CN111569048B

CN111569048B - LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN111569048B
Application number: CN202010440602.4A
Authority: CN
Inventors: 李林溪; 郑泉恩
Original assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: AU2020103976A4; CN111569048A

Abstract

本发明提供了LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，属于生物技术领域。LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，LamG5肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验证明，LamG5编码基因过表达显著升高细胞电阻水平，修复了因PFOS染毒所破坏的支持细胞间紧密连接功能，同时使细胞间连接紧密，修复了支持细胞的紧密连接结构；同时在LamG5过表达后，细胞内的骨架蛋白结构分布明显好于空质粒转染组，显示出的细胞骨架蛋白分布与空白对照组相似，这说明LamG5的过表达修复了支持细胞的细胞骨架蛋白结构。

Description

LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体涉及LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用。

背景技术

全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulphonate，PFOS)是多种不同氟化有机物在环境中的降解产物。PFOS广泛存在于环境中，包括纺织品、纸张、皮革、日化产品等工业生产中，难于分解或降解。PFOS可在生物体内通过食物链发生富集。通过饮用水、食物等摄入机体内的PFOS很难被生物排出体外，最终富集于生物或人体的多种脏器中，其人体代谢半衰期达5年以上。大量研究显示，PFOS具有包括遗传毒性、神经毒性、发育毒性、生殖毒性等多种生物毒性，被认为是一种具有全身多脏器毒性的环境污染物。PFOS对雄性生殖功能具有破坏作用，包括诱导大鼠睾丸损伤，降低男性精子质量和睾酮水平等。

层粘连蛋白-α2链(Laminin α2)是哺乳动物睾丸基膜的主要组成蛋白之一。层粘蛋白-α2在C末端一共有5个LamG结构域，LamG5位于层粘连蛋白型球状(LamG)结构域中最靠近C末端的结构域。现有技术中关于层粘连蛋白-α2的报道较多，例如LAMA2基因通过Hedgehog通路调控人间充质干细胞成骨分化的作用(朱原,2019年.)，再例如血层粘连蛋白与慢性肾功能不全相关的报道(万福俊,2001年.)。但是目前并没有关于LamG5与睾丸中支持细胞损伤有关的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供LamG5肽的新用途，即LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用。

本发明提供了LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，所述LamG5肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述LamG5肽的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述LamG5肽的编码序列以重组表达载体的形式存在；

所述重组表达载体以pCI-neo为基础载体，所述LamG5肽的编码序列插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。

优选的，所述重组表达载体的转染剂量为5～50μg/个睾丸。

优选的，所述LamG5肽的编码序列的扩增引物对如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述睾丸中支持细胞损伤是由全氟辛烷磺酸盐引起的。

优选的，所述睾丸中支持细胞损伤包括支持细胞间紧密连接功能破坏、支持细胞的紧密连接结构损伤和支持细胞的细胞骨架蛋白结构破坏。

本发明提供的LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，所述LamG5肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将LamG5肽的编码基因转染至睾丸支持细胞中过表达，结果表明，转染了pCI-neo-LamG5质粒组的细胞电阻水平显著升高，并且持续至培养第七天。说明LamG5的过表达修复了因PFOS染毒所破坏的支持细胞间紧密连接功能。通过形态学观察，支持细胞PFOS染毒后，细胞-细胞间连接界面发生显著破坏，与空白对照组相比，空质粒转染组因PFOS染毒，使得细胞-细胞间连接界面呈现断续、皱缩和空洞等现象。说明支持细胞体外所形成的紧密连接结构受到了PFOS诱导的损伤。而LamG5过表达组的细胞-细胞间连接与空白对照组相似，细胞间连接紧密，没有明显的断续和皱缩等现象。结果说明LamG5的过表达修复了支持细胞的紧密连接结构。支持细胞PFOS染毒后，空质粒对照组的支持细胞骨架结构受到显著的破坏，例如Actin微丝结构由正常均匀笔直平行贯穿整个细胞质的结构变成交错蜷曲且显示出皱缩的分布；同时，Tubulin细胞骨架结构的由正常的自由舒展分布在整个细胞质的结构变成杂乱卷曲且更加聚集在细胞核周围的形态，在LamG5过表达后，细胞内的骨架蛋白结构分布明显好于空质粒转染组，显示出的细胞骨架蛋白分布与空白对照组相似，这说明LamG5的过表达修复了支持细胞的细胞骨架蛋白结构。

