CN103384680A - 细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及分离的层粘连蛋白-521、制备重组层粘连蛋白-521的方法、表达重组层粘连蛋白-521的宿主细胞、以及包含层粘连蛋白-521的组合物。层粘连蛋白-521能够保持干细胞在体外的多能性，允许自我更新，并使人胚胎干细胞能够单细胞存活。在被重组层粘连蛋白-521（层粘连蛋白-11）包被的平板中，当在分化抑制因子或饲养细胞不存在的条件下培养多能人胚胎干细胞时，胚胎干细胞增殖并保持它们的多能性。还发现人重组层粘连蛋白-521（层粘连蛋白-11）使得干细胞在完全解离为单细胞悬液后能够单细胞存活。本文还公开了有用的细胞培养基，其包含至多3.9ng/ml的β成纤维细胞生长因子（bFGF）。

Description

细胞培养基
背景
本申请要求于2010年12月17日提交的美国临时专利申请序列No.61/424,273、于2011年5月20日提交的美国临时专利申请序列No.61/488,353、于2011年9月9日提交的美国临时专利申请序列No.61/533,063、于2011年9月22日提交的美国临时专利申请序列No.61/537,940、于2011年11月30日提交的美国临时专利申请序列No.61/565,380、以及于2011年12月1日提交的美国临时专利申请序列No.61/565,849的优先权。这些临时申请的全部内容通过引用方式并入本文。
本发明涉及细胞生物学、细胞分化、细胞治疗、分子生物学、蛋白质、人重组蛋白、核酸和层粘连蛋白。
基底层（基底膜）为片状、与细胞相连的细胞外基质，其在细胞生长、细胞分化、细胞表型维持、组织发育和组织维持中起到核心作用。它们实际上存在于所有组织中，并且出现在胚胎发育的最早期阶段。
基底层对各种构建功能和细胞间相互作用功能而言是重要的。例如：
1.它们作为组织的构建支持体，为细胞提供粘附基质。
2.它们在阻碍细胞迁移的组织隔室之间建立选择通透性屏障，并且被动调节大分子的交换。以肾小球基底膜作为例子来描述这些功能，肾小球基底膜起到重要的过滤结构的作用，其建立了有效的血-组织屏障，使得大多数蛋白质和细胞不能透过。
3.基底层建立了高度的相互作用表面，其能够在胚胎发育和创伤修复过程中促进细胞迁移和细胞铺展。在受伤后，它们提供了细胞依靠其再生以恢复正常组织功能的表面。
4.基底层将其结构中所编码的信息呈递给与其接触的、对细胞分化、细胞凋亡抑制和组织维持重要的细胞。该信息通过各种受体而传递给细胞，所述受体包括整联蛋白、肌营养不良蛋白聚糖和细胞表面蛋白聚糖。传递信号不仅依赖于基质配体和相应的受体（该基质配体和受体以足够的亲和力而相互作用）的存在，还依赖于地形因素，如三维基质“景观”中的配体密度，以及依赖于基底层组分聚集受体的能力。由于这些基质蛋白的寿命长，因此，基底层在基底层中为居住性（resident）细胞和暂留性（transient）细胞建立了“表面记忆”。
基底层主要由层粘连蛋白和IV型胶原异三聚体构成，这些组分组织成复杂的聚合结构。其它组分包括诸如凝集素和基底膜蛋白聚糖等蛋白聚糖和巢蛋白（触觉蛋白）。目前，已经确认了六种类型的IV型胶原多肽链和至少12种层粘连蛋白亚基链。这些链具有共同的和独特的功能，并且按特定的时间（发育）和空间（组织位点特异性）模式表达。
层粘连蛋白为主要存在于基底层中的异源三聚体糖蛋白家族。它们通过一侧与相邻的细胞受体进行结合而相互作用，并且与其他层粘连蛋白分子或其它基质蛋白（如胶原、巢蛋白、或蛋白聚糖）结合而发挥作用。层粘连蛋白分子也是重要的信号分子，其能够强烈地影响细胞的行为和功能。层粘连蛋白对于维持细胞/组织表型，以及在组织修复和发育中促进细胞生长和分化是重要的。
层粘连蛋白是大的多结构域蛋白，其具有常见的结构组织。层粘连蛋白分子在一个分子中集合了不同的基质和细胞相互作用的功能。
层粘连蛋白蛋白分子包含一个α链亚基、一个β链亚基和一个γ链亚基，这些亚基通过卷曲螺旋结构域结合在一起成为三聚体。图1示出了所得到的层粘连蛋白分子的结构。在天然的组织中，12种已知的层粘连蛋白亚基链能够形成至少15种三聚体层粘连蛋白类型。三聚体层粘连蛋白结构中具有对其它层粘连蛋白和基底层分子以及膜结合受体有结合活性的可识别结构域。图2分别示出了3种层粘连蛋白链亚基。例如，VI、IVb和IVa结构域形成球状结构，V、IIIb和IlIa结构域（其含有富含半胱氨酸的类EGF元件）形成棒状结构。三种链的I和II结构域参与形成三股卷曲螺旋结构（长臂）。
已经发现存在于人组织中的五种不同的α链、三种β链和三种γ链具有至少15种不同的组合。基于它们的发现历史，这些分子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，然而另一种命名法则是根据它们的链的组成来描述这些同种型，例如层粘连蛋白-111（层粘连蛋白-1），其包含α-1链、β-1链和γ-1链。已经确认了层粘连蛋白的四种结构确定的家族组。第一组的5种确认的层粘连蛋白分子均具有β1链和γ1链，它们的α-链组成（α1至α5链）有所不同。第二组的5种确认的层粘连蛋白分子（包括层粘连蛋白-521）均具有β2链和γ1链，它们的α-链组成也有所不同。第三组确认的层粘连蛋白分子具有一个确认的成员（层粘连蛋白-332），其链组成为α3β3γ2。第四组确认的层粘连蛋白分子具有一个确认的成员（层粘连蛋白-213），其具有新鉴定的γ3链（α2β1γ3）。
尚没有对分离的层粘连蛋白-521的报道，其不含有其它层粘连蛋白链。到目前为止，对层粘连蛋白-521的功能尚没有研究。利用层粘连蛋白链抗体通过亲和层析法从细胞源中纯化层粘连蛋白-521的尝试在去除（例如）层粘连蛋白β1链（其为层粘连蛋白-411和层粘连蛋白-511的成分）方面并不成功。提供含有层粘连蛋白-521（aka LN-521）的组合物和制备层粘连蛋白-521的方法是人们所希望的。
人胚胎干细胞（hES）为针对各种疾病（如脊髓和心脏损伤、I型糖尿病和诸如帕金森病等神经退行性疾病）的再生医学的发展带来了希望。干细胞是一种未分化的细胞，随后由该细胞衍生出特化细胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力，并且具有有分化成所有三种胚层的细胞的潜能的多能性。它们可用于治疗的目的，并且可为组织替代治疗、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源
用于再生医学的由干细胞衍生的细胞的发育的前提条件包括：有一种能够长期培养多能干细胞的方法、一个化学成分确定且可重复的分化流程、以及一种不含异源物的细胞培养系统。然而，在多能人胚胎干细胞（hES细胞）和诱导的多能干细胞（hiPS细胞）的培养方面遇到了很多问题。一个主要的问题在于hES细胞缓慢地成簇生长，这需要人工分离以进行细胞增殖。细胞的解离通常导致大量细胞死亡，完全解离后，hES细胞的克隆效率≤1%。
多能hES细胞的维持需要复合培养基质（例如细胞外基质蛋白混合物，如鼠肿瘤来源的Matrigel或成纤维细胞饲养细胞层），其可能具有免疫原性和毒性，并且会产生大的批间差异从而降低实验的可靠性。到目前为止，用于hES细胞培养的最成功的不含饲养细胞的基质为Matrigel，其为得自鼠Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肉瘤肿瘤组织的肿瘤和BM类提取物复合物。Matrigel主要包含鼠LN-111、IV型胶原、基底膜蛋白聚糖和巢蛋白，但也含有不同量的其它物质，包括生长因子和细胞蛋白，因此其组成不确定并且批次间是不同的。这种差异会导致科学结果的不可再现性，并且由于基质是来源于动物的，使得Matrigel不能用于人类细胞治疗用hES细胞的扩增和维持。
然而，近来已经报道成功研发了能够支持hES和hiPS细胞自我更新的大致确定的包被材料。已经报道了重组玻连蛋白可支持hES细胞的粘附和自我更新。还研发出了包含来自于各种ECM蛋白的各种多肽的丙烯酸酯包被物，并且已经表明合成的甲基丙烯酸酯类聚合物也有利于hES细胞的粘附和自我更新。
hES细胞大规模繁殖的主要问题之一在于它们在解离为单细胞悬液后再接种的存活能力差。因此，这使得多次传代以及大规模自动化扩增变得不可能。然而，在rho-激酶（ROCK）抑制剂10或细胞收缩抑制剂（blebbistatin）11的存在下使用胰蛋白酶进行处理而释放到单细胞悬液中的hES细胞能够被接种并由单克隆进行扩增，但是所述分子不是天然干细胞小生境（niche）的组分，并且它们会影响肌动蛋白细胞骨架，因此能够导致细胞的破坏。因此，对于用于细胞治疗目的hES细胞的长期扩增而言，使用ROCK抑制剂可能不是优选的方案。
为了再生医学的目的，希望开发出这样的方法，在化学成分确定、不含异源物、不含病原体并且批次间稳定的条件下，其使得多能干细胞能够衍生和长期培养。此外，这样的方法应当允许快速且经济有效的扩大培养，从而在短期内获得大量的多能hES/hiPS细胞。优选的是，这些方法还应当允许人ES细胞在不含合成的细胞凋亡抑制剂的培养基中克隆存活，这将有利于涉及细胞分选或细胞内基因敲除的科学应用和临床应用。
发明内容
本公开提供了分离的层粘连蛋白-521（还称为LN-521或层粘连蛋白-11）以及制备分离的层粘连蛋白-521的方法。在进一步的方面，本公开提供了表达层粘连蛋白-521链并分泌重组层粘连蛋白-521的重组宿主细胞。
在其它方面，本公开提供了GMP品质的层粘连蛋白-521，其用于培养为了使细胞发育以进行人细胞治疗的目的而分化和维持的细胞。本公开还提供了药物组合物，其包含分离的层粘连蛋白-521以及可药用的载体。所述药物组合物可任选地与其它细胞外基质组分一起提供。
本公开还提供了有效地产生一定量的用于各种应用的分离的层粘连蛋白-521的方法。在这些用途的优选实施方案中，使用了重组层粘连蛋白-521。还公开了试剂盒，其包含一定量的能有效达到所需效果的分离的层粘连蛋白-521、或其药物组合物，以及使用它们的说明书。
本公开还提供了用于以单层培养物方式（有利于细胞同质性）培养干细胞的方法、在单细胞悬液中从细胞培养平板或其它细胞支持物上移除干细胞的方法、以及在单细胞悬液中重新接种干细胞以在显著稀释条件下进行传代和扩增从而使得干细胞培养物扩增并大规模生产该细胞的方法。
在进一步的方面，本公开描述了以单层培养方式在层粘连蛋白-521上培养多能干细胞，在单细胞悬液中从细胞培养平板以及其它细胞支持材料上移除干细胞，并且将来自于单细胞悬液中的干细胞以单层细胞的方式接种在含有层粘连蛋白-521的基质上，以使得该工艺可以用自动化机器人系统高效进行。
在进一步的方面，本公开提供了改进的医疗器件和植入物，其中所述改进包括提供具有有效量的分离的层粘连蛋白-521的医疗器件和植入物。
在进一步的方面，本公开通过向细胞培养装置（用于细胞粘附和随后的细胞停留（stasis）、增殖、分化和/或迁移）提供有效量的分离的层粘连蛋白-521，提供了改进的细胞培养装置，以及制造改进的细胞培养装置的方法，以用于使培养中的细胞生长并保持表型。
在其它方面，本公开提供了用于在体外培养未分化状态的人胚胎干细胞并使其快速扩增的组合物（例如人重组层粘连蛋白-521）和方法。该方法包括将人胚胎干细胞进行单细胞解离，以及在不含任何Rho-相关激酶（ROCK）抑制剂（例如不含Y-27632）（参见文献“Watanabe et al.,Nature Biotechnology25,681-686(2007)”）的培养基中将它们接种在包被有层粘连蛋白-521的细胞培养皿上。与常规的人胚胎干细胞培养物相比，这种改进为人胚胎干细胞在多能状态下更快地扩增提供了可能性。
在进一步的方面，本公开提供了新材料，例如人重组层粘连蛋白-521，其使得人胚胎细胞在解离为单细胞悬液后能够存活。这种改进使人胚胎干细胞的克隆存活力增强，这可能有利于分离克隆（例如在基因操作之后）或获得同质且均匀的人胚胎干细胞群。
在一些实施方案中公开了分离的重组层粘连蛋白-521，该重组层粘连蛋白-521包含：α链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:1有至少80%一致性的多肽；β链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:2有至少70%一致性的多肽；以及γ链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:3有至少70%一致性的多肽；其中所述α链、β链和γ链装配成重组层粘连蛋白-521。
在进一步的实施方案中，所述α链多肽与所述多肽序列SEQ IDNO:1有至少90%的一致性。所述β链多肽也可以与所述多肽序列SEQID NO:2有至少90%的一致性。所述γ链多肽也可以与所述多肽序列SEQ ID NO:3有至少90%的一致性。
在其它实施方案中，所述α链具有SEQ ID NO:1所示的多肽序列。此外，所述β链可具有SEQ ID NO:2所示的多肽序列。更具体而言，所述γ链可具有SEQ ID NO:3所示的多肽序列。
β链多肽可具有与多肽序列SEQ ID NO:2至少80%的一致性。γ链多肽可具有与多肽序列SEQ ID NO:3至少80%的一致性。
在实施方案中还公开了药物组合物，其包含：a）权利要求1所述的分离的重组层粘连蛋白-521；和b）可药用的载体。
在实施方案中还公开了能使在体外生长的多能干细胞自我更新（self renewal）的组合物，其包含生长介质和覆盖在其上的包被物，所述包被物包含重组层粘连蛋白521（层粘连蛋白-11）。
所述组合物还可包含生长因子。
所述组合物可不含任何分化抑制剂。所述组合物还可不含任何饲养细胞。所述组合物还可不含任何分化诱导物。在一些实施方案中，所述组合物不含任何分化抑制剂、饲养细胞或分化诱导物。
在实施方案中还公开了在体外保持多能干细胞的多能性的方法，包括：提供基底，该基底包含生长介质和覆盖在其上的包被物，所述包被物包含重组层粘连蛋白521（层粘连蛋白-11）；使多能干细胞解离为单细胞悬液；以及将所述单细胞悬液中的多能干细胞接种在所述包被物上。
生长介质可包含一种生长因子或多种生长因子。示例性生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素生长因子。
有时，所述生长介质和所述包被物不含任何分化抑制剂。例如，不存在白血病抑制因子。
所述组合物可不含任何饲养细胞，例如小鼠成纤维细胞或人包皮成纤维细胞。所述组合物可不含任何分化诱导物，如头蛋白或角质形成细胞生长因子。在一些实施方案中，所述组合物不含任何分化抑制剂、饲养细胞或分化诱导物。
可以以单层将所述多能干细胞接种在层粘连蛋白-521包被物上。
所述多能干细胞可以以200个细胞/mm2或更低的密度接种在所述包被物上。可供选择的是，所述多能干细胞可以以200个细胞/mm2或更高的密度接种在所述包被物上。可供选择的是，可以以任意两个干细胞彼此不接触的方式将所述多能干细胞接种在所述包被物上。
实施方案中还公开了由以下方法制备的分离的层粘连蛋白-521，所述方法包括：提供表达重组层粘连蛋白-521的宿主细胞，其中所述重组层粘连蛋白-521包含：第一链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:1有至少80%一致性的多肽；第二链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:2有至少70%一致性的多肽；以及第三链，其包含与多肽序列SEQ ID NO:3有至少70%一致性的多肽；其中所述第一链、第二链和第三链装配成重组层粘连蛋白-521。在刺激所述重组层粘连蛋白-521链表达的条件下，使所述宿主细胞在细胞培养基中生长；使宿主细胞培养基通过柱，其中所述柱包含能与所述重组层粘连蛋白-521结合的化合物；洗涤所述柱以除去未结合的物质；以及从所述柱上将所述结合的重组层粘连蛋白-521洗脱下来。
