KR102158783B1 - 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 - Google Patents

세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제를 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 배지에서 분화된 세포를 배양하는 유도만능줄기세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래의 Wnt 활성제에 비해 세포의 리프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며, 불필요한 세포를 증식시키지 않으면서 직접적으로 유도만능줄기세포를 제조함으로써 제작시간을 단축시킬 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 통해 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발에 활용할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법{CELL REPROGRAMMING COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING AN INDUECED PLURIPOTENT STEM CELL USING THE SAME}
본 발명은 세포 리프로그래밍 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제를 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 배지에서 분화된 세포를 배양하는 유도만능줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)란, 분화된 세포들이 역분화 인자들을 이용한 세포 리프로그래밍 과정을 통해 형성된 전분화능(pluripotency)을 갖는 미분화 상태의 줄기세포를 의미한다. 2006년 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 등 리프로그래밍 유도 전사인자들의 복합적인 과발현을 통해 체세포로부터 유도만능줄기세포를 생산할 수 있는 기술이 개발되었다(cell, 126.4 (2006): 663-676). 이 기술을 기반으로 다양한 역분화 기술이 개발되어 왔다. 또한, 이러한 기술을 통해 인간배아줄기세포의 이용 시 야기될 수 있는 생명윤리 논란 및 면역 적합성 문제를 극복할 수 있으며, 다양한 의약 용도로서 의약산업에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
그러나, 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발 단계에 활용하기 위해서는 암발생 위험, 낮은 역분화 효율, 역분화 과정에 소요되는 긴 시간 프레임 등 극복되어야만 할 문제점들이 아직 남아있는 실정이다. 이에 따라, 기존 리프로그래밍 유도 전사인자들의 기능을 대체할 수 있고, 리프로그래밍 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 새로운 리프로그래밍 인자의 발굴과 이를 역분화 과정에서 실질적으로 활용할 수 있는 후속 기술을 개발하는 것이 필수적으로 요구되고 있다.
Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." cell 126.4 (2006): 663-676.
이에, 본 발명자들은 세포 리프로그래밍에 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제를 유효성분으로 하는 세포 리프로그래밍 조성물을 사용함으로써, 높은 역분화 효율을 가지며 역분화 과정 소요시간을 단축시킬 수 있는 기술을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제를 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 배지에서 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 유도만능줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 리프로그래밍 조성물이 함유된 배지에서, 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 iPSC를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 배양된 iPSC를 제공한다.
본 발명은 종래의 Wnt 활성제에 비해 세포의 리프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며, 불필요한 세포를 증식시키지 않으면서 직접적으로 유도만능줄기세포를 제조함으로써 제작시간을 단축시킬 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 통해 실질적으로 세포치료제 및 신약 개발에 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 세포 리프로그래밍 과정 동안, 대조군, CHIR99021(CHIR) 처리군 및 SKL2001(이하, "SKL"이라함) 처리군의 iPSC 콜로니 형성을 시간에 따라 관찰한 것이다.
도 2는 알칼린 포스파타아제 키트를 사용하여 전분화능을 가진 iPSC 세포의 형성 양상을 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 확인한 것이다.
도 3은 항-Nanog 항체를 이용한 면역세포염색을 통해, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 iPSC 형성 효율을 관찰한 것이다.
도 4는 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 전분화능 관련 유전자의 발현을 관찰한 것이다.
도 5 및 도 6은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 MET 관련 유전자들의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 Gsk3β의 활성을 관찰한 것이다.
도 8은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 Snail 단백질의 수준을 관찰한 것이다.
도 9은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 전분화능 관련 유전자들의 발현 변화를 확인한 것이다.
도 10은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 전분화능 관련 유전자의 프로모터 지역의 변화를 확인한 것이다.
도 11은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 전분화능 관련 유전자들에 독립적인 AP 양성 콜로니의 형성을 확인한 것이다.
도 12는 리프로그래밍 7일째의 SKL 처리군의 iPSC 유사 콜로니와 리프로그래밍 12일째의 대조군 또는 CHIR 처리군의 iPSC 유사 콜로니의 형성, 및 상기 각 군의 전분화능 유전자의 발현을 확인한 것이다.
도 13은 항-β-카테닌 항체를 이용한 면역세포염색을 통해, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 β-카테닌 발현 양상을 확인한 것이다.
도 14 및 도 15는 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 β-카테닌의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 16은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 β-카테닌의 안정성을 확인한 것이다.
도 17은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 전분화능 관련 유전자인 Nanog의 발현을 확인한 것이다.
도 18은 ChIP 분석을 통해, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 β-카테닌과 Nanog 프로모터 영역의 직접적인 결합을 확인한 것이다.
도 19는 CHIR 및 SKL의 병용처리군에서 전분화능 관련 유전자의 발현을 관찰한 것이다.
도 20은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 전사체 발현 패턴을 확인한 것이다.
도 21 및 도 22는 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 리프로그래밍과 연관된 유전자 및 DEG 수를 분석한 것이다.
도 23은 포스포 어레이를 수행하여 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 Mapk/Erk 시그널링의 활성화를 검증한 것이다.
도 24는 웨스턴블롯을 이용하여 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 Erk1/2의 인산화 수준을 확인한 것이다.
도 25 및 도 26은 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 양성 Erk 조절 인자의 수준을 확인한 것이다.
도 27 및 도 28은 AP 염색을 통해 iPSC 콜로니의 개수 변화를 확인하여 SKL의 리프로그래밍 효과가 인간 세포인 CRL2097과 파킨슨병 환자 유래 인간세포에 적용될 수 있는지를 확인한 것이다.
도 29는 다른 기작의 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제(EpiA 및 HLY78)에 비해 SKL의 세포리프로그래밍 효율 향상 능력이 월등함을 확인한 것이다.
