JP6321733B2 - 人工多能性幹細胞を作製するための化学的手法と遺伝的手法の組み合わせ法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年3月17日に出願された米国特許仮出願第61/069,956号および2008年10月31日に出願された同第61/197,986号に係る優先権の恩典を主張する。これらはそれぞれ参照により組み入れられる。
幹細胞は、全能性細胞または多能性細胞と分類されることが多い。全能性幹細胞は、あらゆるものに分化する能力を有し、すなわち、体内の異なる全てのタイプの細胞を生じさせる。全能性幹細胞の一例は受精卵細胞である。多能性幹細胞は、3つの主要な生殖細胞層に由来する体内の全ての細胞タイプ、または胚そのものを生じることができる。
本発明は、哺乳動物細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングまたは脱分化を誘導する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。一部の態様において、前記方法は、
(a)トランスフェクトされた細胞を作製するために、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つを非多能性細胞に導入する工程;
(b)トランスフェクトされた細胞と、異なる作用物質のライブラリーとを接触させる工程;
(c)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程;ならびに
(d)幹細胞の特徴の発生と、ライブラリー由来の特定の作用物質とを相関付け、それによって、多能性幹細胞への細胞の脱分化を刺激する作用物質を特定する工程
を含む。
(a)非多能性細胞の増殖が阻害されかつ多能性幹細胞の増殖が促進されるように、細胞とMAPK/ERKキナーゼ(MEK)インヒビターとを接触させる工程;および
(b)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程
を含む。
工程(a)の前に、前記細胞と作用物質ライブラリーとを接触させる工程;および
工程(b)の後に、工程(b)の結果に基づいて、多能性幹細胞を誘導する作用物質を選択する工程
を含む。
(a)Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの1つまたは複数を、非多能性細胞に導入する工程;
(b)該細胞とH3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む。
i.非多能性細胞と、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される1つまたは複数の外因性ポリペプチドとの接触、
ii.その後に続く、該外因性ポリペプチドの非存在下での細胞の培養
のサイクルを少なくとも2回(例えば、2回、3回、4回、5回、またはそれ以上)含む。
(c)多能性幹細胞の特徴を示す細胞を選択する工程
をさらに含む。
第1の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第1のベクターであって、該第1の発現カセットがKlf4をコードするポリヌクレオチドを含む、第1のベクター;
第2の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第2のベクターであって、該第2の発現カセットがSox2をコードするポリヌクレオチドを含む、第2のベクター;および
第3の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第3のベクターであって、該第3の発現カセットがc-Mycをコードするポリヌクレオチドを含む、第3のベクター
を導入することを含む。
(a)Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、非多能性細胞に導入する工程;
(b)該細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む。
(a)該細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質(BIXを含むが、これに限定されない);
L型Caチャンネルアゴニスト(BayKを含むが、これに限定されない);
cAMP経路のアクチベーター(フォルスコリンを含むが、これに限定されない);
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター(RG108または5-アザ-Cを含むが、これに限定されない);
核受容体リガンド(デキサメタゾンを含むが、これに限定されない);
GSK3インヒビター(CHIR99021を含むが、これに限定されない);
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター(SB431542、A-83-01、または2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジンを含むが、これに限定されない);
HDACインヒビター(TSA、VPA、酪酸ナトリウム、SAHAなどを含むが、これに限定されない);および
Erkインヒビター
のうちの少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上)と
を接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程を含む。
(a)前記細胞と、
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質とを、ならびに
ii.L型Caチャンネルアゴニスト(BayKを含むが、これに限定されない);
cAMP経路のアクチベーター(フォルスコリンを含むが、これに限定されない);
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター(RG108または5-アザ-Cを含むが、これに限定されない);
核受容体リガンド(デキサメタゾンを含むが、これに限定されない);
GSK3インヒビター(CHIR99021を含むが、これに限定されない);
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター(SB431542、A-83-01、または2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジンを含むが、これに限定されない);
HDACインヒビター(TSA、VPA、酪酸ナトリウム、SAHAなどを含むが、これに限定されない);および
Erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質とを
接触させる工程を含む。
(b)Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、および/またはSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、非多能性細胞に導入する工程をさらに含む。
哺乳動物細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター,
HDACインヒビター;および
Erkインヒビター
のうちの少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上)と
の混合物を提供する。
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
Erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む。
H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質と、
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
Erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、組成物を提供する。
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
Erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、キットを提供する。
(a)Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの1つまたは複数を該非多能性細胞に導入する工程;
(b)該細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む、方法。
2. 工程(a)が、前記非多能性細胞と、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される1つまたは複数の外因性ポリペプチドとを接触させることを含む、請求項1記載の方法。
3. 工程(a)が、
i. 前記非多能性細胞と、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される1つまたは複数の外因性ポリペプチドとの接触、
ii.その後に続く、該外因性ポリペプチドの非存在下での細胞の培養
のサイクルを少なくとも2回含む、請求項2記載の方法。
4. 工程(a)が、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを前記非多能性細胞に導入することを含む、請求項1記載の方法。
5. Octポリペプチドの発現のための発現カセットおよびSoxポリペプチドの発現のための発現カセットが前記非多能性細胞に導入される、請求項1記載の方法。
6. 導入する工程が、KLFポリペプチドおよびOctポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを前記非多能性細胞に導入することを含み、Mycポリペプチドおよび/またはSoxポリペプチドのための発現カセットが該細胞に導入されない、請求項1記載の方法。
7. KlfポリペプチドがKlf4であり、かつOctポリペプチドがOct4である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. 前記非多能性細胞が体細胞である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 前記非多能性細胞が線維芽細胞である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
10. Mycポリペプチドの発現のための発現カセットもKlfポリペプチドの発現のための発現カセットも前記非多能性細胞に導入されない、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
11. 導入する工程がインビボで行われる、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
12. 導入する工程がインビトロで行われる、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
13. (c)多能性幹細胞の特徴を示す細胞を選択する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
14. 前記非多能性細胞を動物から得、かつ前記人工多能性幹細胞を望ましい細胞タイプに分化させる、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 前記望ましい細胞タイプが動物に導入される、請求項14記載の方法。
16. 前記動物がヒトである、請求項15記載の方法。
17. 前記動物が非ヒト動物である、請求項15記載の方法。
18. 選択された前記細胞がOct4の発現のための外因性発現カセットを含まない、請求項13記載の方法。
19. 前記作用物質がH3K9メチル化を阻害する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
20. H3K9メチル化を阻害する前記作用物質がBIX01294である、請求項19記載の方法。
21. 前記細胞がヒト細胞である、請求項1〜20いずれか一項記載の方法。
22. 前記細胞が、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
23. 前記非多能性細胞が前駆細胞である、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
24. 前記前駆細胞が、神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、請求項23記載の方法。
