CN114129708B

CN114129708B - Invs蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN114129708B
Application number: CN202111486020.0A
Authority: CN
Inventors: 李林溪; 褚津津; 李晓珩; 王义炎; 曹淑彦; 吕莉秀; 吴颖; 葛仁山
Original assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: LU503112B1; ZA202204058B; CN114129708A

Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，特别是涉及INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用。本发明提供的INVS蛋白可有效修复重金属诱导的睾丸损伤。

Description

INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，特别是涉及INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用。

背景技术

人体暴露在多种环境污染物(包括重金属等)后，以氯化镉为例，对雄性生殖功能会产生多种不利影响，会对精子发生过程造成多种损害。现有多项有关重金属诱导睾丸生精上皮损伤的研究，如【Xiao X,Mruk D D,Tang E I,et al.Environmental toxicantsperturb human Sertoli cell adhesive function via changes in F-actinorganization mediated by actin regulatory proteins[J].Human Reproduction,2014(6):1279-91.】，但目前并没有一种基于平面细胞极化作用相关蛋白的生精上皮损伤的修复药物。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用，所述INVS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述INVS蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述INVS蛋白的编码基因的扩增引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述重金属诱导的睾丸损伤包括睾丸内生精小管生精上皮损伤和/或睾丸细胞骨架蛋白结构损伤。

优选的，所述睾丸内生精小管生精上皮损伤包括睾丸内生精小管生精上皮结构性损伤。

优选的，所述重金属包括镉。

本发明还提供了一种防治睾丸损伤的药物，所述药物包括含INVS蛋白的编码基因的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体的基础载体包括pCI-neo。

优选的，所述INVS蛋白的编码基因位于基础载体的XhoI和NotI酶切位点之间。

优选的，所述药物的有效剂量为每个睾丸5～50μg所述重组表达载体。

有益效果：

INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用。本发明通过试验得出：在睾丸内过表达INVS蛋白，对氯化镉染毒造成睾丸内生精小管生精上皮的结构完整性损害起到了明显的修复作用；氯化镉染毒后造成整个睾丸切面中90％以上的生精小管发生病变，而INVS蛋白过表达将这一病变发生率降低至30％～50％左右，修复作用明显。此外，INVS蛋白在睾丸内过表达，对氯化铬染毒造成睾丸组织的肌动蛋白细胞骨架聚合能力发挥了拯救的作用。INVS蛋白过表达后，与空载体对照组相比，氯化镉染毒造成的游离Actin聚合能力损伤得到了修复，说明INVS蛋白可通过维持生精上皮细胞骨架蛋白结构实现了对氯化铬染毒诱导的生精上皮损伤的修复。

附图说明

图1为INVS蛋白片段的PCR扩增电泳结果；

图2为构建的pCI-neo-INVS过表达载体双酶切后酶切产物电泳图；

图3为pCI-neo-INVS表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒诱导睾丸损伤的抑制情况结果图；其中黑色比例尺长度为100μm；右图为左图方框区域的放大图；

图4为睾丸切片中损伤的生精小管数目占总生精小管数目百分比柱形图；

图5为INVS蛋白过表达后的组织总RNA反转录PCR鉴定结果；

图6为pCI-neo-INVS表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒诱导的睾丸组织细胞骨架蛋白Actin聚合能力检测结果；A为阴性对照，B为阳性对照，C为pCI-neo，D为pCI-neo+Cd，E为pCI-neo-Invs+Cd。

具体实施方式

本发明提供了INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用，所述INVS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MNISENVLSTGSSLASQVHAAAVNGDKGALQRLIVGNSALKDKEDQFGRTPLMYCVLADRLDCADALLKAGADVNKTDHSRRTALHLAAQKGNYRFMKLLLTRRANWMQKDLEEMTPLHLSTRHRSPKCLALLLKFMAPGEVDTQDKNKQTALHWSAYYNNPEHAKLLIKHDSNIGIPDVEGKIPLHWAANHKDASAVHTVRCILDAAPTESLLNWQDYEGRTPLHFAVADGNLTVVDVLTSYESCNITSYDNLFRTPLHWAALLGHAQIVHLLLERNKSGTVPSDSQGATPLHYAAQSNFAETVKVFLTHPSVRDDSDLEGRTSFMWAAGKGSDDVLRTMLSLKSDIDINMADKYGGTALHAAALSGHVSTVKLLLDNDAQVDATDVMKHTPLFRACEMGHRDVIQTLIKGGARVDLVDQDGHSLLHWAALGGNADVCQILIENKINPNVQDYAGRTPLQCAAYGGYINCMAVLMENNADPNIQDKEGRTALHWSCNNGYLDAIKLLLDFAAFPNQMENNEERYTPLDYALLGERHEVIQFMLEHGALSIAAIQDIAAFKIQAVYKGYKVRKAFRDRKNLLMKHEQLRKDAAAKKREEENKRKEAEQKGQPDTDPPRPQVLPCPPSPQNEPSRQSAAPSKQPPASHTVQSPDPEQGRPAGQCPGRASHRDCSSDLQGTASRKPSESPREHCRGASAGVHPRSCEDGDSYRHQGTSSAEKCRGETSGEHQRCEQGPSRARQPVSTGSAGPAEKGEDSSPAITSASQRDRPRKPSKRQDGAPRSRGASQKRRTHQLRDRCSPAGSSRPGSAKAEVARADQSSVHHDTPRNKVTQDKLVGGVSSDVPLSTEELGSGCQKLYEDLCASPENNVAHGPRPGQSVNIHLLPVEQRLLIIQRERSRKELFRRKNKAAAVIQRAWRSYQLRKHLSRLLHLKQLGARDVLRCTQLCAALLLQVWRKELELKFPKSISVSRTSKSPSKGMSAAKSARHSVLRQIYGCSQEGKVHHPIRSPKVPPVLHLSSVNSLQSIHLDSSGRSKKFSYNLQPASQSKNKPKL。