도 30은 SKL2001 유도체들(화학식 2 및 화학식 3)의 세포 리프로그래밍 효율 향상을 확인한 것이다.
본 발명은 일 측면으로, Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물을 제공한다.
본 발명에서, Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 Gsk3β를 저해하지 않고 Wnt 시그널링을 활성화하는 물질을 의미하며, 하기 화학식 1, 2 및 3 중 어느 하나의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019062253259-pat00001
[화학식 2]
Figure 112019062253259-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019062253259-pat00003
.
본 발명에서, 화학식 1은 SKL2001로 명명되어 사용되고 있고, 화학식 2는 SKL2020로 명명되어 사용되고 있으며, 화학식 3은 SKL10096로 명명되어 사용되고 있다. 상기 화학식을 가지는 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 세포 리프로그래밍 시, Gsk3β의 활성을 저해하지 않으면서 Wnt 시그널링을 촉진할 수 있다. 한편, Snail은 종양 유전자로서 세포 리프로그래밍에 중요한 상피-배엽간 상호작용(MET) 과정을 억제한다. 따라서, 본 발명에 따른 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 Gsk3β의 활성을 저해하지 않기 때문에, Gsk3β의 타겟인 Snail을 지속적으로 분해하여 세포 리프로그래밍 초기에 중요한 상피-배엽간 상호작용(MET) 과정을 촉진시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서, 세포 리프로그래밍 조성물은 성인의 섬유아세포(fibroblast)와 같은 성숙한 세포로부터 유도만능줄기세포(iPSC)를 만드는데 사용되는 조성물을 의미한다. 상기 조성물은 성숙한 세포의 iPSC로의 리프로그래밍을 촉진할 수 있다.
상기 조성물은 세포를 배양할 때 필요한 배지를 구성하는 성분을 포함할 수 있으며, 상기 조성물이 함유된 배지 조건하에서 배양된 세포는 유도만능줄기세포로 리프로그래밍될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 조성물은 3 ㎍/㎖의 독시사이클린, 15% 넉아웃 세럼(Knockout serum), 5% FBS, 1% NEAA, 1% 글루타맥스(Glutamax), 0.1 mM β-메르캅토에탄올 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 넉아웃 DMEM으로 구성된 리프로그래밍 배지를 기본으로 하며, 여기에 상기 화학식 1, 2 또는 3의 구조를 갖는 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 포함된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유도만능줄기세포"란, 분화된 세포에 리프로그래밍 기술을 이용하여 배아줄기세포와 유사한 전분화능을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 세포들을 의미한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있다. 보다 구체적으로는, 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 비슷한 세포모양을 가지고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 전분화능을 가진다. 또한, 테라토마를 형성하고, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때 키메라 생쥐를 형성하며, 유전자의 생식선 전이가 가능하다.
본 발명은 다른 측면으로, Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물이 함유된 배지 조건하에서, 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 iPSC를 제조하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 분화된 세포는 체세포일 수 있고, 구체적으로는 인간 유래일 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간 유래 섬유아세포일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 동물 유래 체세포를 모두 사용할 수 있다.
본 발명은 일 실시예에서, 분화된 세포를 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제(SKL)가 처리된 배지에서 배양한 경우, 불필요한 세포를 증식시키지 않고 세포를 직접적으로 유도만능줄기세포로 리프로그래밍할 수 있었다. 또한, 유도만능줄기세포로의 형성 시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 형성 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 종래의 Gsk3β 의존적 Wnt 활성제인 CHIR에 의해 리프로그램된 세포에 비해, 본 발명에 따른 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제에 의해 리프로그램된 세포는 전분화능을 나타내는 전사인자인 Nanog의 발현이 높았으며, β-카테닌의 단백질 안정성이 더 높게 유지되는 것으로 나타났다.
상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 1 μM 내지 10 μM의 농도로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 리프로그래밍을 진행하기 위해, 리프로그래밍 배지에 5 μM의 SKL을 첨가하였다.
본 발명에 따른 iPSC를 제조하는 방법은 7일 내지 9일의 시간이 소요될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, AP 염색을 통해 SKL 처리군의 리프로그래밍 과정에서 iPSC 콜로니 형성을 관찰한 결과, 7일만에 이러한 콜로니가 형성되는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 통해, 약 9일 내지 10일 소요되는 대조군 및 CHIR 처리군보다 SKL 처리군에서 유도만능줄기세포로의 형성 시간이 단축됨을 알 수 있었다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 본 발명의 iPSC를 제조하는 방법으로 배양된 iPSC를 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 또는 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양 및 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍
독시사이클린-유도성 NGFP1(NG1) 유도만능줄기세포(iPSC)(Hanna et al., 2009; Kim et al., 2011)는 젤라틴으로 코팅된 마우스 전분화능줄기세포(PSC) 배지에서 피더(feeder) 세포 없이 유지하였다. 이때, 상기 PSC 배지의 구성은 하기와 같다: 넉아웃 DMEM(10829-018, Gibco), 10% KSR(knockout serum replacement; 10828-028, Gibco), 5% FBS(fetal bovine serum; 26140-079, Gibco), 0.1 mM MEM NEAA(Non-Essential Amino Acids; 11140-050, Gibco), 2 mM Glutamax(35050-061, Gibco), 0.055 mM β-mercaptoethanol(21985-023, Gibco) 및 1000 U/ml LIF(leukemia inhibitory factor; ESG1107, Millipore).