25. 導入する工程が、
第1の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第1のベクターであって、該第1の発現カセットがKlf4をコードするポリヌクレオチドを含む、第1のベクター;
第2の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第2のベクターであって、該第2の発現カセットがSox2をコードするポリヌクレオチドを含む、第2のベクター;および
第3の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第3のベクターであって、該第3の発現カセットがc-Mycをコードするポリヌクレオチドを含む、第3のベクター
を導入することを含む、請求項1または4〜24のいずれか一項記載の方法。
26. ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターである、請求項1または4〜25のいずれか一項記載の方法。
27. 哺乳動物細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングまたは脱分化を誘導する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)トランスフェクトされた細胞を作製するために、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つを非多能性細胞に導入する工程;
(b)該トランスフェクトされた細胞と、異なる作用物質のライブラリーとを接触させる工程;
(c)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程;ならびに
(d)幹細胞の特徴の発生と、ライブラリー由来の特定の作用物質とを相関付け、それによって、多能性幹細胞への細胞の脱分化を刺激する作用物質を特定する工程
を含む、方法。
28. 工程(a)が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、前記非多能性細胞に導入することを含む、請求項27記載の方法。
29. 工程(a)が、外因性Octポリペプチド、外因性Klfポリペプチド、外因性Mycポリペプチド、および外因性Soxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つを、前記非多能性細胞に導入することを含む、請求項27記載の方法。
30. 特定の作用物質が50〜1500ダルトンである、請求項27〜29記載の方法。
31. 工程(a)が、2つの発現カセットを前記細胞に導入することを含み、それぞれの発現カセットが、異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該タンパク質が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択され、かつ該群の残りのメンバーが該細胞に導入されない、請求項27記載の方法。
32. 工程(a)が、3つの発現カセットを前記細胞に導入することを含み、それぞれの発現カセットが、異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該タンパク質が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択され、かつ該群の残りのメンバーが該細胞に導入されない、請求項27記載の方法。
33. 前記細胞がヒト細胞である、請求項27〜32のいずれか一項記載の方法。
34. 前記細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項27〜33のいずれか一項記載の方法。
35. 前記非多能性細胞が前駆細胞である、請求項27〜34のいずれか一項記載の方法。
36. 前記前駆細胞が、神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、請求項35記載の方法。
37. OctポリペプチドがOct4であり、KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、請求項27〜36のいずれか一項記載の方法。
38. 多能性幹細胞の特徴を有する哺乳動物細胞をスクリーニングする方法であって、
(a)非多能性細胞の増殖が阻害されかつ多能性幹細胞の増殖が促進されるように、細胞とMAPK/ERKキナーゼ(MEK)インヒビターとを接触させる工程;および
(b)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程
を含む、方法。
39. 工程(a)の前に、前記細胞と作用物質ライブラリーとを接触させる工程;および
工程(b)の後に、工程(b)の結果に基づいて、多能性幹細胞を誘導する作用物質を選択する工程
を含む、請求項38記載の方法。
40. 前記細胞がヒト細胞である、請求項38〜39のいずれか一項記載の方法。
41. 前記細胞が、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞である、請求項38〜39のいずれか一項記載の方法。
42. MEKインヒビターがPD0325901である、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
43. 哺乳動物細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質との混合物であって、
該細胞が、
Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Soxポリペプチド、およびMycポリペプチドのうちの少なくとも1つまたは複数を発現する;ならびに/または
外因性Octポリペプチド、外因性Klfポリペプチド、外因性Soxポリペプチド、および外因性Mycポリペプチドのうちの少なくとも1つまたは複数と接触している、
混合物。
44. 前記細胞が、第1の組換え発現カセット、第2の組換え発現カセット、および第3の組換え発現カセットを含み、
該第1の発現カセットが、Klfポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、
該第2の発現カセットが、Soxポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、かつ
該第3の発現カセットが、Mycポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、
請求項43記載の混合物。
45. 前記作用物質がH3K9メチル化を阻害する、請求項43〜44のいずれか一項記載の混合物。
46. H3K9メチル化を阻害する前記作用物質がBIX01294である、請求項45記載の方法。
47. 前記細胞が、1つまたは複数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターを含み、
該1つまたは複数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、第1の発現カセット、第2の発現カセット、および第3の発現カセットを含む、
請求項43〜46のいずれか一項記載の混合物。
48. 前記混合物が、第1、第2、および第3のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターを含み、
該第1のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、前記第1の発現カセットを含み、
該第2のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、前記第2の発現カセットを含み、
該第3のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、前記第3の発現カセットを含む、
請求項47記載の混合物。
49. 前記細胞がヒト細胞である、請求項43〜48のいずれか一項記載の混合物。
50. 前記細胞が、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞である、請求項43〜48のいずれか一項記載の混合物。
51. 前記細胞が前駆細胞を含む、請求項43〜50のいずれか一項記載の混合物。
52. 前記前駆細胞が神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、請求項51記載の混合物。
53. KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、請求項43〜52のいずれか一項記載の混合物。
54. Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも1つを内因的に発現する、哺乳動物細胞であって、
該細胞が、該群の少なくとも1つのタンパク質を内因的に発現せず、
内因的に発現されない該タンパク質が、該細胞に存在する異種組換え発現カセットによってコードされるRNAから発現され、
該細胞が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドをそれぞれ内因的または異種的に発現し、かつ
異種発現カセットからの該タンパク質の発現により、該細胞の非多能性細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングまたは脱分化が生じる、
哺乳動物細胞。
55. OctポリペプチドがOct4であり、KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、請求項54記載の細胞。
56. SoxポリペプチドおよびMycポリペプチドを内因的に発現し、かつOctポリペプチドおよびKlfポリペプチドを異種的に発現する、請求項54〜55のいずれか一項記載の細胞。
57. OctポリペプチドがOct4であり、KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、請求項56記載の細胞。
58. 細胞においてOct4発現を誘導する方法であって、
該細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、該細胞におけるOct4発現を誘導する工程
を含む、方法。
59. 接触させる工程の直前に、前記細胞がOct4を発現しない、請求項58記載の方法。
60. 接触させた前記細胞が多能性細胞でない、請求項58〜59のいずれか一項記載の方法。
61. 接触させる工程の後に、前記細胞が多能性になるように誘導される、請求項58〜59のいずれか一項記載の方法。
62. 非多能性細胞を多能性細胞に誘導する方法であって、
該非多能性細胞と多能性を誘導する1つもしくは複数の作用物質とを接触させる、かつ/または多能性を誘導するタンパク質を発現するように発現カセットを該細胞に導入する工程であって、該細胞が、フィーダー細胞上で培養されず、かつ固体培養表面に接着される工程
を含む、方法。
63. 前記細胞が、マトリゲル、細胞外マトリックス(ECM)またはECM類似体、ラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲンからなる群より選択される分子テザーにより固体培養表面に接着される、請求項62記載の方法。
64. 接触させる工程が、請求項1または請求項1の従属項に記載の工程を含む、請求項62記載の方法。
65. 人工多能性幹細胞を哺乳動物非多能性細胞から作製する方法であって、
(a)該細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つと
を接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む、方法。
66. 接触させる工程が、
(a)前記細胞と、
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;ならびに
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質
のうちの少なくとも2つと
を接触させることを含む、請求項65記載の方法。
67. (b)Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、および/またはSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、前記非多能性細胞に導入する工程
をさらに含む、請求項65または66記載の方法。
68. Klf4およびOct4が前記細胞に導入される、請求項65〜67のいずれか一項記載の方法。
