WO2023248934A1 - 細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置 - Google Patents

細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2023248934A1
WO2023248934A1 PCT/JP2023/022327 JP2023022327W WO2023248934A1 WO 2023248934 A1 WO2023248934 A1 WO 2023248934A1 JP 2023022327 W JP2023022327 W JP 2023022327W WO 2023248934 A1 WO2023248934 A1 WO 2023248934A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
drug
cell support
cultured
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/022327
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
越史 高橋
文彦 北川
直樹 石黒
学 森永
麻美 齋藤
真仁 高谷
Original Assignee
日機装株式会社
日本ベーリンガーインゲルハイム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日機装株式会社, 日本ベーリンガーインゲルハイム株式会社 filed Critical 日機装株式会社
Publication of WO2023248934A1 publication Critical patent/WO2023248934A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell support complex, a method for producing a drug evaluation device, a drug evaluation method, and a drug evaluation device.
  • kidney cells are susceptible to the nephrotoxic effects of drugs.
  • RPTECs proximal tubular epithelial cells
  • Patent Document 1 discloses a culture technique for obtaining a sufficient number of proximal tubular epithelial cells by suppressing gene expression of cell cycle control factors.
  • the present invention has been made in view of these circumstances, and one of its purposes is to provide a technique for improving the accuracy of drug evaluation assays using cells.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing a cell support complex.
  • This production method involves culturing kidney cells in the form of aggregates, separating the aggregates into individual cultured cells, and seeding them at a seeding density of 5 x 104 cells/cm2 or more and 18 x 104 cells/cm2 or less.
  • the method includes seeding cultured cells on a substrate and culturing the cultured cells on the substrate for a period of 12 hours or more and 48 hours or less to form a monolayer of cultured cells.
  • Another aspect of the present invention is a method for manufacturing a drug evaluation device.
  • This manufacturing method includes installing the cell support complex produced by the method for manufacturing a cell support complex according to the above aspect on a support part, or installing a base material on the support part and using the method for manufacturing a cell support complex according to the above aspect.
  • the method includes seeding cultured cells on a base material to produce a cell support complex, and forming a first chamber and a second chamber that are lined up with the cell support complex in between, and at least one of which accommodates a drug to be evaluated. .
  • Another aspect of the present invention is a drug evaluation method.
  • This method includes evaluating the transport of a drug by the cultured cells included in the cell support complex using the drug evaluation device obtained by the method for manufacturing a drug evaluation device of the above aspect.
  • Another aspect of the present invention is a drug evaluation device.
  • This device includes a cell support complex manufactured by the method for manufacturing a cell support complex of the above aspect, a support part that supports the cell support complex, and a support part that supports the cell support complex, which are arranged with the cell support complex in between, and at least one of which is an evaluation target.
  • a first chamber and a second chamber containing a drug are arranged with the cell support complex in between, and at least one of which is an evaluation target.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a cell support complex according to an embodiment.
  • FIG. 2(A) to FIG. 2(C) are process diagrams of a method for manufacturing a cell support complex and a method for manufacturing a drug evaluation device according to the embodiment.
  • FIGS. 3(A) to 3(C) are process diagrams of a method for manufacturing a cell support complex and a method for manufacturing a drug evaluation device according to an embodiment.
  • FIGS. 4(A) to 4(E) are diagrams schematically showing examples of employing cell support complexes.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates.
  • FIGS. 6(A) to 6(C) are diagrams showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates.
  • FIGS. 7(A) to 7(C) are diagrams showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates.
  • FIGS. 8(A) to 8(C) are diagrams showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates. This is an optical microscopic image of cells separated from aggregates the day after reseeding. It is a figure showing TEER at each elapsed time after reseeding.
  • FIG. 11(A) and FIG. 11(B) are diagrams showing changes in TEER over time at each seeding density.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes over time in the expression level of the OAT1 gene.