마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEF)는 NG1 iPSC를 C57BL/6 마우스 배반포(blastocyst)에 주입하고, 이를 대리 쥐(CD1; Harlan)에 이식하여 발생시켰다. 리프로그래밍을 위해, 상기 MEF를 겔트렉스(geltrex)가 코팅된 배양 접시에서 1.5Х104 세포/cm2 내지 2Х104 세포/cm2의 밀도로, MEF 배지에서 배양하였다. 이때, 상기 MEF 배지의 구성은 하기와 같다: DMEM(11965-092, Gibco), 10% FBS, 0.1 mM NEAA 및 0.055 mM β-mercaptoethanol. 이후, MEF 배지에 독시사이클린(DB0889, Bio Basic; 3 μg/mL)을 처리하였고(day 0), 1일 후 리프로그래밍 배지(3 μM CHIR99021 또는 5 μM SKL2001로 보충된 PSC 배지)로 교체하였다. 이후, 정해진 시점에서 리프로그램된 유도만능줄기세포를 수득하였다.
실시예 2. 알칼린 포스파타아제 염색
알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 염색은 LAP(Leukocyte Alkaline Phosphatase) Kit(86R-1KT, Sigma)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 리프로그램된 유도만능줄기세포를 포름알데하이드 용액(HT5014, Sigma)으로 30초 동안 고정시켰고, AP 염색 용액으로 15분간 암실에서 염색하였다.
실시예 3. 정량 RT- PCR ( qRT - PCR )
qRT-PCR을 수행하기 위해, 전체 RNA를 RNeasy Plus mini kit with QiaShredder(74136, Qiagen)를 이용하여 수득하였고, 상기 전체 RNA 중 1 μg을 cDNA 합성에 사용하였다. 상기 cDNA는 iScript cDNA 합성 키트(BR170-8891, BioRad)를 이용하여 제조사의 실험 방법을 준수하여 합성하였다. qRT-PCR은 iQ SYBR Green Supermix (BR170-8884AP, Biorad)를 이용하여 ABI-7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems) 기기에서 수행하였다. 상기 qRT-PCR에서 사용된 각 유전자의 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
Analysis Gene 5'-Sequence-3'
qRT - PCR Oct4 F : ACATCGCCAATCAGCTTGG (서열번호 1)
R : AGAACCATACTCGAACCACAT (서열번호 2)
Sox2 F : ACAGATGCAACCGATGCACC (서열번호 3)
R : TGGAGTTGTACTGCAGGGCG (서열번호 4)
Nanog F : GAAAG CCATGCGCAT TTTAGC (서열번호 5)
R: AATATTTGGAAGAAGGAAGGAACCT (서열번호 6)
Dppa5a F : GTCCATGGCTGAGAGGTACCACCTG (서열번호 7)
R : TAACCTGCATCCAGGTCGGAG (서열번호 8)
Tbx3 F : CTTGGAAGCCAAGCCAGACAG (서열번호 9)
R : AGTGCACTGGCACATTTGACCA (서열번호 10)
Klf2 F : ACATGAAGCGACACATGTAGCCT (서열번호 11)
R : TCCAATAAATAGCAGTCTGTTTGCAA (서열번호 12)
Dppa3 F : AAGAATTAGGAGCTTACATTGTACG (서열번호 13)
R : AAGGTTAACAAGTTAAGATTCCC (서열번호 14)
Rex1 F : CGCTTCTCCCTGGATTTCAACT (서열번호 15)
R : GGTTAGGATGTGAATCTTCTGGTTATT (서열번호 16)
Prdm14 F : CTGGATCAAGAGGCTTTCTATGCC (서열번호17)
R : CAGCGTTCTTGGTTTGTAACTG (서열번호 18)
Nr5a2 F : ATAACCTCCTCATTGAGATGCTGCATG (서열번호 19)
R : AGAGTATTGTGTTTCTGTCATCGTCC (서열번호 20)
E-cadherin F : GACGGTCAAC AACTGCATGA AGGC (서열번호 21)
R : AACAGTAGGAGCAGCAGGATCAGAATC (서열번호 22)
Epcam F : CTTCTCAGAA AACACAAGAC GACGTGGA (서열번호 23)
R : TCCGTTCACTCTCAGGTCCATGC (서열번호 24)
Cldn7 F : GCTCTTACC CCAAGTCCAA TT (서열번호 25)
R : AGCAAACTATACATGATGTTTGGAGG (서열번호 26)
N-cadherin F : TTGTCTGATC CTGCCAACTG GCT (서열번호 27)
R : GGGATTCCATTGTCAGAAGCAAGGAAG (서열번호 28)
Fibronectin F : TTGAGTGCTT CATGCCGCTA GA (서열번호 29)
R : CTTAAGGGTGAAAGGACCACTC (서열번호 30)
Vimentin F : TTGAGACCAG AGATGGACAG GTGATCA (서열번호 31)
R : AGTAAAGGCACTTGAAAGCTGT (서열번호 32)
Esrrb F : TTCTACAGT GTGAAACTGC AGGG (서열번호 33)
R : CTCCACTTGGATCGTGTCCGT (서열번호 34)
Klf4 F : ACATGAAGCGACACATGTAGCCT (서열번호 35)
R : TCCAATAAATAGCAGTCTGTTTGCAA (서열번호 36)
Lin28a F : C CAGTTCTCAG GGAAAGCCTG (서열번호 37)
R : TTAAAGTGGGGATTAGCCAAAGA (서열번호 38)
Axin2 F : TACGAAGGCA GGATCCTGGG (서열번호 39)
R : GAATATTTCGTGGCTGTTGCGT (서열번호 40)
Gas6 F : TGCCAGAAGTATCGGTGATTTCTG (서열번호 41)
R : GTGTGTCCAAACCCTGCTTCAT (서열번호 42)
Nodal F : AG ACCAAGCCAC TGAGCATGC (서열번호 43)
R : TGCTCCCTGGACAGACACAATGGA (서열번호 44)
Ramp3 F : TTCCTGTCGTGCTGACTGTG G (서열번호 45)
R : AGACAGAAGCCGAGTCTGCC (서열번호 46)
F2rl1 F : CGCT CAGCTCCAAC AAGTTCT (서열번호 47)
R : GTTGGTGCATCCCTACCACG (서열번호 48)