69. 哺乳動物細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つと
の混合物。
70. 混合物が、
i. H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質と、
ii. L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、請求項69記載の混合物。
71. 前記細胞が、Octポリペプチド発現のための異種発現カセットおよびSoxポリペプチド発現のための異種発現カセットを含む、請求項69〜70のいずれか一項記載の混合物。
72. 前記細胞が非多能性細胞である、請求項69〜71のいずれか一項記載の混合物。
73. 前記細胞が線維芽細胞である、請求項69〜72のいずれか一項記載の混合物。
74. Mycポリペプチドの発現のための発現カセットもKlfポリペプチドの発現のための発現カセットも非多能性細胞に導入されない、請求項69〜73のいずれか一項記載の混合物。
75. H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つ
を含む、組成物。
76. i. H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、請求項75記載の組成物。
77. H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つを含む、キット。
78. i.H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、請求項77記載のキット。
79. 哺乳動物細胞をさらに含む、請求項77または78記載のキット。
[本発明1001]
人工多能性幹細胞を哺乳動物非多能性細胞から作製する方法であって、
(a)該細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも1つと
を接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
接触させる工程が、
(a)前記細胞と、
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;ならびに
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質
のうちの少なくとも2つと
を接触させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
(b)Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、および/またはSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、前記非多能性細胞に導入する工程
をさらに含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
Klf4およびOct4が前記細胞に導入される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
人工多能性幹細胞を哺乳動物非多能性細胞から作製する方法であって、
(a)Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの1つもしくは複数を該非多能性細胞に導入するか、または該非多能性細胞におけるOctポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの1つもしくは複数の発現を改変する工程;
(b)該細胞とH3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、人工多能性幹細胞を作製する工程
を含む、方法。
[本発明1006]
工程(a)が、前記非多能性細胞と、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される1つまたは複数の外因性ポリペプチドとを接触させることを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
工程(a)が、
i.前記非多能性細胞と、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される1つまたは複数の外因性ポリペプチドとの接触、
ii.その後に続く、該外因性ポリペプチドの非存在下での該細胞の培養
のサイクルを少なくとも2回含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
工程(a)が、Klfポリペプチド、Octポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、前記非多能性細胞に導入することを含む、本発明1005の方法。
[本発明1009]
Octポリペプチドの発現のための発現カセットおよびSoxポリペプチドの発現のための発現カセットが前記非多能性細胞に導入される、本発明1005の方法。
[本発明1010]
導入する工程が、KLFポリペプチドおよびOctポリペプチドの発現のための1つまたは複数の発現カセットを前記非多能性細胞に導入することを含み、Mycポリペプチドおよび/またはSoxポリペプチドのための発現カセットが該細胞に導入されない、本発明1005の方法。
[本発明1011]
KlfポリペプチドがKlf4であり、かつOctポリペプチドがOct4である、本発明1005の方法。
[本発明1012]
前記非多能性細胞が体細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1013]
前記非多能性細胞が線維芽細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1014]
Mycポリペプチドの発現のための発現カセットもKlfポリペプチドの発現のための発現カセットも前記非多能性細胞に導入されない、本発明1005の方法。
[本発明1015]
導入する工程がインビボで行われる、本発明1005の方法。
[本発明1016]
導入する工程がインビトロで行われる、本発明1005の方法。
[本発明1017]
(c)多能性幹細胞の特徴を示す細胞を選択する工程
をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1018]
前記非多能性細胞を動物から得、かつ前記人工多能性幹細胞を望ましい細胞タイプに分化させる、本発明1005の方法。
[本発明1019]
前記望ましい細胞タイプが動物に導入される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記動物がヒトである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記動物が非ヒト動物である、本発明1019の方法。
[本発明1022]
選択された前記細胞が、Oct4の発現のための外因性発現カセットを含まない、本発明1017の方法。
[本発明1023]
前記作用物質がH3K9メチル化を阻害する、本発明1005の方法。
[本発明1024]
H3K9メチル化を阻害する前記作用物質がBIX01294である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1026]
前記細胞が、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1027]
前記非多能性細胞が前駆細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1028]
前記前駆細胞が、神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
導入する工程が、
第1の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第1のベクターであって、該第1の発現カセットがKlf4をコードするポリヌクレオチドを含む、第1のベクター;
第2の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第2のベクターであって、該第2の発現カセットがSox2をコードするポリヌクレオチドを含む、第2のベクター;および
第3の発現カセットに機能的に連結されたプロモーターを含む、第3のベクターであって、該第3の発現カセットがc-Mycをコードするポリヌクレオチドを含む、第3のベクター
を導入することを含む、本発明1005の方法。
[本発明1030]
ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターである、本発明1005の方法。
[本発明1031]
哺乳動物細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングまたは脱分化を誘導する作用物質をスクリーニングする方法であって、
(a)トランスフェクトされた細胞を作製するために、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つを非多能性細胞に導入する工程;
(b)該トランスフェクトされた細胞と、異なる作用物質のライブラリーとを接触させる工程;
(c)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程;および
(d)幹細胞の特徴の発生と、ライブラリー由来の特定の作用物質とを相関付け、それによって、多能性幹細胞への細胞の脱分化を刺激する作用物質を特定する工程
を含む、方法。
[本発明1032]
工程(a)が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つの発現のための1つまたは複数の発現カセットを、前記非多能性細胞に導入することを含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
工程(a)が、外因性Octポリペプチド、外因性Klfポリペプチド、外因性Mycポリペプチド、および外因性Soxポリペプチドのうちの全てではないが少なくとも1つを、前記非多能性細胞に導入することを含む、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記特定の作用物質が50〜1500ダルトンである、本発明1031の方法。
[本発明1035]
工程(a)が、2つの発現カセットを前記細胞に導入することを含み、それぞれの発現カセットが、異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該タンパク質が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択され、かつ該群の残りのメンバーが該細胞に導入されない、本発明1031の方法。
[本発明1036]
工程(a)が、3つの発現カセットを前記細胞に導入することを含み、それぞれの発現カセットが、異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、該タンパク質が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択され、かつ該群の残りのメンバーが該細胞に導入されない、本発明1031の方法。
[本発明1037]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1031の方法。
[本発明1038]
前記細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、本発明1031の方法。
[本発明1039]
前記非多能性細胞が前駆細胞である、本発明1031の方法。
[本発明1040]
前駆細胞が、神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、本発明1040の方法。
[本発明1041]
OctポリペプチドがOct4であり、KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、本発明1031の方法。
[本発明1042]
多能性幹細胞の特徴を有する哺乳動物細胞をスクリーニングする方法であって、
(a)非多能性細胞の増殖が阻害されかつ多能性幹細胞の増殖が促進されるように、細胞とMAPK/ERKキナーゼ(MEK)インヒビターとを接触させる工程;および
(b)接触させた該細胞を多能性幹細胞の特徴についてスクリーニングする工程
を含む、方法。
[本発明1043]
工程(a)の前に、前記細胞と作用物質ライブラリーとを接触させる工程;および
工程(b)の後に、工程(b)の結果に基づいて、多能性幹細胞を誘導する作用物質を選択する工程