  • FIGS. 13(A) to 13(F) are diagrams showing changes over time in the expression level of OAT1 protein.
  • FIG. 14(A) and FIG. 14(B) are diagrams showing the expression levels of kidney-related transporter proteins in cell membrane proteins.
  • FIG. 14(C) is a diagram showing changes over time in the expression level of kidney-related transporter proteins in all proteins.
  • FIG. 15(A) is a diagram showing the results of membrane transport of Adefovir.
  • FIG. 15(B) is a diagram showing the results of membrane transport of Metformin.
  • kidney cells primary cultured cells
  • proximal tubular epithelial cells isolated from the kidney dedifferentiate and lose their functions due to loss of the in vivo environment or culture environment such as two-dimensional culture on a petri dish. Gradually decreases or disappears. For this reason, simply culturing kidney cells only increases the number of cells with insufficient kidney physiological function. Cells with inadequate physiological functions may not transport drugs normally or respond normally to drug toxicity. For this reason, the use of kidney cells for drug discovery research has been delayed.
  • the applicant has discovered a technology for producing cultured cells with significantly improved kidney physiological functions by culturing kidney cells that have lost their physiological functions in the form of aggregates (International Application No. PCT/JP2018/011392) .
  • a technology for producing cultured cells with significantly improved kidney physiological functions by culturing kidney cells that have lost their physiological functions in the form of aggregates (International Application No. PCT/JP2018/011392) .
  • drug evaluations can be performed with high precision.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a cell support complex 10 according to an embodiment.
  • Cell support complex 10 includes a substrate 12 and a monolayer of cultured cells 16. Furthermore, the cell support complex 10 of this embodiment also includes a coating agent layer 14.
  • the base material 12 is made of, for example, an artificial material.
  • the base material 12 has permeability to water and various ions.
  • the base material 12 also has permeability to sugars, low molecular weight proteins, and the like.
  • the drug 50 present on the cell apical membrane side is transferred to the cell support complex via the first transporter 18 on the cell apical membrane side and the second transporter 20 on the cell basement membrane side of the cultured cell 16 and the base material 12. 10 and move to the cell basement membrane side.
  • the transport of the drug 50 by the cultured cells 16 involves not only moving the drug 50 present on the cell apical membrane side to the cell basement membrane side, but also moving the drug 50 present on the cell basement membrane side to the cell apical membrane side. This also includes when moving.
  • the base material 12 is provided with, for example, holes.
  • the average pore diameter of the pores provided in the base material 12 is preferably 5 ⁇ m or less. By setting the average pore diameter to 5 ⁇ m or less, it is possible to reduce the possibility that the cultured cells 16 will pass through the substrate 12.
  • a Transwell insert manufactured by Corning Co., Ltd., average pore diameter of 0.4 ⁇ m or 3.0 ⁇ m
  • a Transwell insert manufactured by Corning Co., Ltd., average pore diameter of 0.4 ⁇ m or 3.0 ⁇ m
  • the base material 12 that does not have permeability to various substances may be used.
  • the drug 50 present on the cell apical membrane side is taken into the cultured cells 16 via the first transporter 18 of the cultured cells 16.
  • the movement of the drug 50 to the cell basement membrane side via the second transporter 20 of the cultured cells 16 is small. Therefore, no deformation occurs in the layer of cultured cells 16.
  • the amount of movement of the drug 50 via the second transporter 20 increases, but the drug 50 cannot pass through the base material 12.
  • the layer of cultured cells 16 rises to form a dome.
  • the material constituting the base material 12 is not particularly limited, but includes, for example, polystyrene, polycarbonate (PC), polyester (PET), polyester polymer alloy (PEPA), ethylene-vinyl alcohol copolymer (EVOH), polyethylene, and polysulfone. (PSf), polyethersulfone (PES), and the like.
  • Cultured cells 16 adhere to substrate 12 .
