KR101998633B1 - 엘립티신의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 용도 - Google Patents

엘립티신의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엘립티신의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 엘립티신이 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도능이 우수하고, 엘립티신에 의해 분화 유도된 연골세포는 골관절염 등의 치료적 효과가 우수함을 입증함으로써 연골질환의 세포치료제로 사용할 수 있음을 제공하는 효과가 있다.

Description

엘립티신의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 용도{Use of ellipticine for inducing differentiation of stem cells into chondrocytes}
본 발명은 엘립티신의 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 용도에 관한 것이다.
전 세계적으로 인구의 고령화로 인해 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환인 연골질환의 치료를 위한 다양한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 연골 조직은 노화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 세포의 기능에도 변화가 유발된다. 또한, 특이하게 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직으로 알려져 있다.
연골질환의 치료를 위해서는 진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등과 같은 약물이나 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등과 같은 연골을 보호할 수 있는 보조적인 물질을 이용하는 것이 일반적이다. 그러나 위와 같은 약물의 경우 통증이나 염증 반응을 비특이적으로 완화할 뿐 연골 세포의 재생이나 증식을 유도하지는 못한다. 또한, 히알루론산과 같은 연골 보호제 또한 연골의 조직의 유지를 위해 도움을 줄 뿐 마찬가지로 연골 세포의 재생이나 증식에는 효과가 없다.
따라서, 최근에는 퇴행성 관절염 등과 같은 손상된 연골조직의 재생을 위해 세포공학(cell therapy) 및 조직공학(tissue engineering) 기술을 이용하여 손상된 연골조직을 대체하고자 하는 방법이 시도되고 있으나 세포 및 조직공학에는 대량의 연골세포가 필요하지만 연골세포를 생체 외에서 증식시키는 과정에서 연골세포의 특성을 소실하는 탈분화(de-differentiation) 현상이 일어나기 때문에 연골세포의 대량획득에 어려움이 있다.
성체줄기세포는 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등의 다양한 세포로의 분화가 가능해 세포치료제의 세포원으로 주목을 받고 있다. 최근 성체줄기세포 이식법에 의한 연골 재생이 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나, 아직까지 많은 한계점이 존재한다. 구체적으로 시술에 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 줄기세포의 표현형이 감소되며 탈분화 현상이 일어날 수 있다는 단점이 있다. 또한, 성체줄기세포가 연골세포로 분화되는 데 있어서, 이식된 연골조직 부위의 비대화 현상(Hypertrophy)에 의해 생체 내에서 석회화(calcification)된 조직이 형성되는 등의 문제점이 발생할 가능성도 존재한다. 따라서 성체줄기세포를 이용하여 효과적으로 연골질환을 치료하기 위해, 연골재생을 위한 충분한 세포수의 확보 및 연골 조직 재생 시 발생할 수 있는 비대화 현상을 극복할 수 있는 방안이 요구된다.
한편, 엘립티신(Ellipticine)은 피뿔나무의 알카로이드 추출물로서, DNA와의 삽입성 결합을 통해 토포이소머레이즈 II를 억제하는 것으로 알려져 있으나, 줄기세포의 분화 유도에 대해서는 알려진 바 없다.
Auclair, C, Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1): 1-14 (1987)
본 발명의 목적은 줄기세포의 연골세포로의 분화능이 우수한 엘립티신의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 엘립티신이 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도능이 우수하고, 엘립티신에 의해 분화 유도된 연골세포는 골관절염 등의 치료적 효과가 우수함을 입증함으로써 연골질환의 세포치료제로 사용할 수 있음을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 엘립티신 처리된 줄기세포에서 성숙한 연골세포 특이적 마커의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 엘립티신 처리된 줄기세포에서 연골의 분해 및 사멸을 촉진하는 비대화 연골세포(hypertrophic chondrocyte) 특이적 마커(colX, RUNX2)의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 엘립티신 처리된 줄기세포에서 연골의 분해 및 사멸을 촉진하는 비대화 연골세포 특이적 마커(ADAMTS4, ADAMTS5, mmp13)의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 인 비트로 조건에서 alcian blue 염색에 의한 연골세포로의 분화를 확인한 결과이다.