を含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記細胞が、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、ラット、および非ヒト霊長類細胞である、本発明1042の方法。
[本発明1046]
MEKインヒビターがPD0325901である、本発明1042の方法。
[本発明1047]
哺乳動物細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質との混合物であって、
該細胞が、
Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Soxポリペプチド、およびMycポリペプチドのうちの少なくとも1つまたは複数を発現する;ならびに/または
外因性Octポリペプチド、外因性Klfポリペプチド、外因性Soxポリペプチド、および外因性Mycポリペプチドのうちの少なくとも1つまたは複数と接触している、
混合物。
[本発明1048]
前記細胞が、第1の組換え発現カセット、第2の組換え発現カセット、および第3の組換え発現カセットを含み、
該第1の発現カセットが、Klfポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、
該第2の発現カセットが、Soxポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、
該第3の発現カセットが、Mycポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、
本発明1047の混合物。
[本発明1049]
前記作用物質がH3K9メチル化を阻害する、本発明1047の混合物。
[本発明1050]
H3K9メチル化を阻害する前記作用物質がBIX01294である、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記細胞が、1つまたは複数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターを含み、
該1つまたは複数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、第1の発現カセット、第2の発現カセット、および第3の発現カセットを含む、
本発明1047の混合物。
[本発明1052]
前記混合物が、第1、第2、および第3のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターを含み、
該第1のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、第1の発現カセットを含み、
該第2のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、第2の発現カセットを含み、かつ
該第3のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクター、またはエピソーム発現ベクターが、第3の発現カセットを含む、
本発明1051の混合物。
[本発明1053]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1047の混合物。
[本発明1054]
前記細胞が、マウス細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞である、本発明1047の混合物。
[本発明1055]
前記細胞が前駆細胞を含む、本発明1047の混合物。
[本発明1056]
前記前駆細胞が、神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、本発明1055の混合物。
[本発明1057]
KlfポリペプチドがKlf4であり、Mycポリペプチドがc-Mycであり、かつSoxポリペプチドがSox2である、本発明1047の混合物。
[本発明1058]
Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択されるタンパク質の少なくとも1つを内因的に発現する、哺乳動物細胞であって、
該細胞が、該群の少なくとも1つのタンパク質を内因的に発現せず、
内因的に発現されない該タンパク質が、該細胞に存在する異種組換え発現カセットによってコードされるRNAから発現され、
該細胞が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドをそれぞれ内因的または異種的に発現し、かつ
異種発現カセットからの該タンパク質の発現により、該細胞の非多能性細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングまたは脱分化が生じる、
哺乳動物細胞。
[本発明1059]
Oct ポリペプチドがOct 4であり、Klf ポリペプチドがKlf 4であり、Myc ポリペプチドがc-Mycであり、かつSox ポリペプチドがSox2である、本発明1058記載の細胞。
[本発明1060]
Sox ポリペプチドおよびMyc ポリペプチドを内因的に発現し、かつOct ポリペプチドおよびKlf ポリペプチドを異種的に発現する、本発明1058記載の細胞。
[本発明1061]
Oct ポリペプチドがOct 4であり、Klf ポリペプチドがKlf 4であり、Myc ポリペプチドがc-Mycであり、かつSox ポリペプチドがSox2である、本発明1060記載の細胞。
[本発明1062]
細胞においてOct4 発現を誘導する方法であって、
該細胞と、H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する作用物質とを接触させ、それによって、該細胞におけるOct4 発現を誘導する工程
を含む、方法。
[本発明1063]
接触させる工程の直前に、前記細胞がOct4を発現しない、本発明1062記載の方法。
[本発明1064]
接触させた前記細胞が多能性細胞でない、本発明1062記載の方法。
[本発明1065]
接触させる工程の後に、前記細胞が多能性になるように誘導される、本発明1064記載の方法。
[本発明1066]
非多能性細胞を多能性細胞に誘導する方法であって、
該非多能性細胞と多能性を誘導する1つもしくは複数の作用物質とを接触させる、かつ/または多能性を誘導するタンパク質を発現するように発現カセットを該細胞に導入する工程であって、該細胞が、フィーダー細胞上で培養されず、かつ固体培養表面に接着される工程
を含む、方法。
[本発明1067]
前記細胞が、マトリゲル、細胞外マトリックス(ECM)またはECM類似体、ラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲンからなる群より選択される分子テザーにより固体培養表面に接着される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
接触させる工程が、本発明1005または本発明1005の従属項のいずれかの工程を含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
哺乳動物細胞と、
H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つと
の、混合物。
[本発明1070]
i.H3K9メチル化を阻害するかまたはH3K9脱メチルを促進する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、本発明1069の混合物。
[本発明1071]
前記細胞が、Octポリペプチド発現のための異種発現カセットおよびSoxポリペプチド発現のための異種発現カセットを含む、本発明1069の混合物。
[本発明1072]
前記細胞が非多能性細胞である、本発明1069の混合物。
[本発明1073]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1069の混合物。
[本発明1074]
Mycポリペプチドの発現のための発現カセットもKlfポリペプチドの発現のための発現カセットも非多能性細胞に導入されない、本発明1071の混合物。
[本発明1075]
H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つ
を含む、組成物。
[本発明1076]
i.H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、本発明1075の組成物。
[本発明1077]
H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質;
L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
のうちの少なくとも2つを含む、キット。
[本発明1078]
i.H3K9メチル化を阻害する1つの作用物質と、
ii.L型Caチャンネルアゴニスト;
cAMP経路のアクチベーター;
DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;
核受容体リガンド;
GSK3インヒビター;
MEKインヒビター;
TGFβ受容体/ALK5インヒビター;
HDACインヒビター;および
erkインヒビター
からなる群より選択される1つの作用物質と
を含む、本発明1077のキット。
[本発明1079]
哺乳動物細胞をさらに含む、本発明1077のキット。
「Octポリペプチド」は、オクタマー転写因子ファミリーの天然メンバー、または最も近縁の天然ファミリーメンバーと比較して類似の転写因子活性(少なくとも50%、80%、もしくは90%以内の活性)を維持しているその変種、または少なくとも天然ファミリーメンバーのDNA結合ドメインを含み、任意で、転写活性化ドメインを含むポリペプチドのいずれかを指す。例示的なOctポリペプチドには、例えば、POUドメインを含有するOct3/4(本明細書にでは「Oct4」と呼ぶ)が含まれる。Ryan, A.K.およびRosenfeld, M. G. Genes Dev. 11, 1207-1225(1997)を参照されたい。一部の態様において、変種は、天然のOctポリペプチドファミリーメンバー、例えば、前記で列挙したものと比較して、配列全体にわたって少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。
I.序論
本発明は、低分子を用いると、人工多能性幹細胞(iPS)の誘導に関与する転写因子の効果を模倣できるという驚くべき発見に一部基づいている。例えば、本明細書において詳述したように、Oct4は、ヒストン3リジン9(H3K9)のメチル化を低下させる低分子で「代替する」ことができる。従って、例えば、G9a(H3K9のヒストンメチルトランスフェラーゼ)を特異的に阻害する低分子であるBIX01294を、Klf4、c-Myc、およびSox2が発現している哺乳動物細胞と接触させると、多能性幹細胞が誘導される。
A.異種発現/内因性発現
本発明の一部の態様において、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群に由来する少なくとも1つ(任意で、2つまたは3つ)のタンパク質を内因的に発現する非多能性細胞が特定される。次いで、この群に由来する残りの(非内因的に発現される)タンパク質を細胞において異種的に発現させ、任意で、MEKインヒビター、H3K9メチル化を阻害する作用物質、L型Caチャンネルアゴニスト;cAMP経路のアクチベーター;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;核受容体リガンド;GSK3インヒビター;MEKインヒビター;TGFβ受容体/ALK5インヒビター;HDACインヒビター;および/またはErkインヒビターのうちの1つまたは複数の存在下で、多能性細胞へのリプログラミングおよび/または脱分化についてスクリーニングすることができる。
本明細書において詳述するように、本発明の多くの態様は、1つまたは複数のポリペプチドを細胞に導入し、それによって、細胞において多能性を誘導することを伴う。前記で議論したように、細胞へのポリペプチドの導入は、1つまたは複数の発現カセットを含むポリヌクレオチドの細胞への導入および発現の誘導、それによる発現カセットからの転写および翻訳によるポリペプチドの細胞への導入を含んでもよい。または、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入を伴わない多くの異なる方法によって、外因性ポリペプチド(すなわち、細胞外から供給される、および/または細胞によって産生されないタンパク質)を細胞に導入することができる。