附图说明

图1为LamG5片段的PCR扩增电泳结果图；

图2为pCI-neo-LamG5经哺乳动物体内过表达提取的质粒经双酶切得到的酶切产物电泳结果；

图3为支持细胞体外紧密连接通透性电阻检测结果；

图4为支持细胞体外紧密连接结构检测结果；

图5为支持细胞体外细胞骨架蛋白Actin结构检测；

图6为支持细胞体外细胞骨架蛋白Tubulin结构检测。

具体实施方式

本发明提供了LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，所述LamG5肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(VGLDLLVEFEFRTTRPTGVLLGVSSQKMDGMGIEMIDEKLMFHVDNGAGRFTAVYDAGSPGHMCDGRWHKVTAKKIKNRLELVVDGNQVDAQSPNAASTSADTNDPVFVGGFPDGLNQFGLTTNVRFRGCIRSLKLTKGTGKPLEVNFAKAL)。

在本发明中，所述睾丸中支持细胞损伤优选包括支持细胞间紧密连接功能破坏、支持细胞的紧密连接结构损伤和支持细胞的细胞骨架蛋白结构破坏。所述睾丸中支持细胞损伤优选是由全氟辛烷磺酸盐(PFOS)引起的。例如，PFOS处理后，使支持细胞的电阻显著降低，使细胞-细胞间连接界面发生显著破坏，与空白对照组相比，空质粒转染组因PFOS染毒，使得细胞-细胞间连接界面呈现断续、皱缩和空洞等现象，还会造成Actin微丝结构由正常均匀笔直平行贯穿整个细胞质的结构变成交错蜷曲且显示出皱缩的分布；同时，Tubulin细胞骨架结构的由正常的自由舒展分布在整个细胞质的结构变成杂乱卷曲且更加聚集在细胞核周围的形态。

在本发明中，所述LamG5肽通过在支持细胞中过表达发挥作用。所述LamG5肽的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。所述LamG5肽的编码序列优选以重组表达载体的形式存在；所述重组表达载体优选以pCI-neo为基础载体，所述LamG5肽的编码序列优选插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。所述LamG5肽的编码序列的扩增引物对优选如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。所述LamG5肽的编码序列导入支持细胞中的方法优选转染。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可。在本发明实施例中，所述转染采用转染试剂实现。所述重组表达载体的转染剂量优选为5～50μg/个睾丸，更优选15μg/个睾丸。

在本发明中，LamG5的过表达使细胞电阻水平显著升高，修复了因PFOS染毒所破坏的支持细胞间紧密连接功能；LamG5过表达组的细胞-细胞间连接与空白对照组相似，细胞间连接紧密，没有明显的断续和皱缩等现象，说明LamG5的过表达修复了支持细胞的紧密连接结构；同时在LamG5过表达后，细胞内的骨架蛋白结构分布明显好于空质粒转染组，显示出的细胞骨架蛋白分布与空白对照组相似，这说明LamG5的过表达修复了支持细胞的细胞骨架蛋白结构。

下面结合实施例对本发明提供的LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

LamG5编码基因片段的克隆方法

采用SD大鼠睾丸cDNA，参考大鼠层粘蛋白α2编码基因序列XM_017590489.1设计克隆引物

上游引物：CCGCTCGAGATGGTTGGATTGGACCTTCTTGTA(SEQ ID NO.3)；

下游引物ACGCGTCGACTTACAGAGCCTTGGCAAAATTAAC(SEQ ID NO.4)；

引物中包括限制性内切酶位点XhoI/SalI、启动/中止密码子和保护性碱基，PCR扩增后得到LamG5编码基因片段，电泳检测。其电泳结果如图1所示，图1为LamG5片段的PCR扩增电泳结果图。由图1可知，PCR产物预测长度为481bp，电泳结果与预测产物长度相符合。由此可知，扩增得到符合预测长度的PCR产物。

2.LamG5编码基因片段的测序

回收扩增所得编码基因片段PCR产物，送GeneWiz公司测序，测序结果如SEQ IDNO.2所示

(GTTGGATTGGACCTTCTTGTAGAATTTGAATTCCGTACCACAAGACCCACTGGAGTCCTCCTGGGAGTCAGCAGTCAGAAGATGGATGGAATGGGTATTGAAATGATTGACGAGAAGCTTATGTTCCATGTGGATAATGGCGCCGGCCGATTCACTGCGGTCTACGATGCTGGGAGCCCAGGCCATATGTGCGATGGACGATGGCATAAAGTCACTGCCAAGAAGATCAAAAACCGCCTTGAGCTGGTGGTAGATGGGAACCAGGTGGATGCCCAGAGCCCAAATGCAGCCTCCACATCAGCAGATACAAACGACCCTGTTTTTGTTGGCGGTTTCCCAGATGGCCTCAATCAGTTTGGCCTGACCACCAACGTTAGGTTCCGAGGCTGCATCCGATCTCTGAAGCTCACCAAAGGGACAGGCAAGCCGCTGGAGGTTAATTTTGCCAAGGCTCTG)。上述测序结果显示与参考大鼠层粘蛋白α2编码基因序列XM_017590489.1同源度达99％以上，说明成功克隆LamG5编码基因片段。

