CN111494612B - 层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用 - Google Patents

层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了涉及层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用，属于生物技术技术领域。层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用，同时还提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备修复或阻断破坏睾丸生精小管结构的药物中的应用；所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验结果表明，LG3/4/5在睾丸内过表达能有效维持血睾屏障功能的完整性并且有效修复血睾屏障功能。同时LG3/4/5的过表达对氯化铬染毒造成的睾丸生精小管结构破坏产生了明显的修复作用，同时降低睾丸生精小管病变比例，具有较高的治疗作用。

Description

层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用。
背景技术
在雄性哺乳动物中，睾丸生精小管是精子发生过程的起点，其中睾丸支持细胞，位于生精小管基底膜上并伸入管腔，分支伸入不同阶段的生殖细胞之间。支持细胞的重要的功能之一是构成了机体中最紧密的血液-组织屏障结构之一即血睾屏障。血睾屏障的功能包括阻止细胞毒性物质进入生精小管管腔内，并且防止精子引起的自身免疫反应。人体暴露多种环境污染物包括重金属等后，对雄性生殖功能会产生多种不利影响，会对精子发生过程造成多种损害。
层粘连蛋白又称板层素其分子量为805kD，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成。它是构成细胞间质的一种非胶原糖，在肝内主要由内皮细胞及贮脂细胞合成，与胶原一起构成基底膜的成分。其生物功能是细胞黏着于基质的介质，并与多种基底膜成分结合，调节细胞生长和分化。层粘连蛋白α2链(LAMA2)是哺乳动物睾丸基底膜的主要组成蛋白之一。层粘连蛋白型球状(LamG)结构域(LamG3/4/5，80kDa片段)可以通过基质金属蛋白酶9(MMP9)的作用从C末端的层粘连蛋白α2上裂解。层粘连蛋白型球状(LamG)结构域是Lamninα2的C末端区域，主要就由三个LamG结构域构成，层粘蛋白α2在C末端一共有5个LamG结构域，可以称其为LG1-5，最后三个就是LG3，LG4，LG5，将这三个结构域一起表达称为LG3/4/5。现有技术中报道了LAMA2基因通过Hedgehog通路调控人间充质干细胞成骨分化的作用(朱原,2019年.)，同时也有关于血层粘连蛋白与慢性肾功能不全相关的报道(万福俊,2001年.)。但是目前并没有关于层粘蛋白α2与血睾屏障功能有关的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备维持血睾屏障功能的药物中的应用，所述粘蛋白α2功能区LG3/4/5能有效阻断睾丸生精上皮结构破坏。
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备修复或阻断破坏睾丸生精小管结构的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的形式包括重组表达载体；所述重组表达载体以pCI-neo为基础载体，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。
优选的，重组表达载体pCI-neo-LG3/4/5的转染剂量为5～50μg/个睾丸。
优选的，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列的扩增引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验证明，氯化铬染毒后，会破坏生精小管中血睾屏障的完整性，使得荧光标记的生物素无障碍的扩散到血睾屏障之后，即生精小管管腔之中。通过LG3/4/5在睾丸内过表达后，荧光标记生物素在生精小管管腔中分布极少，说明血睾屏障完整性较高，LG3/4/5能显著修复血睾屏障的功能。同时，氯化铬染毒诱导的血睾屏障功能破坏，使得生物活性物质(绿色荧光标记的生物素)扩散到生精小管管腔中，对绿色荧光分布的情况进行数据统计，测算从基底膜至管腔中绿色荧光信号分布的距离。统计后数据说明，LG3/4/5在睾丸内过表达显著降低了荧光标记生物素对生精管管腔的扩散程度，说明LG3/4/5的过表达修复了血睾屏障功能。
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备阻断或修复睾丸生精上皮结构破坏的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验证明，本发明通过LG3/4/5在睾丸内进行过表达，能显著降低了氯化铬染毒对睾丸生精上皮的破坏作用，氯化铬染毒诱发的多种病变包精原细胞/精子细胞脱离、生精上皮空洞等病变显著好转。说明了LG3/4/5的过表达对氯化铬染毒造成的睾丸生精小管结构破坏产生了明显的修复作用。同时通过LG3/4/5在睾丸内过表达，使氯化铬染毒造成的对睾丸内生精小管生精上皮的结构完整性损害起到了明显的修复作用，具体为氯化铬染毒后造成整个睾丸切面中90％以上的生精小管发生病变，而LG3/4/5的过表达将这一病变发生率降低至30％左右，修复作用明显，说明LG3/4/5过表达降低睾丸生精小管病变比例，对睾丸生精小管具有较好的治疗作用。