在本发明中，所述INVS蛋白的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：ATGAACATATCAGAGAATGTGCTCTCTACGGGGTCCTCATTAGCATCTCAGGTTCATGCCGCTGCAGTTAATGGAGATAAAGGTGCCCTTCAGAGACTCATTGTTGGAAACTCTGCTCTTAAAGACAAAGAAGACCAATTTGGGAGAACACCACTTATGTATTGTGTGTTGGCAGACAGATTGGACTGTGCAGATGCCCTTCTAAAAGCAGGGGCAGATGTCAACAAAACCGACCATAGCCGGAGAACAGCCCTCCACCTTGCAGCCCAAAAGGGAAATTACCGCTTTATGAAACTCTTACTCACTCGCAGAGCAAACTGGATGCAGAAGGACCTAGAAGAGATGACGCCTCTGCACCTGAGCACTCGGCACAGGAGCCCCAAGTGTCTAGCGCTCCTGCTGAAGTTTATGGCGCCCGGGGAGGTGGATACACAGGACAAAAACAAGCAAACAGCTCTGCACTGGAGCGCCTACTACAACAATCCCGAGCATGCGAAGCTGCTCATCAAGCATGACTCCAACATCGGGATTCCTGACGTGGAGGGCAAGATCCCCCTCCACTGGGCAGCCAACCATAAAGACGCGAGTGCCGTGCACACAGTGAGATGCATCCTGGATGCCGCCCCAACAGAGTCTTTATTGAACTGGCAAGACTATGAGGGCCGCACACCTCTGCACTTCGCAGTTGCTGATGGAAACCTAACGGTGGTGGATGTCTTGACCTCCTATGAAAGCTGCAACATAACGTCTTATGACAACTTATTTCGAACCCCACTTCACTGGGCAGCCTTACTAGGCCATGCACAGATTGTCCATCTCCTTCTGGAAAGAAACAAGTCTGGAACCGTCCCTTCCGACAGCCAAGGGGCAACACCCTTGCACTATGCAGCTCAGAGTAATTTTGCTGAAACAGTTAAGGTGTTTTTAACGCATCCTTCAGTGAGAGATGATTCTGACTTGGAAGGAAGAACATCTTTCATGTGGGCAGCAGGAAAAGGCAGTGACGACGTGCTCAGAACTATGCTCAGTTTAAAATCGGACATCGACATCAACATGGCGGACAAATATGGAGGCACAGCTTTACATGCCGCTGCCCTTTCTGGCCACGTCAGCACCGTGAAGTTGTTATTGGACAATGATGCCCAAGTAGATGCTACTGACGTCATGAAACACACTCCACTGTTCCGAGCCTGCGAGATGGGACACAGAGACGTGATTCAGACGCTTATTAAAGGCGGAGCACGAGTCGACCTGGTTGACCAAGATGGACATTCACTTCTACACTGGGCAGCACTGGGAGGAAACGCTGACGTCTGCCAGATCCTGATAGAAAACAAGATCAACCCAAACGTGCAGGACTACGCGGGAAGAACCCCACTTCAGTGCGCTGCATATGGAGGGTACATCAACTGCATGGCTGTGCTCATGGAGAACAATGCAGACCCCAACATCCAAGACAAAGAGGGACGAACAGCTCTGCACTGGTCCTGTAACAACGGCTACCTCGATGCCATTAAACTACTGCTGGACTTCGCTGCTTTCCCTAACCAGATGGAGAACAATGAGGAGAGGTACACACCCCTTGACTATGCATTGCTTGGTGAGCGCCATGAGGTGATCCAGTTCATGCTGGAACACGGTGCCCTGTCCATCGCAGCTATTCAAGACATCGCTGCCTTCAAAATCCAAGCGGTCTACAAAGGATACAAGGTCAGAAAAGCCTTCCGAGACCGGAAGAACCTCCTCATGAAGCACGAACAGCTGAGAAAGGACGCTGCAGCTAAGAAACGGGAGGAGGAAAACAAGCGGAAGGAAGCTGAACAGAAAGGACAGCCGGACACAGATCCTCCCAGGCCCCAAGTCCTCCCCTGTCCACCCAGCCCCCAGAATGAGCCCAGTAGGCAGAGCGCAGCCCCTAGCAAACAGCCACCTGCTAGCCACACAGTCCAGAGCCCCGACCCAGAGCAGGGCAGGCCTGCAGGCCAATGTCCAGGCAGAGCCTCCCACAGGGATTGTTCCTCAGACCTTCAGGGAACAGCCTCCAGAAAGCCGAGTGAATCCCCCAGGGAGCACTGCAGAGGCGCCTCTGCCGGCGTGCACCCCAGATCCTGCGAGGATGGTGATAGCTACAGGCATCAGGGAACATCCTCTGCGGAGAAGTGCAGAGGTGAGACCAGTGGCGAACACCAGCGGTGTGAGCAGGGCCCAAGCAGAGCCAGGCAGCCCGTGTCCACTGGGTCAGCGGGGCCTGCCGAGAAAGGAGAGGACTCCAGCCCTGCCATTACAAGTGCTTCCCAGCGGGACCGCCCCCGGAAACCCAGCAAGAGACAGGACGGGGCGCCCAGGTCCAGAGGTGCGTCCCAGAAAAGACGCACCCATCAGCTCAGAGACAGGTGCTCCCCCGCTGGGTCCAGCCGGCCTGGCAGTGCTAAGGCGGAAGTTGCCCGCGCTGATCAGAGTTCTGTCCACCATGACACACCAAGAAACAAGGTGACCCAGGACAAGCTTGTAGGAGGGGTCTCCTCGGATGTGCCACTCAGCACAGAAGAGCTGGGGTCAGGATGCCAGAAGCTTTATGAGGACCTGTGTGCATCTCCGGAGAACAATGTGGCTCACGGCCCCCGACCTGGACAGAGTGTGAATATCCACCTTCTTCCCGTAGAACAGCGCCTGCTGATAATCCAGAGGGAACGGAGCAGGAAGGAGCTGTTTCGGAGAAAAAACAAGGCAGCGGCCGTCATCCAGCGAGCTTGGCGAAGCTACCAGCTCAGGAAGCACCTCTCTCGGCTTCTGCATTTGAAGCAGCTTGGAGCCAGAGATGTGCTCAGATGTACTCAACTGTGCGCAGCCCTGCTCCTCCAGGTTTGGAGGAAAGAACTGGAGCTCAAGTTCCCAAAGTCCATCTCAGTAAGCAGAACATCAAAGAGTCCATCCAAAGGCATGTCGGCCGCAAAGTCCGCCAGGCACTCAGTGCTCAGGCAGATCTACGGTTGTTCTCAGGAAGGGAAAGTACATCATCCCATCAGATCTCCCAAAGTCCCTCCTGTGCTTCATCTCAGTTCAGTGAACAGTTTGCAGTCTATACATCTTGACAGCAGTGGAAGATCAAAGAAGTTTTCTTACAATCTGCAACCAGCCAGTCAATCAAAAAACAAGCCAAAGCTTTGA。