Fgf15 F : GGATGGTGGAGGATGTAGACCAC (서열번호 49)
R : ACAGGGTCCATGTGAGACTTAGAAT (서열번호 50)
Epha2 F : AGGATCGGAG TGCGTCTTCC (서열번호 51)
R : AGACCACTGTGGCTCTTCAAGT (서열번호 52)
ChIP Nanog F : TCC CTC CCT CCC AGT (서열번호 53)
R : CCT CCT ACC CTA CCC ACC C (서열번호 54)
Bisulfite sequencing Nanog F : GGTGGATTTT GTAGGTGGGA TTAATTGTGA ATT (서열번호 55)
R : ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATA (서열번호 56)
실시예 4. 크로마틴 면역침강반응
크로마틴 면역침강반응(Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 분석은 SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit with magnetic beads(9003, Cell Signaling)를 이용하여 제조사의 실험 방법을 준수하여 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 리프로그램된 유도만능줄기세포를 1% 포름알데하이드에 10분 동안 실온에서 고정시켰다. 이후, 글라이신을 첨가하여 교차결합(cross-linking)을 중단시켰다. 상기 세포를 차가운 PBS로 세척한 후, 세포의 핵막을 깨기 위해 소니케이션(sonication)을 수행하였다. 이후, 용해물을 각각 β-카테닌 항체 및 일반 래빗 IgG와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. Protein G 마그네틱 비드(magnetic bead)를 첨가하고, 샘플들을 4℃에서 4시간동안 인큐베이션하였다. 상기 Protein G 마그네틱 비드 펠렛을 저염(low-salt) 및 고염(high-salt) 용액에서 세척하였다. 이후, 항체-Protein G 비드로부터 크로마틴을 분리하였고, DNA 용출 버퍼를 이용하여 DNA를 수득하였다. 상기 ChIP 분석의 결과물은 qRT-PCR을 이용하여 Nanog 프로모터 부분을 증폭하는데 사용하였다.
실시예 5. 술폰산( Bisulfite ) 시퀀싱
제조사의 프로토콜에 따라 EpiTect 키트(Qiagen)를 이용하여 Genomic DNA를 분리하였고, 술폰산을 처리하여 사이토신(cytosine) 및 우라실(uracil)의 치환을 유도하였다. 술폰산을 처리한 DNA를 PCR을 통해 증폭하였고(94℃ 30초, 50℃ 40초, 72℃ 30초; 21 cycle 반복), 이어서 추가적으로 PCR을 수행하였다(94℃ 30초, 55℃ 40초 및 72℃ 30초; 31 cycle 반복). 상기 PCR에 사용한 프라이머는 상기 표 1에 나타내었다. 상기 PCR 결과물을 정제하고, pGEM-T easy vector(Promega)에 클로닝하였다.
실시예 6. 면역세포염색 및 면역블로팅을 위한 항체
면역세포염색에 하기와 같은 항체를 사용하였다: 항-Nanog(ab80892, Abcam), 항-β-카테닌(610153, BD science) 및 항-Oct4(sc-8628, Santacruz). 면역블로팅에는 하기와 같은 항체를 사용하였다: 항-β-카테닌(610153, BD science), 항-Rpl7(A300-741A, Bethyl), 항-활성 β-카테닌(05-665, Millipore), 항-포스포-Erk1/2(9101, Cell signaling) 및 항-Erk1/2 (sc292838, Santacruz).
실시예 7. RNA-시퀀싱
cDNA 라이브러리는 TruSeq RNA 라이브러리 키트를 이용하여 수립하였고, Illumina HiSeq2500을 이용하여 시퀀싱하였다. Mus musculus(mm10)의 표준유전체 서열과 주석 데이터는 USCS 테이블 브라우저(http://genome.uscs.edu)를 통해 다운로드 받았다. Tophat v2.0.13(Trapnell et al., 2009)을 이용하여 서열을 얼라인하였고, Cufflinks(Trapnell et al., 2010)를 통해 발현량을 측정하였다. 상대적인 발현량은 Cufflinks의 FPKM(Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped)로 계산하였다. 유전자 수준의 상대적인 발현량은 유전자 내의 FPKM의 합으로 계산하였다. 차등 발현 데이터의 통계적인 유의성은 표본 사이에 차이가 없다는 전제 하에 배수 변화(fold change)로 나타내었다. 차등 발현된 유전자(differentially expressed gene, DEG) 세트의 경우, 완전연관(complete linkage)과 유클리디안 거리(Euclidean distance)를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행하였다. 유의성이 있는 유전자 목록에서 유전자 집합(gene-enrichment)을 수행하였고, 주석 분석은 Gene Ontology(www.geneontology.org/)를 통해 수행하였다. 또한, DEG에 대한 경로 분석은 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)를 통해 수행하였다.
실시예 8. 포스포 -어레이( phospho -array)
Erk의 활성화 및 iPSC 리프로그래밍 시그널링 경로는 Human/Mouse MAPK 인산화 어레이 키트(AAH-MAPK-1-2, RayBiotech)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 블로킹된 MAPK 어레이 막을 리프로그래밍 6일째에 수득한 세포로부터 얻어진 전체 단백질 100 μg와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후, 단백질과 인큐베이션한 MAPK 어레이 막을 세척하고 검출 항체와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 막을 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈(HRP)-결합된-항-래빗 IgG와 인큐베이션하였고, ECL(enhanced chemiluminence) 웨스턴블로팅 검출 시약을 이용하여 확인하였다. 인산화된 단백질 레벨은 Quantity One software(BioRad)를 이용하여 정량화하였고, 내부 양성 대조군을 기준으로 정규화 하였다.