本発明の一部の態様において、細胞は、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドより選択される少なくとも1つのタンパク質(例えば、これらの少なくとも1つ、2つ、または3つ)を(内因的にまたは異種的に)発現し、残っている非発現タンパク質の1つまたは複数、すなわち、細胞において発現されない、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、またはSoxポリペプチドのいずれかの発現の非存在下で、細胞を多能性幹細胞に誘導するのに十分な少なくとも1つの作用物質と接触させる。
本明細書で使用する、「非多能性細胞」とは、多能性細胞でない哺乳動物細胞を指す。このような細胞の例には、分化細胞ならびに前駆細胞が含まれる。分化細胞の例には、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織、および末梢血により選択される組織に由来する細胞が含まれるが、これに限定されない。例示的な細胞タイプには、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、およびT細胞が含まれるが、これに限定されない。
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的な技法に頼っている。本発明における一般的な使用方法を開示する基本的な教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.,1994))が含まれる。
ある特定の態様において、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用することが意図される。一般的に、これらの宿主に関して、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択が可能なマーキング配列を有してもよい。
ある特定のウイルスが、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に感染または侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込み、ウイルス遺伝子を安定してかつ効率的に発現することができれば、外来核酸を細胞(例えば、哺乳動物細胞)に導入するための魅力的な候補となる。本発明の核酸を送達するのに使用することができるウイルスベクターの非限定的な例を下記で説明する。
核酸を送達する特定の方法はアデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。アデノウイルスベクターのゲノムDNAへの組み込み能力は低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターにより得られる高い遺伝子導入効率によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、(a)構築物のパッケージングを支持するのに十分な、および(b)ベクターにクローニングされた組織特異的構築物または細胞特異的構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。約36kbの直線二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子組成の知識があるので、アデノウイルスDNAの大きな断片を7kbまでの外来配列で置換することができる(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992))。
核酸は、アデノウイルスを介したトランスフェクションを用いて細胞に導入することができる。アデノウイルスが対となったシステムを用いる細胞システムにおいて、高いトランスフェクション効率が報告されている(Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.)。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、組込み頻度が高く、非分裂細胞に感染することができ、従って、哺乳動物細胞、例えば、組織培養されている哺乳動物細胞への遺伝子送達(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992)、またはインビボでの遺伝子送達に有用であるので魅力的なベクターシステムである。rAAVベクターの作製および使用に関する詳細は米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込む能力、多量の外来遺伝物質を導入する能力、広範囲の種および細胞タイプに感染する能力、特殊な細胞株においてパッケージングされる能力があるので遺伝子送達ベクターとして有望である(Miller et al., Am. J. Clin. Oncol, 15(3):216-221, 1992)。
送達しようとする核酸は、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルスの中に収容されてもよい。従って、ウイルス粒子は、標的細胞のコグネイト受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。レトロウイルスベクターを特異的に標的化するように設計された新規の手法は、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この改変があると、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染が可能になる。
本発明と共に使用するための細胞、組織、または生物を形質転換するのに適した核酸送達法は、本明細書に記載のように、または当業者に公知のように、核酸(例えば、DNA)を細胞、組織、または生物に導入することができる実質的に全ての方法を含むと考えられる。このような方法には、例えば、エクスビボトランスフェクション(Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987)、任意で、Fugene6(Roche)またはLipofecyamine (Invitrogen)を用いたエクスビボトランスフェクション;マイクロインジェクション(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-1099, 1985;米国特許第5,789,215号)を含む、注射(米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号、および同第5,580,859号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);エレクトロポレーション(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,253号;Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81.7161-7165, 1984);リン酸カルシウム沈殿(Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol, 10:689-695, 1990);DEAE-デキストラン後のポリエチレングリコールの使用(Gopal, Mol. Cell Biol, 5:1188-1190, 1985);ダイレクトソニックローディング(Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987);リポソームを介したトランスフェクション(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol Chem., 266:3361-3364, 1991)、および受容体を介したトランスフェクション(Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987;それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)、ならびにこのような方法の任意の組み合わせによるDNAの直接送達が含まれるが、これに限定されない。
多能性になるように誘導しようとする細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って培養することができる。大まかなガイドラインは、例えば、Maherali, et al., Cell Stem Cell 3:595-605 (2008)に見られる。
本発明は、予防的使用または治療的使用を含むが、これに限定されない、幹細胞技術のさらなる研究および開発を可能にする。例えば、一部の態様において、本発明の細胞(多能性細胞または望ましい細胞運命に沿って分化するように誘導された細胞のいずれか)は、器官、組織、または細胞タイプの再生を必要とする個体を含むが、これに限定されない、本発明の細胞を必要とする個体に導入される。一部の態様において、細胞は、最初に、生検において個体から得られ、本明細書に記載のように多能性になるように誘導され、任意で、(例えば、特定の望ましい前駆細胞に)分化するように誘導され、次いで、移植によって個体に戻される。一部の態様において、細胞は、個体に導入される前に遺伝子組換えされる。
本発明は、4種類のiPS転写因子(すなわち、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチド)の1つを「代替する」ことができる作用物質、または細胞を多能性細胞にリプロラミングするのにMycが必要でない細胞では、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、もしくはSoxポリペプチドを代替することができる作用物質(Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P.およびJaenisch, R. Cell Stem Cell 2, 10-12(2008))、あるいは多能性への融合効率を改善する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本明細書において議論されるように、本発明は、H3K9メチル化を阻害する作用物質;L型Caチャンネルアゴニスト;cAMP経路のアクチベーター;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;核受容体リガンド;GSK3インヒビター;MEKインヒビター;TGFβ受容体/ALK5インヒビター;HDACインヒビター;またはErkインヒビターからなる群より選択される1つまたは複数の化合物との混合物中の非多能性細胞を提供する。一部の態様において、化合物は、多能性を誘導するのに十分な濃度で、または多能性への誘導効率を改善するのに十分な濃度で混合されている。例えば、一部の態様において、化合物は、少なくとも0.1nM、例えば、少なくとも1nM、10nM、100nM、1000nM、10000nM、または100000nM、例えば、0.1nM〜100000nM、例えば、1nM〜10000nM、例えば、10nM〜10000nMの濃度である。一部の態様において、混合物は、合成容器(例えば、試験管、ペトリ皿など)の中にある。従って、一部の態様において、細胞は、単離された細胞であり(動物の一部でない)。一部の態様において、細胞は、動物(ヒトまたは非ヒト)から単離され、容器に入れられ、本明細書に記載のように1つまたは複数の化合物と接触させられる。その後に、細胞を培養してもよく、任意で、同じ動物または異なる動物に戻すことができ、任意で、特定の細胞タイプまたは系列になるように細胞を刺激した後に、同じ動物または異なる動物に戻すことができる。
本発明はまた、例えば、細胞における多能性の誘導または多能性の誘導効率の改善において使用するためのキットを提供する。このようなキットは、H3K9メチル化を阻害する作用物質;L型Caチャンネルアゴニスト;cAMP経路のアクチベーター;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;核受容体リガンド;GSK3インヒビター;MEKインヒビター;TGFβ受容体/ALK5インヒビター;HDACインヒビター;またはErkインヒビターからなる群より選択される1つまたは複数の化合物を含んでもよい。一部の態様において、キットは、H3K9メチル化を阻害する作用物質(BIX-01294を含むが、これに限定されない)、およびL型Caチャンネルアゴニスト;cAMP経路のアクチベーター;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)インヒビター;核受容体リガンド;GSK3インヒビター;MEKインヒビター;TGFβ受容体/ALK5インヒビター;HDACインヒビター;またはErkインヒビターのうちの少なくとも1つより選択される第2の化合物(H3K9メチル化を阻害する作用物質とは別個の、またはH3K9メチル化を阻害する作用物質と混合される)を含む。