附图说明
图1为LG3/4/5片段的PCR扩增电泳结果；
图2为构建的pCI-neo-LG3/4/5过表达载体双酶切后酶切产物电泳图；
图3为LG3/4/5过表达后的组织总RNA反转录PCR鉴定结果；
图4为pCI-neo-LG3/4/5表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒睾丸损伤的修复情况结果图；
图5为睾丸切片中损伤的生精小管数目占总生精小管数目百分比柱形图；
图6为pCI-neo-LG3/4/5表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒睾丸血睾屏障功能的修复；
图7为血睾屏障通透性检测的数据分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(氨基酸序列：VGTEINLSFSTRNESGIILLGSGGTLTPPRRKRRQTTQAYYAIFLNKGRLEVHLSSGTRTMRKIVIKPEPNLFHDGREHSVHVERTRGVFTVQVDENRRHMQNLTEEQPIEVKKLFVGGAPPEFQPSPLRNIPAFQGCVWNLVINSIPMDFAQPIAFKNADIGRCAYQKPREEEDDAVPAEVTVQPQPVPTPAFPFPAPTMVHGPCVAESEPAFLSGSKQFGLSRNSHIALAFDDTKVKNRLTIELEVRTEAESGLLFYMARINHADFATVQLRNGFPYFSYDLGSGDTSTMIPTRINDGQWHKIKITRVKQEGILSVDDASNQTISPKKADILDVVGILYVGGLPINYTTRRIGPVTYSLDGCVRNLYMEQAPVDLDQPTSSFHVGTCFANAEKGTYFDGTGFAKAVGGFKVGLDLLVEFEFRTTRPTGVLLGVSSQKMDGMGIEMIDEKLMFHVDNGAGRFTAVYDAGSPGHMCDGRWHKVTAKKIKNRLELVVDGNQVDAQSPNAASTSADTNDPVFVGGFPDGLNQFGLTTNVRFRGCIRSLKLTKGTGKPLEVNFAKAL)。
在本发明中，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列优选如SEQ ID NO.2所示。所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列的扩增引物对优选如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的形式优选包括重组表达载体；所述重组表达载体优选以pCI-neo为基础载体，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。
所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的给药方式，采用本领域所熟知的蛋白或编码基因的给药方式即可。在本发明实施例中，以含LG3/4/5编码序列的重组表达载体转染SD大鼠睾丸内。重组表达载体pCI-neo-LG3/4/5的转染的剂量为5～50μg/个睾丸，更优选为15μg/个睾丸。所述转染优选包括三次，每次转染的间时间优选为24h。为了验证LG3/4/5过表达取得的治疗效果，在处死大鼠前30min睾丸注射荧光标记生物素，以荧光标记生物素的分布位置来评价血睾屏障功能的维持或恢复情况。血睾屏障功能障碍由重金属引起的病变。实验结果表明，LG3/4/5在睾丸内过表达显著降低了荧光标记生物素对生精小管腔的扩散程度，说明其过表达修复了血睾屏障功能。同时LG3/4/5在睾丸内过表达后，荧光标记生物素在生精小管管腔中分布极少，说明血睾屏障完整性较高，LG3/4/5显著修复了氯化铬染毒对血睾屏障功能造成的破坏。
本发明提供了层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备修复或阻断破坏睾丸生精小管结构的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5与上述应用中层粘蛋白α2功能区LG3/4/5完全一致，在此不做赘述。
在本发明中，睾丸生精小管结构损伤由重金属引起的病变。所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5能有效使氯化铬染毒诱发的精原细胞/精子细胞脱离、生精上皮空洞等病变显著好转。LG3/4/5的表达对氯化铬染毒造成的睾丸生精小管结构破坏产生了明显的修复作用，同时LG3/4/5的过表达将这一病变发生率由原来的90％显著降低至30％左右，修复作用十分明显。
下面结合实施例对本发明提供的层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
LamG3/4/5编码基因片段的克隆方法
采用SD大鼠睾丸cDNA，参考大鼠层粘蛋白α2编码基因序列设计克隆引物：上游引物：CCGCTCGAGATGGTCGGAACGGAAATCAACCTG(SEQ ID NO.3)；
下游引物：ACGCGTCGACTTACAGAGCCTTGGCAAAATTAAC(SEQ ID NO.4)；