在其它实施方案中描述了在体外保持多能干细胞的多能性的方法，包括：取得其上具有包被物的基底，所述包被物包含完整的层粘连蛋白；将多能干细胞和细胞培养基置于所述基底上；以及激活PI3-激酶/Akt通路。
所述完整的层粘连蛋白可为层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-511。在一些实施方案中，所述细胞培养基不含任何生长因子，如β成纤维细胞生长因子（bFGF）。所述包被物还可包含钙粘蛋白。所述多能干细胞可以以200个细胞/mm2或更低的密度接种在所述包被物上。
本公开还涉及可以用于保持干细胞处于多能状态的细胞培养基。在不同的实施方案中描述了为多能干细胞提供营养的细胞培养基，其包含大于0至3.9ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
所述细胞培养基可包含3.5ng/mL或更少的bFGF，包括0.5ng/mL至3.5ng/mL的bFGF。
所述细胞培养基还可包含至少一种无机盐、至少一种微量矿物质（trace mineral）、至少一种能量物质、至少一种脂类、至少一种氨基酸、至少一种维生素或至少一种附加生长因子。在特定的实施方案中，所述细胞培养基还包含至少一种无机盐、至少一种微量矿物质、至少一种能量物质、至少一种脂类、至少一种氨基酸和至少一种维生素。
所述细胞培养基可不含以下物质中的任意一者：(1)白蛋白，(2)胰岛素或胰岛素替代物，或(3)转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
所述细胞培养基还可包含白蛋白、胰岛素、氯化锂、GABA、TGFβ1、哌啶酸、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液和DMEM/F12溶液。
所述细胞培养基还可包含至少一种附加生长因子、至少一种微量矿物质和至少一种脂类。
还公开了一种保持多能干细胞的系统，包含：细胞培养基，其含有大于0至3.9ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；和为干细胞提供支持的基底。
所述基底可包含层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-511。所述基底还可包含钙粘蛋白。
下面将更详细地描述本公开的这些以及其它的非限定性特征。
附图说明
本专利或申请文件包括至少一幅带有颜色的图。在提出请求并支付必要费用后，官方将提供附有彩图的本专利或专利申请公开的副本。
下面是附图的简要说明，其目的在于说明本文所公开的示例性实施方案，而不是为了对其进行限制的目的。
图1为重组层粘连蛋白分子的旋转式投影电子显微镜照片。
图2示出了层粘连蛋白α、β和γ链的结构基序。N端、内部和C端的球状结构域用白色椭圆形表示。卷曲螺旋形成结构域（I和II）用白色长方形表示。棒状结构（V、IIIb和IlIa结构域）用灰色长方形表示。
图3示出了使用SDS-PAGE对人重组层粘连蛋白-521进行鉴定的结果。在非还原（标记为ox）和还原（标记为red）条件下进行重组层粘连蛋白-521的免疫印迹。将3-8%凝胶中的蛋白质转印至PVDF膜上，然后用抗层粘连蛋白α5（2F7）、β2（MAB2066）、β1（MAB1921）和γ1（H-19）的抗体进行染色。
图4和图5示出了对培养1天后粘附至包被有以下物质的培养皿中的人ES细胞的结晶紫染色结果，所述物质为Matrigel（Mg）、鼠层粘连蛋白-111（mLN111）、人重组-层粘连蛋白-511（r-层粘连蛋白-511或r-LN-511）、人重组-层粘连蛋白-521（r-层粘连蛋白-521或r-LN-521）、或r-层粘连蛋白-511和r-层粘连蛋白-521的混合物（mix）。在图4中，在不存在ROCK抑制剂的条件下培养所述细胞。在图5中，在存在ROCK抑制剂Y-27632的条件下培养所述细胞。
图6为示出在不存在ROCK抑制剂下培养1小时后，人ES细胞对包被有人r-层粘连蛋白-521（记为LN521）、人r-层粘连蛋白-511（LN511）和Matrigel（Mg）的培养皿的粘附的图。误差线示出了测量的标准误差（n=3）。
图7为示出在不存在ROCK抑制剂下培养1天后，人ES细胞对包被有Matrigel（Mg）、鼠层粘连蛋白-111（mLN111）、人r-层粘连蛋白-511（LN511）、人r-层粘连蛋白-521（LN521）、或r-层粘连蛋白-511和r-层粘连蛋白-521的混合物（mix）的培养皿的粘附的图。还包括在培养1天后，对具有ROCK抑制剂和Matrigel（In&Mg）、鼠层粘连蛋白-111（In&mLN111）、人r-层粘连蛋白-511（In&LN511）、人r-层粘连蛋白-521（In&LN521）、或r-层粘连蛋白-511和r-层粘连蛋白-521的混合物（In&mix）的培养皿的结果。对于这两个实验，将细胞以相同密度接种在相同的细胞培养皿上。误差线示出了测量的标准误差（n=3）。
图8示出采用单细胞解离传代的培养在r-层粘连蛋白-521（LN-521_1和LN-521_2）上的人ES细胞的生长曲线，以及采用小簇传代的培养在Matrigel（Mg_1和Mg_2）上的人ES细胞的生长曲线。后一种情况按照文献“Rodin et al.,Nature Biotechno l.,vol.28,pp.611-615(2010)”所述对细胞进行传代。
图9为在r-层粘连蛋白-521上进行几次单细胞解离传代后，检测人ES细胞的OCT4（多能性标志物）的FACS分析。阳性细胞的百分比列在括号中。
图10为在Matrigel上采用以分开的小簇的方式传代几次后，检测人ES细胞的OCT4的FACS分析。阳性细胞的百分比列在括号中。
图11示出了实时定量RT-PCR分析的结果，其用于比较培养在人r-层粘连蛋白-521（LN521）上的进行了几次单细胞解离传代后的人ES细胞中，以及培养在Matrigel上的进行了小簇传代几次后的细胞中的多能性标志物Oct4和Nanog的mRNA转录本的数目。误差线示出了95%置信区间。
图12为比较接种在Matrigel（Mg）、LN-111、LN-511和LN-521上，生长了1小时的干细胞中的磷酸化肌球蛋白轻链（P-MLC）的水平的蛋白质印迹（Western blot）图。
图13为比较接种在Matrigel（Mg）、LN-111、LN-511和LN-521上，生长了6小时的干细胞中的磷酸化肌球蛋白轻链（P-MLC）的水平的蛋白质印迹图。
图14为比较接种在Matrigel（Mg）、LN-111、LN-511和LN-521上，生长了5至7小时的人胚胎干细胞的相对迁移量的图。
图15为比较施加了IgG和IgM封闭抗体（IgGM）和施加了抗整联蛋白β1（b1）的功能性封闭抗体，生长在LN-521上的人胚胎干细胞的相对迁移量的图。这表明封闭整联蛋白极大地降低了运动性。
图16为比较在水、DMSO、LY294002（Akt抑制剂）、渥曼青霉素（PI3K/Akt抑制剂）和PD98059(MEK1抑制剂）的存在下，hES细胞在LN-521上的相对存活率的图。这表明PI3K/Akt的激活是hES细胞在LN-521上存活所必要的。培养基中包含bFGF。
图17为比较在DMSO、LY294002（Akt抑制剂）和PD98059(MEK1抑制剂）的存在下，hES细胞在LN-521上的相对存活率的图。不存在外源性bFGF。
图18为接种在LN-521上1小时后收集并用LY294002处理的细胞与对照细胞（DMSO）比较的蛋白质印迹。
图19为接种在LN-521上1小时后收集并用PD98059处理的细胞与对照细胞（DMSO）比较的蛋白质印迹。
图20为示出采用ELISA获得的，接种在Matrigel（Mg）、LN-111、LN-511或LN-521上1小时后收集的细胞的裂解物中的Akt2磷酸化的相对水平的图。
图21为示出采用ELISA获得的，接种在Matrigel（Mg）、LN-111、LN-511或LN-521上1小时后收集的细胞的裂解物中的Akt1磷酸化的相对水平的图。
图22为示出培养在低bFGF培养基（O3_3.9）中的HS181hES细胞相比于培养在较高bFGFF培养基（O3_100）中的HS181hES细胞的生长曲线的图。
图23为示出培养在低bFGF培养基（O3_3.9）中的HS181hES细胞相比于培养在较高bFGFF培养基（O3_100）中的HS181hES细胞中的两种多能性标志物（Oct4和Nanog）的RNA表达的相对水平的图。
图24为示出新的人胚胎干细胞系HS841在层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上的早期分化的照片。
具体实施方式
结合附图，可对本文所述的组合物和方法有更完整的理解。为了方便且易于理解本发明，这些图仅为示意性代表图，因此它们的意图不在于定义或限制示例性实施方案的范围。
尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语旨在仅用于表示被选择用来说明附图的实施方案的特定结构，并且不意味着定义或限制本公开的范围。在附图和下文中，应当理解相似的数字标记表示具有类似功能的组分。
本文所述所有的出版物、专利和专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
除非另有说明，本申请所用的技术可参见几个公知参考文献中的任何一篇，如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Sambrook etal.，1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press）、Gene ExpressionTechnology（Methods in Enzymology，Vol.185,edited by D.Goeddel,1991，Academic Press,San Diego,Calif.）、"Guide to ProteinPurification"in Methods in Enzymology（M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications（Innis et al.,1990.Academic Press,San Diego,Calif.）、Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,Second Ed.（R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,N.Y.）、Gene Transfer andExpression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray，The Humana PressInc.,Clifton,N.J.）、或者Ambion1998Catalog（Ambion,Austin,Tex.）。
本文所用的术语“分离的核酸序列”是指不含在该核酸所来自的有机体的基因组DNA中与该核酸为天然侧翼序列的基因序列（即，在该核酸所来自的有机体的基因组DNA中与该所分离的核酸分子的基因相邻的遗传序列）的核酸序列。然而，所述“分离的”序列可连接至与所述序列不为天然侧翼序列的其它核苷酸序列，例如异源启动子序列或其它载体序列。对所分离的核酸序列而言，不必认为其必须不含其它细胞物质才是“分离的”，因为本公开的核酸序列可以是用于转染宿主细胞的表达载体的一部分（见下文）。
本公开提供了重组表达载体，其包含人层粘连蛋白β2链的全长层粘连蛋白β2链核酸序列（SEQ ID NO:4）。在一些实施方案中，该表达载体含有由SEQ ID NO:4编码的核酸，其被有效连接（operativelylinked）至异源启动子（即，不是给定层粘连蛋白β2链的天然存在的启动子）上。当启动子能够启动层粘连蛋白β2链DNA表达为RNA时，该启动子和层粘连蛋白β2链核酸序列即被“有效连接”。
本文所用的术语“载体”是指能够运载其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其是指能够克隆其中的另外的DNA片段的环状双链DNA。另一种类型的载体为病毒载体，其中另外的DNA片段可被克隆至病毒基因组。某些载体能够自动在它们被引入的宿主细胞中复制（如具有细菌的复制起点的细菌载体、和哺乳动物游离型载体）。其它载体（如哺乳动物非游离型载体）在被引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。在本文中这样的载体称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。在本公开中，通过将本发明的启动子序列有效连接至待表达的基因，本发明的启动子序列可指导层粘连蛋白多肽序列的表达。一般来讲，重组DNA技术中所用的表达载体通常为质粒的形式。由于质粒是最常用的载体形式，因此在本说明书中“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本公开意欲包括表达载体的其它形式，例如起到同等功能的病毒载体（如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。
载体还可包含其它的序列，如用于亚克隆其它核酸序列的多位点接头、或使转录本进行合适的多腺苷酸化的多腺苷酸化信号。我们认为，多腺苷酸化信号的本性不是成功实现本发明的方法的关键，并且可采用任何这样的序列，包括但不限于SV40和牛生长激素poly-A位点。预期所述载体还可以包含的元件为终止序列，其能够用于提高信息水平并使从构建体到其它序列的通读最小化。另外，表达载体通常具有选择性标记，其通常为抗生素抗性基因的形式，从而能够使携带这些载体的细胞被筛选出来。
在另一实施方案中，本公开提供了被表达层粘连蛋白β2链的重组表达载体转染的宿主细胞。本文所用的术语“宿主细胞”是指已经引入了本公开的核酸（如重组表达载体）的细胞。该细胞可以为原核细胞，其可用于例如快速产生大量的本公开的表达载体，或者可以为真核细胞以用于功能性研究。
在本文中术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可以互换使用。应当理解这些术语不仅仅指特定的受试细胞，还指该细胞的子代细胞或是潜在的子代细胞。由于变异或受到环境影响，传代时可能发生一定的改变，因此实际上这样的子代可能不会与母代细胞完全相同，但它们仍然包括在本文所用的术语的范围中。
可以用本公开的一种或多种表达载体瞬时或稳定地转染宿主细胞。将表达载体转染入原核或真核细胞可以通过本领域已知的任意技术实现，所述技术包括但不限于：标准细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔、或脂质体介导的-、DEAE葡聚糖介导的-、聚阳离子介导的-、或病毒介导的转染。（参见（例如）文献“Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook et al.，1989,Cold Spring HarborLaboratory Press”；“Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,N.Y.)”）。