発癌性転写因子(例えば、cMycおよびOct4(Hochedlinger, K. et al., Cell 121, 465-477(2005))のウイルス導入に代替することができ、およびリプログラミング効率を増強できる条件を特定することに向けて、本発明者らは2つの手法の組み合わせを活用しようと努力した。1つは、ある特定の接触可能な成体前駆細胞が多能性を誘導するために必要とされる遺伝子のいくつかをある特定のレベルで内因性に発現している可能性があり、ならびに/または、これらの遺伝子の座位が、そのような前駆細胞がより効率的におよび/もしくはより少ない遺伝子操作でリプログラミングされ得るように、より少なくサイレンシングされている可能性があるという概念に基づいて、画定された前駆細胞のタイプを調査することであり;他方の手法は、特異的な転写因子のウイルス組み込みに代替することができ、および/またはリプログラミング過程を促進できる可能性がある低分子をスクリーニングすることであった。
神経前駆細胞培養
神経前駆細胞は、Contiらにより報告された手順に従い、mESCまたはマウス胎児脳由来であった(Conti, L. et al., PLoS Biol. 3, e283 (2005))。簡潔には、mESCを0.1%ゼラチンでコーティングしたディッシュ上に1×104細胞/cm2で神経誘導培地(50% DMEM/F12基本培地、50% Neurobasal培地、0.5× N2、0.5× B27、1× Glutamax、50 ug/ml BSA)においてプレーティングし、7〜8日間分化させた。次に、形成された神経ロゼットをトリプシン処理して単細胞にし、神経球を形成するようにUltra-Low Attachment dish(Corning)中に神経前駆細胞拡大培地(DMEM/F12、1× N2、10 ng/ml bFGF、10 ng/ml EGF、50ug/ml BSA)において再プレーティングした。懸濁液において3日後に神経球をゼラチンでコーティングしたディッシュに再接着させて、それらをさらに単細胞で継代し、単層で、ゼラチンでコーティングしたディッシュ上で神経前駆細胞拡大培地において5〜6継代を超える間増殖させる前に、4〜6日間さらに分化させた。
Oct4、Klf4、Sox2、およびc-MycのマウスcDNAをpMSCVレトロウイルスベクター中にクローニングし、塩基配列決定により検証した。pMXベースのレトロウイルスベクターはAddgeneより入手した。ウイルス生産および導入は、2〜3に記載されているように行った。
mESC由来または初代OG2マウス神経前駆細胞をMatrigel(1:50, BD Biosciences)でコーティングした6ウェルプレート中に3.5×104細胞/ウェルで神経前駆細胞拡大培地においてプレーティングした。1日後、これらの細胞にレトロウイルスを一晩導入し、培地を、BIX01294(0.5〜1μM)を含むかまたは含まないmESC増殖培地[DMEM、5% FBS、10% KSR、1×non-essential amino acids(Gibco)、2mM L-グルタミン(Gibco)、0.1 mM β-メルカプトエタノール(Gibco)、および103単位/ml LIF(Chemicon)]に交換した。GFP陽性iPS細胞コロニーは9〜14日後に出現し、選び出してMEFフィーダー細胞上でmESC増殖培地を用いて拡大した。
ALP染色はAlkaline Phosphatase Detection Kit(Chemicon)により指示されているように行った。細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、PBSで3回洗浄し、次に、0.3% TritonX-100(Sigma)および10%正常ロバ血清(Jackson ImmunoResearch)を含むPBS中で30分間室温でインキュベーションした。その後、細胞を以下の1次抗体と一晩4℃でインキュベーションした:マウス抗Oct4抗体、マウス抗SSEA1抗体(1:200、Santa Cruz)、ウサギ抗Sox2抗体(1:200、Chemicon)、ウサギ抗Nanog抗体(AbCam)、ウサギ抗Pdx1(1:200、C. Wright博士より)、マウス抗βIII-チューブリン抗体(1:500、Covance)、マウス抗心筋トロポニンT(1:200、DSHB)、ウサギ抗アルブミン抗体(DAKO)。洗浄後、細胞をさらに2次抗体:Alexa Fluro555ロバ抗マウスIgGまたはAlexa Fluro555ロバ抗ウサギIgG(1:500、Invitrogen)と30分間、RTでインキュベーションした。核をDAPI(Sigma)染色により検出した。画像をNikon TE2000-Uにより捕捉した。
凝集体キメラを得るために、iPS細胞を露出されたコンパクション後の8細胞期胚と凝集させた。2.5 dpcで雌から流し出した8細胞胚(B6C3F1)をミネラルオイルの下でKSOM培地(10% FCS)の微小滴において培養した。短時間のトリプシン処理後のiPS細胞の塊(10〜20細胞)を選択し、透明帯除去8細胞胚を含む微小滴中に移した。iPS細胞と凝集した8細胞胚を一晩、37℃、5% CO2で培養した。8細胞期から発生した凝集した胚盤胞を2.5 dpcの偽妊娠レシピエントの1つの子宮角中に移植した。
体細胞は、4種類の転写因子の組み合わせ、Oct4/Sox2/Klf4/c-MycまたはOct4/Sox2/Nanog/LIN28を用いて、多能性幹細胞(iPSC)に誘導することができる。このことは、種々の治療用途および研究用途のために患者特異的な細胞を得ることを可能にするプラットホームを提供する。しかしながら、効率およびウイルスのゲノム組み込みに付随する欠点のために、本手法が治療的に関連するにはいくつかの問題が残っている。上記で説明したように、Oct4/Klf4を導入した神経前駆細胞(NPC)をiPSCにリプログラミングすることができる。しかしながら、NPCは内因性にSox2を発現し、ことによると外因性のSox2が無い状態においてリプログラミングを促進する。本研究において、本発明者らは、リプログラミングに不可欠な因子を内因性に発現していないOct4/Klf4を導入したマウス胚繊維芽細胞のリプログラミングを可能にする低分子の組み合わせ、BIX-01294およびBayK8644を特定した。本研究は、表現型スクリーニングにより特定された低分子が、Sox2のような重要な因子のウイルス導入を補償することができ、およびリプログラミング効率を改善できることを証明する。
表現型スクリーニングは、2種類のTFのみを導入した際にMEFのリプログラミングを可能にする低分子の発見をもたらす。
129マウスのE13〜14胚由来の改変されていないMEFを最初のスクリーニングに使用した。MEFをMatrigel上に6ウェルプレートのウェルあたり3.5×104細胞でプレーティングし、OK(Oct4およびKlf4を発現するレトロウイルスベクター)単独を導入した。14〜21日内に、特徴的な胚性幹細胞(ESC)コロニー形態を有しかつ多能性マーカーであるアルカリホスファターゼ(ALP)が陽性であるコロニーの出現について、処理した細胞を評価した。そのようなOKを導入した細胞は、ALP発現が弱陽性である小さな緻密でないコロニーを少しのみ生成した。これらのコロニーはウイルス導入後21日以内に最初に出現し、拡大するのが難しかった。そのため、そのようなアッセイシステムは、望ましいリプログラミング誘導活性を有する低分子の特定のためにきれいなバックグラウンドを提供した。このシステムを用いて、およそ2000個の公知低分子のライブラリー由来の化合物(下記の実験手順参照)をスクリーニングし、処理後14〜21日以内にALPが強陽性であるESCコロニーの出現を誘導した際にヒットとして特定した。このイメージに基づく方法は、同種のレポーターに基づくアッセイ法と比較するとリプログラミングのより正確な評価を提供した。BIXは、高いALP発現を有する1〜2個より多い緻密なESC様コロニーの再現性のある誘導に最も強い効果を有すると見受けられた。本発明者らは、MEFをOKウイルス導入後にBIXで処理した際に、強いALP発現を有する緻密なコロニーをおよそ14〜21日以内に容易に検出できることを観察した。これらの細胞はまた、Nanog、Oct4、およびSSEA-1発現について陽性であった。3種類の不可欠なリプログラミング遺伝子のいずれをも内因性に発現していないより一般的な細胞タイプを用いて得られた本結果は、BIXが強いリプログラミング誘導活性を有し、G9a HMTaseがリプログラミングを促進することができる(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008))という本発明者らの以前の観察をさらに確証する。しかしながら、OKを導入し、かつBIXで処理したMEFにおけるリプログラミング効率は、MEFの4因子で誘導されるリプログラミングまたはOK/BIX NPCリプログラミングと比較すると依然として低く、約2コロニー/3.5×104細胞であった(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008))。そのため、本発明者らは、同様の手順であるが、OKウイルス導入後にBIXを基本培地に添加した手順を用いて2回目のスクリーニングを実施した。これは、さらにリプログラミング効率を改善できる新たな低分子を特定するためのより許容的なプラットホームを提供した。より重要なことに、この2回目のスクリーニングは、より特異的な様式において、例えば、ヒストンまたはDNA修飾酵素よりもむしろシグナル伝達経路に作用することによってリプログラミングに影響を与える低分子の発見を促進することができた。この2回目のスクリーニングにおいて、本発明者らは再びおよそ2000個の公知低分子のライブラリー(実験手順参照)を検定し、スクリーニングの基準に基づいてリプログラミングを改善するようにBIXと相乗的な様式において作用することができる2個の化合物を確認した。1つの例はDNAメチルトランスフェラーゼ(DMNT)インヒビターであるRG108であり(Brueckner, B. et al., Cancer Res, 65:6305-6311 (2005))、BIXの存在下でOKを導入したMEFのリプログラミングを増強した(図3)。しかしながら、BIXと同様にRG108は一般的なエピジェネティックレベルで細胞に影響を与えることが公知であり、別のDNAメチルトランスフェラーゼインヒビターである5-アザシチジンがリプログラミングを増強することが既に示されている(Mikkelsen, T. S. et al., Nature, 454:49-55 (2008))。従って、RG108は本研究のためにはさらに追求しなかった。その代わりに、本発明者らは、2回目のスクリーニングにおいて特定されたもう1つの低分子であるL-カルシウムチャンネルアゴニストのBayKに、表現型および機能的特徴決定を集中させた。公知のDNA/ヒストン修飾因子の他にスクリーニングにおいて最も強い効果を示した本低分子をさらに研究した。なぜなら、BIXの非存在下においてはOKを導入したMEFに対して観察可能なリプログラミング活性を有さず、およびエピジェネティックレベルで細胞に直接影響を与えずにむしろ細胞シグナル伝達レベルで影響を与えることが公知であるためである。従って、BayKはリプログラミング過程においてより特異的な役割を果たす可能性がある。129MEFに空のレトロウイルス(陰性対照)を導入した際には;コロニーは観察されなかった。129MEFに低分子無しでOKを導入した際には;弱いALP発現を有する少しの小さな平坦なコロニーしか存在しなかった。129MEFにOKを導入し、およびBIX/BayKで処理した14〜21日後にはESC様iPSCコロニーが観察され;これらのESC様コロニーは強いALP発現を示した。OKを導入したMEFをBayKとの組み合わせでBIXで処理した際には、BIX単独で処理したOKを導入したMEF(〜2コロニー)と比較して、mESCの形態に酷似しているALP+コロニーの数において有意な増加を観察することができた(〜7コロニー)。これらの初代iPSCコロニーのさらなる特徴決定により、免疫蛍光法によって測定すると、Oct4、Sox2、Nanog、およびSSEA1などの典型的な多能性マーカーが陽性であることが示された。