在本发明中，所述INVS蛋白的编码基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO.3：GGTCGAGATGAACATATCAGAGAATGT和SEQ ID NO.4所示：GCGGCCGCTCAAAGCTTTGGCTTGTTTT。在本发明中，扩增INVS蛋白编码基因的反应体系以25μL计，优选包括：预混液12.5μL(Thermofisher Cat.货号12359-010)，上下游引物(50μM)各0.5μL，模板cDNA 0.5μL，和余量去离子水；扩增INVS蛋白编码基因的反应程序优选包括：95℃预变性2min；95℃变性10s，70℃退火10s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸5min。

在本发明中，所述重金属优选包括镉；所述重金属诱导的睾丸损伤优选包括睾丸内生精小管生精上皮损伤和/或睾丸细胞骨架蛋白结构损伤；所述睾丸内生精小管生精上皮损伤优选包括睾丸内生精小管生精上皮结构性损伤。由本发明实施例可知：本发明腹腔注射氯化镉溶液，再过表达INVS蛋白，虽然生精小管也显示出了部分病变如官腔趋近闭合、成熟精子受困于上皮底部等病理变化，但其整体上功能性结构完整，生殖细胞分布正常，精子仍然可以有序的在生精上皮表面排布；INVS蛋白的过表达显著降低了氯化镉染毒诱导的包括精细胞提前脱离、生精上皮空洞等多种病变；其次，氯化镉染毒后造成整个睾丸切面中90％以上的生精小管发生病变，而INVS蛋白的过表达将这一病变发生率降低至30％～50％左右，修复作用明显；最后，氯化镉染毒可诱导睾丸组织中Actin聚合能力显著降低，说明氯化镉染毒影响了睾丸中细胞骨架蛋白的结构，破坏了睾丸生殖功能，而INVS蛋白过表达后，睾丸组织的Actin聚合能力得到了显著的恢复，说明INVS蛋白可有效修复氯化镉染毒诱导的睾丸细胞骨架蛋白结构损伤。可见，利用INVS蛋白制备的药物可以修复睾丸损伤，特别是可以修复氯化镉染毒诱导的睾丸生精上皮损伤，以及恢复生精上皮中的细胞骨架蛋白Actin聚合能力降低。