  • Cultured cells 16 of this embodiment are fixed to base material 12 by coating agent layer 14 .
  • the coating agent layer 14 is omitted, the cultured cells 16 adhere directly to the base material 12.
  • the cultured cell 16 has the first transporter 18 located on the cell apical membrane side and the second transporter 20 located on the cell basement membrane side.
  • the cultured cells 16 are produced by culturing kidney cells in a culture container in a non-adherent state.
  • the cultured cells 16 must maintain physiological functions in order to be used for drug evaluation.
  • kidney cells when kidney cells are cultured in an environment different from the in-vivo environment, they dedifferentiate and their physiological functions decline.
  • by culturing kidney cells in a culture container in a non-adherent state it is possible to restore the deteriorated physiological functions of kidney cells.
  • the kidney cells form aggregates during the culture period. For example, aggregates form within the first day of culture (ie within 24 hours).
  • aggregates form within the first day of culture (ie within 24 hours).
  • kidney cells that form the basis of the cultured cells 16 include tissue-derived kidney cells. Also included are kidney cells derived from stem cells such as iPS cells, ES cells, or Muse cells. Kidney cells also include, for example, at least one of epithelial cells of the proximal tubular system, the distal tubular system, and the collecting duct system. More specifically, examples of kidney cells include human proximal tubular epithelial cells, human distal tubular epithelial cells, and human collecting duct epithelial cells collected and isolated from the kidney.
  • kidney cells include proximal tubular epithelial cells, distal tubular epithelial cells, and collecting duct epithelial cells induced to differentiate from human iPS cells, human ES cells, or human Muse cells.
  • the kidney cells are proximal tubular epithelial cells.
  • kidney cells include the above-mentioned immortalized kidney cells, established cell lines (HK-2 cells, etc.), transformed cells into which genes are introduced into kidney cells to express proteins such as specific transporters, and Contains renal progenitor cells.
  • kidney cells derived from other animal species MDCK cells, LLC-PK1 cells, JTC-12 cells, etc.
  • MDCK cells, LLC-PK1 cells, JTC-12 cells, etc. can also be used instead of human-derived kidney cells.
  • the cultured cells 16 form a confluent monolayer on the substrate 12 without being substantially layered.
  • the "monolayer” is preferably a layer in which the cultured cells 16 are not stratified at all.
  • the above-mentioned “single layer” can also include a partially multilayered structure (substantially single layer) to the extent that a decrease in substance transfer efficiency due to multilayering is not a problem.
  • the term "confluent” preferably means a state in which the area occupied by the cultured cells 16 in the observed image is 100% of the total area of the observed image.
  • the term “confluent” means that the ratio of the area occupied by the cells to the entire culture surface of the substrate 12 is 100%, that is, the state in which cells proliferate throughout the culture surface without gaps.
  • the term “confluent” can also include a state in which there are some gaps (substantial confluence) to the extent that the occurrence of concentration-dependent mass transfer in the gaps between adjacent cells is not a problem. Those skilled in the art can easily determine whether it is a single layer or not and whether it is confluent or not.
  • the coating agent layer 14 is composed of a coating agent. Coating agent layer 14 covers at least a portion of base material 12 .
  • the coating agent layer 14 is fixed to the base material 12 by adhering to the surface of the base material 12 .
  • the coding agent comprises one or more adhesion molecules selected from the group consisting of laminin molecules, fragments of laminin molecules, basement membrane matrix mixtures, fragments of basement membrane matrix mixtures, collagen molecules, and fragments of collagen molecules. Laminin molecules, basement membrane matrix mixtures, collagen molecules, and fragments thereof may be used alone or in combination of two or more. When the coating agent layer 14 contains these adhesive molecules, it becomes easier to form a monolayer film of the cultured cells 16.
  • the coating may also contain other adhesion proteins, such as gelatin, fibronectin, and fragments thereof, in addition to or in place of the adhesion molecules described above.
