜上皮細胞を含む細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項16～18のいずれか一項記載の方法。
  20. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項19記載の方法。
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