3.LamG5片段重组表达载体的构建

对克隆的LamG5编码基因片段连接至真核表达载体pCI-neo(Promega公司)，得到表达载体pCI-neo-LamG5。对表达载体进行XhoI/SalI双酶切，酶切图谱如图2所示，图2为pCI-neo-LamG5经哺乳动物体内过表达提取的质粒经双酶切得到的酶切产物电泳结果。由图2可知，插入片段长度为456bp，克隆得到正确的表达载体。

实施例2

原代睾丸支持细胞分离培养

20日龄雄性SD大鼠共10只，处死后取睾丸。去除睾丸包膜，游离生精小管团，以剪刀剪碎至1mm³，然后依次以胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂、胶原酶、透明质酸酶等酶类消化。消化后的细胞团以玻璃巴氏吸管吹打后，密度梯度离心，最终取沉淀的细胞测量其体积并换算为细胞数。最终将细胞培养于含有人转铁蛋白(5μg/ml)、牛胰岛素(10μg/ml)、杆菌肽(5μg/ml)和上皮生长因子(2.5ng/ml)的F12/DMEM细胞培养液中。

实施例3

支持细胞PFOS染毒后LamG5的过表达对细胞间连接功能的修复

实施例2分离的支持细胞可在体外培养条件下形成类似上皮细胞的紧密连接形态。在接种原代分离的支持细胞前，将培养液稀释的基质胶包被在细胞培养小室的硝酸纤维素膜表面上，之后接种支持细胞，待其贴附培养小室生长，以Millicell-ERS(Millipore)细胞电阻检测仪检测其跨膜电阻，每天检测一次。在支持细胞培养第三天进行PFOS处理，终浓度20μM，处理共24小时。第四天(PFOS处理后24小时)换液，转染LamG5真核细胞表达载体pCI-neo-LamG5或空载体pCI-neo，转染试剂为Lipojet InVitro Transfection Reagent(SignaGen Laboratories,Rockville,MD,USA)，总转染体系3μl，其中包含1μg实施例1制备的重组表达载体DNA。转染12小时后换液洗去转染试剂。每天检测细胞电阻至原代分离后7天。每组均有3个细胞培养小室。

结果见图3。图3为支持细胞体外紧密连接通透性电阻检测结果。由图3可知，PFOS处理后，细胞电阻显著降低，两组(空质粒对照组和LamG5表达组)的细胞电阻值较空白对照组下降达30～40Ohm·cm²，说明PFOS对支持细胞的细胞间紧密连接功能具有显著的破坏作用。空白对照组和空质粒对照组转染了pCI-neo空质粒，LamG5表达组转染了pCI-neo-LamG5质粒，因为转染试剂的具有一定毒性作用，所有各组的细胞电阻值均有不同程度的下降。但在培养第六天的检测中可发现，转染了pCI-neo-LamG5质粒组的细胞电阻水平显著升高，并且持续至培养第七天。说明LamG5的过表达修复了因PFOS染毒所破坏的支持细胞间紧密连接功能。

实施例4

体外支持细胞PFOS染毒后LamG5的过表达对其细胞间连接功能修复的形态学观察

在进行支持细胞分离前一天，将灭菌的盖玻片置入12孔板中，表面包被细胞培养液稀释的基质胶，无菌风干后放入细胞培养箱中备用。支持细胞分离后，接种进12孔板中培养。在培养第三天进行PFOS处理。加入终浓度20μM的PFOS，处理24小时后(培养第四天)洗去PFOS。同时加入转染试剂和不同分组相应的pCI-neo空质粒或pCI-neo-LamG5表达质粒，转染进行12小时后，洗去转染体系加入新鲜培养液。继续培养至分离后第六天，收集接种细胞的盖玻片，加入多聚甲醛溶液固定。

为了观察支持细胞体外培养时的细胞间紧密连接形态，以支持细胞紧密连接结构相关蛋白CAR(SantaCruz，sc-373791)和ZO-1(ThermoFisher，61–7300)的抗体进行免疫荧光染色(绿色荧光)，并在染色结束后以DAPI染色细胞核(蓝色荧光)。封片后以荧光显微镜观察并拍摄照片。

实验结果显示如图4所示，支持细胞PFOS染毒后，细胞-细胞间连接界面发生显著破坏，与空白对照组相比，空质粒转染组因PFOS染毒，使得细胞-细胞间连接界面呈现断续、皱缩(黄色箭头)和空洞(红色箭头)等现象。说明支持细胞体外所形成的紧密连接结构受到了PFOS诱导的损伤。而LamG5过表达组的细胞-细胞间连接与空白对照组相似，细胞间连接紧密，没有明显的断续和皱缩等现象。结果说明LamG5的过表达修复了支持细胞的紧密连接结构。