OK導入およびBIX/BayK処理がMEFがiPSCになるように誘導できることをさらに確認し、および特徴決定するために、本発明者らはOct4-GFPレポーターを含むOG2+/-/ROSA26+/-(OG2)トランスジェニックマウス由来の初代MEFを使用した(Do, J.T. and Scholer, H.R., Stem Cells, 22:941-949 (2004))。これらの細胞は一度リプログラミングされると、次にキメラおよび生殖系列適格性を便利に評価するのに使用することができる。129 MEFと同様に、OKを導入したOG2 MEFはBayK/BIXの組み合わせで処理した際にiPSCを作製することができた(OK2B iPSC)(図3)。GFP+ iPSCコロニーはウイルス導入および化合物処理後14〜21日に最初に検出することができた。OG2 MEFにOKを導入していかなる化合物でも処理しなかった際には、3.5×104細胞あたり平均0.5±0.7コロニーの少しの小さなコロニーのみが出現した。これらのコロニーは継代することが難しく、そのためそれ以上は研究しなかった。OKを導入したOG2 MEFのBIX単独での処理は、3.5×104細胞あたり2.5±0.7コロニーと、OK単独と比較して容易にかつ再現的にリプログラミングを可能にした。OKを導入したOG2 MEFをBIX(2μM)およびBayK(2μM)の組み合わせで処理した際にはリプログラミング効率においてさらに有意な改善があり、本発明者らは3.5×104細胞あたり7.7±1.5コロニーを観察した(図3)。OKを導入したOG2 MEFのBIXの非存在下におけるBayK単独での処理は、上記のOKを導入したMEF対照のリプログラミング効率を増加させなかった(データは示していない)。
OK2B iPSCは懸濁液において胚様体(EB)を効率的に形成することができ、胚様体は3つの一次胚葉の派生物である内胚葉細胞(アルブミンおよびPdx1)、中胚葉細胞/心筋細胞(CT3)および外胚葉細胞/ニューロン(βIII-チューブリン、Tuj1)に分化することができた。加えて、OK2B iPSCは、8細胞胚との凝集に続いて胚盤胞の内部細胞塊中に効率的に組み込まれ、凝集した胚を偽妊娠マウスに移植した後にインビボで生殖系列貢献を伴うキメリズムをもたらすことができた。さらに、これらの胚盤胞から得られた1匹の成体雄の子孫を雌のCD1野生型マウスと交配させるとLacZ+子孫の産生をもたらし、そのうち3匹はこれらのiPSCが生殖系列伝達に貢献できたことをさらに確証するOct4-GFP+生殖腺を示した。これらのインビトロおよびインビボの特徴決定により、2種類の遺伝子OKのみのレトロウイルス導入、およびBIX/BayK処理との組み合わせが、表現型および機能的に古典的なmESCと同様であるiPSCにMEFをリプログラミングするのに十分であることが確認された。
本明細書において示されている研究は、ある特定のTFのウイルス導入に機能的に代替し、およびMEFのような一般的な細胞のタイプからiPSCを作製する際にリプログラミング効率を改善するための合理的に設計された表現型スクリーニングから低分子が特定され得るという、原理証明の実証を提供する。標的/過程のより正確および時間的な制御を提供する、iPSCの作製のためのそのような化学的手法は、有害な検出しがたい挿入性のゲノム変化も導入する可能性がある癌遺伝子での遺伝子操作に優って有利であると考えられる。同様の戦略が、完全に化学的に画定された条件において系列が制限された細胞の多能性または多分化能状態へのリプログラミングを最終的に可能にし得る追加的な低分子を見出すために使用されている。BIXは当初はG9a HMTaseの特異的インヒビターとして特定され、特徴決定された(Kubicek, S. et a., Mol Cell, 25:473-481 (2007))。G9a標的遺伝子でH3K9me2レベルを減少させることが示されている(Feldman, N. et al., Nat Cell Biol, 8:188-194 (2006))。興味深いことに、G9aにより媒介されるヒストンH3K9メチル化およびヘテロクロマチン化は、Oct4およびRex1などの胚性遺伝子のエピジェネティックサイレンシングのための高度に特異的な機構に相当する(Feldman, N. et al., Nat Cell Biol, 8:188-194 (2006))。さらに、G9aのノックダウンは成体神経細胞の融合に基づくリプログラミングを補助できることも証明された(Ma, D.K. et al., Stem Cells, 26:2131-2141 (2008))。そのため、BIXがOKまたはKlf4/Sox2/c-Mycのいずれかを導入したNPCからのiPSCの作製を促進でき(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008))、Sox2またはOct4の内因性発現を補償できると示唆することを本発明者らが以前に観察したのは適切である。しかしながら、NPCは既に有意なレベルのSox2を発現しており、これらの細胞を上述した条件においてリプログラミングにより感受性にさせた可能性がある。本研究は、リプログラミングに必要であると考えられるTFのいずれをも発現していないMEFのリプログラミングを可能にできる低分子を特定することを目標にした。本発明者らがNPCおよびMEF両方のスクリーニングにおいてBIXを特定したのは思いがけないことであり、本分子が体細胞からのiPSCの作製を可能にし、および改善する役割を有することをさらに確認する。BIXの特徴決定された作用機構を考慮すると、本発明者らの研究は、薬理学的阻害を介した機能喪失が、不可欠なiPSCリプログラミング遺伝子の機能獲得を補償するのに十分である分子標的を潜在的に特定した。それはさらに、特異的なエピジェネティック過程であるG9a媒介H3K9me2の阻害をiPSC作製に機構的に結びつける。BIXは、多能性遺伝子のサイレンシングされた状態から活動的な転写状態へのエピジェネティックバランスの移行を促進するように機能する可能性がある。明らかに、RG108などの異なる標的および作用機構を有する他のクロマチン修飾低分子とのBIXの組み合わせを、よりよいリプログラミングのために活用することができた。他方で、特異的なL型カルシウムチャンネルアゴニストとして特徴決定された活性を有するBayK(Schramm, M. et al., Nature, 303:535-537 (1983))がリプログラミング効率を改善するという本発明者らの観察は興味深い。L型カルシウムチャンネルは血圧調節、平滑筋収縮、インシュリン分泌、心臓発生などのような様々な組織における細胞内過程を媒介することが公知である(Tosti, E., Reprod Biol Endocrinol, 4:26(2006))。さらに、BayKを含む様々なアゴニストによるL型カルシウムチャンネルの活性化は、CREB活性化、筋小胞体Ca2+の放出、およびcAMP活性における変化によって細胞内シグナルを誘導することが示されている。より重要なことに、いくつかの報告は、mES細胞の増殖の制御においてカルシウムが役割を果たす可能性があることを示唆している(Heo, J.S. et al., Am J Physiol Cell Physiol, 290:C123-133 (2006))。しかしながら、本発明者らの手においては、2μM BayK単独または1μM BIXとの組み合わせでのmES細胞の処理は、増殖における変化をもたらさない(図5)。さらに、2μM BayK単独または1μM BIXとの組み合わせでのOG2 MEFの処理は、SOX2発現を誘導しない(図6)。言うまでもなく、BayKがリプログラミング過程に影響を与える正確な機構を吟味するにはより多くの仕事が行われる必要がある。しかしながら、以前にはリプログラミングに関連付けられていなかったシグナル経路において活性を有する低分子が有意にその効率を増強できることを見出すのは興味深い。これまでのところ、それは、クロマチン修飾因子に直接作用することなくリプログラミングへの影響を示す、Wnt3タンパク質(Marson, A. et al., Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008))とは別のタイプの最初の低分子である。なぜなら、最新では、リプログラミングに影響を与えることが見出された他の低分子のほとんどが細胞のエピジェネティック状態を直接修飾すると見受けられるからである:すなわち、BIX(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008))、バルプロ酸(Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol, 26:795-797 (2008))、および5'アザシチジン(Mikkelsen, T.S. et al., Nature, 454:49-55 (2008))。重要なことに、BayKはインビボでのリプログラミングおよび/または再生に治療的に関連する分子にとって最終的に望ましいと考えられるいくつかの重要な特徴を有するように見受けられる。それだけでは作用/リプログラミングしないが、その効果を発揮するためにBIXの存在を必要とする事実は、おそらく損傷により引き起こされてリプログラミングの形式を既に経験している細胞がその効果により感受性である可能性があることを示唆する。このことは、直接のエピジェネティック修飾因子がそうであるように、全身性に健常細胞に影響を与えることなくより特異的な様式において標的細胞を最終的にリプログラミングすることを許容し得る。
MEFの由来
129S2/SvPasCrlfまたはROSA26+/-/OG2+/-MEFは、WiCell Research Instituteのウェブサイト:「Introduction to human embryonic stem cell culture methods.」に報告されている手順に従って得られた。動物実験は、Max Planck Institute for Biomolecular Research, GermanyのAnimal Protection Guidelinesに従って行った。
マウスOct4、Klf4、c-Myc、およびSox2についてのpMXベースのレトロウイルスベクターはAddgene(Cambridge, MA)より入手した。ウイルス産生および導入過程は記載されているように行った(Takahashi, K. et al., Cell, 131:861-872 (2007))。化合物BIX-01294の合成および完全な特徴決定は、以前に記載された通りであり(Kubicek, S. et al., Mol Cell, 25:473-481 (2007))、Bayk8644はEMD/Calbiochem Biochemical (San Diego, CA)から購入した。
1次および2次スクリーニングのために、公知化合物のコレクションを使用した。本コレクションは、FDAにより認可された薬物、特徴決定された酵素の公知のインヒビターおよびアクチベーターを含む、市販されているおよそ2000個の公知生理活性分子から構成されていた(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)由来のLOPACコレクション、BIOMOL (Plymouth Meeting, PA)由来のKnown Bioactive Library、およびEMD Calbiochem (San Diego, CA)由来の非重複公知化合物を含む)。
ALP染色は、Alkaline Phosphatase Detection Kit(Millipore)を用いて製造業者の指示に従って行った。免疫蛍光アッセイ法のために、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で15分、室温(RT)で固定し、PBSで洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液(BB)[PBS(Invitrogen)において0.3% Triton X-100(Sigma-Aldrich)、10%正常ロバ血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)]中で30分、RTでインキュベーションした。次に、1次抗体と一晩4℃でBB中でインキュベーションした。その後、細胞をPBSで洗浄し、2次抗体とBB中で45〜60分間RTでインキュベーションした。1次抗体は以下であった;マウス抗Oct4(1:200)(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)、マウス抗SSEA1(1:200)(Santa Cruz Biotechnology Inc.)、ウサギ抗Nanog(1:500)(Abcam Inc., Cambridge, MA)、マウス抗Sox2(1:200)(Millipore)、ウサギ抗Pdx1(1:200)(C.Wright博士からの親切な贈り物)、マウス抗βIII-チューブリン(Tuj1)(1:500)(Covance Research Products Inc., Denver, PA)、マウス抗心筋トロポニンT(CT3)(1:200)(Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa, Iowa City, IA)、ウサギ抗アルブミン(DAKO)。2次抗体はAlexa Fluor555ロバ抗マウスまたはウサギIgG(1:500)(Invitrogen)であった。核をDAPI(Sigma-Aldrich)染色により検出した。画像を測光CoolSnap HQ2 カメラを有するNikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO顕微鏡を用いて捕捉した。