실험예 1. SKL2001에 의한 마우스 섬유아세포의 리프로그래밍 효율 향상 확인
마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 리프로그래밍을 진행하기 위해, 독시사이클린(Doxycyclin, Sigma) 유도에 의해 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 발현시킬 수 있는 시스템을 지놈(genome) 상에 포함하고 있는 마우스로부터 13.5일째의 배아를 수득하였다. 이후, 이로부터 MEF를 분리하였다.
분리된 MEF를 마트리겔이 코팅된 24-웰 플레이트에 웰 당 4x104개의 세포 밀도로 시딩하였다. 1일 후, 3 μg/ml의 독시사이클린이 포함된 섬유아세포 배지로 교체하였다. 1일 후, 3 μg/ml의 독시사이클린이 포함된 리프로그래밍 배지로 교체하였다. 이후, 리프로그래밍 과정 동안 하루에 한번씩 리프로그래밍 배지로 갈아주었다. 상기 리프로그래밍 배지는 실시예 1에 기재된 바와 같다. 상기 CHIR99021(이하, 'CHIR')은 가장 잘 알려진 Gsk3β 의존적 Wnt 활성제이고, SKL2001(이하, 'SKL')은 상기 화학식 1의 구조를 가지는 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제이다. 이후, 상기 실시예 2에 기재된 AP 염색 과정을 통해, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 리프로그래밍 과정에서 iPSC 콜로니 형성을 관찰하였다.
그 결과, 리프로그래밍 과정 동안 대조군 및 CHIR 처리군에서는 약 9일 내지 10일까지 진행했을 때 iPSC 콜로니가 나타나는 반면, SKL 처리를 한 경우에는 7일만에 이러한 콜로니가 형성되는 것을 관찰하였다. 이는, iPSC 콜로니 형성 전에 나타나는 중간단계의 세포군이 형성되지 않고 바로 리프로그래밍이 진행되어 전체적인 과정이 단축됨을 의미한다(도 1). 리프로그래밍 6일째에 알칼린 포스파타아제 키트를 사용하여 전분화능을 가진 iPSC 세포의 형성 양상을 확인한 결과, SKL을 처리한 군에서 대조군 및 CHIR 처리군에 비해 AP 양성 콜로니 수가 증가된 것을 확인하였다(도 2). 또한, SKL로 처리한 군에서 나타난 콜로니는 과립 세포를 형성하지 않고 보다 빠르게 형성되었다(도 1).
또한, 상기 실시예 6에 기재된 항-Nanog 항체를 사용하여 면역세포염색을 함으로써, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군의 iPSC 형성 효율을 관찰하였다. 그 결과, Nanog가 콜로니 전체에 고르게 발현하여 완전히 전분화능을 획득한 상태에서 iPSC 형성 효율이, SKL 처리군에서 대조군 및 CHIR 처리군에 비해 더 높은 것을 확인하였다(도 3). 이때, 상기 Nanog는 줄기세포를 어떤 조직 또는 장기로 분화시킬 것인지 총괄하는 유전자이다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, SKL 처리군에서는 대조군 및 CHIR 처리군에 비해 후기 전분화능 관련 유전자(Nanog, Dppa5a, Tbx3, Klf2, Dppa3, Rex1, 및 Prdm14)의 활성화를 두드러지게 유도하였다. 상기 결과를 통해, Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제가 Gsk3β 의존적 Wnt 활성제보다 더 빠르게 전분화능 상태에 도달하는 것을 도울 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. SKL에 의한 상피- 배엽간 상호작용(MET) 과정 촉진확인
리프로그래밍 6일째에, 상기 실험예 1의 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군에서 각 세포를 회수하였다. 그리고, 상기 실시예 3의 방법으로 RNA를 수득하고 수득한 RNA를 cDNA로 변화시킨 후, 리프로그래밍 단계 동안의 형태학적 변화에 중요한 MET 관련 유전자(E-cadherin, Epcam, Cldn7, N-cadherin, Fibronectin 및 Vimentin)들의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 리프로그래밍 6일째에 대조군과 CHIR 처리군의 세포에서는 작은 크기의 과립 세포가 나타났으나, SKL 처리군의 세포에서는 단단히 포장된 iPSC 유사 콜로니가 형성되었다. 또한, SKL 처리군에서 상피 유전자(Epcam 및 Cldn7)는 유의하게 증가하였으며, 중간엽 줄기세포 유전자(E-cadherin, N-cadherin, Fibronectin 및 Vimentin)는 발현이 감소하였다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, MET 관련 유전자, 특히, MET 과정의 후기 단계 관련 유전자(Epcam 및 Cldn7)의 발현이 리프로그래밍 인자를 유도하지 않은 MEF에서 SKL 처리에 의해 두드러지게 증가하였다. 상기 결과들을 통해, SKL이 MET 관련 유전자들의 발현을 변화시킴을 알 수 있었고, SKL이 리프로그래밍 인자 비의존적인 방식으로 MET 관련 유전자들을 직접 조절함을 알 수 있었다.
또한, 리프로그래밍 6일째 세포를 회수하고 RIPA 버퍼를 이용하여 단백질을 수득하여 웨스턴블롯을 진행하였다. 웨스턴블롯에서 MET 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있는 많은 후보 단백질 중, Snail에 중점을 두었다. Snail은 상피 유전자의 발현을 직접적으로 감소시키는 것으로 알려진 전사 억제 물질이고, Gsk3β 매개 인산화 의존적 방식으로 분해되는 것으로 알려져 있다. 이때, p-Gsk3β-Y216는 활성화된 Gsk3β 형태를 의미하고, p-Gsk3β-S9는 비활성화된 Gsk3β 형태를 의미한다.