引物中包括限制性内切酶位点XhoI/SalI、启动/中止密码子和保护性碱基，PCR扩增后得到LamG3/4/5编码基因片段，序列如SEQ ID NO.2所示，(GTCGGAACGGAAATCAACCTGTCCTTCAGTACCAGGAACGAGTCTGGGATCATTCTCTTGGGAAGTGGAGGGACACTCACACCACCCAGGAGAAAACGGAGACAAACTACACAGGCTTATTATGCCATATTCCTCAACAAGGGCCGTCTGGAAGTGCATCTCTCCTCGGGGACACGAACGATGAGGAAAATTGTCATCAAACCCGAGCCAAATTTGTTTCATGATGGGAGAGAACATTCTGTCCACGTAGAAAGAACCAGAGGAGTCTTCACTGTTCAAGTTGATGAAAACAGAAGACATATGCAAAACCTGACAGAGGAGCAGCCCATCGAAGTGAAAAAGCTCTTTGTTGGGGGTGCTCCTCCTGAATTCCAGCCCTCCCCACTCAGAAATATCCCAGCTTTTCAAGGCTGTGTGTGGAACCTTGTTATTAACTCCATCCCCATGGACTTTGCACAGCCTATAGCTTTCAAAAATGCTGATATTGGCCGCTGTGCCTATCAAAAGCCCCGGGAAGAAGAAGACGATGCCGTTCCAGCTGAAGTTACTGTCCAGCCTCAGCCAGTGCCTACCCCTGCCTTCCCTTTCCCGGCCCCCACCATGGTACATGGCCCGTGTGTTGCAGAATCAGAACCAGCTTTTCTGTCGGGGAGCAAGCAGTTCGGGCTTTCCAGAAACAGCCACATTGCTCTCGCTTTTGATGACACCAAAGTTAAAAACCGCCTCACCATTGAGCTGGAAGTGCGAACTGAGGCTGAATCAGGCTTACTCTTTTACATGGCTCGGATCAATCATGCAGATTTTGCTACTGTTCAGCTGAGGAATGGCTTCCCCTACTTCAGTTATGATCTGGGGAGCGGGGACACAAGCACCATGATCCCCACCCGAATCAACGATGGCCAGTGGCACAAGATTAAGATTACGAGAGTGAAGCAGGAGGGAATTCTTTCTGTAGATGACGCCTCCAACCAAACCATCAGTCCCAAGAAAGCTGACATCCTGGATGTTGTGGGGATTCTGTATGTTGGTGGCTTGCCGATCAACTATACCACACGCAGAATTGGTCCAGTAACCTACAGCCTAGATGGCTGTGTTAGGAATCTTTACATGGAACAAGCCCCTGTTGATCTGGACCAGCCTACCTCCAGTTTTCACGTCGGGACATGCTTTGCCAATGCAGAGAAGGGGACTTACTTTGATGGAACTGGTTTTGCTAAAGCAGTTGGTGGCTTCAAAGTTGGATTGGACCTTCTTGTAGAATTTGAATTCCGTACCACAAGACCCACTGGAGTCCTCCTGGGAGTCAGCAGTCAGAAGATGGATGGAATGGGTATTGAAATGATTGACGAGAAGCTTATGTTCCATGTGGATAATGGCGCCGGCCGATTCACTGCGGTCTACGATGCTGGGAGCCCAGGCCATATGTGCGATGGACGATGGCATAAAGTCACTGCCAAGAAGATCAAAAACCGCCTTGAGCTGGTGGTAGATGGGAACCAGGTGGATGCCCAGAGCCCAAATGCAGCCTCCACATCAGCAGATACAAACGACCCTGTTTTTGTTGGCGGTTTCCCAGATGGCCTCAATCAGTTTGGCCTGACCACCAACGTTAGGTTCCGAGGCTGCATCCGATCTCTGAAGCTCACCAAAGGGACAGGCAAGCCGCTGGAGGTTAATTTTGCCAAGGCTCTG)。其电泳结果如图1所示，图1为LG3/4/5片段的PCR扩增电泳结果。由图1可知，PCR产物预测长度为1739bp，电泳结果与预测产物长度相符合，可知得到符合预测长度的PCR产物。
实施例2
1.LamG3/4/5编码基因片段的测序
回收实施例1中所得编码基因片段PCR产物，送GeneWiz公司测序，测序结果显示与参考大鼠层粘蛋白α2编码基因序列XM_017590489.1同源度达99％以上，说明成功克隆LamG3/4/5编码基因片段。
2.LG3/4/5片段表达载体的构建
对克隆的LamG3/4/5编码基因片段连接至真核表达载体pCI-neo(购自Promega公司)XhoI/SalI多克隆位点处，得到表达载体pCI-neo-LG3/4/5。对得到的重组表达载体进行XhoI/SalI双酶切。酶切图谱见图2，图2为构建的pCI-neo-LG3/4/5过表达载体双酶切后酶切产物电泳图。由图2可知，插入片段长度为1714bp，电泳结果与预测产物长度相符合。可知，克隆得到正确的重组表达载体。
实施例3
大鼠氯化铬染毒后睾丸内pCI-neo-LG3/4/5过表达对血睾屏障功能的修复作用
分组方法：雄性SD大鼠共18只，分为3组，每组6只。