另一方面，本公开提供了由SEQ ID NO:2的氨基酸序列构成的分离的全长人层粘连蛋白β2链多肽。
本文所用的“分离的多肽”是指基本上不含其它蛋白质（包括其它层粘连蛋白链）和胶凝试剂（如聚丙烯酰胺和琼脂糖）的多肽。在优选的实施方案中，分离的层粘连蛋白多肽不含可检测到的污染层粘连蛋白链。因此，所述蛋白可以是从天然来源分离的，或者是从上述转染的宿主细胞中分离的重组蛋白。
在另一方面，本公开提供了分离的层粘连蛋白-521。本文所用的术语“层粘连蛋白-521”是指由α5、β2和γ1链结合在一起而形成的蛋白质。该术语应当被理解为既包括重组层粘连蛋白-521，也包括天然来源的异三聚体层粘连蛋白-521。在优选的实施方案中，层粘连蛋白-521包括重组层粘连蛋白-521（或“r-层粘连蛋白-521”）。
本文所用的术语“r-层粘连蛋白-521”是指重组异三聚体层粘连蛋白-521，其由已经转染了一种或多种表达载体的宿主细胞表达，所述表达载体含有至少一种编码选自α5、β2和γ1链的层粘连蛋白-521链的核酸序列；或者是指该重组异三聚体层粘连蛋白-521的加工或分泌形式。因此，所述r-层粘连蛋白-521可包含来自同一一个有机体或不同有机体的α5、β2和γ1序列。各种层粘连蛋白-521链DNA序列是本领域已知的，并且预期可以使用任意这样的序列来制备本公开所述的r-层粘连蛋白-521。（参见，例如“Pouliot,N.et al.，Experimental CellResearch261(2):360-71,(2000)”；“Kikkawa,Y.et al.，Journal of CellScience113(Pt5):869-76,(2000)”；“Church,H J.et al.，BiochemicalJournal332(Pt2):491-8,(1998)”；“Sorokin,L M.et al.，DevelopmentalBiology189(2):285-300,(1997)”；“Miner,J H.et al.，Journal ofBiological Chemistry270(48):28523-6,(1995)”；“Sorokin,L.et al.，European Journal of Biochemistry223(2):603-10,(1994)”）。在优选的实施方案中，r-层粘连蛋白-521由重组人α5、β2和γ1多肽链形成。
本公开包括这样的层粘连蛋白分子，其中重组异三聚体层粘连蛋白-521中的仅一条链或两条链是由内源性层粘连蛋白-521链编码的。在优选的实施方案中，α5、β2和γ1多肽链均为重组表达的。
层粘连蛋白-521是完整的蛋白质。术语“完整的”是指该蛋白质由α-链、β-链和γ-链的所有结构域构成，并且所述3条链结合在一起形成异三聚体结构。该蛋白质没被拆成独立的链、片段或功能结构域。术语“链”是指层粘连蛋白的α、β或γ链的整体。术语“片段”是指包含一个、两个或三个具有与另一分子或受体的结合活性的功能性结构域的任何蛋白质片段。然而，链不应当被理解为片段，因为每条链都具有多于3个的这样的结构域。相似地，完整的层粘连蛋白不应当被理解为片段。功能性结构域的例子包括结构域I、II、III、IV、V、VI和G结构域。
层粘连蛋白-521是分泌型蛋白，其能由信号序列被引导至内质网（ER）、分泌小泡和细胞外间隙。如果分泌型蛋白被释放到细胞外间隙，那么该分泌型蛋白能够经过细胞外加工而成为“成熟的”蛋白质。所述加工的情况可以不同，因此可以产生不同形式的最终的“成熟蛋白质”。例如，各蛋白的α5、β2和γ1链的长度可以不同。然而，虽然链的长度不同，但最终的成熟蛋白质仍然具有相同的功能。本公开的分离的层粘连蛋白-521包括含有全长多肽链的异三聚体，也包括任何经所述天然加工的层粘连蛋白-521多肽链。
如本文所用，层粘连蛋白-521多肽链是指以下一种或多种多肽链：
(a)包含选自由R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4组成的组中的多肽结构的多肽链，其中R1为氨基末端甲硫氨酸；R2为能引导多肽分泌的信号序列，其中该信号序列可以为针对特定的层粘连蛋白链的天然信号序列、或者是另一种分泌型蛋白的信号序列、或者是人工序列；R3为分泌型的层粘连蛋白链，其选自由α5链、β2链和γ1链组成的组中；并且R4为还包含附加表位（如下文所述的那些）的分泌型的α5、β2或γ1层粘连蛋白链，所述附加表位可位于所述层粘连蛋白链氨基酸序列的任意位置；或
(b)由在高或低严格条件下与本文公开的一种或多种重组层粘连蛋白-521链DNA序列（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6）的编码区或编码区的一部分杂交或者与它们的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽链；或
(c)与本文所公开的一种或多种层粘连蛋白-521多肽链氨基酸序列（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3）有至少70%一致性的多肽链，优选有至少80%的一致性，最优选有至少约90%的一致性。
本文所用的杂交“严格度”或“严格条件”是指核酸杂交体的洗涤条件，在该条件下被洗涤时该核酸杂交体是稳定的。本公开还包括在高严格条件下（如本文中所定义）与本文所公开的层粘连蛋白链多核苷酸的编码序列的全部或一部分杂交或者与它们的互补序列杂交的核酸。该杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少50个核苷酸。如本领域普通技术人员已知的，杂交体的稳定性由该杂交体的解链温度（TM）反映。序列同源性每降低1%，TM降低约1℃至1.5℃。通常，杂交体的稳定性是钠离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应在严格度较低的条件下进行，然后在不同且较高的严格度下洗涤。如本文所用，高严格度是指在以下溶液中在42℃下孵育过夜，然后将滤膜在约65℃下在0.1×SSC中洗涤，所述溶液包含50%甲酰胺、5×SSC（750mMNaCl、75mM柠檬酸钠）、50mM磷酸钠（pH7.6）、5×邓哈特溶液（Denhardt's solution）、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的、切断的鲑鱼精子DNA。
本发明还包括在严格度较低的杂交条件下与本公开的多核苷酸杂交的编码层粘连蛋白-521的核酸序列。改变杂交的严格度以及检测信号主要通过控制甲酰胺的浓度（甲酰胺的百分比较低导致严格度较低）、盐浓度或温度来完成。例如，低严格条件包括在以下溶液中在37℃下孵育过夜，然后在50℃下用1×SSPE、0.1%SDS洗涤，所述溶液包含6×SSPE（20×SSPE=3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA,pH7.4）、0.5%SDS、30%甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精子封闭DNA。此外，为了达到更低的严格度，严格杂交后进行的洗涤可以在更高的盐浓度（如5×SSC）下完成。
请注意，上述条件的改变可以通过引入和/或替换可选的封闭试剂来完成，所述封闭试剂用于抑制杂交实验的背景信号。典型的封闭试剂包括邓哈特试剂（Denhardt's reagent）、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA、以及市售的专用制剂。由于相容性的问题，可能需要对上述杂交条件进行改变来包含具体的封闭试剂。
如本文所用，两种氨基酸或两种核酸的“一致性”百分比是采用由Karlin和Altschul提出（参见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264.2268,1990”）并由Karlin和Altschul改进（参见“Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993”）的算法确定的。该算法被并入Altschul等（参见“J.Mol.Biol.215:403-410,1990”）的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索利用NBLAST程序进行，设定分值为100，词长=12，从而确定核苷酸序列与本公开核酸分子的一致性。BLAST蛋白搜索是用XBLAST程序进行的，设定分值=50，词长=3，从而确定氨基酸序列与本公开多肽的一致性。为了获得空位比对（gapped alignment）结果以进行比较，按照Altschul等（参见“NucleicAcids.Res.25:3389-3402,1997”）所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序（如XBLAST和NBLAST）的缺省参数。
本公开的进一步的实施方案包括编码层粘连蛋白-521链多肽的多核苷酸，所述层粘连蛋白-521链多肽与包含在SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6中的一种或多种多肽序列有至少70%的一致性，优选至少80%的一致性，最优选至少90%的一致性。
如本文所用，“α5多核苷酸”是指编码层粘连蛋白α5链的多核苷酸。该多核苷酸可以由以下一者或多者表征：（a）编码与选自SEQ IDNO:5的序列有至少70%一致性、优选80%一致性、最优选至少90%一致性的多肽的多核苷酸；（b）在低或高严格条件下与SEQ ID NO:5的编码序列或其互补序列杂交的多核苷酸；或（c）编码具有选自由R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4组成的组中的通用结构的层粘连蛋白α5链多肽的多核苷酸，其中R1和R2如上所述，R3为分泌型的α5链，R4为含有附加表位的分泌型的α5链。
如本文所用，“β2多核苷酸”是指编码同名的β2层粘连蛋白链的多核苷酸。该多核苷酸可以由以下一者或多者表征：（a）编码与SEQID NO:4的序列有至少70%一致性、优选至少80%一致性、最优选至少90%一致性的多肽的多核苷酸；（b）在低或高严格条件下与SEQ IDNO:4的编码序列或其互补序列杂交的多核苷酸；或（c）编码具有选自R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4中的通用结构的多肽的多核苷酸，其中R1和R2如上所述，R3为分泌型的β2链，R4为含有附加表位的分泌型的β2链。
如本文所用，“γ1多核苷酸”是指编码同名的γ1层粘连蛋白链的多核苷酸。该多核苷酸可以由以下一者或多者表征：（a）编码与SEQID NO:6的序列具有至少70%一致性、优选至少80%一致性、最优选至少90%一致性的多肽的多核苷酸；（b）在低或高严格条件下与SEQID NO:6的编码序列或其互补序列杂交的多核苷酸；或（c）编码具有选自R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4中的通用结构的多肽的多核苷酸，其中R1和R2如上所述，R3为分泌型的γ1链，R4为含有附加表位的分泌型的γ1链。
本文所用的术语“附加表位”是指作为嵌合蛋白的一部分被表达的多肽序列，其中该附加表位为用于与针对该附加表位而产生的抗体结合的识别位点，或者为用于与其它分子结合的识别位点，所述其它分子可以用于亲和纯化含有该表位的序列。
在优选的实施方案中，将编码层粘连蛋白α5、β2和γ1链、或它们的片段的cDNA亚克隆至表达载体中。可供选择的是，可以使用包含一个或多个内含子的层粘连蛋白α5、β2和/或γ1基因序列，将它们亚克隆至表达载体中。
在其它方面，本公开提供了表达层粘连蛋白-521的细胞，该细胞已被包含与核酸序列有效连接的启动子序列的表达载体转染，所述核酸序列编码至少一种包含选自由层粘连蛋白-521的α5、β2和γ1链组成的组中的序列的多肽序列，其中所述转染的细胞能分泌含有重组层粘连蛋白链的异三聚体层粘连蛋白-521。在优选的实施方案中，该细胞被包含与核酸序列有效连接的启动子序列的多个重组表达载体系统地转染，所述核酸序列编码包含层粘连蛋白-521的α5、β2和γ1链（它们更优选均为人类来源的链）的多肽序列。多重转染后，该细胞表达重组层粘连蛋白-521链，其然后形成异三聚体r-层粘连蛋白-521。
将表达载体转染到真核细胞中可通过本领域已知的任意技术完成，所述技术包括但不限于：磷酸钙共沉淀、电穿孔、或脂质体介导的-、DEAE葡聚糖介导的-、聚阳离子介导的-、或病毒介导的转染。细菌细胞的转染可通过标准方法完成。
在优选的实施方案中，细胞被稳定转染。稳定转染的方法以及选择已被合适转染的细胞的方法是本领域已知的。在其它优选的实施方案中，在人胚肾293细胞系中使用CMV启动子驱动的表达载体。
可以使用能表达和分泌r-层粘连蛋白-521的任意细胞。优选地，使用真核细胞，并且最优选地使用哺乳动物细胞，其包括但不限于肾和上皮细胞系。用于驱动单个的链或r-层粘连蛋白-521的表达的启动子序列可以是组成型的（由各种启动子中的任意启动子启动，包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF）或诱导型的（由各种可诱导的启动子中的任意启动子启动，包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇应答性的启动子）。认为糖类和二硫化物翻译后修饰是层粘连蛋白-521折叠和发挥功能所必需的。这使得优选使用真核细胞来制备功能性r-层粘连蛋白-521，尽管其它体系有利于获得（例如）用于生产抗体的抗原。在最优选的实施方案中，哺乳动物细胞不会内源性表达层粘连蛋白β2链。在其它优选的实施方案中，细胞不会内源性表达所有层粘连蛋白-521链。
所述蛋白可包含有利于促进蛋白质纯化的附加序列，例如附加表位和转运信号。所述附加表位的例子包括但不限于FLAG（SigmaChemical公司，圣路易斯，密苏里州）、myc（9E10）（Invitrogen公司，卡尔斯班，加利福尼亚州）、6-His（Invitrogen公司；Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州）、和HA(Boehringer Manheim Biochemicals公司）。所述转运信号的例子包括但不限于输出信号、分泌信号、核定位信号和质膜定位信号。
在一些实施方案中，至少一种层粘连蛋白链多肽序列或其片段被有效与编码“附加表位”的核酸序列连接，从而至少一种所述链被表达为具有所表达的附加表位的融合蛋白。附加表位可以表达作为氨基末端、羧基末端、或位于含有r-层粘连蛋白-521的任意多肽链的内部，只要所得r-层粘连蛋白-521仍然具有功能性即可。
在其它实施方案中，r-层粘连蛋白-521链中的一种被表达为具有第一附加表位的融合蛋白，并且至少另一种r-层粘连蛋白链被表达为具有不同的第二附加表位的融合蛋白。这允许进行多次纯化。可供选择的是，可以将相同的附加表位用于制备具有多于一种r-层粘连蛋白链的融合蛋白。