도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군 및 CHIR 처리군과 달리, SKL 처리군에서 Gsk3β의 활성이 증가되었으며(도 7), 이로 인해 MET 과정을 방해할 수 있는 Snail 단백질이 지속적으로 분해되어 낮은 발현양을 가짐을 확인하였다(도 8). 또한, SKL 처리군은 p-Gsk3β-S9 발현에 변화가 없었으나, CHIR 처리군에서는 p-Gsk3β-S9의 발현이 증가하였다. 또한, SKL 처리군은 p-Gsk3β-Y216의 발현이 증가하였고, 전체 Snail 단백질의 수준이 감소하였다. 상기 결과는 Gsk3β에 의한 Snail의 지속적인 분해가 iPSC 리프로그래밍에 유리하다는 것을 의미한다.
실험예 3. iPSC 리프로그래밍의 가속화
SKL2001에 의한 리프로그래밍 과정에서 일어나는 분자 현상을 더 잘 이해하기 위하여, 실시예 3의 방법으로 전분화능 관련 유전자들의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다. 한편, 도 10에서 검은색 원은 메틸화 상태를 의미하고, 흰색 원은 탈메틸화 상태를 의미한다다.
도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, Nanog, Dppa5a, Rex1 및 Esrrb와 같은 전분화능 관련 유전자들은 SKL 처리군의 세포에서 상향 조절되었으며(도 9), 프로모터 부위는 효과적으로 탈메틸화되었다(도 10). 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, SKL2001이 전분화능 관련 유전자들의 발현을 향상시켰기 때문에, 전분화능 관련 유전자들에 독립적인 AP 양성 콜로니의 수가 SKL 처리군에서 유의하게 증가하였다. 또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 리프로그래밍 7일째의 SKL 처리군의 iPSC 유사 콜로니는 리프로그래밍 12일째의 대조군 또는 CHIR 처리군의 iPSC 유사 콜로니와 유사하거나 더 많은 전분화능 유전자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Lin28a)의 발현을 나타내었다. 상기 결과를 통해, SKL은 리프로그래밍 과정에서 효과적으로 전분화능 상태로 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. SKL에 의한 β- 카테닌의 안정성 유지 확인
β-카테닌의 넉다운은 리프로그래밍을 억제하는 것으로 나타났으며, β-카테닌의 과발현은 반대 효과를 가진다고 보고되었다(Zhang et al., 2014). 이는 β-카테닌의 안정성이 리프로그래밍과 직접적인 관련이 있음을 의미한다. 이에, SKL이 β-카테닌 안정성을 효과적으로 조절하는지 여부를 확인하였다. 리프로그래밍 6일째 세포를 회수한 후, 상기 실시예 6에 기재된 항-β-카테닌 항체로 면역세포염색을 실시하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, SKL 처리군에서 대조군 및 CHIR 처리군에 비해 높은 β-카테닌의 발현을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 리프로그래밍 6일째, 대조군 및 CHIR 처리군에서 MEF와 유사한 β-카테닌 발현 양상을 보였으며, SKL 처리군의 세포 핵 및 세포 표면에서 β-카테닌의 발현이 강하게 나타나 iPSC와 유사한 상태를 보였다.
또한, 상기 면역세포염색을 통해 확인된 결과를 웨스턴블롯을 통해 정량화하기 위해, 대조군, CHIR 처리군 및 SKL 처리군으로부 세포를 회수하고 RIPA 버퍼를 이용하여 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고, PVDF 멤브레인으로 전기이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인을 5% 탈지유(Skim milk) 버퍼로 상온에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 이후, 항체가 희석된 블록킹 버퍼로 4℃에서 하룻밤 반응시켰으며, 세척 후 HRP가 결합된 2차 항체로 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후, RAS300 장비를 이용하여 이미지를 분석하였다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 전체 리프로그래밍 과정 동안 SKL 처리군에서 대조군 및 CHIR 처리군에 비하여 지속적으로 높은 β-카테닌의 단백질 발현양을 유지하는 것을 확인하였다. 또한 도 15에 나타난 바와 같이, β-카테닌의 유전자 발현 또한 SKL 처리군에서 높은 것을 확인하였다. 결과적으로, SKL 처리 시 종래의 Wnt 활성제에 비해 보다 높은 β-카테닌의 발현을 보인다는 점을 통해, SKL이 더욱 효과적으로 Wnt 시그널링 효율을 증진시킴을 확인할 수 있었다.
또한, 웨스턴블롯을 통해 SKL 처리 후 활성 β-카테닌의 탈인산화 형태가 증가하는 것으로 보아, SKL이 일반적인 인산화 의존 분해 경로로 β-카테닌의 안정성을 조절하였음을 확인하였다(도 16). 또한, 리프로그래밍 6일째에, Nanog와 같은 전분화능 관련 유전자의 발현은 주로 SKL의 처리에 의해 증가하였으나, CHIR의 처리에 의해서는 증가하지 않았다(도 17).
한편, 전분화능 유전자가 어떻게 조절되는지를 확인하기 위해, 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 ChIP 분석을 수행하였다. 그 결과, SKL을 처리한 후에만 β-카테닌과 Nanog 프로모터 영역의 직접적인 결합을 발견하였다(도 18). 상기 결과를 통해, Gsk3β 비의존적인 Wnt 활성화가 Gsk3β 의존적인 방식보다 β-카테닌 매개 전분화능 유전자 조절을 보다 잘 설명함을 알 수 있다.
실험예 5. SKL에 의한 Mapk / Erk 시그널링의 활성 확인
CHIR과 SKL을 병용하여 리프로그래밍 속도를 더욱 향상시키고자 했다. 리프로그래밍 배지에 5 μM의 SKL을 처리한 SKL 처리군과 5 μM SKL 및 3 μM CHIR을 동시에 처리한 SKL 및 CHIR 병용 처리군에서 6일 동안 리프로그래밍을 진행하였다. 이후, 세포를 회수하여 실시예 3의 방법으로 RNA를 수득하고 수득한 RNA를 cDNA로 변화시킨 후, 전분화능 관련 유전자의 발현 변화를 확인하여 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, 전분화능 관련 유전자의 발현은 CHIR 및 SKL의 병용처리에 의해 약간 감소하였다. 따라서, SKL의 진보된 결과가 Wnt 시그널링의 활성화에 의한 것만으로는 설명될 수 없었다.