도 5는 동물모델에서 엘립티신이 처리된 줄기세포 이식 시 골관절염(osteoarthritis)에 대한 치료 효과를 확인한 결과로, 적색은 연골(cartilage), 뮤신(mucin), 비만세포 과립(mast cell granules)을 보여준다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 엘립티신은 줄기세포로부터 연골세포를 분화 유도하며, 엘립티신 처리된 줄기세포에서 성숙한 연골세포 특이적 마커인 SOX9, aggrecan의 발현이 대조군(DMSO 처리 군)에 비해 증가하였고, 비대화 연골세포(hypertrophic chondrocyte) 특이적 마커인 colX, RUNX2의 발현은 증가하지 않았으며, 매트릭스 분해 효소인 ADAMTS4, ADAMTS5, mmp13의 발현은 오히려 감소함을 확인하였다. 따라서, 엘립티신은 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도제로 사용할 수 있다.
상기 엘립티신은 하기 화학식 1(C17H14N2)로 표시될 수 있고, 몰 질량이 246,313 g/mol이다:
[화학식 1]
Figure 112017107911977-pat00001
본 발명의 연골세포로의 분화 유도에 사용되는 줄기세포는 포유동물에서 유래한 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로는, 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
공지의 줄기세포 공급원으로부터 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
줄기세포의 연골세포로의 분화 유도는 엘립티신을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 수행될 수 있다.
상기 배지는 줄기세포의 배양 시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이러한 배지로, MEM-alpha(Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 시 상기 배지에는 연골세포 분화 유도 성분으로, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 덱사메타손, L-아스코르베이트-2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트 등을 첨가할 수 있다.
배양 기간은 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도에 일반적으로 유도하는 시간으로, 상기 엘립티신을 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 엘립티신의 농도, 줄기세포의 공급원에 따라 달라질 수 있어 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법은, 당업계에 알려진 3차원 배양 방법을 적용할 수 있다. 3차원 배양이란 세포 성장에 의해 세포단층(mono-layer)이 형성되도록 배양하는 통상적인 단층배양이 아닌 세포들이 뭉쳐서 성장하여 3차원적인 입체형태(예를 들면, 구체 또는 타원체)를 형성하도록 배양하는 것을 말하며, 바람직하게는 펠렛(pellet) 배양을 적용할 수 있다. 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이며, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "연골세포"는 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포 또는 연골세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 발명에 있어서, 엘립티신의 처리에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포는 연골세포 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 연골세포는 연골세포 특이적 마커의 발현이 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 연골세포 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, SOX9 또는 aggrecan 등일 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 수득한 연골세포는 비대화 연골세포 특이 마커의 발현이 줄기세포와 비교하여 증가하지 않거나(유지되거나) 감소하는 특징이 있다. 상기 비대화 연골세포 특이적 마커는 colX, RUNX2, ADAMTS4, ADAMTS5 또는 mmp13 등일 수 있다.
상기 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 연골조직 재생용 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 "연골조직 재생"이란 손상된 연골조직을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골조직을 재생(regeneration)하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 줄기세포만을 처리한 대조군에 비해 엘립티신을 처리한 줄기세포(또는 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포)를 동물 모델에 투여한 경우, 골관절염에 대한 우수한 치료 효과를 확인하였다. 따라서, 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포는 연골질환 치료를 위한 세포치료제로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법에 의해 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 연골질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 연골질환 치료용 의약 조성물에 사용하는 연골세포는 "엘립티신이 처리된 줄기세포" 또는 "엘립티신에 의해 분화 유도된 연골세포"를 의미한다.
상기 "연골질환"은 연골 분화 및 재생을 필요로 하는 연골에 관련된 질환을 의미한다. 이러한 연골질환에는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 연골손상 및 연골결손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 연골질환은 연골세포의 비정상적 소멸 또는 연골 조직의 손상에 의해 야기되는 연골질환일 수 있고, 예를 들어 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염, 무형성 골질환이 대표적이지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 개체는 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 생쥐, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유동물일 수 있다.
상기 연골세포는 인간 또는 비인간 포유동물의 연골 손상부에 적용하여, 연골의 재생(분화)을 촉진시키기 위해서, 또는 관절 내에 주입 투여하여 연골손상의 치료를 위해서 이용될 수 있다.
본 발명의 연골질환 치료용 의약 조성물에 사용되는 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포는 치료 대상이 인간인 경우, 환자 자신의 생물학적 샘플에서 유래된 줄기세포나 타인의 샘플에서 유래된 줄기세포로부터 분화 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 연골질환 치료용 의약 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입될 수 있다. 또한, 상기 연골세포의 투여량은 1×104 내지 1×108 세포/㎏일 수 있다. 그러나 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 변경될 수 있다. 또한, 주입 시 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 투여하는 조성물의 양 및 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 연골질환 치료용 의약 조성물은 연골세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 연골질환 치료용 의약 조성물은 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁하거나 용해시킬 수 있으며, 이때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따라 분화 유도된 연골세포 또는 본 발명의 의약 조성물은 각종 연골질환 치료를 위한 세포치료제로 이용될 수 있다. 세포치료제는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.