  • Laminin molecules have a heterotrimeric structure with one ⁇ chain, one ⁇ chain, and one ⁇ chain. At present, five types of ⁇ chains, three types of ⁇ chains, and three types of ⁇ chains have been identified. It is known that laminin molecules form at least 12 different isoforms depending on these combinations. For example, the laminin molecule is selected from one or more of laminin 111, laminin 211, laminin 221, laminin 311, laminin 332, laminin 421, laminin 511, and laminin 521.
  • the laminin molecule also includes modified laminin (modified laminin) in which a predetermined modification group is added to one or more of the above-mentioned isoforms.
  • variant laminin modified laminin
  • Variants include genetically recombinant proteins, that is, proteins obtained by introducing mutations into proteins obtained from recombinant genes, partial proteins of genetically recombinant proteins, and proteins having peptides derived from genetically recombinant proteins.
  • Modifying groups of modified laminin are, for example, growth factor binding molecules or cell adhesion molecules.
  • the concentration of laminin molecules in the coating agent and the amount of laminin molecules adhering to the substrate 12 are adjusted as appropriate so that the cell support complex 10 can maintain its performance during the practical period.
  • the amount of adhesion of laminin molecules can be controlled by adjusting the concentration of laminin molecules in the coating agent.
  • the amount of adhesion of laminin molecules to the substrate 12 can be measured using methods known to those skilled in the art.
  • An example of a fragment of a laminin molecule is a variant of the E8 region of the laminin molecule (full-length laminin) that includes the cell adhesion site (integrin binding site) of domain I (referred to as laminin***-E8).
  • Examples of such variants include laminin 111-E8, laminin 211-E8, laminin 421-E8, laminin 511-E8, and laminin 521-E8.
  • As the laminin molecule fragment not only a modified E8 region but also a laminin peptide having cell adhesion activity or a peptide synthesized only from the cell active site can also be used.
  • laminin peptides examples include YIGSR-containing peptides, PDSGR-containing peptides, RYVVLPR-containing peptides, RGD-containing peptides, KAFDITYVRLKF-containing peptides, IKVAV-containing peptides, and LRE-containing peptides. Note that the size of the laminin molecule fragment is not particularly limited.
  • a mixture of multiple isoforms of laminin molecules and fragments may be used. Furthermore, a mixture of laminin molecules and fragments may be used. Alternatively, a plurality of coating agents containing different types of laminin molecules and/or fragments may be applied to the base material 12 to laminate a plurality of coating agent layers 14 containing different types of laminin.
  • basement membrane matrix mixture is a mixture of extracellular matrix proteins extracted from mouse sarcomas.
  • the basement membrane matrix mixture contains laminin, collagen IV, and entactin as main components.
  • An example of the basement membrane matrix mixture is Matrigel (registered trademark: Corning).
  • Matrigel refers to a soluble basement membrane matrix extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, which is rich in extracellular matrix proteins.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • Matrigel also includes Matrigel (Growth Factor Reduced Matrigel Matrix) in which growth factors are reduced compared to this Matrigel.
  • the concentration of the basement membrane matrix mixture in the coating agent and the amount of adhesion of the basement membrane matrix mixture to the base material 12 are adjusted as appropriate so that the cell support complex 10 can maintain its performance during the practical period.
  • the amount of adhesion of the basement membrane matrix mixture can be controlled by adjusting the concentration of the basement membrane matrix mixture in the coating agent.
  • the amount of adhesion of the basement membrane matrix mixture to the substrate 12 can be measured using methods known to those skilled in the art.
  • the fragment of the basement membrane matrix mixture is a mixture of at least one of a laminin fragment, a collagen IV fragment, and an entactin fragment. Furthermore, a plurality of types of basement membrane matrix mixture and fragments may be used in combination. Furthermore, the basement membrane matrix mixture and the fragments may be used as a mixture. Alternatively, a plurality of coating agents containing different types of basement membrane matrix mixtures and/or fragments may be applied to the substrate 12, and a plurality of coating agent layers 14 containing different types of mixtures may be laminated.