实施例5

体外支持细胞PFOS染毒后LamG5的过表达对其细胞骨架功能修复的形态学观察。

细胞分离培养方法按照实施例2中方法进行，接种细胞于准备好的12孔板中。结束实验后经多聚甲醛固定的细胞进行特异性荧光染色和免疫荧光染色。其中，对于细胞骨架蛋白Actin的染色采用荧光标记的鬼笔毒素(ThermoFisher，A12379)染色(绿色荧光)，对于细胞骨架蛋白Tubulin的染色采用抗体(Abcam，ab7291)染色(绿色荧光)，并在染色结束后以DAPI染色细胞核(蓝色荧光)。封片后以荧光显微镜观察并拍摄照片。

实验结果如图5和6所示。图5为支持细胞体外细胞骨架蛋白Actin结构检测；对各组细胞采用绿色荧光标记的鬼笔毒素(Alexa Fluor^TM488Phalloidin ThermoFisher，A12379)染色，细胞核染色DAPI为蓝色荧光；比例尺＝40μm。图6为支持细胞体外细胞骨架蛋白Tubulin结构检测。对各组细胞采用Tubulin抗体(Abcam，ab7291)及其相应荧光二抗染色为绿色荧光，细胞核染色DAPI为蓝色荧光；比例尺＝40μm。

支持细胞PFOS染毒后，空质粒对照组的支持细胞骨架结构受到显著的破坏。其主要体现在Actin(图5)微丝结构由正常均匀笔直平行贯穿整个细胞质的结构(橙色箭头)变成交错蜷曲且显示出皱缩的分布(黄色箭头)。同时，Tubulin细胞骨架结构(图6)的由正常的自由舒展分布在整个细胞质的结构变成杂乱卷曲且更加聚集在细胞核周围的形态。在LamG5过表达后，细胞内的骨架蛋白结构分布明显好于空质粒转染组，显示出的细胞骨架蛋白分布与空白对照组相似(见图5和图6)。结果说明LamG5的过表达修复了支持细胞的细胞骨架蛋白结构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院

<120> LamG5肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu Phe Arg Thr Thr Arg Pro

1 5 10 15

Thr Gly Val Leu Leu Gly Val Ser Ser Gln Lys Met Asp Gly Met Gly

20 25 30

Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp Asn Gly Ala

35 40 45

Gly Arg Phe Thr Ala Val Tyr Asp Ala Gly Ser Pro Gly His Met Cys

50 55 60

Asp Gly Arg Trp His Lys Val Thr Ala Lys Lys Ile Lys Asn Arg Leu

65 70 75 80

Glu Leu Val Val Asp Gly Asn Gln Val Asp Ala Gln Ser Pro Asn Ala

85 90 95

Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe Val Gly Gly Phe

100 105 110

Pro Asp Gly Leu Asn Gln Phe Gly Leu Thr Thr Asn Val Arg Phe Arg

115 120 125

Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly Lys Pro Leu

130 135 140

Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu

145 150

<210> 2

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttggattgg accttcttgt agaatttgaa ttccgtacca caagacccac tggagtcctc 60

ctgggagtca gcagtcagaa gatggatgga atgggtattg aaatgattga cgagaagctt 120

atgttccatg tggataatgg cgccggccga ttcactgcgg tctacgatgc tgggagccca 180

ggccatatgt gcgatggacg atggcataaa gtcactgcca agaagatcaa aaaccgcctt 240

gagctggtgg tagatgggaa ccaggtggat gcccagagcc caaatgcagc ctccacatca 300

gcagatacaa acgaccctgt ttttgttggc ggtttcccag atggcctcaa tcagtttggc 360

ctgaccacca acgttaggtt ccgaggctgc atccgatctc tgaagctcac caaagggaca 420

ggcaagccgc tggaggttaa ttttgccaag gctctg 456

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgctcgaga tggttggatt ggaccttctt gta 33

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgcgtcgac ttacagagcc ttggcaaaat taac 34

Claims

1.LamG5 肽在制备修复睾丸中支持细胞损伤的药物中的应用，所述LamG5 肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述睾丸中支持细胞损伤是由全氟辛烷磺酸盐引起的；

所述睾丸中支持细胞损伤包括支持细胞间紧密连接功能破坏、支持细胞的紧密连接结构损伤和支持细胞的细胞骨架蛋白结构破坏。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述LamG5肽的编码序列的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述LamG5肽的编码序列以重组表达载体的形式存在；

所述重组表达载体以pCI-neo为基础载体，所述LamG5肽的编码序列插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组表达载体的转染剂量为5~50μg/个睾丸。

5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述LamG5肽的编码序列的扩增引物对如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。