本发明还提供了一种防治睾丸损伤的药物，所述药物包括含INVS蛋白的编码基因的重组表达载体。在本发明中，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的INVS蛋白的编码基因和基础载体；所述重组表达载体的基础载体优选包括pCI-neo；所述INVS蛋白的编码基因优选位于基础载体的XhoI和NotI酶切位点之间。本发明对所述重组表达载体的构建方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的构建方法即可。

在本发明中，所述药物的有效剂量优选为每个睾丸5～50μg所述重组表达载体，进一步优选为每个睾丸10～30μg所述重组表达载体，更优选为每个睾丸15μg所述重组表达载体。本发明所述药物以上述重组表达载体为有效成分，利用上述重组表达载体使INVS蛋白过表达来实现氯化铬染毒诱导的睾丸损伤的修复。本发明对给药方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的蛋白或编码基因的给药方式即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

INVS蛋白编码基因片段的克隆方法

采用SD大鼠睾丸cDNA，参考大鼠Invs编码基因序列NM_001107932.2设计INVS蛋白的克隆引物；

上游引物：GGTCGAGATGAACATATCAGAGAATGT(SEQ ID NO.3)；

下游引物：GCGGCCGCTCAAAGCTTTGGCTTGTTTT(SEQ ID NO.4)；

引物中包括限制性内切酶位点XhoI、NotI、启动密码子、终止密码子和保护性碱基，PCR扩增(反应体系：预混液12.5μL(Thermofisher Cat.货号12359-010)，上下游引物(50μM)各0.5μL，模板cDNA 0.5μL，去离子水补足至25μL；反应程序：95℃预变性2min；95℃变性10s，70℃退火10s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸5min)后得到INVS蛋白编码基因片段，电泳检测。其电泳结果如图1所示，图1为INVS蛋白编码基因的PCR扩增产物电泳结果图。由图1可知，PCR产物预测长度为3183bp，电泳结果与预测产物长度相符合。由此可知，扩增得到符合预测长度的PCR产物。

INVS蛋白编码基因片段的测序

回收扩增所得编码基因片段PCR产物，送GeneWiz公司测序，测序结果如SEQ IDNO.2所示；

上述测序结果显示与参考大鼠层粘蛋白α2编码基因序列NM_001107932.2中INVS蛋白的编码基因同源度为100％，说明成功克隆INVS蛋白编码基因片段。

INVS蛋白重组表达载体的构建

对克隆的INVS蛋白编码基因片段连接至真核表达载体pCI-neo(Promega公司)，得到表达载体pCI-neo-Invs。对表达载体进行XhoI/NotI双酶切，酶切图谱如图2所示，图2为pCI-neo-Invs哺乳动物过表达载体的质粒双酶切产物电泳结果。由图2可知，插入片段长度约为3179bp，克隆得到正确的表达载体。

实施例2

研究大鼠睾丸内pCI-neo-Invs过表达对氯化镉染毒诱导的睾丸损伤的修复作用的方法

分组方法：雄性SD大鼠共18只，分为3组，每组6只。

实验方法为：氯化铬对照组6只、pCI-neo空质粒转染组6只、氯化铬染毒后转染pCI-neo-Invs过表达载体实验组6只。染毒方法为腹腔注射氯化镉一次，剂量为3mg/kg体重。染毒24小时后，将重组表达载体pCI-neo-Invs转染至SD大鼠睾丸内，每个睾丸注射15μg重组表达载体(每个睾丸总注射量70μl，其中含有质粒DNA15μg，in-vivojet PEI转染试剂1.8μl，溶解于5％无菌葡萄糖溶液中)，睾丸注射共三次，每次间隔24小时。氯化镉注射56天后，处死大鼠。

处死后的大鼠取睾丸，进行固定和石蜡包埋、切片及HE染色，白光显微镜拍摄观察(结果见图3)；对HE染色后的大鼠睾丸切片拍照后，除观察病变情况外，对各组石蜡切片中各个生精小管进行评估，计算出损伤的生精小管数目占总生精小管数目百分比(％)，每只睾丸选取3个切面，每组共6只睾丸，结果见图4。