RNeasy Plus Mini KitをQIAshredderと組み合わせて用いて、iPSCおよび対照細胞株からRNAを抽出した。iScript(商標)cDNA Synthesis Kit(BioRad, Hercules, CA)を用いてRNAをcDNAに変換した。特異的遺伝子の増幅は、以前に発表されたプライマー(Takahashi, K. et al., Cell, 131:861-872 (2007);Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126:663-676 (2006))およびPlatinum PCR SuperMix(Invitrogen)を用いてMastercycler ep gradient PCR machine(Eppendorf)上で行った。
Non Organic DNA Isolation Kit(Millipore)を用いてR1、OG2 MEF、およびOK iPSC(10継代)細胞からDNAを単離した。次に、バイサルファイト塩基配列決定のためにDNAをEZ DNA Methylation-Gold Kit(商標)(Zymo Research Corp., Orange, CA)で処理した。次に、処理したDNAを関心対象の配列を増幅するために用いた。プロモーター断片増幅のために使用したプライマーは以前に発表された通りであった(Blelloch, R. et al., Stem Cells, 24:2007-2013 (2006))。結果として生じた断片をTOPO TA cloning Kit for sequencing(Invitrogen)を用いてクローン化し、塩基配列決定を行った。
凝集体キメラを得るために、iPCを露出されたコンパクション後の8細胞期胚と凝集させた。8細胞胚(B6C3F1)を2.5 dpcで雌から流し出して、ミネラルオイルの下でKSOM培地(10% FCS)の微小滴において培養した。短時間のトリプシン処理後のiPSCの塊(10〜20細胞)を選択し、透明帯除去8細胞胚を含む微小滴中に移した。iPSCと凝集した8細胞胚を一晩、37℃、5%CO2で培養した。8細胞期から発生した凝集した胚盤胞を2.5 dpcの偽妊娠レシピエントの1つの子宮角中に移植した。1匹の成体雄キメラを雌のCD1野生型マウスと交配させた。X-gal染色により、キメラマウスおよび野生型マウスのこの自然交配から得られた6個のF1胚が生殖系列伝達により作製されたことが示された。
棒グラフおよび統計解析は、Excelにおける標準的なt検定を用いて行った。
OK2B iPSCを完全なmES細胞培地においてゼラチン(Millipore, Temecula, CA)上で2日間増殖させた[Knockout DMEM、10% ESに適したFBS、10% Knockout serum replacement、1% Glutamax、1% Non-essential amino acids、ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1 mMβ-メルカプトエタノール、1% EmbryoMax ESC Qualified Nucleosides(Millipore)、および103 U/ml LIF(Millipore)](言及している以外、すべての製品はInvitrogen, Carlsbad, CA由来である)。次に、RNAeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて2通りのウェルからのRNAを単離した。MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit(Ambion, Austin, TX)を用いて、全RNA試料を増幅し、かつ標識した。次に、増幅して標識した試料をMouse Genome 430 2.0 Arrays(Affymetrix)にハイブリダイズさせ、GenePattern(ワールドワイドウェブ:broad.mit.edu/cancer/software/)を使用した階層的クラスタリング(ピアソン、対数変換(log-transformed)、列中心(row-centered)値)を用いて解析を行った。
mES R1細胞をゼラチンでコーティングした6ウェルプレート上に2×105細胞/ウェルの密度で完全なmES細胞培地においてプレーティングした。細胞接着と同時、およそ12時間で、DMSO、1μM BIX、2μM BayK、および両方の組み合わせのいずれかで、細胞を3連で処理した。15、24、および48時間で、細胞をトリプシンを用いて剥離させ、血球計算板を用いて計数した。トリパンブルー(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)を死細胞除去のために使用した。
OG2+/-/ROSA26+/- MEFを6ウェルプレート上にウェルあたり3.4×104細胞の密度でプレーティングした。次の日に、DMSO、1μM BIX、2μM BayK、および両方の組み合わせで、細胞を3連で6日間処理した。培地を3日目に新しくした。次に、RNAeasy Mini Kit(Quiagen)を用いて各ウェルからのRNAを単離した。RNAの逆転写をiScript(商標)cDNA Synthesis Kit(BioRad, Hercules, CA)を用いて行った。内因性Sox2の増幅は以前に発表されたプライマー(Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc 2, 3081-3089;Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676)をPlatinum PCR SuperMix(Invitrogen)と共に用いて、Mastercycler(登録商標)ep gradient PCR machine(Eppendorf)において行った。
本実施例は、哺乳動物細胞の転写因子タンパク質とのインキュベーションが多能性を誘導するのに十分であることを証明する。
大腸菌(E.coli)において高レベルのタンパク質発現を得るために、4種類すべてのヒトTF遺伝子のコドン領域を最初に最適化し(G A Gutman and G W Hatfield (1989). PNAS. vol. 86.pp:3699-3703)、DNAオリゴベース/PCR遺伝子構築技術(Danilo R Casimiro, Peter E WrightおよびH Jane Dyson. (1997). Structure. Vol.5. pp: 1407- 1412.)を用いて全長を合成した。ポリアルギニンタグ:
を設計において各タンパク質のC末端に付加した(Gump JM, Dowdy SF. (2007) Trends Mol Med. 2007 Oct;13(10):443-8)。最終的なDNA断片にNdeIおよびXhoI部位を隣接させ、タンパク質発現のためにpET41発現ベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。各プラスミドをDNA配列で検証し、次に組み換えタンパク質生産のために自己誘導培地を用いて一晩、BL21出発のコンピテントセルを形質転換した(Studier FW, (2005) Protein Expr Purif. 41(1). Pp: 207-234.)。
大腸菌(Escherichia coli)BL21(DE3)細胞をpET-Oct4-PTD(「PTD」はタンパク質導入ドメインを指す)、pET-Soc2-PTD、pET-Klf4-PTD、およびpET-c-Myc-PTDで別々に形質転換し、自己誘導法を用いてタンパク質発現を行った(Studier F.W., Protein Expression and Purification, 41 (2005) 207-234.)。記載されているように、封入体を可溶化してタンパク質をリフォールディングした(LaFevre BM, Wu S.およびLin X. Molecular Cancer Therapeutics 7, 1420-1429, June 1, 2008. doi: 10.1158/1535-7163;Medynski D., Tuan M., Liu, W., Wu, S.およびLin, X. Protein Expression and Purification Vol. 52, 395-402, April 2007;Hou W., Medynski D., Wu, S., Lin, X.およびLi, LY. Clinical Cancer Research Vol. 11, 5595-5602, August 1, 2005)。
Claims (18)
- 細胞療法のための治療的組成物を作製する方法であって、
(a)
(i) Octポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Klfポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびSoxポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む1つまたは複数の発現カセット;または
(ii) 外因性Octポリペプチド、外因性Soxポリペプチド、および外因性Klfポリペプチド
を体細胞、前駆細胞、または哺乳動物非多能性幹細胞に導入する工程;
(b) 該体細胞、前駆細胞、または哺乳動物非多能性幹細胞と、GSK3インヒビター、MEKインヒビター、およびTGFβ受容体/ALK5インヒビターを接触させる工程;ならびに
(c) 工程(a)および(b)から得られた該細胞を望む細胞タイプに分化させる工程
を含み、
該治療的組成物が、工程(c) から得られた該細胞を含む、
方法。 - OctポリペプチドがOct4である、請求項1記載の方法。
- KlfポリペプチドがKlf4である、請求項1記載の方法。
- SoxポリペプチドがSox2である、請求項1記載の方法。
- 体細胞、前駆細胞、または哺乳動物非多能性幹細胞が、ヒト細胞である、請求項1記載の方法。
- 体細胞が線維芽細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 前駆細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 前駆細胞が神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、請求項7記載の方法。
- TGFβ受容体/ALK5インヒビターがSB431542およびA-83-01からなる群から選択され、
GSK3インヒビターがCHIR99021を含み、MEKインヒビターがPD0325901を含む、請求項1記載の方法。 - 細胞療法のための治療的組成物の製造のための混合物の使用であって、
該混合物が、
(a) 体細胞、前駆細胞、または非多能性幹細胞、ならびに
(b) GSK3インヒビター、MEKインヒビター、およびTGFβ受容体/ALK5インヒビター
を含み、
該体細胞、前駆細胞、または非多能性幹細胞が、
(i) Octポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Klfポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびSoxポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む1つまたは複数の発現カセット;または
(ii) 外因性Octポリペプチド、外因性Soxポリペプチド、および外因性Klfポリペプチド
を含む、
使用。 - OctポリペプチドがOct4である、請求項10記載の使用。
- KlfポリペプチドがKlf4である、請求項10記載の使用。
- SoxポリペプチドがSox2である、請求項10記載の使用。
- 体細胞、前駆細胞、または非多能性幹細胞が、ヒト細胞である、請求項10記載の使用。
- 体細胞が線維芽細胞を含む、請求項10記載の使用。
- 前駆細胞を含む、請求項10記載の使用。
- 前駆細胞が神経前駆細胞、皮膚前駆細胞、または毛包前駆細胞である、請求項16記載の使用。
- TGFβ受容体/ALK5インヒビターがSB431542およびA-83-01からなる群から選択され、
GSK3インヒビターがCHIR99021を含み、MEKインヒビターがPD0325901を含む、請求項10記載の使用。
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