实验方法为：氯化铬对照组6只、pCI-neo空质粒转染组6只、氯化铬染毒后转染pCI-neo-LG3/4/5过表达载体实验组6只。染毒方法为腹腔注射氯化铬一次，剂量为3mg/kg体重。染毒24小时后，将重组表达载体pCI-neo-LG3/4/5转染至SD大鼠睾丸内，每个睾丸注射15μg重组表达载体(每个睾丸总注射量70μl，其中含有质粒DNA15μg，in-vivo jet PEI转染试剂1.8μl，溶解于5％无菌葡萄糖溶液中)，睾丸注射共三次，每次间隔24小时。氯化铬注射56天后，处死大鼠。处死大鼠前30分钟睾丸注射荧光标记生物素。
处死后的大鼠取双侧睾丸，一枚睾丸进行固定和石蜡包埋、切片及HE染色，白光显微镜拍摄观察；另一枚睾丸进行速冻和冰冻切片，染色细胞核指示染料DAPI，荧光显微镜拍摄观察。对HE染色后的大鼠睾丸切片拍照后，除观察病变情况外，统计病变生精小管数目占总生精小管数目的比例。对冰冻切片及DAPI染色的大鼠睾丸切片进行荧光显微镜观察和拍照，以荧光标记的生物素侵入生精小管的情况作为血睾屏障功能完整性的直接指示依据。冰冻睾丸样本中取小块组织提取RNA并反转录cDNA，以LG3/4/5克隆引物进行RT-PCR，验证LG3/4/5片段在睾丸中的过表达。
实验结果：
1.睾丸生精小管的病变
图3为LG3/4/5过表达后的组织总RNA反转录PCR鉴定结果，如图所示，pCI-neo-LG3/4/5表达载体转染后，LG3/4/5片段的表达量与空载体转染对照组相比显著增加。
图4为pCI-neo-LG3/4/5表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒的睾丸损伤的修复情况结果。对实验后的睾丸进行石蜡切片和HE染色后的拍摄结果。如图4可见，氯化铬染毒后，几乎所有生精小管的管腔呈空洞状态，方框指示为自相应组别图片中截取的区域，显示生殖细胞丢失，同时，生精上皮中(框截取区域)形成丢失生殖细胞后的空洞。以上结果表明氯化铬染毒造成睾丸生精小管广泛损伤，生精上皮功能严重受损。在pCI-neo-LG3/4/5过表达组中，大部分生精上皮结构完整，生殖细胞仍在生精上皮中，但在部分区域(框截取区域)仍有部分轻微损伤，包括生殖细胞逐渐向管腔聚集(框截取区域)和精子细胞提前脱离生精上皮的趋势(框截取区域)。黑色比例尺长度为150μm。
通过睾丸内LG3/4/5的过表达，显著降低了氯化铬染毒对睾丸生精上皮的破坏作用，氯化铬染毒诱发的多种病变包括精原细胞/精子细胞脱离、生精上皮空洞等病变显著好转。说明了LG3/4/5的表达对氯化铬染毒造成的睾丸生精小管结构破坏产生了明显的修复作用。
2.睾丸生精小管病变比例
图5为睾丸切片中损伤的生精小管数目占总生精小管数目百分比柱形图。对各组石蜡切片中各个生精小管进行评估，计算出损伤的生精小管数目占总生精小管数目百分比(％)，每只睾丸选取3个切面，每组共6只睾丸。统计结果显示氯化铬染毒后诱发超过90％的睾丸生精小管发生病变，而pCI-neo-LG3/4/5过表达组中的大部分生精小管恢复正常，损伤生精小管比例约为30％-40％。pCI-neo-LG3/4/5在睾丸内过表达显著修复了氯化铬染毒引起的睾丸生精小管损伤。
由此可见，LG3/4/5的睾丸内过表达，对氯化铬染毒造成睾丸内生精小管生精上皮的结构完整性损害起到了明显的修复作用。氯化铬染毒后造成整个睾丸切面中90％以上的生精小管发生病变，而LG3/4/5的过表达将这一病变发生率降低至30％左右，修复作用明显。
3.血睾屏障完整性
图6为pCI-neo-LG3/4/5表达载体转染大鼠睾丸内对氯化铬染毒睾丸血睾屏障功能的修复。对大鼠体内实验后的睾丸进行冰冻切片和DAPI细胞核染色后的荧光显微镜拍摄结果。如图6可见，氯化铬染毒后，生精小管内出现大量绿色荧光信号，说明大量荧光标记生物素穿过了血睾屏障，进入到生精小管管腔中。而LG3/4/5过表达后的睾丸切片显示，生精小管管腔中的绿色荧光信号极少，起到了良好的屏障作者用，阻止了荧光标记生物素的穿越。以上结果说明血睾屏障的功能被修复。
由上述可知，氯化铬染毒后，会破坏生精小管中血睾屏障的完整性，使得荧光标记的生物素无障碍的扩散到血睾屏障之后，即生精小管管腔之中。LG3/4/5在睾丸内过表达后，荧光标记生物素在生精小管管腔中分布极少，说明血睾屏障完整性较高，LG3/4/5显著修复了血睾屏障的功能。
4.血睾屏障功能的修复
图7为血睾屏障通透性检测的数据分析结果图。经过对生物素侵染的生精小管中，生物素分布情况的数据分析发现，氯化铬染毒后的睾丸生精小管中，生物素广泛分布在生精小管管腔中，生物素分布几乎直至管腔中心，其弥散的厚度可达100μm以上(自基底膜至管腔中绿色荧光分布的厚度)。而LG3/4/5过表达后，绿色荧光分布仅局限在生精小管基底膜周围，与对照组的弥散厚度相比差异不显著。以上结果说明血睾屏障功能被LG3/4/5的过表达所修复。
由上述可知，氯化铬染毒诱导的血睾屏障功能破坏，使得生物活性物质(绿色荧光标记的生物素)扩散到生精小管管腔中，对绿色荧光分布的情况进行数据统计，测算从基底膜至管腔中绿色荧光信号分布的距离。统计后数据说明，LG3/4/5的睾丸内过表达显著降低了荧光标记生物素对生精小管腔的扩散程度，说明LG3/4/5的过表达修复了血睾屏障功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
<120> 层粘蛋白α2功能区在制备维持或修复血睾屏障功能的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gly Thr Glu Ile Asn Leu Ser Phe Ser Thr Arg Asn Glu Ser Gly
1               5                   10                  15