对不同处理组睾丸样本中取小块组织提取RNA并反转录cDNA，以INVS扩增引物进行反转录PCR(PCR扩增同实施例1)，验证INVS蛋白在睾丸中的过表达，鉴定结果如图5所示。

由图3可知，氯化镉染毒四天后，与空白对照组相比，阳性对照组因氯化镉染毒引起生精上皮的广泛病变，生殖细胞及未成熟的精子脱离生精上皮，且生精小管中出现部分空洞；长方形框截取区域中可见部分未成熟的精子提前脱离生精上皮。以上结果表明氯化镉染毒后可诱导睾丸生精上皮发生广泛损伤，生精上皮功能严重受损。在过表达INVS蛋白之后再染毒氯化镉的实验组中，虽然生精小管也显示出了部分病变如管腔趋近闭合、精子细胞脱离(长方形框中指示)等病理变化，但其整体上功能性结构完整，生殖细胞分布正常，精子仍然可以有序的在生精上皮表面排布。可见，INVS蛋白的过表达显著降低了氯化镉诱导的包括精细胞提前脱离、生精上皮空洞等多种病变，说明睾丸内过表达INVS后可有效的修复氯化镉诱导的生精上皮损伤。

由图4可知，氯化镉染毒可诱发超过90％的睾丸生精小管发生病变，而在经过INVS蛋白过表达后氯化镉染毒的实验组中受损伤的生精小管比例降至约30％～50％。INVS蛋白在睾丸内的过表达显著修复了氯化镉染毒诱导的生精小管损伤。

由此可见，INVS蛋白的睾丸内过表达，对氯化镉染毒造成睾丸内生精小管生精上皮的结构完整性损害起到了明显的修复作用。氯化镉后造成整个睾丸切面中90％以上的生精小管发生病变，而INVS蛋白的过表达将这一病变发生率降低至30％～50％左右，修复作用明显。

由图5可知，pCI-neo-Invs表达载体转染后，INVS蛋白的表达量与空载体转染对照组相比显著增加。

实施例3

大鼠睾丸内pCI-neo-Invs过表达对氯化镉诱导的睾丸组织细胞骨架蛋白Actin聚合能力的恢复作用

分组与动物实验方法同实施例2。大鼠处死后，取部分新鲜睾丸组织，保持37℃温度下进行组织匀浆，采用G-Actin/F-actin In Vivo Assay Biochem Kit试剂盒(Cytoskeleton,Inc.美国)，参考其试剂盒说明进行操作。其主要原理为在组织匀浆中加入荧光标记的游离G-actin单体和ATP等能量物质，在60分钟内进行37℃孵育，孵育的同时检测单体G-actin聚合后的荧光，进而评价样本的细胞骨架蛋白Actin聚合能力，实验结果见图6。

细胞骨架蛋白(cytoskeletonproteins)是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构器，是调控生精上皮功能重要因素。其中肌动蛋白(Actin)以多聚体/单体的形式大量存在于生精上皮中，在精子发生、血睾屏障功能调控等生物学过程中发挥重要的直接作用。

由图6可知，氯化镉染毒(pCI-neo+Cd)可诱导睾丸组织中Actin聚合能力显著降低，说明氯化镉影响了睾丸中细胞骨架蛋白的结构，破坏了睾丸生殖功能。而Invs蛋白过表达后(pCI-neo-Invs+Cd)，睾丸组织的Actin聚合能力得到了显著的恢复，说明INVS蛋白可有效修复氯化镉诱导的睾丸细胞骨架蛋白结构损伤。

综上所述，INVS蛋白可有效修复重金属诱导的睾丸损伤，对重金属染毒造成睾丸内生精小管生精上皮的结构完整性损害、生精小管发生病变和睾丸内生精小管生精上皮的细胞骨架蛋白损伤/破坏能起到明显的修复作用。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院）

<120> INVS蛋白在制备修复重金属诱导的睾丸损伤的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1055

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Ile Ser Glu Asn Val Leu Ser Thr Gly Ser Ser Leu Ala Ser

1 5 10 15

Gln Val His Ala Ala Ala Val Asn Gly Asp Lys Gly Ala Leu Gln Arg

20 25 30

Leu Ile Val Gly Asn Ser Ala Leu Lys Asp Lys Glu Asp Gln Phe Gly

35 40 45

Arg Thr Pro Leu Met Tyr Cys Val Leu Ala Asp Arg Leu Asp Cys Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Lys Thr Asp His Ser

65 70 75 80

Arg Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Gln Lys Gly Asn Tyr Arg Phe