在进一步的实施方案中，可以将附加表位设计为可从r-层粘连蛋白-521链上切除。可供选择的是，没有附加表位与任何r-层粘连蛋白-521链融合，r-层粘连蛋白-521通过标准技术分离，所述技术包括但不限于使用层粘连蛋白-521特异性抗体或其它的层粘连蛋白-521结合性分子的亲和层析。
首先通过蛋白质印迹（Western blot）法，利用层粘连蛋白链特异性抗体对被单一层粘连蛋白链转染的细胞的培养基进行分析。转染后通常在细胞内表达单一层粘连蛋白链。通过任意适当的方法检测显示出对单一一种所转染的链有反应性的克隆，从而确定引入了所转染的基因，所述方法例如PCR、逆转录PCR、或核酸杂交。优选的是，通过PCR，利用层粘连蛋白链特异性引物对对由所述克隆制备的基因组DNA进行分析。通过任意合适的方法（包括蛋白质印迹分析和细胞结合检验）对产生所有三种链的转染克隆的培养基进行进一步分析，从而分析r-层粘连蛋白-521的分泌和/或活性。
在优选的实施方案中，通过使转染细胞的培养基通过抗体亲和柱来完成r-层粘连蛋白-521的纯化。在一些实施方案中，将针对在至少一种重组链上表达的多肽表位的抗体连接至亲和柱，该抗体会与分泌到培养基中的r-层粘连蛋白-521结合。通过使过量的多肽流过柱子来从柱子上除去r-层粘连蛋白-521。利用任意合适的方法分析洗脱部分，所述方法包括凝胶电泳和蛋白质印迹分析。在另一实施方案中，纯化后可切除多肽表位。在其它实施方案中，两种或三种独立的r-层粘连蛋白链被表达为融合蛋白，每种均具有不同的附加表位，从而允许两次或三次纯化以及双重或三重分离的r-层粘连蛋白-521。可以设计附加表位，使得纯化后附加表位可以从r-层粘连蛋白-521链上切除。可供选择的是，没有附加表位与任何r-层粘连蛋白-521链融合，r-层粘连蛋白-521通过标准技术分离，所述技术包括但不限于使用层粘连蛋白-521特异性抗体或其它的层粘连蛋白-521结合性分子的亲和层析。
在其它实施方案中，通过使转染细胞的培养基通过凝胶过滤层析柱来完成r-层粘连蛋白-521的纯化。通过任意合适的方法分析洗脱部分，所述方法包括凝胶电泳和蛋白质印迹分析。收集含有r-层粘连蛋白-521的部分并通过任意合适的方法评价样品的纯度，所述方法包括凝胶电泳和蛋白质印迹分析。在一些实施方案中，可以使蛋白质溶液再次通过凝胶过滤层析柱以获得更高纯度的蛋白质。在一些实施方案中，为了使r-层粘连蛋白-521溶液达到更高的纯度，可以使经前述纯化步骤获得的培养基或r-层粘连蛋白-521溶液通过离子交换柱。通过任意合适的方法分析洗脱部分，所述方法包括凝胶电泳和蛋白质印迹分析。收集含有r-层粘连蛋白-521的部分并通过任意合适的方法（包括上述方法）评价样品的纯度。
本公开的层粘连蛋白-521多肽链还包括：（i）一个或多个非保守性氨基酸残基的替换，其中替换的氨基酸残基可以由或不由遗传密码编码，或（ii）一个或多个具有取代基的氨基酸残基的替换，或（iii）成熟多肽与另一种化合物的融合，所述化合物为，例如，能增加多肽的稳定性和/或可溶性的化合物（例如聚乙二醇），或（iv）多肽与其它氨基酸的融合，例如IgG Fc融合区肽段、或导向或分泌序列、或利于纯化的序列。本领域技术人员根据本发明的教导能够理解该变体多肽在本发明的范围之内。
例如，包含将带电氨基酸替换为其它带电或中性氨基酸的多肽变体可以产生具有改善的特征（例如减少聚集）的蛋白质。由于聚集体的免疫活性，药物配制物的聚集会降低活性并提高清除率（参见文献：“Pinckard et al.，Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967)”；“Robbinset al.，Diabetes36:838-845(1987)”；“Cleland et al.，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems10:307-377(1993)”）。
在特定的实施方案中，分离的层粘连蛋白-521包含3条链。第一链包含与多肽序列SEQ ID NO:1（即α5层粘连蛋白链）有至少80%一致性的多肽。第二链包含与多肽序列SEQ ID NO:2（即β2层粘连蛋白链）有至少70%一致性的多肽。第三链包含与多肽序列SEQ ID NO:3（即γ1层粘连蛋白链）有至少70%一致性的多肽。这些第一链、第二链和第三链装配成重组层粘连蛋白-521。
在更具体的实施方案中，第一链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:1具有至少80%的一致性，第二链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:2具有至少80%的一致性，第三链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:3具有至少80%的一致性。
在更具体的实施方案中，第一链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:1具有至少90%的一致性，第二链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:2具有至少90%的一致性，第三链的多肽与多肽序列SEQ ID NO:3具有至少90%的一致性。
在具体的实施方案中，第一链包含多肽序列SEQ ID NO:1，第二链包含多肽序列SEQ ID NO:2，第三链包含多肽序列SEQ ID NO:3。
在具体的实施方案中，第一链为多肽序列SEQ ID NO:1，第二链为多肽序列SEQ ID NO:2，第三链为多肽序列SEQ ID NO:3。
本公开还提供了包含分离的层粘连蛋白-521和可药用的载体的药物组合物。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含分离的r-层粘连蛋白-521。根据本公开的这些方面，根据所处理的病症，所述药物组合物可以包含其它试剂。所述药物组合物还可包含一种或多种其它化合物，其包括但不限于以下物质中的任意一者，所述物质为胶原、其它种类的层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙粘蛋白、整联蛋白、α-肌营养不良蛋白聚糖、触觉蛋白/巢蛋白、α-肌营养不良蛋白聚糖、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、粘多糖、表皮生长因子,血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、或神经生长因子、及其多肽片段。
包含分离的层粘连蛋白-521的药物制剂可以被制备为任意合适的形式，并且其通常包含分离的层粘连蛋白-521以及可药用的载体。所述载体可以为可注射载体、局部载体、透皮载体等。所述制剂可以有利地为用于局部给药的形式，例如软膏、凝胶、乳剂、喷雾剂、分散剂、悬浮剂或糊剂。所述制剂还可在组合物中有利地包含防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗氧化剂、渗透剂和类似物质，并且其量为常规用量。用于本公开的合适的溶液为无菌的，并且是对所需应用无害的，并且可经过常规的药剂操作如灭菌和/或可包含常规的佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。为了帮助配制本公开的组合物，可参见文献“Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1975)”。
在进一步的方面，本公开包括生物相容性提高的医疗器件，其中该器件的外表面包被有分离的层粘连蛋白-521或其药物组合物，该分离的层粘连蛋白-521或其药物组合物单独包被或与用于提高器件表面的生物相容性的其它蛋白质或试剂一起包被。经包被的器件可刺激细胞粘附（如内皮细胞粘附），并且可在该器件的植入部位提供减少的炎症和/或感染。
该医疗器件可以为用于植入体内的任意材料，并且优选由生物相容性金属（如不锈钢或钛）制备或包被。可供选择的是，该器件由陶瓷材料或聚合物制备或包被，所述聚合物如聚酯、聚乙醇酸或聚半乳糖-聚乙醇酸共聚物。
如果所述器件是由天然或合成的生物可降解性材料制成的网、片或织物的形式，那么分离的层粘连蛋白-521或其药物组合物可以直接涂敷于其表面。然后可将合适的细胞培养在该基质上以形成可移植的或可植入的器件，包括牙科支持片、针、金属针或棒；留置导管；结肠造口术管；外科用网状物以及任意其它需要以分离的层粘连蛋白-521包被的器具。可供选择的是，可以将所述器件植入，并且可使细胞在体内粘附。
对分离的层粘连蛋白-521的偶联可为非共价的方式（例如通过吸附）或者是共价的方式。可将所述器件在分离的层粘连蛋白-521或其药物组合物中浸渍、孵育，或者用分离的层粘连蛋白-521或其药物组合物喷涂。
利用本公开的分离的层粘连蛋白-521进行各种治疗的给药方案取决于一系列因素，包括损伤或病症的类型、年龄、体重、性别、个体的医疗情况、病症的严重程度以及给药途径。因此，给药方案可以非常广泛，但可以由医师利用标准方法常规地确定。层粘连蛋白是非常有效的分子，在每个细胞中一个或几个分子就可以产生效果。因此，如果优化了给药方式，有效剂量可以在每毫升皮克的范围内。
在其它方面，本公开提供了新的材料，即分离的层粘连蛋白-521，其使得人胚胎干细胞在解离为单细胞悬液后能够存活。通过胰蛋白酶-EDTA处理将干细胞解离为单细胞悬液，离心使其成团，重悬于O3培养基中，用40μm筛过滤，并且以3万个细胞/cm2的密度接种在由分离的层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-511或Matrigel预包被的细胞培养皿中。培养一天后，如本领域所知，接种在Matrigel中的细胞死亡。接种在层粘连蛋白-521上的人胚胎干细胞，以及大部分情况下接种在层粘连蛋白-511上的人胚胎干细胞存活并开始增殖，由此形成多能细胞的小克隆。
在进一步的方面，本公开提供了扩增多能状态下的人胚胎干细胞的方法。已经显示，以单细胞悬液方式接种在层粘连蛋白-521上的人胚胎干细胞存活，并且以比本领域已知的经典方法更高的速率增殖。3代后（1个月），以单细胞悬液方式传代的细胞经历了与在Matrigel上以片的方式传代20代（3个月）的细胞培养物相同的细胞分裂次数。因此，所述新方法在时间和人力方面是有益的，其可以提供显著的经济效益。
层粘连蛋白-521通常由人多能胚胎干细胞表达和分泌，并且也可见于肾、神经肌肉接头、肺和胎盘。
能够获得纯的层粘连蛋白-521将能够研究该蛋白对细胞分化和细胞表型维持的影响。因此，如果能够获得纯的完整的分离的层粘连蛋白-521，那么在包括但不限于治疗组织损伤、促进细胞粘附、扩增和迁移、来自体外（ex vivo）的细胞疗法、改善医疗器件的生物相容性、以及制备改进的细胞培养装置和媒介等大量的研究和治疗目的方面将会取得进步。此外，由于层粘连蛋白-521在早期哺乳动物胚胎中表达，因此纯的层粘连蛋白-521对干细胞的影响对研究非常重要。
因此，在本领域中，需要分离的层粘连蛋白-521用于研究和治疗目的，并且需要制备分离的层粘连蛋白-521的方法。层粘连蛋白-521可以作为解离的人ES和诱导的多能干（iPS）细胞在化学成分完全确定、不含饲养细胞且不含动物蛋白质（不含异源物）条件下进行长期自我更新和快速增殖的基质。基于LN-521的体系易于使用并且易于自动化操作，并且允许快速扩大人ES/iPS的培养。
本公开还涉及能用于为细胞（特别是干细胞）提供营养的细胞培养基。在这一方面，培养干细胞通常需要两种物质：（1）为干细胞提供结构支持的基底或包被物；以及（2）为干细胞提供营养的细胞培养基。所述基底或包被物（1）通常置于（例如）有盖培养皿中或其它容器中。
本文所用的术语“自我更新”是指干细胞经过多次细胞分裂周期并保持未分化状态（即多能性）的能力。多能性本身是指干细胞分化为任意细胞类型的能力。术语“增殖”是指干细胞分裂的能力。存活是指分化或未分化的干细胞生存的能力，其不需要干细胞保持其分裂或分化的能力。
本公开的细胞培养基特别适合与含有层粘连蛋白-521和/或层粘连蛋白-511的基底一起使用。这些层粘连蛋白激活α6β1整联蛋白，进而导致PI3K/Akt通路的激活。这增强了干细胞的多能性、自我更新和/或增殖。认为基底可由完整的、独立的链、或片段形式的层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-511组成。重组层粘连蛋白-521和重组层粘连蛋白-511是市售可得的。许多不同的分子可以激活PI3K/Akt通路，尽管具有不同的效率。例如，TGFβ1和bFGF激活该通路。使用层粘连蛋白-521和/或层粘连蛋白-511使得这些分子在细胞培养基中的用量降低。层粘连蛋白-521通过α6β1整联蛋白传送最高剂量的信号，由此激活PI3K/Akt通路。使用层粘连蛋白-521允许以单细胞悬液方式传代而不需要加入对细胞不利的rho激酶（ROCK）抑制剂来提高单细胞酶解后的细胞存活率。之前，进行人ES细胞单细胞酶催化传代而不使用人工凋亡抑制剂是不可能的。传代程序简单化意味着实验方差降低，并且允许该过程自动化以进行高通量细胞培养，并且导致不需要细胞培养人员的大量训练和花费。另外，接种在层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-511上的人ES和iPS细胞以单层生长，由于细胞相等地暴露于基质和细胞培养基，因此这使得培养同质化。与生长在Matrigel上以簇的方式传代的细胞相比，在化学成分确定且不含异源物的环境中、在层粘连蛋白-521上生长，在缺乏ROCK抑制剂的条件下以单细胞传代的人ES细胞培养物可以以更高的生长速率连续扩增数月。这些多能的长期扩增的细胞均一地表达Oct4，并且保持核型正常。因此，人们可以获得具有持续存活和增殖能力的人ES和iPS细胞。
相比于其它可用的基底，培养在层粘连蛋白-511上的细胞的平均接触面积和铺展均匀性更大。在层粘连蛋白-511上生长超过3个月的人ES细胞保持了多能性，并且在植入SCID小鼠后能产生畸胎瘤。层粘连蛋白-511还支持小鼠ES细胞自我更新超过5个月，而不需要LIF或饲养细胞的存在，而其它已知的物质在持续支持细胞方面却不能超过几周。
生长在所述细胞培养基中的干细胞可以被诱导成为多能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞、羊膜干细胞、以及通常的任意多能干细胞。
通常，细胞培养基包含大量的各种生长因子和细胞因子以抑制分化并提高增殖。本公开的细胞培养基的一个优点在于其不包含种类如此多或量如此高的生长因子或细胞因子。
最通常地，与通常使用的细胞培养基相比，本公开的细胞培养基需要较少量的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。认为细胞培养基可包含大于0至3.9纳克/毫升（ng/mL）的bFGF。该bFGF为人bFGF，从而该细胞培养基为完全人源的且成分确定的。在一些更具体的实施方案中，所述细胞培养基可包含3.5ng/mL或更少的bFGF。在其它实施方案中，所述细胞培养基可包含0.5ng/mL至3.5ng/mL的bFGF。在一些实施方案中，细胞培养基可具有零bFGF，即不存在bFGF。
一般来讲，所述细胞培养基包含液体相，其中溶解有至少一种无机盐、至少一种微量矿物质、至少一种能量物质、至少一种脂类、至少一种氨基酸、至少一种维生素和至少一种生长因子（除bFGF之外）。下表1列出了可存在于本公开的细胞培养基中的各种成分，以及存在该成分时的最低和最高浓度。数值用科学计数法表示。例如“4.1E-01”应当被理解为4.1x10-01。
表1.