  • collagen molecule examples include collagen I and collagen IV. These can be obtained from Nitta Gelatin Co., Ltd., for example.
  • the concentration of collagen molecules in the coating agent and the amount of collagen molecules adhering to the base material 12 are adjusted as appropriate so that the cell support composite 10 can maintain its performance during the practical period.
  • the amount of collagen molecules adhered can be controlled by adjusting the concentration of collagen molecules in the coating agent.
  • the amount of adhesion of collagen molecules to the substrate 12 can be measured using methods known to those skilled in the art.
  • a mixture of multiple types of collagen molecules and fragments may be used. Further, a mixture of collagen molecules and fragments may be used. Alternatively, a plurality of coating agents containing different types of collagen molecules and/or fragments may be applied to the base material 12, and a plurality of coating agent layers 14 containing different types of collagen may be stacked.
  • FIG. 3 is a process diagram of the method. Note that in FIGS. 3(A) and 3(B), only a portion of the base material 12 is illustrated.
  • the method for manufacturing the cell support complex 10 involves culturing kidney cells 24 in the form of aggregates 30, separating the aggregates 30 into individual cultured cells 16, and placing them on a substrate 12 at a predetermined seeding density.
  • the method includes seeding the cultured cells 16 on the substrate 12 and culturing the cultured cells 16 for a predetermined period of time to form a monolayer film of the cultured cells 16.
  • the method for manufacturing the drug evaluation device 42 according to the present embodiment includes installing the cell support complex 10 manufactured by the method for manufacturing the cell support complex 10 according to the present embodiment on the support section 32 or using the base material.
  • the method includes forming a first chamber 34 and a second chamber 36 which are arranged on both sides of the drug 50 and at least one of which accommodates the drug 50 to be evaluated.
  • kidney cells 24 are seeded in a culture container 26. Further, a culture solution 28 is added to the culture container 26.
  • the culture container 26 is not particularly limited as long as the kidney cells 24 can be cultured in suspension.
  • Examples of the culture vessel 26 include a U-bottom or V-bottom 96-well plate, a U-bottom 384-well plate, a microwell plate with a larger number of wells, a spinner flask, a Petri dish, a hollow fiber, a culture bottle, a culture bag, and a microflow. Examples include channels, culture tanks, etc.
  • the culture container 26 may be a high-density spheroid production plate.
  • aggregates 30 can be produced in large quantities.
  • high-density spheroid production plates include ELPLASIA (registered trademark) plate (Corning) and EZSPHERE (registered trademark) plate (AGC Technoglass).
  • ELPLASIA plates include types such as 6-well plates, 24-well plates, 96-well plates, and 384-well plates.
  • the bottom area of the wells varies depending on the number of wells.
  • the number of aggregates 30 to be produced varies depending on the size of the base area.
  • the aggregates produced on the high-density spheroid production plate may subsequently be cultured in suspension with shaking.
  • aggregates are housed in a dish or plate that has been subjected to cell non-adhesion treatment, and the dish or the like is placed on a shaker to culture the aggregates.
  • a shaker a reciprocating shaker or a rotating shaker can be used.
  • the culture solution 28 is not particularly limited as long as it can culture the kidney cells 24, and can be appropriately selected from known culture solutions depending on the type of cells to be cultured. For example, when culturing proximal tubular cells, REGM (Lonza), EpiCM (ScientCell), Keratinocyte SFM (Life Technologies), etc. can be used. Furthermore, commercially available renal tubular cell culture media, epithelial cell culture media, vascular endothelial cell culture media, etc. can also be used.
  • kidney cells 24 are cultured.
  • the kidney cells 24 are cultured in a non-adherent state on the surface of the culture container 26. Therefore, as shown in FIG. 2(B), aggregates 30 of kidney cells 24 are formed during the culture period.