85 90 95

Met Lys Leu Leu Leu Thr Arg Arg Ala Asn Trp Met Gln Lys Asp Leu

100 105 110

Glu Glu Met Thr Pro Leu His Leu Ser Thr Arg His Arg Ser Pro Lys

115 120 125

Cys Leu Ala Leu Leu Leu Lys Phe Met Ala Pro Gly Glu Val Asp Thr

130 135 140

Gln Asp Lys Asn Lys Gln Thr Ala Leu His Trp Ser Ala Tyr Tyr Asn

145 150 155 160

Asn Pro Glu His Ala Lys Leu Leu Ile Lys His Asp Ser Asn Ile Gly

165 170 175

Ile Pro Asp Val Glu Gly Lys Ile Pro Leu His Trp Ala Ala Asn His

180 185 190

Lys Asp Ala Ser Ala Val His Thr Val Arg Cys Ile Leu Asp Ala Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Ser Leu Leu Asn Trp Gln Asp Tyr Glu Gly Arg Thr Pro

210 215 220

Leu His Phe Ala Val Ala Asp Gly Asn Leu Thr Val Val Asp Val Leu

225 230 235 240

Thr Ser Tyr Glu Ser Cys Asn Ile Thr Ser Tyr Asp Asn Leu Phe Arg

245 250 255

Thr Pro Leu His Trp Ala Ala Leu Leu Gly His Ala Gln Ile Val His

260 265 270

Leu Leu Leu Glu Arg Asn Lys Ser Gly Thr Val Pro Ser Asp Ser Gln

275 280 285

Gly Ala Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Gln Ser Asn Phe Ala Glu Thr

290 295 300

Val Lys Val Phe Leu Thr His Pro Ser Val Arg Asp Asp Ser Asp Leu

305 310 315 320

Glu Gly Arg Thr Ser Phe Met Trp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Asp Asp

325 330 335

Val Leu Arg Thr Met Leu Ser Leu Lys Ser Asp Ile Asp Ile Asn Met

340 345 350

Ala Asp Lys Tyr Gly Gly Thr Ala Leu His Ala Ala Ala Leu Ser Gly

355 360 365

His Val Ser Thr Val Lys Leu Leu Leu Asp Asn Asp Ala Gln Val Asp

370 375 380

Ala Thr Asp Val Met Lys His Thr Pro Leu Phe Arg Ala Cys Glu Met

385 390 395 400

Gly His Arg Asp Val Ile Gln Thr Leu Ile Lys Gly Gly Ala Arg Val

405 410 415

Asp Leu Val Asp Gln Asp Gly His Ser Leu Leu His Trp Ala Ala Leu

420 425 430

Gly Gly Asn Ala Asp Val Cys Gln Ile Leu Ile Glu Asn Lys Ile Asn

435 440 445

Pro Asn Val Gln Asp Tyr Ala Gly Arg Thr Pro Leu Gln Cys Ala Ala

450 455 460

Tyr Gly Gly Tyr Ile Asn Cys Met Ala Val Leu Met Glu Asn Asn Ala

465 470 475 480

Asp Pro Asn Ile Gln Asp Lys Glu Gly Arg Thr Ala Leu His Trp Ser

485 490 495

Cys Asn Asn Gly Tyr Leu Asp Ala Ile Lys Leu Leu Leu Asp Phe Ala

500 505 510

Ala Phe Pro Asn Gln Met Glu Asn Asn Glu Glu Arg Tyr Thr Pro Leu

515 520 525

Asp Tyr Ala Leu Leu Gly Glu Arg His Glu Val Ile Gln Phe Met Leu

530 535 540

Glu His Gly Ala Leu Ser Ile Ala Ala Ile Gln Asp Ile Ala Ala Phe

545 550 555 560

Lys Ile Gln Ala Val Tyr Lys Gly Tyr Lys Val Arg Lys Ala Phe Arg

565 570 575

Asp Arg Lys Asn Leu Leu Met Lys His Glu Gln Leu Arg Lys Asp Ala

580 585 590

Ala Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Asn Lys Arg Lys Glu Ala Glu Gln