본 발명의 세포치료제는 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 생쥐, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유동물의 연골 손상부에 적용하여, 연골의 재생(분화)을 촉진시키기 위해서, 또는 관절 내에 주입 투여하여 연골손상의 치료를 위해서 이용될 수 있다.
상기 세포치료제는 공지의 방법에 따라 환자의 관절 내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드(scaffold)와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 투여하는 세포수를 조절할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 조성물 또는 세포치료제는 연골형성을 위한 지지체 상에 접종되어 연골 손상부에 적용될 수 있다. 상기 지지체로 스폰지, 젤, 섬유 및 마이크로비드(microbead) 등의 여러 가지 형태를 사용할 수 있으며, 구체적으로 세포부착률을 향상시킬 수 있고, 부피에 대한 고율의 표면장력을 유지할 수 있는 다공성 구조를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 엘립티신의 줄기세포 분화 유도 조사
엘립티신은 santacruz biotechnology에서 구입하였다. Low glucose DMEM과 FBS는 Gibco에서 구매하였고, Trizol은 Thermofisher를 통해 구입하였다. 클로로포름과 2-프로판올, 에탄올, NFW, alcian blue, 포름 알데하이드는 sigma-aldrich에서 구입하였고, RTsystem kit와 아가로스는 promega에서 구입하였다.
지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells: ASCs)는 Invitrogen에서 구입하였으며, low glucose DMEM과 FBS를 사용하여 배양하였다. ASC는 7계대 전까지만 사용하였다.
엘립티신을 사용하여 ASC를 연골세포(chondrocyte)로 분화 유도를 확인하기 위하여 세포배양접시에 ASCs를 깔아준 뒤, 3일마다 10% FBS low glucose DMEM에 엘립티신을 1μM의 농도로 처리해주었다.
다음으로, RT-PCR 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위해, 엘립티신이 처리된 세포를 Trizol을 사용하여 용해한 후, 클로로포름을 100 ㎕ 첨가하여 섞어준 뒤 12,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 RNA와 DNA, 단백질을 분리하였다. 분리된 RNA를 새로운 튜브에 옮겨 담은 뒤 2-프로판올을 300㎕ 첨가하여 섞어준 뒤 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 펠렛을 수득하였다. RNA 펠렛을 75%(v/v) 에탄올을 사용하여 세척한 뒤 12,000rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하였다. 에탄올을 제거한 뒤 펠렛을 상온에서 건조한 뒤 30㎕의 NFW에 용해시켰다. 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용하여 OD260/OD280 비율을 계산하여 정량하였다.
상보성 DNA 합성에는 RTsystem 키트를 사용하였다. 정량된 RNA에 RTase, RNase 저해제, oligo dT 프라이머, dNTP 믹스, 10×buffer를 넣어준 뒤, 42℃ 15분 99℃ 5분, 4℃ 5분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA를 PCR 튜브에 넣고 확인할 mRNA 각각의 프라이머(표 1), dNTP 믹스, Taq 폴리머레이즈, 반응 버퍼를 넣고 혼합하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃ 30초, 프라이머의 온도조건에서 30초, 72℃에서 30초간 반응을 30번 반복한 뒤 72℃에서 10분간 유지 후 4℃에 보관하였다. PCR 산물을 확인하기 위해서 1.2%(w/v)의 아가로스 젤에서 전기영동으로 분리하여 확인하였다.