Figure BDA0000367057370000281
Figure BDA0000367057370000291
Figure BDA0000367057370000301
细胞培养基的液相可以为水、血清或白蛋白。
上表1中列出的许多组分或成分不是必须的，或者可以以较低浓度使用。
认为细胞培养基可包含胰岛素或胰岛素替代物。相似地，细胞培养基可包含转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
在更具体的实施方案中，认为细胞培养基可不包含：（1）白蛋白，（2）胰岛素或胰岛素替代物，（3）转铁蛋白或转铁蛋白替代物，或者这三种组分的任意组合。
应当注意的是，其它细胞培养基可包含生长因子，如白细胞介素-1β（IL-1β或异化产物）、白细胞介素-6(IL6）、或色素上皮衍生因子（PEDF）。这些生长因子不存在于本公开的细胞培养基中。
表2提供了细胞培养基的一种具体配方：
表2.
成分 量 单位
bFGF 0.39 微克(μg)
白蛋白 1.34 毫克(Mg)
胰岛素 2 mg
氯化锂 4.23 mg
GABA 0.01 mg
TGFβ1 0.06 μg
哌啶酸 0.013 mg
L-谷氨酰胺 2.92 克
MEM非必需氨基酸溶液 1 mL
DMEM/F12 100 mL
在此，MEM非必需氨基酸溶液通常以100×浓缩物的形式提供。表2中的MEM在稀释至1×后使用，并且包含表3列出的具有如下浓度的以下氨基酸：
表3.
MEM氨基酸 浓度(ng/mL)
甘氨酸 7.50E+03
L-丙氨酸 8.90E+03
L-天冬酰胺 1.32E+04
L-天冬氨酸 1.33E+04
L-脯氨酸 1.15E+04
L-丝氨酸 1.05E+04
DMEM/F12含有表4所列出的以下组分：
表4.
DMEM/F12成分 浓度(ng/mL)
甘氨酸 187.5
L-丙氨酸 44.5
L-盐酸精氨酸 1475
L-天冬酰胺-H2O 75
L-天冬氨酸 66.5
L-盐酸半胱氨酸-H2O 175.6
L-半胱氨酸-2HCl 312.9
L-谷氨酸 73.5
L-谷氨酰胺 3650
L-盐酸组氨酸-H2O 314.8
L-异亮氨酸 544.7
L-亮氨酸 590.5
L-盐酸赖氨酸 912.5
L-甲硫氨酸 172.4
L-苯丙氨酸 354.8
L-脯氨酸 172.5
L-丝氨酸 262.5
L-苏氨酸 534.5
L-色氨酸 90.2
L-酪氨酸二钠盐二水合物 557.9
L-缬氨酸 528.5
生物素 0.035
氯化胆碱 89.8
D-泛酸钙 22.4
DMEM/F12成分 浓度(ng/mL)
叶酸 26.5
烟酰胺 20.2
盐酸吡多辛 20
核黄素 2.19
盐酸硫胺素 21.7
维生素B12 6.8
i-肌醇 126
氯化钙(CaCl2)(无水) 1166
硫酸铜(CuSO4-5H2O) 0.013
硝酸铁(Fe(NO3)3-9H2O) 0.5
硫酸铁(FeSO4-7H2O) 4.17
氯化镁(无水) 286.4
硫酸镁(MgSO4)(无水) 488.4
氯化钾(KCl) 3118
碳酸氢钠(NaHCO3) 24380
氯化钠(NaCl) 69955
磷酸氢二钠(Na2HPO4)无水 710.2
磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O) 625
硫酸锌(ZnSO4-7H2O) 4.32
D-葡萄糖(Dextrose) 31510
次黄嘌呤Na 23.9
亚油酸 0.42
硫辛酸 1.05
酚红 81
腐胺2HCl 0.81
丙酮酸钠 550
胸苷 3.65
层粘连蛋白基底与本公开的细胞培养基的组合使得细胞培养系统能够更廉价，并且在保持多能干细胞方面更高效。实质上，这需要的只是层粘连蛋白和最少量的营养。特别地，认为与该细胞培养基组合使用的层粘连蛋白为LN-511或LN-521。
以下实施例为了进一步解释本公开。这些例子仅仅是示例性的，并非旨在将本公开的装置限制于所述材料、条件、工艺参数。
实施例
实施例1
人层粘连蛋白β2cDNA的克隆
使用引物5’-GTGGTACCCACAGGCAGAGTTGAC-3’（SEQ IDNO:7）和5’-GCTCTAGAGCTCTTCAGTGCATAGGC-3’（SEQ ID NO:8），由人肝cDNA文库（BD Biosciences公司）PCR扩增人层粘连蛋白β2cDNA的5.6kb片段，从而在该片段末端引入人工XbaI和KpnI切割位点。为了降低PCR扩增过程中的错误率，使用PhusionTM高保真PCR试剂盒（Finnzymes公司）。随后，用XbaI和KpnI消化该片段，并亚克隆到经相同的限制性内切酶消化的pSK载体（pSKHLAMB2质粒）上。为了检验该序列的完整性，对pSKHLAMB2质粒的若干克隆进行测序。使用ABI BigDyeTMTerminator循环测序试剂盒（PEApplied Biosystems公司），在ABI PRISMTM310遗传分析仪（PerkinElmer公司）上进行测序。仅选择与NCBI数据库人层粘连蛋白β2序列完全匹配的序列用于进一步的克隆。
构建体的表达
为了表达人层粘连蛋白β2链，将pSKHLAMB2质粒用XbaI和KpnI消化并亚克隆到经XbaI-KpnI处理的pcDNA3.1(+)载体（Invitrogen）中。
前人已经描述了用于表达人层粘连蛋白α5（HLN5Full.pcDNA构建体）和γ1（HG1构建体）的构建体（参见文献“Doi,M.et al.，J.Biol.Chem.277(15),12741-8(2002)”）。
抗体
抗层粘连蛋白β2（MAB2066）单克隆抗体（mAb）购自RDSystems公司。抗层粘连蛋白α5mAb（2F7）购自Abnova公司。抗层粘连蛋白β1mAb（MAB1921）购自Chemicon公司。抗层粘连蛋白γ1（H-190）兔多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。
重组层粘连蛋白-521的制备和纯化
利用在湿润的5%CO2气氛、37℃下，在DMEM、10%FCS中培养的人胚肾细胞（HEK293，ATCC CRL-1573）生产r-层粘连蛋白-521。使用标准磷酸钙法，用HG1构建体转染野生型细胞，并使用100mg/ml潮霉素（Cayla公司）将稳定的克隆选择出来。所有进一步的细胞培养和克隆扩增均在连续存在相应的选择性抗生素的条件下进行。然后用人层粘连蛋白β2构建体转染高表达的克隆，并且使用500mg/mlG418（Life Technologies公司）将稳定的克隆选择出来。最后用HLN5Full.pcDNA构建体转染高表达层粘连蛋白γ1和层粘连蛋白β2的克隆，并且使用200mg/ml博莱霉素（Cayla公司）将稳定的细胞群选择出来。进一步扩增表现出最高分泌量的克隆。
为了制备r-层粘连蛋白-521，将融合细胞在DMEM中培养至多5天。使用抗FLAG M2基质（Sigma公司）来亲和纯化r-层粘连蛋白-521。以分批的方式将收集到的培养基与所述基质在4℃下孵育搅拌过夜。在室温下，用50mg/ml溶于TBS/E（50mM Tris-Cl、pH7.5,150mMNaCl、1mM EDTA）中的FLAG多肽（Sigma公司）对结合的r-层粘连蛋白-521进行竞争性洗脱。浓缩洗脱液，并且采用30kD截留超滤膜（Millipore公司）以PBS替换缓冲液。最后使该浓缩的溶液流过0.2mm滤膜以除去自聚集的聚合物。
重组层粘连蛋白-521的鉴定
纯化后，使用3-8%梯度SDS-PAGE鉴定培养基中的分泌型的层粘连蛋白。使用Sypro染色（Bio-Rad公司）或转印至PVDF上肉眼观测蛋白质（图3）。用上述抗体探测所述膜。洗涤后，用HRP-偶联山羊抗体孵育膜。按照制造商的说明书，用化学发光试剂盒（Life ScienceProducts公司）检测免疫反应性。
方法
人ES细胞培养
在37℃、5%CO2中，在包被有r-层粘连蛋白-521的实验培养皿上，在化学成分确定的O3培养基中培养人ES细胞（在文献“Rodin et al.，Nature Biotechnol.,vol.28,pp.611-615(2010)”中有所描述）。每10至12天，在37℃下将细胞暴露于胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCOInvitrogen公司）5分钟，从而对细胞进行常规传代。然后温和地吹打使其分开成为单细胞悬液，并加入一定的胰蛋白酶抑制剂（GIBCOInvitrogen公司）。将该细胞悬浮液离心4分钟，丢弃上清，将所得细胞团重悬在预温的O3培养基中，然后使细胞通过40μm筛。之后将细胞以3万个细胞/cm2（1:25-1:30分流比）的浓度接种在新的包被有r-层粘连蛋白-521的培养皿上。除了传代后的第一天仅加入几滴新鲜培养基以外，每天用在孵育器中已预温1小时的新鲜培养基喂养细胞一次。如文献“Rodin et al.，Nature Biotechnol.,vol.28,pp.611-615(2010)”所述，在O3培养基中、在Matrigel（BD Biosciences公司）上培养相同细胞系的对照细胞。将对照细胞分成多个小份以进行传代。
细胞培养皿的包被
在4℃下，用浓度均为30μg/ml(5μg/cm2)的以下无菌溶液将96孔组织细胞培养板包被过夜：小鼠ECM蛋白LN-111（Invitrogen公司）无菌溶液、人重组LN-511无菌溶液和人重组LN-521无菌溶液。根据制造商的说明书，对对照细胞使用了BD MatrigelTM hESC qualified（BDBiosciences公司）。
细胞粘附试验
按照文献所述（Extracellular Matrix Protocols,2000）进行粘附分析。简言之，根据上面描述的方法将96孔板用细胞外基质蛋白包被，并用含有牛血清白蛋白的O3培养基封闭。将ES细胞以600个细胞/mm2的细胞密度接种在包被有细胞外基质的平板上，并使其在细胞孵育器中粘附1小时或1天。将没有粘附的细胞冲洗掉，并将粘附的细胞用5%的戊二醛固定20分钟，并用0.1%的结晶紫染色。
mRNA的实时PCR定量
如文献“Rodin et al.，Nature Biotechnol.,vol.28,pp.611-615(2010)”所述，分离总RNA并合成cDNA。使用Applied Biosystems7300实时PCR系统进行实时定量RT-PCR Taqman分析。用含有针对目的mRNA的引物和探针的预制基因表达检验混合物（AppliedBiosystems）进行所有反应，一式四份。对每个实验进行包括针对GAPDH的预制基因表达分析混合物的额外反应，以用于使RNA输入标准化。所有数据用7300System SDS软件第1.4版分析。
FACS分析
按照Ludwig,T.E等所述，分析OCT4的表达。人胚胎干细胞在规定的环境中分化（参见文献“Nat.Biotechnol.24,185–187(2006)”）。使细胞通过FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。数据用CellQuest软件（Becton Dickinson）分析。
实施例1的结果