  • the size of the aggregate 30 is, for example, about 100 ⁇ m or more and about 350 ⁇ m or less.
  • the size of the aggregate 30 is defined as the maximum width of the aggregate 30. That is, the size of the aggregate 30 is the length of the largest straight line connecting two points on the outer edge of the aggregate 30.
  • the size of the aggregate 30 can be controlled by adjusting the number of cells seeded in the culture container 26.
  • the number of kidney cells 24 seeded per well is preferably 500 or more and 5000 or less. In culture in a well plate, one aggregate 30 is formed in one well. Therefore, when the number of kidney cells 24 seeded per well is 500 to 5,000, the number of kidney cells constituting the aggregate 30 is 500 to 5,000.
  • the size of the aggregate 30 is 100 ⁇ m or more and 350 ⁇ m or less when the number of constituent cells is 500 or more and 5000 or less.
  • the number of constituent cells of the aggregate 30 By setting the number of constituent cells of the aggregate 30 to 500 or more or the size to 100 ⁇ m or more, it is possible to easily avoid the aggregate 30 being sucked together with the old culture solution when replacing the medium. . Further, by setting the number of constituent cells to 5000 or less or the size to 350 ⁇ m or less, cultured cells 16 having better physiological functions can be obtained.
  • the size of the aggregate 30, in other words, the number of kidney cells 24 constituting one aggregate 30, can be controlled by adjusting the cell density in the container.
  • the cell density in the Petri dish is 1500 cells. It is adjusted to 15,000 pieces/cm 2 or more and 15,000 pieces/cm 2 or less. Then, by statically culturing, shaking culturing, or stirring culturing the kidney cells 24, a plurality of aggregates 30 having a desired size and number of constituent cells can be formed at once.
  • Collagen I may be added to the culture solution 28.
  • Collagen I has the function of adhering kidney cells 24 to each other. Therefore, by culturing the kidney cells 24 in the culture solution 28 containing collagen I, it is possible to more easily form the aggregates 30.
  • the collagen I added is preferably full-length collagen I, but it may also be ⁇ 1 chain or ⁇ 2 chain constituting collagen I, or collagen peptides in which each chain is fragmented.
  • the animal species of collagen I is not particularly limited, and collagen I derived not only from humans but also from other animals can be used.
  • the culture container 26 is subjected to a cell non-adhesion treatment or is made of a cell non-adhesion material.
  • the aggregate 30 can be formed more easily.
  • the cell non-adhesion treatment include a cell non-adhesion hydrogel coating treatment on the surface of the container, an MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) coating treatment, a Proteosave (registered trademark) SS coating treatment, a mirror polishing treatment, and the like. Glass etc. are illustrated as a cell non-adhesion material.
  • Cell non-adhesive materials include low density polyethylene, medium density polyethylene, polyvinyl chloride, polyethylene-vinyl acetate copolymer, poly(ethylene-ethyl acrylate) copolymer, poly(ethylene-methacrylate) copolymer, poly(ethylene vinyl acetate) ) copolymers, and mixtures of two or more of these polymers.
  • the culture period of kidney cells 24 is preferably 5 days or more. Further, the culture period is preferably 90 days or less (ie, 2160 hours or less), and more preferably 14 days or less (ie, 336 hours or less). By setting the culture period to 5 days or more, it becomes easier to obtain cultured cells 16 in which physiological functions are more highly expressed. Furthermore, by setting the culture period to 90 days or less, it becomes easier to obtain cultured cells 16 in which physiological functions are more highly expressed. Furthermore, by setting the culture period to 14 days or less, it becomes easier to separate cultured cells from aggregates. Culture conditions are, for example, 37°C and 5% CO2 . During the culture period, it is preferable to exchange the culture solution 28 periodically. For example, the culture medium 28 is replaced every two days.
  • the aggregate 30 is separated into individual cultured cells 16.