Ile Ile Leu Leu Gly Ser Gly Gly Thr Leu Thr Pro Pro Arg Arg Lys
            20                  25                  30
Arg Arg Gln Thr Thr Gln Ala Tyr Tyr Ala Ile Phe Leu Asn Lys Gly
        35                  40                  45
Arg Leu Glu Val His Leu Ser Ser Gly Thr Arg Thr Met Arg Lys Ile
    50                  55                  60
Val Ile Lys Pro Glu Pro Asn Leu Phe His Asp Gly Arg Glu His Ser
65                  70                  75                  80
Val His Val Glu Arg Thr Arg Gly Val Phe Thr Val Gln Val Asp Glu
                85                  90                  95
Asn Arg Arg His Met Gln Asn Leu Thr Glu Glu Gln Pro Ile Glu Val
            100                 105                 110
Lys Lys Leu Phe Val Gly Gly Ala Pro Pro Glu Phe Gln Pro Ser Pro
        115                 120                 125
Leu Arg Asn Ile Pro Ala Phe Gln Gly Cys Val Trp Asn Leu Val Ile
    130                 135                 140
Asn Ser Ile Pro Met Asp Phe Ala Gln Pro Ile Ala Phe Lys Asn Ala
145                 150                 155                 160
Asp Ile Gly Arg Cys Ala Tyr Gln Lys Pro Arg Glu Glu Glu Asp Asp
                165                 170                 175
Ala Val Pro Ala Glu Val Thr Val Gln Pro Gln Pro Val Pro Thr Pro
            180                 185                 190
Ala Phe Pro Phe Pro Ala Pro Thr Met Val His Gly Pro Cys Val Ala
        195                 200                 205
Glu Ser Glu Pro Ala Phe Leu Ser Gly Ser Lys Gln Phe Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Arg Asn Ser His Ile Ala Leu Ala Phe Asp Asp Thr Lys Val Lys Asn
225                 230                 235                 240
Arg Leu Thr Ile Glu Leu Glu Val Arg Thr Glu Ala Glu Ser Gly Leu
                245                 250                 255
Leu Phe Tyr Met Ala Arg Ile Asn His Ala Asp Phe Ala Thr Val Gln
            260                 265                 270
Leu Arg Asn Gly Phe Pro Tyr Phe Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Gly Asp
        275                 280                 285
Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr Arg Ile Asn Asp Gly Gln Trp His Lys
    290                 295                 300
Ile Lys Ile Thr Arg Val Lys Gln Glu Gly Ile Leu Ser Val Asp Asp
305                 310                 315                 320
Ala Ser Asn Gln Thr Ile Ser Pro Lys Lys Ala Asp Ile Leu Asp Val