为了得知不同细胞培养包被物如何影响不含任何添加剂的O3培养基中的人ES细胞的单细胞存活，我们将HS181细胞群完全解离，并将其接种在Matrigel、小鼠层粘连蛋白-111、人r-层粘连蛋白-511、人r-层粘连蛋白-521、或r-层粘连蛋白-511和r-层粘连蛋白-521的混合物中。结果如图4所示。正如所期望的那样，接种24小时后几乎没有细胞仍然粘附在Matrigel或小鼠层粘连蛋白-111上。相比之下，在人r-层粘连蛋白-521、所述混合物上的细胞存活，在人r-层粘连蛋白-511上的细胞较少存活。
利用O3培养基中的用ROCK抑制剂Y-27632处理的人ES细胞重复该实验。结果如图5所示。干细胞仍然粘附在所有5种包被物上。
为了量化该效果，在接种1小时和1天后，我们在所有上述包被物上进行了细胞粘附实验（即，5种包被物，有或没有Y-27632）。图6示出了对不存在Y-27632的LN-521、LN-511和Matrigel（Mg）进行1小时实验的结果。在不含任何添加剂的O3培养基中人ES细胞的粘附在此时基本相同。
图7示出了对所有包被物进行1天实验的结果。含有Y-27632抑制剂和包被物的平板被标记为“In&”。接种1天后，粘附至到不含添加剂的LN-521上的干细胞比粘附到不含添加剂的Matrigel上的多20倍。另外，结果显示，细胞对不含添加剂的LN-521的粘附与含有ROCK抑制剂的所有培养皿上的细胞粘附相似。也就是说，必要的是，不含ROCK抑制剂的情况与LN-532包被物结合，由此获得与包含ROCK抑制剂的包被物相似的结果。
我们在人r-层粘连蛋白-521上培养人ES细胞，每10至12天，在完全解离为单细胞悬液后以1:25至1:30的比例传代。细胞以稳定且高的速率健壮生长持续至少9代（3个月）。此外，3代后（1个月），它们完成了与使用常规方法培养20代（100天）之后的干细胞相同的细胞增倍数目。这在图8中示出，其中示出了细胞数目随时间的增长。与在Matrigel上相比，在LN-521上的细胞以远远较高的速率增加。因此，在时间和人力方面，新的r-层粘连蛋白-521hES细胞培养方法是有利的。
为了鉴定hES细胞在不含任何添加剂的O3培养基中在人r-层粘连蛋白-521上经过几次单细胞悬液传代之后的同一性，我们对多能性标志物Oct4进行了FACS分析。图9示出了在r-LN-521上生长的细胞的结果，而图10示出了在Matrigel上生长的细胞的结果。阳性细胞的百分比被列在括号中。R-LN-521具有较高百分比的多能性细胞。
另外，对多能性标志物Oct4和Nanog的mRNA转录本数量进行定量。图11示出了这些结果。对于这两种标志物，LN-521上的细胞显示出较高数量的转录本。
这两种方法表明，与使用Matrigel作为细胞培养皿包被材料并且以小簇方式传代细胞的现有方法相比，所述新方法提供了品质相同或更好的hES细胞。
实施例2
在本实施例2中，研究了被表达和纯化的重组LN-521（也在多能性hES细胞中表达）对培养的hES和iPS细胞的影响。结果表明，LN-521可单独强烈地支持多能性hES和iPS细胞的自我更新，并且重要的是，在在LN-521上以高的稀释度接种单细胞悬液中的经胰蛋白酶处理的干细胞后，其能够使得多能干细胞存活。据表明，LN-521的作用是通过诱导hES细胞迁移和激活PI3K/Akt通路并由α6β1整联蛋白传递信号而介导的。其结果可以用于大规模生产多能性hES和iPS细胞的有效甚至自动化的扩增方法，并且可用于开发用于多能干细胞自我更新的新培养基配制物。本文描述的新的hES/hiPS细胞培养方法非常类似于标准的细胞培养方法（例如用于培养成纤维细胞的方法），因此，其不需要特殊的技巧。该方法在每次细胞分裂时仅消耗极少的细胞包被材料，并且是省时的，从而相比于培养hES/hiPS细胞的现有工艺提供了显著的经济效益。
通过克隆全长层粘连蛋白β2cDNA，并用人层粘连蛋白α5、β2和γ1链三重转染HEK293细胞来制备人重组LN-521，该人重组LN-521的纯化形式在本发明之前还不能获得。类似地，通过克隆全长α1和β2链cDNA，并且用人α1、β1和γ1链cDNA以及α1、β2和γ1链cDNA分别三重转染HEK293细胞，从而制备人重组LN-111和LN-121。如蛋白质染色和蛋白质印迹分析所示，表明纯化的LN-521、LN-111和LN-121蛋白分别包含纯的α5、β2和γ1链，α1、β1和γ1链以及α1、β2和γ1链。
方法
人ES和iPS细胞培养
在37℃、5%CO2下，在包被有LN-521的培养皿上，在O3培养基（如文献“Rodin et al.，Nature Biotechnol.,vol.28,pp.611-615(2010)”所述，并且调节pH至7.35）中，在mTeSR1（STEMCELLTechnologies公司）和化学成分确定且不含异源物的TeSR2（STEMCELL Technologies公司）中培养人ES细胞HS181和HS401。首先，使用灭菌刀小心刮擦，然后进行胰蛋白酶处理而将细胞系从人饲养细胞层转移至LN-521包被物上，或者从LN-511包被物上将细胞胰蛋白酶消化为单细胞悬液。除了接种后第一天仅加入几滴新鲜培养基以外，每天给细胞提供已在孵育器中预温1小时的新鲜培养基1次。每10至12天，在37℃、5%CO2下将细胞暴露于胰蛋白酶/EDTA（GIBCO Invitrogen公司，位于苏格兰佩斯利）5分钟，由此对细胞进行常规传代。然后温和地吹打使其分开成为单细胞悬液，并加入规定的胰蛋白酶抑制剂（GIBCO Invitrogen公司）。将细胞悬浮液以25rcf离心4分钟，丢弃上清，将所得细胞团重悬在预温的O3培养基中，然后使细胞通过40μm筛。之后，将细胞以30,000个细胞/cm2的浓度（1:25-1:30分流比）接种在新的包被有层粘连蛋白-521的培养皿上。如前所述，在O3培养基中，在Matrigel（STEMCELLTechnologies公司）和LN-511上培养相同细胞系的对照细胞9。
对于确定的且不含异源物的培养物，使用了TeSR2（STEMCELLTechnologies公司）培养基和确定的不含任何动物来源组分的TrypLETMSelect（GIBCO Invitrogen公司，位于苏格兰佩斯利）酶。每10至14天在37℃、5%CO2下将细胞暴露于TrypLETMSelect，暴露时间为4至5分钟，以进行传代。然后小心地吸取酶，并加入预温的TeSR2培养基。然后，温和地吹打细胞使其分散为单细胞悬液，离心，丢弃上清，将细胞团重悬在预温的TeSR2中。然后使细胞通过40μm筛并接种在新鲜的包被有LN-521的培养皿上。
将组织细胞培养板用ECM蛋白（如人重组LN-521，浓度均为30μg/ml(5μg/cm2)）的无菌溶液在4℃下包被过夜。根据STEMCELLTechnologies的说明书，对照板用Matrigel包被。使用前，将培养皿在孵育器中预温1小时，然后不对该培养皿进行额外地洗涤而加入预温的O3培养基。向新的培养皿中施加新鲜的LN-521溶液后，剩余的LN-521溶液还可以使用至少一次。使用新鲜的包被材料进行所有的粘附、存活和存活抑制实验。
作为人iPS细胞，ChiPSW细胞系来自于用病毒转导OCT-4/SOX2/NANOG/LIN28重组基因的人包皮成纤维细胞（HFF）。经过对不同代的重复测试，ChiPSW细胞系具有正常男性核型（46，XY）。在细胞培养和传代实验之前，首先在体外鉴定细胞的多能性标志物的表达。用抗Oct3/4（SC-5279）、Nanog（SC-33759）、TRA-1-60（SC-21705）和SSEA4（sc-21704）的抗体进行的免疫荧光研究表明，这些细胞表达所有这些多能性标志物。RT-PCR分析证实这些细胞缺乏病毒转基因的表达。ChiPSW细胞的多能性通过体外（胚状体形成和免疫荧光研究）和体内（皮下注射到SCID浅褐色小鼠）实验证实。ChiSW细胞系的细胞可进一步分化成跳动的心肌细胞。它们还可进行造血分化。
在进行本发明的不含饲养细胞的培养之前，在经照射的人包皮成纤维细胞上保持并使iPS细胞增殖。将补充有血清（KSR，Invitrogen公司）的Knock-out培养基用于增殖，其中补充了8ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，R&D Systems公司）。每天喂养细胞并每周用胶原酶IV（1mg/ml，Roche公司）或采用人工分离（需要时）进行传代。
在这些实验之前，显示出CutB1.2细胞表达多能性标志物Oct4/Nanog/Sox2/TRA-1-60/TRA-1-81，不表达病毒转基因，该细胞的多能性通过体内和体外分化研究得到证实。
层粘连蛋白-521和其它包被材料
基本上按照上文所述的方法，依次用全长层粘连蛋白γ1、β1和α5构建体转染人胚肾细胞（HEK293；ATCC CRL-1573），在该细胞中制备人重组LN-521（可购自BioLamina公司，AB，斯德哥尔摩（www.biolamina.com））。对于蛋白质的制备，在补充有GlutaMax I的Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM培养基）中培养HEK293细胞至多6天。使用抗-FLAG基质（Sigma公司）来亲和纯化LN-521分子，然后在还原和非还原条件下使用3-8%和4-15%梯度的SDS-PAGE鉴定LN-521分子。使用Sypro Ruby（Bio-Rad公司）对聚偏二氟乙烯膜上的链进行蛋白质染色和免疫染色，从而使蛋白质可被视觉观察。为了进一步对蛋白质进行鉴定，使用抗层粘连蛋白α5、β1和γ1链的抗体进行蛋白质印迹分析。按照与LN-521相似的方法制备人重组层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-121，并且通过蛋白质印迹和SDS-PAGE显示出其包含预计分子大小的正确的链。除非另有说明，将相应的小鼠层粘连蛋白-111（Invitrogen公司）表示为LN-111。
试剂和抗体.
InSolutionTM LY294002（特异性Akt抑制剂）、InSolutionTM渥曼青霉素（特异性PI3K抑制剂）和InSolutionTM98059（特异性MEK1/Erk抑制剂）购自Calbiochem公司。抗phospho-Akt（#4060）、抗total-Akt（#9272）、抗phospho-Erk（#9101）和抗total-Erk（#9102）的抗体购自Cell Signaling Technology公司。PathScan Phospho-Akt1夹心ELISA试剂盒（#7160）、PathScan total Akt1夹心ELISA试剂盒（#7170）、PathScan Phospho-Akt2夹心ELISA试剂盒（#7048）和PathScan total Akt2夹心ELISA试剂盒（#7046）也购自Cell SignalingTechnology公司。抗钙联接蛋白（#ab10286）的抗体购自Abcam公司。针对各种整联蛋白亚基的功能性封闭抗体、小鼠同种型抗体和α-肌营养不良蛋白聚糖购自Millipore公司。由于抗αV（MAB1980）和α6（MAB1378）的功能性封闭抗体存在于具有叠氮化钠的溶液中，因此在抑制存活实验之前，所有抗α整联蛋白亚基的抗体用O3培养基透析3次，每次2小时。抗卢氏（Lutheran）受体和α-甲胎蛋白的抗体、以及大鼠同种型对照抗体得自R&D Systems公司。抗Oct4、Nanog、SSEA-4、平滑肌肌动蛋白和MAP-2的抗体购自Millipore公司。
免疫荧光.