595 600 605

Lys Gly Gln Pro Asp Thr Asp Pro Pro Arg Pro Gln Val Leu Pro Cys

610 615 620

Pro Pro Ser Pro Gln Asn Glu Pro Ser Arg Gln Ser Ala Ala Pro Ser

625 630 635 640

Lys Gln Pro Pro Ala Ser His Thr Val Gln Ser Pro Asp Pro Glu Gln

645 650 655

Gly Arg Pro Ala Gly Gln Cys Pro Gly Arg Ala Ser His Arg Asp Cys

660 665 670

Ser Ser Asp Leu Gln Gly Thr Ala Ser Arg Lys Pro Ser Glu Ser Pro

675 680 685

Arg Glu His Cys Arg Gly Ala Ser Ala Gly Val His Pro Arg Ser Cys

690 695 700

Glu Asp Gly Asp Ser Tyr Arg His Gln Gly Thr Ser Ser Ala Glu Lys

705 710 715 720

Cys Arg Gly Glu Thr Ser Gly Glu His Gln Arg Cys Glu Gln Gly Pro

725 730 735

Ser Arg Ala Arg Gln Pro Val Ser Thr Gly Ser Ala Gly Pro Ala Glu

740 745 750

Lys Gly Glu Asp Ser Ser Pro Ala Ile Thr Ser Ala Ser Gln Arg Asp

755 760 765

Arg Pro Arg Lys Pro Ser Lys Arg Gln Asp Gly Ala Pro Arg Ser Arg

770 775 780

Gly Ala Ser Gln Lys Arg Arg Thr His Gln Leu Arg Asp Arg Cys Ser

785 790 795 800

Pro Ala Gly Ser Ser Arg Pro Gly Ser Ala Lys Ala Glu Val Ala Arg

805 810 815

Ala Asp Gln Ser Ser Val His His Asp Thr Pro Arg Asn Lys Val Thr

820 825 830

Gln Asp Lys Leu Val Gly Gly Val Ser Ser Asp Val Pro Leu Ser Thr

835 840 845

Glu Glu Leu Gly Ser Gly Cys Gln Lys Leu Tyr Glu Asp Leu Cys Ala

850 855 860

Ser Pro Glu Asn Asn Val Ala His Gly Pro Arg Pro Gly Gln Ser Val

865 870 875 880

Asn Ile His Leu Leu Pro Val Glu Gln Arg Leu Leu Ile Ile Gln Arg

885 890 895

Glu Arg Ser Arg Lys Glu Leu Phe Arg Arg Lys Asn Lys Ala Ala Ala

900 905 910

Val Ile Gln Arg Ala Trp Arg Ser Tyr Gln Leu Arg Lys His Leu Ser

915 920 925

Arg Leu Leu His Leu Lys Gln Leu Gly Ala Arg Asp Val Leu Arg Cys

930 935 940

Thr Gln Leu Cys Ala Ala Leu Leu Leu Gln Val Trp Arg Lys Glu Leu

945 950 955 960

Glu Leu Lys Phe Pro Lys Ser Ile Ser Val Ser Arg Thr Ser Lys Ser

965 970 975

Pro Ser Lys Gly Met Ser Ala Ala Lys Ser Ala Arg His Ser Val Leu

980 985 990

Arg Gln Ile Tyr Gly Cys Ser Gln Glu Gly Lys Val His His Pro Ile

995 1000 1005

Arg Ser Pro Lys Val Pro Pro Val Leu His Leu Ser Ser Val Asn Ser

1010 1015 1020

Leu Gln Ser Ile His Leu Asp Ser Ser Gly Arg Ser Lys Lys Phe Ser

1025 1030 1035 1040

Tyr Asn Leu Gln Pro Ala Ser Gln Ser Lys Asn Lys Pro Lys Leu

1045 1050 1055

<210> 2

<211> 3168

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacatat cagagaatgt gctctctacg gggtcctcat tagcatctca ggttcatgcc 60