                325                 330                 335
Val Gly Ile Leu Tyr Val Gly Gly Leu Pro Ile Asn Tyr Thr Thr Arg
            340                 345                 350
Arg Ile Gly Pro Val Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Cys Val Arg Asn Leu
        355                 360                 365
Tyr Met Glu Gln Ala Pro Val Asp Leu Asp Gln Pro Thr Ser Ser Phe
    370                 375                 380
His Val Gly Thr Cys Phe Ala Asn Ala Glu Lys Gly Thr Tyr Phe Asp
385                 390                 395                 400
Gly Thr Gly Phe Ala Lys Ala Val Gly Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp
                405                 410                 415
Leu Leu Val Glu Phe Glu Phe Arg Thr Thr Arg Pro Thr Gly Val Leu
            420                 425                 430
Leu Gly Val Ser Ser Gln Lys Met Asp Gly Met Gly Ile Glu Met Ile
        435                 440                 445
Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp Asn Gly Ala Gly Arg Phe Thr
    450                 455                 460
Ala Val Tyr Asp Ala Gly Ser Pro Gly His Met Cys Asp Gly Arg Trp
465                 470                 475                 480
His Lys Val Thr Ala Lys Lys Ile Lys Asn Arg Leu Glu Leu Val Val
                485                 490                 495
Asp Gly Asn Gln Val Asp Ala Gln Ser Pro Asn Ala Ala Ser Thr Ser
            500                 505                 510
Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe Val Gly Gly Phe Pro Asp Gly Leu
        515                 520                 525
Asn Gln Phe Gly Leu Thr Thr Asn Val Arg Phe Arg Gly Cys Ile Arg
    530                 535                 540
Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly Lys Pro Leu Glu Val Asn Phe
545                 550                 555                 560
Ala Lys Ala Leu
<210> 2
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcggaacgg aaatcaacct gtccttcagt accaggaacg agtctgggat cattctcttg 60
ggaagtggag ggacactcac accacccagg agaaaacgga gacaaactac acaggcttat 120
tatgccatat tcctcaacaa gggccgtctg gaagtgcatc tctcctcggg gacacgaacg 180
atgaggaaaa ttgtcatcaa acccgagcca aatttgtttc atgatgggag agaacattct 240
gtccacgtag aaagaaccag aggagtcttc actgttcaag ttgatgaaaa cagaagacat 300
atgcaaaacc tgacagagga gcagcccatc gaagtgaaaa agctctttgt tgggggtgct 360
cctcctgaat tccagccctc cccactcaga aatatcccag cttttcaagg ctgtgtgtgg 420