유전자 프라이머 서열(5'→ 3')
Sox9 Forward: GAGGAAGTCGGTGAAGAACG
Reverse: ATCGAAGGTCTCGATGTTGG
Aggrecan Forward: TGAGGAGGGCTGGAACAAGT
Reverse: GGAGGTGGTAATTGCAGGGA
Type X collagen Forward: ATGACCCAAGGACTGGAATCTTTA
Reverse: CTGAGAAAGAGGAGTGGACATAC
RUNX2 Forward: AAGGGTCCACTCTGGCTTTG
Reverse: CTAGGCGCATTTCAGGTGCT
ADAMTS4 Forward: TTTCCCTGGCAAGGACTATG
Reverse: GGAGGAGAACTGGACACCAC
ADAMTS5 Forward: TGACCATGAGGAGCACTACG
Reverse: TGGGAGAGGCCAAGTAAATG
MMP13 Forward: GTGGTGTGGGAAGTATCATCA
Reverse: GCATCTGGAGTAACCGTATTG
GAPDH Forward: CATGGGTGTGAACCATGAGA
Reverse: GGTCATGAGTCCTTCCACGA
다음으로, 엘립티신이 처리된 세포를 PBS로 한 번 씻어준 뒤 1시간 동안 4% 포름알데히드 용액으로 상온에서 고정시켰다. 3%(v/v)의 아세트산에 녹인 1%(w/v) alcian blue 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 염색 후, alcian blue 시료를 2분 동안 수돗물을 이용해 씻어준 뒤 색 변화를 관찰하였다.
다음으로, 관절염 모델 제작을 위해, 250g의 Spraque-Dawley(SD) RAT을 사용하였으며 관절염 모델 제작 시 마취를 위해 20mg/kg 졸레틸(zoletil)과 5mg/kg 럼푼(rompun)을 사용하였다. 관절내로 50㎕의 saline(대조군) 혹은 250U이나 500U의 Collagenase type II를 2차례(0주 & 2주)에 걸쳐 주입하여 관절염 모델을 제작하였다. 줄기세포 혹은 엘립티신에 의해 분화 유도된 연골세포의 주입 후 6주 뒤에 연골조직을 채취하여 파라핀 절편을 제작하였고 연골에서의 회복능을 관찰하기 위해 파라핀 절편에 Safranin O-fast green 염색을 하여 검증하였다. 파라핀 절편은 디파라핀과 함수의 과정을 거쳐 0.1% fast green solution에 5분 염색하였고 1% 아세트산으로 10초 세척 후 0.1% safranin O 염색용액으로 30분 동안 염색하였다.
도 1은 엘립티신 처리된 줄기세포에서 성숙한 연골세포 특이적 마커의 발현을 확인한 결과로, SOX9, aggrecan의 발현이 대조군(DMSO 처리 군)에 비해 증가하였다.
도 2는 엘립티신 처리된 줄기세포에서 연골의 분해 및 사멸을 촉진하는 비대화 연골세포(hypertrophic chondrocyte) 특이적 마커(colX, RUNX2)의 발현을 확인한 결과로, 비대화 연골세포 특이적 마커의 발현은 증가하지 않았다.
도 3은 엘립티신 처리된 줄기세포에서 연골의 분해 및 사멸을 촉진하는 비대화 연골세포 특이적 마커(ADAMTS4, ADAMTS5, mmp13)의 발현을 확인한 결과로, 비대화 연골세포 특이적 마커인 매트릭스 분해 효소인 ADAMTS4, ADAMTS5, mmp13의 발현은 오히려 감소하였다.
도 4는 인 비트로 조건에서 alcian blue 염색에 의한 연골세포로의 분화 확인 결과로, 농도 의존적으로 분화 유도능이 향상됨을 확인하였다.
도 5는 동물모델에서 엘립티신이 처리된 줄기세포 이식 시 골관절염(osteoarthritis)에 대한 치료 효과를 확인한 결과로, 줄기세포 치료군에 비해 엘립티신이 처리된 줄기세포 처리군에서 현저히 우수한 치료 효과를 확인하였다.

Claims (13)

  1. 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    줄기세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    연골세포는 줄기세포에 비해 성숙한 연골세포(mature chondrocyte) 특이적 마커의 발현이 증가되어 있고, 비대화 연골세포(hypertrophic chondrocyte) 특이적 마커의 발현은 유지되거나 감소하는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    연골세포 특이적 마커는 SOX9 및 aggrecan으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    비대화 연골세포 특이적 마커는 colX, RUNX2, ADAMTS4, ADAMTS5 및 mmp13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
  6. 엘립티신(Ellipticine)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    줄기세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    연골세포는 줄기세포에 비해 성숙한 연골세포(mature chondrocyte) 특이적 마커의 발현이 증가되어 있고, 비대화 연골세포(hypertrophic chondrocyte) 특이적 마커의 발현은 유지되거나 감소하는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    연골세포 특이적 마커는 SOX9 및 aggrecan으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    비대화 연골세포 특이적 마커는 colX, RUNX2, ADAMTS4, ADAMTS5 및 mmp13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
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