SKL에 의한 세포의 변화를 더욱 자세히 확인하기 위해, 리프로그래밍 6일째에 세포의 RNA를 회수하여 전체 전사체 수준에서 분석하였다. 그 결과, SKL 처리군의 경우, 대조군 및 CHIR 처리군과 매우 다른 형태의 전사체 발현 패턴이 나타나는 것을 확인하였다(도 20). 또한, SKL 처리군은 리프로그래밍과 연관된 유전자, 즉 전분화능 및 상피 유전자의 상향 조절을 유도하였다(도 21). 대조군에 비해 다르게 변화한 유전자들의 분석을 진행하였다. 구체적인 실험과정은 실시예 7에 기재된 바와 같다. 그 결과, 많은 수의 유전자들이 Erk 시그널링에 속해 있음을 확인하였다. 또한, SKL 처리군에서 DEG의 수는 CHIR 처리군에서보다 월등히 더 높았다. 상기 DEG는 주로 전분화능 및 세포 부착과 같은 리프로그래밍 관련 카테고리와 관련이 있으며, 흥미롭게도 Mapk 시그널링에서 높은 발현을 나타내었다(도 22).
Mapk/Erk 시그널링의 활성화를 다시 검증하기 위해 웨스턴블롯 및 포스포 어레이를 수행하였다. 구체적인 실험과정은 상기 실시예 8에 기재된 바와 같다. 그 결과, SKL 처리군이 대조군 및 CHIR 처리군보다 Erk 시그널링이 더 활성화됨을 확인하였다(도 23 및 도 24). 중심 신호 분자인 Erk1/2의 인산화 수준을 웨스턴블롯을 이용하여 다시 검증한 결과는 대조군 및 CHIR 처리군보다 SKL 처리군에서 높게 나타났다(도 25). 또한, Gas6, Nodal, Ramp3, F2rl1, Fgf15 등의 양성 Erk 조절 인자의 수준은 SKL 처리 후에 증가하는 것으로 나타났다(도 25 및 도 26). 상기 결과를 통해, SKL이 Wnt 시그널링 및 Mapk/Erk 시그널링을 활성화시킴으로써, 정확한 리프로그래밍 경로를 유도함을 알 수 있었다.
실험예 6. SKL에 의한 인간 세포의 리프로그래밍 효율 향상 확인
SKL의 리프로그래밍 효과가 인간 세포에 적용될 수 있는지 조사하기 위하여, 인간 세포인 CRL2097에 센다이바이러스(Thermofisher scientific)를 처리하여 iPSC 리프로그래밍을 진행하였으며, 상기 실시예 2와 같이 알칼린 포스파타아제(AP) 염색을 통해 iPSC 콜로니의 개수 변화를 확인하였다. 또한, SKL의 리프로그래밍 효과가 파킨슨병 환자 유래 인간세포(PD fibroblast)에 적용될 수 있는지를 조사하였다. 그 결과를 도 27 및 도 28에 나타내었다.
도 27에 나타난 바와 같이, SKL 처리군에서 AP 염색된 iPSC 콜로니의 개수가 증가하는 것을 확인하였고, 상기 결과를 통해 SKL 처리가 CRL2097 세포의 리프로그래밍 효율을 향상시킴을 알 수 있었다. 또한, 도 28에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 환자 유래 인간세포에서도 SKL이 효과적으로 리프로그래밍 효율을 증가시켰음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, SKL의 리프로그래밍 효과가 환자 세포의 재생 의학 분야뿐만 아니라 인간에게도 적용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 7. SKL 유도체들의 세포의 리프로그래밍 효율 향상 확인
SKL의 리프로그래밍 효과가 다른 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제에 비해 월등 한지 확인하기 위해, 리프로그래밍 배지에 또 다른 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제인 Epiblastin A(EpiA)와 HLY78을 첨가하여 6일 동안 리프로그래밍을 진행하였다. 그 결과, EpiA와 HLY78은 리프로그래밍 향상 효과가 SKL에 비해 낮은 것을 확인하였다(도 29). 이후, 세포를 회수하여 실시예 3의 방법으로 RNA를 수득하고 수득한 RNA를 cDNA로 변화시킨 후, 전분화능 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, EpiA와 HLY78은 처리로 전분화능 유전자의 발현증가는 나타나지 않았다(도 29). 이를 통해, 다른 기작의 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제에 비해 SKL의 세포 리프로그래밍 효율 향상 능력이 월등함을 확인하였다.