为了进行免疫荧光研究，在8孔玻片小室（BD Biosciences公司）或96孔板中培养ES细胞并用4%的多聚甲醛将其固定，用0.1%的Triton-X进行通透，并用溶于含0.1%的Tween-20（Sigma-Aldrich,St.Louis,http://www.sigmaaldrich.com）的磷酸盐缓冲液（PBS）中的10%胎牛血清（GIBCO Invitrogen公司）封闭1小时。在室温下用一抗孵育1.5小时。用二抗和4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，分子探针）孵育40分钟。在两次孵育之间，将样品用含0.1%Tween-20的PBS缓冲液洗3-5次。将样品保存在荧光封固剂（Dako公司，丹麦格洛斯楚普市，http://www.dako.com）中，并用荧光显微镜（Leica公司,瑞士赫尔伯格市,http://www.leica.com）观察。
不同mRNA的实时PCR定量
按照制造商的说明书，用Absolutely RNA Microprep试剂盒（Stratagene公司,加州拉由拉市,www.stratagene.com）分离总RNA。按照制造商的说明书，使用0.2μg的总RNA在20μl反应混合物中合成cDNA，所述反应混合物含有寡聚胸腺嘧啶（oligo(dT)）12-18引物和SuperscriptⅡ反转录酶（GIBCO Invitrogen公司）。使用AppliedBiosystems7300实时PCR系统（Applied Biosystems公司,加州福斯特市）进行实时定量RT-PCR Taqman检验。使用含有引物和针对目的mRNA的探针的预制基因表达检验混合物（Applied Biosystems公司）完成所有反应，一式四份。对每个实验进行包括针对GAPDH的预制基因表达检验混合物的额外反应，以用于使RNA输入标准化。所有数据用7300System SDS软件第1.4版分析。
FACS分析
用胰蛋白酶/EDTA从培养皿上取下细胞，将其解离为单细胞悬液并在冰冷的FACS缓冲液（2%胎牛血清、含有0.1%叠氮化钠的Hank缓冲液）中重悬。在冰上，用抗SSEA-4的一抗孵育1小时（Millipore公司,麻省比尔里卡市，http://www.millipore.com）。然后用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞3次。之后，在避光条件下，在含有1:400稀释的Alexa Fluor抗小鼠二抗（GIBCO Invitrogen公司）的FACS缓冲液中对细胞进行探测30分钟，洗涤4次。用小鼠免疫球蛋白孵育对照细胞，随后用上述二抗孵育。在FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson公司,加州圣何塞市）上分析细胞。用CellQuest软件（Becton Dickinson公司）分析数据。
核型分析
使用标准Q带技术对细胞系进行核型分析。细胞样品用秋水仙胺KaryoMAX（0.1μg/ml；Gibco Invitrogen公司）处理至多4小时，之后用TrypLETMExpress（GIBCO Invitrogen公司）解离。通过离心使细胞成团，并在预温的0.0375M KCl低渗溶液中重悬，并且孵育10分钟。在离心之后，将细胞重悬于固定剂（3:1的甲醇:乙酸）中。在显微镜用玻片上制备中期涂片，短暂暴露于胰蛋白酶并用4:1的Gurr/Leishmann氏染料（Sigma-Aldrich公司）染色，从而获得G带。分析至少10片中期涂片，并对另外20片进行计数。
形成畸胎瘤
在患重症联合免疫缺陷病（SCID）的幼年（7周大）小鼠的睾丸囊下植入约106个细胞，从而进行畸胎瘤形成实验。每种细胞系使用3只动物。通过每周触诊来观察畸胎瘤的生长，并且在植入8周后杀死小鼠。将畸胎瘤固定，用苏木精和曙红（HE），或者用苏木精、曙红和PAS（HE-PAS）对切片进行染色。通过对染色的切片的分析，所有三个胚胎种系层的组织成分的存在得到了证实。根据伦理委员会的批准，所有动物实验都是在卡罗林斯卡大学医院的无感染动物设备中进行的。
形成胚状体
在37℃、5%CO2下，使来自包被有LN-521的细胞培养皿上的ES细胞暴露于TrypLETMSelect中1分钟，用培养基洗涤两次，将其破坏成大的片，并以悬浮液的形式在低粘附平板中培养。所用培养基为补充有2mM L-谷氨酰胺、20%胎牛血清（GIBCO Invitrogen公司）、0.1mMβ-巯基乙醇（GIBCO Invitrogen公司）和1%非必需氨基酸（GIBCO Invitrogen公司）的Knockout DMEM（GIBCO Invitrogen公司）。悬浮1至2周后，将胚状体转移至包被有明胶的组织细胞培养96孔板（Sarstedt公司）中，培养1至2周，然后固定，用分别抗三个胚胎种系层标志物（平滑肌肌动蛋白、MAP-2和α-甲胎蛋白）的抗体染色，并如上所述进行免疫荧光分析。
细胞粘附试验
简言之，根据上面描述的方法将MaxiSorp96孔板（Nunc）用细胞外基质蛋白包被，并用含有牛血清白蛋白的O3培养基封闭。将ES细胞以50,000个细胞/cm2的细胞密度接种在包被有细胞外基质的平板上，并使其在细胞孵育器中粘附1小时。之后用培养基洗涤平板三次以除去没有粘附的细胞，之后将粘附的细胞用5%的戊二醛固定20分钟，并用0.1%的结晶紫（Kebo Lab公司，瑞典斯庞加市，http://www.kebolab.se）染色。1小时后，用水洗涤3次，用10%乙酸提取结晶紫，并通过在570nm下测量光密度来进行定量。所有实验以一式四份进行。
细胞存活和存活抑制试验
按照与上述细胞粘附试验相同的方法进行存活试验，不同之处在于将细胞置于细胞孵育器中24小时。对于存活抑制试验，将细胞保持在含有制造商推荐浓度的功能性封闭抗体或文中所示浓度的通路抑制剂的培养基中30分钟，然后接种在包被的培养皿上。所有实验以一式四份进行。
蛋白质印迹和ELISA.
如上所述，将HS181细胞用胰蛋白酶消化为单细胞悬液。对于抑制实验，将细胞置于具有封闭抗体或通路抑制剂的O3培养基中30分钟，然后将45万个细胞接种在预先包被了合适的基质包被物的35mm培养皿中。对于其它实验，在胰蛋白酶消化后直接接种相同数目的细胞。在所有情况中，允许细胞在37℃、5%CO2下铺展1小时。用冰冷的PBS洗涤两次后，将具有细胞的平板在液氮中急速冷冻并储存在-80℃。为了制备用于蛋白质印迹和ELISA的样品，将所述平板缓慢解冻并放置在冰上，在其上添加100-150μl的裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5%脱氧胆酸盐，0.5%SDS，1%Triton X-100，1%Igepal，CompleteTM（Roche公司）和Phospho-StopTM（Roche公司））。然后，利用27G3/4"针对细胞进行刮擦、吹和剪切。之后，在4℃下以16,100rcf离心15分钟以净化细胞团。对于蛋白质印迹，使用4-12%梯度凝胶进行SDS电泳，并将蛋白质转印至PVDF膜上。根据制造商的说明书，用目的抗体对该膜进行杂交。使用购自Amersham Biosciences公司的化学发光HRP-底物进行可视化。为了进行光密度法分析，以2,400dpi扫描该膜并用ChemiImager5500程序（1D-Multi Line光密度法分析模式）进行分析。对于ELISA，根据制造商的说明书将样品施加在孔中。
体内成像和迁移试验.
用细胞外基质蛋白包被24孔板，并用含有牛血清白蛋白的O3培养基封闭。以30,000-40,000个细胞/cm2的细胞密度将ES细胞接种在包被有细胞外基质的平板上，并在细胞孵育器中使其粘附半小时。之后，将平板转移至配有环境控制单元的高含量成像系统Operetta（PerkinElmer公司）中，使其保持37℃、5%CO2。对于拍摄的两部影像，在接种后的24小时内，每15分钟用Harmony软件（PerkinElmer公司）拍摄一次明场图像，输出，并用ImageJ软件（NIH公司，美国）分析。对于迁移试验，在接种后18小时内每7分钟拍摄一次图像。使用MTrackJ plug-in（大学医疗中心，荷兰鹿特丹市）对接种后在第5至第7小时之间获得的图像进行分析。对每个包被物上的100个粘附的细胞进行追踪，并且计算目前的踪迹点到之前的踪迹点的平均距离。误差线示出了平均标准误差（n=100）。
统计.通过Student’s双尾t检验确定不等方差，由此确定统计显著性。
实施例2的结果讨论
多能hES细胞表达α1、α5、β1、β2和γ1层粘连蛋白链。为了比较由单细胞悬液接种到不同包被基底上的hES细胞的粘附和克隆存活率，将在LN-511上以单层生长、或在饲养层上以簇生长的hES细胞用胰蛋白酶消化为处于O3培养基中的单细胞悬液，并且在不存在或存在ROCK抑制剂（Y-27632）下，接种在包被有Matrigel、LN-111、LN-511、LN-521、或LN-511和LN-521的混合物的细胞培养皿上，24小时后进行分析。
在Matrigel或LN-111上细胞未存活，但是它们在人重组LN-511和LN-521上以单细胞形式存活，并且在这两者的混合物上也存活。然而，LN-521上的细胞存活率显著高于在LN-511上的细胞存活率（下面用数值进行比较）。接种在人重组LN-111或LN-121上的细胞在24小时后不能存活（数据未示出），因此，这表明层粘连蛋白三聚体中存在β2链不足以支持该作用。在ROCK抑制剂Y-27632的存在下，hES细胞在所有表面上存活。
然而，在接种24小时之后，在缺乏或存在ROCK抑制剂的条件下生长在LN-521上的细胞之间，细胞形状有显著差别。在缺乏ROCK抑制剂的条件下，接种24小时后，生长在LN-521上的细胞为圆形；而在存在ROCK抑制剂的条件下生长的细胞则为类似纺锤或新月的形状，这可能由肌动蛋白细胞骨架重排导致。
为了检验LN-521是否可以用作用于人多能细胞长期自我更新的细胞包被材料，在O3、mTeSR1或TeSR2培养基中，在该蛋白质上培养HS181、HS401、H1细胞和人iPS ChiPSW和CutB1.2细胞。每10至14天，将在O3或mTeSR1培养基中生长的细胞以1:20-1:30的比例以单细胞悬液的方式传代。与生长在LN-511或Matrigel上以小簇方式传代的细胞相比，多能hES细胞以相似或更高的稳定速率增殖。因此，与以小簇方式传代两次的对照细胞相比，在LN-521上传代一次产生了相同或更高数目的细胞分裂。HS181、HS401和H1细胞分别在O3培养基中增殖至少24、5和15代（9、2和6个月）。CutB1.2iPS和ChiPSW细胞分别在mTeSR1中培养了5和3代。有趣的是，在完全确定且不含异源物的条件下，使用TeSR2培养基和TrypLE Select酶，能够在LN-521上培养解离的hES细胞。传代一次之后的接种效率略低于O3或mTeSR1培养基中的细胞，通常每10至14天以1:15-1:20的比例对解离的细胞进行传代。H1和HS401细胞已经在TeSR2中分别培养了12和4代（5和1.5个月）。
在包被有LN-521的培养皿中通常以每1cm230,000个细胞的密度，以单细胞悬液的形式接种hES细胞，这种接种使得各个细胞彼此之间没有任何的直接接触。接种8小时后，可以观察到单细胞形式的表达多能性标志物Oct4、Nanog和Sox2的hES细胞。接种24小时后，细胞形成小的单层群落，并最终结合形成覆盖孔的大部分的单层的大的岛状物。
在LN-521上生长的细胞显示出多能性标志物Oct4、Nanog和SSEA4的稳定的表达水平，这与接种在Matrigel上且以小簇方式传代的那些细胞相似。为了比较LN-521和Matrigel培养物的自发分化水平，在传代1次（10天）和传代10次（4个月）后，比较Matrigel培养物和LN-521培养物中所表达的分化标志物PAX6、SOX17和SOX7的mRNA的量。定量RT-PCR表明，在LN-521培养物中，所有三种分化标志物的表达水平类似于或低于Matrigel培养物，而不依赖于传代次数。
在O3培养基中在LN-521上分别传代12次和10次后，经鉴定，hES细胞系HS181和H1的核型正常；并且H1在TeSR2培养基中传代7次后核型也正常。向SCID小鼠中注射以下细胞以形成畸胎瘤：在O3培养基中在LN-521上分别培养13和12代的HS181和H1细胞以及在TeSR2培养基中在LN-521上培养7代的H1细胞；对该畸胎瘤进行的组织学检验表明，发育出了包含人胚胎的所有三个胚系的组织。体外分化也表明三种情况中的细胞保持了形成胚状体的能力，其表达中胚层（平滑肌肌动蛋白）、外胚层（MAP-2）和内胚层（α-甲胎蛋白）的标志物。
为了对包被基底的效果进行量化，研究了解离的hES细胞在Matrigel、LN-111、LN-511、LN-521、和LN-511与LN-521的等量混合物上，在1小时之后的粘附以及在24小时之后的存活。有趣的是，1小时后，虽然细胞在LN-521和LN-511上的铺展明显优于在Matrigel或LN-111上（未示出）的铺展，但约75-80%的相同量的细胞粘附在所有包被物上。24小时后，在Matrigel或LN-111上几乎没有细胞存活，在LN-511上仅有非常少量的细胞存活。相比之下，hES细胞在LN-521上的存活力比在Matrigel上的存活率高大约20倍，并且比在LN-511上的高3倍。
为了定量地比较LN-521和ROCK抑制剂（Y-27632）的作用，我们将来自相同的单细胞悬液的细胞以相同的接种密度（每1cm240,000个细胞）接种在含有10μM Y-27632的培养基中，并研究它们在不同包被物上的存活力。在接种24小时后，在LN-521上的未处理的细胞与在Matrigel上的经Y-27632处理的细胞显示出相似的存活率。有趣的是，与Matrigel相比，即使是经Y-27632处理的人ES细胞也在LN-521上存活得更好。
如果从O3培养基中除去外源bFGF，细胞仍然显示出在LN-521上的存活力比在Matrigel上高20倍。此外，hES细胞在接种24小时后在LN-521上仍存活，即使在缺乏TeSR1配制物的所有生长因子（bFGF、LiCl、γ-氨基丁酸（GABA）,哌啶酸和TGFβ）16的培养基中也是如此，这表明存活机制不依赖于由这些因子诱导的信号传递。
利用抗位于质膜上的针对LN-521的潜在受体的功能性封闭抗体对细胞存活的抑制进行检验，该检验表明抗整联蛋白α6的抗体（对β1有较低程度的抗性）抑制了人ES细胞在LN-521上的存活。抗其它所检验的整联蛋白亚基的功能性封闭抗体，以及抗卢氏受体和抗α-肌营养不良蛋白聚糖的功能性封闭抗体显示出对人ES细胞在LN-521上的存活力有非常低（几乎没有）的影响。
近来，已经表明ROCK抑制剂和细胞收缩抑制剂通过消除肌动蛋白-肌球蛋白的收缩而发挥作用，所述收缩是通过肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化介导的。为了检验LN-521是否具有类似的活性，比较接种之后1小时和6小时，位于Matrigel、LN-111、LN-511和LN-521上的解离细胞之间的磷酸化MLC的水平（图12和图13）。有趣的是，蛋白质印迹表明，与Matrigel和LN-111上的细胞相比，在LN-511和LN-521上的细胞中的MLC的磷酸化水平甚至更高。由于肌动蛋白-肌球蛋白重排不仅对于收缩是必须的，其对于细胞的运动性也是必需的，因此我们推测细胞迁移可能由LN-521与其整联蛋白受体α6β1之间的相互作用引起。Matrigel和LN-521上的细胞的体内成像表明，通过聚集成小的快速移动的群落，细胞在后者上迁移得更快并且能够存活。在接种后的第5小时和第7小时之间（此时，在所有情况中细胞仍然粘附），比较了hES细胞在所述四种包被物上的迁移（图14）。hES细胞在LN-521上的运动性高于该细胞在其它包被物上的运动性，并且这与细胞在包被物上存活的能力有关。用抗整联蛋白β1的功能性封闭抗体进行处理，显著降低了细胞在LN-521上的运动性（图15）和粘附性（数据未示出）。