gctgcagtta atggagataa aggtgccctt cagagactca ttgttggaaa ctctgctctt 120

aaagacaaag aagaccaatt tgggagaaca ccacttatgt attgtgtgtt ggcagacaga 180

ttggactgtg cagatgccct tctaaaagca ggggcagatg tcaacaaaac cgaccatagc 240

cggagaacag ccctccacct tgcagcccaa aagggaaatt accgctttat gaaactctta 300

ctcactcgca gagcaaactg gatgcagaag gacctagaag agatgacgcc tctgcacctg 360

agcactcggc acaggagccc caagtgtcta gcgctcctgc tgaagtttat ggcgcccggg 420

gaggtggata cacaggacaa aaacaagcaa acagctctgc actggagcgc ctactacaac 480

aatcccgagc atgcgaagct gctcatcaag catgactcca acatcgggat tcctgacgtg 540

gagggcaaga tccccctcca ctgggcagcc aaccataaag acgcgagtgc cgtgcacaca 600

gtgagatgca tcctggatgc cgccccaaca gagtctttat tgaactggca agactatgag 660

ggccgcacac ctctgcactt cgcagttgct gatggaaacc taacggtggt ggatgtcttg 720

acctcctatg aaagctgcaa cataacgtct tatgacaact tatttcgaac cccacttcac 780

tgggcagcct tactaggcca tgcacagatt gtccatctcc ttctggaaag aaacaagtct 840

ggaaccgtcc cttccgacag ccaaggggca acacccttgc actatgcagc tcagagtaat 900

tttgctgaaa cagttaaggt gtttttaacg catccttcag tgagagatga ttctgacttg 960

gaaggaagaa catctttcat gtgggcagca ggaaaaggca gtgacgacgt gctcagaact 1020

atgctcagtt taaaatcgga catcgacatc aacatggcgg acaaatatgg aggcacagct 1080

ttacatgccg ctgccctttc tggccacgtc agcaccgtga agttgttatt ggacaatgat 1140

gcccaagtag atgctactga cgtcatgaaa cacactccac tgttccgagc ctgcgagatg 1200

ggacacagag acgtgattca gacgcttatt aaaggcggag cacgagtcga cctggttgac 1260

caagatggac attcacttct acactgggca gcactgggag gaaacgctga cgtctgccag 1320

atcctgatag aaaacaagat caacccaaac gtgcaggact acgcgggaag aaccccactt 1380

cagtgcgctg catatggagg gtacatcaac tgcatggctg tgctcatgga gaacaatgca 1440

gaccccaaca tccaagacaa agagggacga acagctctgc actggtcctg taacaacggc 1500

tacctcgatg ccattaaact actgctggac ttcgctgctt tccctaacca gatggagaac 1560

aatgaggaga ggtacacacc ccttgactat gcattgcttg gtgagcgcca tgaggtgatc 1620

cagttcatgc tggaacacgg tgccctgtcc atcgcagcta ttcaagacat cgctgccttc 1680

aaaatccaag cggtctacaa aggatacaag gtcagaaaag ccttccgaga ccggaagaac 1740

ctcctcatga agcacgaaca gctgagaaag gacgctgcag ctaagaaacg ggaggaggaa 1800

aacaagcgga aggaagctga acagaaagga cagccggaca cagatcctcc caggccccaa 1860

gtcctcccct gtccacccag cccccagaat gagcccagta ggcagagcgc agcccctagc 1920

aaacagccac ctgctagcca cacagtccag agccccgacc cagagcaggg caggcctgca 1980

ggccaatgtc caggcagagc ctcccacagg gattgttcct cagaccttca gggaacagcc 2040

tccagaaagc cgagtgaatc ccccagggag cactgcagag gcgcctctgc cggcgtgcac 2100

cccagatcct gcgaggatgg tgatagctac aggcatcagg gaacatcctc tgcggagaag 2160

tgcagaggtg agaccagtgg cgaacaccag cggtgtgagc agggcccaag cagagccagg 2220

cagcccgtgt ccactgggtc agcggggcct gccgagaaag gagaggactc cagccctgcc 2280

attacaagtg cttcccagcg ggaccgcccc cggaaaccca gcaagagaca ggacggggcg 2340

cccaggtcca gaggtgcgtc ccagaaaaga cgcacccatc agctcagaga caggtgctcc 2400

cccgctgggt ccagccggcc tggcagtgct aaggcggaag ttgcccgcgc tgatcagagt 2460

tctgtccacc atgacacacc aagaaacaag gtgacccagg acaagcttgt aggaggggtc 2520

tcctcggatg tgccactcag cacagaagag ctggggtcag gatgccagaa gctttatgag 2580

gacctgtgtg catctccgga gaacaatgtg gctcacggcc cccgacctgg acagagtgtg 2640

aatatccacc ttcttcccgt agaacagcgc ctgctgataa tccagaggga acggagcagg 2700

aaggagctgt ttcggagaaa aaacaaggca gcggccgtca tccagcgagc ttggcgaagc 2760

taccagctca ggaagcacct ctctcggctt ctgcatttga agcagcttgg agccagagat 2820

gtgctcagat gtactcaact gtgcgcagcc ctgctcctcc aggtttggag gaaagaactg 2880

gagctcaagt tcccaaagtc catctcagta agcagaacat caaagagtcc atccaaaggc 2940

atgtcggccg caaagtccgc caggcactca gtgctcaggc agatctacgg ttgttctcag 3000

gaagggaaag tacatcatcc catcagatct cccaaagtcc ctcctgtgct tcatctcagt 3060

tcagtgaaca gtttgcagtc tatacatctt gacagcagtg gaagatcaaa gaagttttct 3120

tacaatctgc aaccagccag tcaatcaaaa aacaagccaa agctttga 3168

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcgagatg aacatatcag agaatgt 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggccgctc aaagctttgg cttgtttt 28

Claims

1.INVS蛋白在制备修复由镉引起的睾丸损伤的药物中的应用，所述INVS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述睾丸损伤为睾丸内生精小管生精上皮损伤和/或睾丸细胞骨架蛋白结构损伤，所述睾丸内生精小管生精上皮损伤包括睾丸内生精小管生精上皮结构性损伤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述INVS蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述INVS蛋白的编码基因的扩增引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.表达INVS蛋白的重组表达载体在制备修复由镉引起的睾丸损伤的药物中的应用，所述表达INVS蛋白的重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因和基础载体，所述睾丸损伤为睾丸内生精小管生精上皮损伤和/或睾丸细胞骨架蛋白结构损伤，所述睾丸内生精小管生精上皮损伤包括睾丸内生精小管生精上皮结构性损伤。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基础载体包括pCI-neo载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述编码基因位于pCI-neo载体的XhoI和NotI酶切位点之间。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述INVS蛋白的编码基因的扩增引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。