또한, SKL(화학식 1)과 같은 기작을 가진 SKL 유도체(화학식 2 및 화학식 3)들을 이용하였을 때, 리프로그래밍 효율이 크게 증가하였으며, 활성 β-카테닌 단백질의 양이 증가하는 것으로 보아 SKL의 세포 리프로그래밍 효율 향상 능력을 다시 한번 확인하였다(도 30).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> CELL REPROGRAMMING COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING AN INDUECED PLURIPOTENT STEM CELL USING THE SAME <130> FPD/201904-0003 <150> KR 10-2018-0069525 <151> 2018-06-18 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 forward primer <400> 1 acatcgccaa tcagcttgg 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 reverse primer <400> 2 agaaccatac tcgaaccaca t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 forward primer <400> 3 acagatgcaa ccgatgcacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 reverse primer <400> 4 tggagttgta ctgcagggcg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog forward primer(qRT-PCR Analysis) <400> 5 gaaagccatg cgcattttag c 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog reverse primer(qRT-PCR Analysis) <400> 6 aatatttgga agaaggaagg aacct 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa5a forward primer <400> 7 gtccatggct gagaggtacc acctg 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa5a reverse primer <400> 8 taacctgcat ccaggtcgga g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx3 forsward primer <400> 9 cttggaagcc aagccagaca g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx3 reverse primer <400> 10 agtgcactgg cacatttgac ca 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf2 forward primer <400> 11 acatgaagcg acacatgtag cct 23 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf2 reverse primer <400> 12 tccaataaat agcagtctgt ttgcaa 26 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa3 forward primer <400> 13 aagaattagg agcttacatt gtacg 25 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dppa3 reverse primer <400> 14 aaggttaaca agttaagatt ccc 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rex1 forward primer <400> 15 cgcttctccc tggatttcaa ct 22 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rex1 reverse primer <400> 16 ggttaggatg tgaatcttct ggttatt 27 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm14 forward primer <400> 17 ctggatcaag aggctttcta tgcc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm14 reverse primer <400> 18 cagcgttctt ggtttgtaac tg 22 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr5a2 forward primer <400> 19 ataacctcct cattgagatg ctgcatg 27 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nr5a2 reverse primer <400> 20 agagtattgt gtttctgtca tcgtcc 26 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin forward primer <400> 21 gacggtcaac aactgcatga aggc 24 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-cadherin reverse primer <400> 22 aacagtagga gcagcaggat cagaatc 27 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epcam forward primer <400> 23 cttctcagaa aacacaagac gacgtgga 28 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epcam reverse primer <400> 24 tccgttcact ctcaggtcca tgc 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cldn7 forward primer <400> 25 gctcttaccc caagtccaat t 21 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cldn7 reverse primer <400> 26 agcaaactat acatgatgtt tggagg 26 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cadherin forward primer <400> 27 ttgtctgatc ctgccaactg gct 23 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-cadherin reverse primer <400> 28 gggattccat tgtcagaagc aaggaag 27 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin forward primer <400> 29 ttgagtgctt catgccgcta ga 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin reverse primer <400> 30 cttaagggtg aaaggaccac tc 22 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin forward primer <400> 31 ttgagaccag agatggacag gtgatca 27 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin reverse primer <400> 32 agtaaaggca cttgaaagct gt 22 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Esrrb forward primer <400> 33 ttctacagtg tgaaactgca ggg 23 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Esrrb reverse primer <400> 34 ctccacttgg atcgtgtccg t 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 forward primer <400> 35 acatgaagcg acacatgtag cct 23 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klf4 reverse primer <400> 36 tccaataaat agcagtctgt ttgcaa 26 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28a forward primer <400> 37 ccagttctca gggaaagcct g 21 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lin28a reverse primer <400> 38 ttaaagtggg gattagccaa aga 23 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin2 forward primer <400> 39 tacgaaggca ggatcctggg 20 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin2 reverse primer <400> 40 gaatatttcg tggctgttgc gt 22 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gas6 forward primer <400> 41 tgccagaagt atcggtgatt tctg 24 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gas6 reverse primer <400> 42 gtgtgtccaa accctgcttc at 22 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nodal forward primer <400> 43 agaccaagcc actgagcatg c 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nodal reverse primer <400> 44 tgctccctgg acagacacaa tgga 24 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp3 forward primer <400> 45 ttcctgtcgt gctgactgtg g 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ramp3 reverse primer <400> 46 agacagaagc cgagtctgcc 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2rl1 forward primer <400> 47 cgctcagctc caacaagttc t 21 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2rl1 reverse primer <400> 48 gttggtgcat ccctaccacg 20 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf15 forward primer <400> 49 ggatggtgga ggatgtagac cac 23 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fgf15 reverse primer <400> 50 acagggtcca tgtgagactt agaat 25 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epha2 forward primer <400> 51 aggatcggag tgcgtcttcc 20 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epha2 reverse primer <400> 52 agaccactgt ggctcttcaa gt 22 <210> 53 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog forward primer(ChIP Analysis) <400> 53 tccctccctc ccagt 15 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog reverse primer(ChIP Analysis) <400> 54 cctcctaccc tacccaccc 19 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog forward primer(Bisulfite sequencing Analysis) <400> 55 ggtggatttt gtaggtggga ttaattgtga att 33 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog reverse primer(Bisulfite sequencing Analysis) <400> 56 accaaaaaaa cccacactca tatcaatata 30

Claims (11)

  1. Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 세포 리프로그래밍 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 하기 화학식 1, 2 및 3 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 세포 리프로그래밍 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019062253259-pat00004

    [화학식 2]
    Figure 112019062253259-pat00005

    [화학식 3]
    Figure 112019062253259-pat00006
    .
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 Gsk3β를 저해하지 않고 Wnt 시그널링을 활성화하는 것인, 세포 리프로그래밍 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 리프로그래밍 조성물은 성숙한 세포를 iPSC로의 리프로그래밍을 촉진하는 것인, 세포 리프로그래밍 조성물.
  5. 제1항에 따른 조성물이 함유된 배지 조건하에서, 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 iPSC를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분화된 세포는 체세포인 것인, iPSC를 제조하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 분화된 세포는 인간 유래인 것인, iPSC를 제조하는 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제를 1 μM 내지 10 μM 농도로 포함하는 것인, iPSC를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 Gsk3β 비의존적 Wnt 활성제는 하기 화학식 1, 2 및 3 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, iPSC를 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112019062253259-pat00007

    [화학식 2]
    Figure 112019062253259-pat00008

    [화학식 3]
    Figure 112019062253259-pat00009
    .
  10. 제5항에 있어서,
    상기 iPSC가 배양 후 7일 내지 9일 내에 형성되는 것인, iPSC를 제조하는 방법.
  11. 제5항의 방법으로 배양된 iPSC.
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