大量数据表明由整联蛋白激活的MEK1/Erk或PI3-激酶/Akt通路可以阻断失巢凋亡。对LY294002和PD98059（分别是Akt和MEK1的特异性抑制剂）的效用进行了检验，以研究这些通路在hES细胞在LN-521上存活中的潜在作用。发现用LY294002阻断Akt的激活可促进hES细胞的分离和死亡，在LN-521上接种24小时后没有细胞存活（图16）。相比之下，用PD98059处理不那么严重地影响存活。用另一种PI3K/Akt特异性抑制剂渥曼青霉素处理的hES细胞在接种在LN-521上24小时后也无法存活，这证明激活PI3K/Akt是细胞在LN-521上存活所必需的。
由于已知bFGF是MEK1/Erk通路的有效激活剂，其影响不能被PD98059完全抑制，因此，我们在不含外源性bFGF的O3培养基中进行了相同的实验并得到了相同的结果（图17）。对接种在LN-521上1小时之后所收集的经处理的细胞和对照细胞进行蛋白质印迹分析，由此确定了LY294002处理和PD98059处理的作用（图18和图19）。
对在Matrigel和LN-521上生长的细胞的提取物用抗磷酸化-Akt的抗体进行蛋白质印迹分析，结果表明两种情况中的PI3K/Akt通路均被激活（数据未示出）。为了确定不同包被物上的细胞中的Akt激活水平，对在Matrigel、LN-111、LN-511和LN-521上接种1小时后（此时细胞彼此之间还没有直接接触）收集的细胞裂解物进行ELISA分析（图20和图21）。不同包被物上的细胞中的Akt2磷酸化水平与在它们上的存活力有关。
已经证明在α和β亚基中，α6和β1整联蛋白分别是人ES细胞中表达最丰富的整联蛋白同种型。整联蛋白α6β1表现出对不同层粘连蛋白有广谱特异性，但是其对LN-521或LN-511的结合亲和力高于对LN-111的结合亲和力。近来已经确定，与β1层粘连蛋白相比，β2层粘连蛋白对整联蛋白的亲和力更高。因此，由于对整联蛋白具有最高的亲和力，LN-521能提供用于迁移的最佳锚定，并且可通过α6β1整联蛋白传送最高量的信号，这导致解离的多能hES细胞具有最佳的存活力，尽管（例如）LN-511也可以以较低的水平做到这一点。
本发明的结果可有利于人多能干细胞的普遍培养和扩增，甚至可使这种细胞（包括用于临床应用的细胞）的自动化扩增成为可能。解离的hES细胞在LN-521上的存活似乎依赖于迁移，因此以极低密度接种后该细胞不能存活。本文所述的新的hES细胞培养方法仅利用天然存在的LN-521粘着蛋白，其不会像ROCK抑制剂处理或细胞收缩抑制剂处理那样损坏细胞骨架。因此，只有在细胞表面上具有正确的整联蛋白谱时，LN-521才能最有利于细胞的存活。本发明的结果还表明，以每1cm220,000-30,000个细胞的较低的密度接种在LN-521上的hES细胞能够存活，并且能够至少与其它hES培养系统一样有效地增殖。所述新方法非常类似于标准的细胞培养程序（如成纤维细胞的培养），因此，在LN-521上培养hES细胞不需要受到特别训练的人员，而这在之前是一个主要的问题，因为培养hES细胞是具有技术挑战的。
广泛使用的用于人多能干细胞自我更新的TeSR1配制物最初是被开发用于Matrigel的，并且其含有高剂量的主要针对MEK1/Erk通路的bFGF，因此其不被广泛地认为对多能hES细胞具有有益效果。本发明的结果可凭借LN-521作为包被材料以及通路特异性的优势来开发新的培养基配制物，这对于人ES细胞自我更新而言是重要的。
总体而言，本发明表明，与LN-511相似，由多能hES正常分泌的LN-521可以在培养中单独用作支持人多能干细胞自我更新的包被材料。这两种层粘连蛋白均有利于细胞在体外以同质的单层生长。然而，这两种层粘连蛋白之间的重要差别在于，hES/hiPS细胞可以被胰蛋白酶消化为单细胞悬液，并且可在LN-521上接种并由单细胞有效地扩增，这与手工分开细胞簇是不同的，而手工分开细胞簇是在Matrigel或饲养细胞上生长的hES/iPS细胞进行扩增所需要的。本发明的结果可以有利于培养人多能干细胞并且有利于这种细胞的自动化扩增。
实施例3
在两种不同的细胞培养基中，在层粘连蛋白-521基底上培养人胚胎干细胞。两种细胞培养基的不同之处在于bFGF的含量，3.9ng/ml和100ng/ml。
图22示出了在含有3.9ng/mL bFGF并具有层粘连蛋白-521基底的O3培养基中培养的HS181hES细胞传代5次（40天）后的生长曲线，该曲线用黑色实线表示。O3培养基是市售可得的化学成分确定的mTeSR1培养基的变化形式，其含有牛血清白蛋白作为唯一的动物来源成分。在含有100ng/mL bFGF并具有层粘连蛋白-521基底的O3培养基中培养的HS181hES细胞的生长曲线用虚线表示。将细胞解离为单细胞悬液以用于传代。如本文所示，bFGF量较低的生长曲线与bFGF量较高的生长曲线一样好或更好。
图23示出了在两种培养基中传代5次（40天）后，多能性标志物Oct4和Nanog的mRNA转录本的相对量，这利用实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析而获得。两种细胞培养基又一次获得了相似的量，这表明量较低的bFGF中的干细胞保持了多能性。因此，特别是与层粘连蛋白-521基质结合使用时，可以使用较低量的bFGF，并且仍然可以获得良好的结果。
实施例4
在实施例1和2中，解离的干细胞主要通过在LN-521上进行活跃运动并且联合成小的有效生长和迁移的单层岛状物而存活。以非常低的克隆密度接种的细胞通过失巢凋亡（程序性细胞死亡的特殊形式）而死亡。通常，来自于细胞外基质分子（如层粘连蛋白）的整联蛋白相关的信号传递以及钙粘蛋白相关的细胞-细胞信号传递可以防止失巢凋亡。人ES细胞表面最丰富的钙粘蛋白同种型为上皮-钙粘蛋白（E-钙粘蛋白）。进行实施例3中的实验以研究LN-521和E-钙粘蛋白结合是否能保护人ES细胞不发生失巢凋亡并使得细胞能够克隆存活。
在mTeSR1培养基中，在不同包被物上，以每cm2250个细胞的密度接种hES细胞，培养5天后使用碱性磷酸酶染色试剂盒进行检测。层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白都不能单独地使得已被分成单个的hES细胞实现有效的克隆存活。
接下来，检测层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的结合以确定这种结合是否能保持细胞的克隆存活。使用固定量的层粘连蛋白-521包被细胞培养皿，并且滴加E-钙粘蛋白。不同比例的E-钙粘蛋白和层粘连蛋白-521实现了细胞的克隆存活，所述比例包括约1:10w/w至约1:5w/w。
进行另外的测试以检测对mTeSR1培养基进行各种改变的效果。使用比例为约1:10w/w的E-钙粘蛋白与层粘连蛋白-521的混合物包被平板。出乎意料的是，发现白蛋白浓度升高2倍显著提高了hES细胞在层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上的克隆存活。在这些条件下，独立化的hES细胞的存活率为10%至15%，并且无论是在mTeSR1培养基中还是在含有附加的白蛋白的mTeSR1培养基中，该存活率均比在单独的Matrigel、层粘连蛋白-521或E-钙粘蛋白上的细胞高一个数量级。对细胞的延时摄影证明，层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白包被物通过单细胞的增殖而不是通过不同细胞的聚集而促进细胞的存活。相似地，层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白保持了细胞在化学成分完全确定且不含异源物的、添加有重组人血清白蛋白（rHSA）的TeSR2培养基中的克隆存活。
在另一试验中，使hES细胞系进行了衍生分化。用Dulbecco磷酸盐缓冲液洗涤24孔组织细胞培养板2次。然后在37℃下用含有下列物质的灭菌溶液包被所述培养板2小时，从而制备层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质，所述物质为：48μL的100μg/mL层粘连蛋白-521（BioLamina AB公司，斯德哥尔摩）；6μL的82μg/mL E-钙粘蛋白（RDSystems公司）；和含有钙和镁的300μL of DPBS（GIBCO公司）。
在得到合作伙伴同意和伦理会批准后，从公认的体外受精诊所获得了用于衍生分化hES细胞系的捐赠胚胎。仅使用了新鲜或冷冻胚胎（其不能用于不孕不育治疗）用于分化程序。在使用为此目的设计的激光装置在透明带上打开一个小开口后，使用微量吸液管从8细胞期胚胎中分离出一个或两个细胞。该工艺已经获得了在临床上用于胚胎植入前基因诊断（PGD）的授权。将细胞接种在含有附加的rHSA的TeSR2培养基中的层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上。细胞成功地粘附并开始增殖。允许母代胚胎生长至胚泡期并冷冻。在37℃和5%O2/10%CO2下，利用在油中形成液滴的不含异源物的标准化体外受精培养基进行胚胎培养。除去透明带后，人工分离出5个人胚泡的内细胞团，并接种在4孔培养板（Nunc公司）中的层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上。初始培养48小时后，每天更换培养基。10至14天后，人工分离出生长晕并重新接种在层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上。采用人工传代进行随后的2至3次传代，之后使用TrypLE Select（GIBCO公司）对克隆进行传代。
通过使用上述的层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质以及含有附加的牛白蛋白的mTeSR1培养基，由6个培养的胚泡衍生分化出3个新的hES细胞系。接种4天后，内细胞团提供了干细胞样生长晕。图24示出了新的人胚胎干细胞系HS841在层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上的早期分化。显示了由6天的胚泡的内细胞团，在人工分离出内细胞团并接种在层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质上4天后生长出的形态学典型的人胚胎干细胞。
出乎意料的是，所述细胞培养系统和方法由6个胚胎中的3个（50%）提供了稳定的hES细胞系，其分化率高于标准方法。
使用层粘连蛋白-521/E-钙粘蛋白基质和含有附加的rHSA的TeSR2培养基（其为化学成分完全确定且不含异源物的环境）产生了与新hES细胞系衍生分化类似的结果。
应当理解，可以将上述公开以及其它特征和功能的改变形式或其替代形式组合成很多其它不同的系统或应用。本领域技术人员可以进行目前未预见到或未预料到的各种替换、修改、改变或改进，也应理解这些替换、修改、改变或改进亦被包含在所附权利要求书中。
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Claims (20)

1.一种用于保持多能干细胞的系统，包含：
细胞培养基，其含有大于0至3.9ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；和
为所述干细胞提供支持的基底。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述基底包含层粘连蛋白-521或层粘连蛋白-511。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述基底还包含钙粘蛋白。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述基底包含层粘连蛋白-521，并且其中所述bFGF的量为小于或等于3.5ng/mL。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述细胞培养基包含0.5ng/mL至3.5ng/mL的bFGF。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述细胞培养基还包含至少一种附加生长因子、至少一种微量矿物质和至少一种脂类。
7.一种为多能干细胞提供营养的细胞培养基，包含大于0至3.9ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其包含小于或等于3.5ng/mL的bFGF。
9.根据权利要求7所述的细胞培养基，其包含0.5ng/mL至3.5ng/mL的bFGF。
10.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种无机盐。
11.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种微量矿物质。
12.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种能量物质。
13.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种脂类。
14.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种氨基酸。
15.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种维生素。
16.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种附加生长因子。
17.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种无机盐、至少一种微量矿物质、至少一种能量物质、至少一种脂类、至少一种氨基酸和至少一种维生素。
18.根据权利要求7所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基不含以下物质中的任意一者：（1）白蛋白，（2）胰岛素或胰岛素替代物，或（3）转铁蛋白或转铁蛋白替代物。
19.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含白蛋白、胰岛素、氯化锂、GABA、TGFβ1、哌啶酸、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、以及DMEM/F12溶液。
20.根据权利要求7所述的细胞培养基，其还包含至少一种附加生长因子、至少一种微量矿物质和至少一种脂类。
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