aaccttgtta ttaactccat ccccatggac tttgcacagc ctatagcttt caaaaatgct 480
gatattggcc gctgtgccta tcaaaagccc cgggaagaag aagacgatgc cgttccagct 540
gaagttactg tccagcctca gccagtgcct acccctgcct tccctttccc ggcccccacc 600
atggtacatg gcccgtgtgt tgcagaatca gaaccagctt ttctgtcggg gagcaagcag 660
ttcgggcttt ccagaaacag ccacattgct ctcgcttttg atgacaccaa agttaaaaac 720
cgcctcacca ttgagctgga agtgcgaact gaggctgaat caggcttact cttttacatg 780
gctcggatca atcatgcaga ttttgctact gttcagctga ggaatggctt cccctacttc 840
agttatgatc tggggagcgg ggacacaagc accatgatcc ccacccgaat caacgatggc 900
cagtggcaca agattaagat tacgagagtg aagcaggagg gaattctttc tgtagatgac 960
gcctccaacc aaaccatcag tcccaagaaa gctgacatcc tggatgttgt ggggattctg 1020
tatgttggtg gcttgccgat caactatacc acacgcagaa ttggtccagt aacctacagc 1080
ctagatggct gtgttaggaa tctttacatg gaacaagccc ctgttgatct ggaccagcct 1140
acctccagtt ttcacgtcgg gacatgcttt gccaatgcag agaaggggac ttactttgat 1200
ggaactggtt ttgctaaagc agttggtggc ttcaaagttg gattggacct tcttgtagaa 1260
tttgaattcc gtaccacaag acccactgga gtcctcctgg gagtcagcag tcagaagatg 1320
gatggaatgg gtattgaaat gattgacgag aagcttatgt tccatgtgga taatggcgcc 1380
ggccgattca ctgcggtcta cgatgctggg agcccaggcc atatgtgcga tggacgatgg 1440
cataaagtca ctgccaagaa gatcaaaaac cgccttgagc tggtggtaga tgggaaccag 1500
gtggatgccc agagcccaaa tgcagcctcc acatcagcag atacaaacga ccctgttttt 1560
gttggcggtt tcccagatgg cctcaatcag tttggcctga ccaccaacgt taggttccga 1620
ggctgcatcc gatctctgaa gctcaccaaa gggacaggca agccgctgga ggttaatttt 1680
gccaaggctc tg 1692
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgaga tggtcggaac ggaaatcaac ctg 33
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgcgtcgac ttacagagcc ttggcaaaat taac 34

Claims (6)

1.层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备修复血睾屏障功能的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；血睾屏障功能损伤由重金属引起的病变；所述重金属为氯化铬。
2.层粘蛋白α2功能区LG3/4/5在制备修复睾丸生精小管结构的药物中的应用，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；睾丸生精小管结构损伤由重金属引起的病变；所述重金属为氯化铬。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的形式包括重组表达载体；所述重组表达载体以pCI-neo为基础载体，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列插入pCI-neo的XhoI/SalI多克隆位点处。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，重组表达载体pCI-neo-LG3/4/5的转染的剂量为5～50μg/个睾丸。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述层粘蛋白α2功能区LG3/4/5的编码序列的扩增引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
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