  • the cultured cells 16 can be separated from the aggregates 30 by enzymatically treating the aggregates 30 using Accumax, trypsin/EDTA, Accutase, collagenase, EDTA, TrypLE Select, or the like.
  • An example of enzyme dispersion treatment includes incubation at 37° C. for 10 minutes or more and pipetting with a micropipette. Thereby, a cell suspension in which single cultured cells 16 are dispersed is obtained.
  • the concentration of the enzyme used for the treatment can be appropriately set depending on the type of cultured cells 16. However, when the enzyme concentration is high, isolation of the cultured cells 16 becomes easier, but there is an increased possibility that cell surface proteins of the cultured cells 16 will be damaged. For this reason, it is desirable that the enzyme concentration be as low as possible.
  • a coating agent is applied to at least a portion of the base material 12.
  • a coating agent layer 14 is formed on the surface of the base material 12.
  • cultured cells 16 are seeded onto the substrate 12.
  • cultured cells 16 can be seeded on the substrate 12 by applying a cell suspension obtained by enzyme dispersion treatment to the substrate 12. Then, the cultured cells 16 are cultured on the substrate 12 to form a monolayer film of the cultured cells 16.
  • the cultured cells 16 are seeded on the substrate 12 at a seeding density of 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less.
  • a seeding density of 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less.
  • the number of cultured cells 16 is 2 ⁇ 10 4 or more and 6 ⁇ 10 4 or less per well.
  • the substrate 12 is seeded at a seeding density. Note that a cell culture insert for a 12-well plate with a seeding area of 1.131 cm 2 can also be used as the substrate 12.
  • the cultured cells 16 are cultured on the substrate 12 for a period of 12 hours or more and 48 hours or less.
  • the cultured cells 16 are cultured at 37° C. and 5% CO 2 using, for example, REGM (Lonza) as a culture medium. After the cultured cells 16 proliferate on the substrate 12 until they become confluent, they maintain the confluent state. Through the above steps, the cell support complex 10 is obtained.
  • Consisting of cultured cells 16 that maintain good physiological function by setting the seeding density to 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, and the culture period to 12 hours or more and 48 hours or less. It is possible to obtain a monolayer film with substantially no drug leakage. More preferably, the cultured cells 16 are seeded on the substrate 12 at a seeding density of 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 12 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less. In the case of a cell culture insert with a seeding area of 0.336 cm 2 , cultured cells 16 are seeded on the substrate 12 at a seeding density of 2 ⁇ 10 4 cells/well or more and 4 ⁇ 10 4 cells/well or less. Thereby, it is possible to easily extend the period during which the monolayer membrane of the cultured cells 16 is maintained well, in other words, the period during which the cell support complex 10 can be used for drug evaluation.
  • the cell support complex 10 is installed on the support section 32.
  • the drug evaluation device 42 of this embodiment takes the form of a transwell.
  • substrate 12 is a cell culture insert and support 32 is a well of a well plate.
  • An insert as a base material 12 is accommodated in a well as a support 32 .
  • the space within the well is divided into two by the cell support complex 10, and a first chamber 34 and a second chamber 36 are formed, which are lined up with the cell support complex 10 in between.
  • the first chamber 34 is arranged above the cell support complex 10, that is, on the cell monolayer side, and the second chamber 36 is arranged below the cell support complex 10, that is, on the base material 12 side.
  • a drug evaluation device 42 including the cell support complex 10, the support section 32, the first chamber 34, and the second chamber 36 is obtained.
  • cultured cells 16 are seeded on the base material 12 to produce the cell support complex 10. After installation, cultured cells 16 may be seeded on the base material 12 to produce the cell support complex 10.
  • At least one of the first chamber 34 and the second chamber 36 accommodates the drug 50 to be evaluated.
  • a liquid obtained by adding drug 50 to a balanced salt solution such as an HBSS buffer is contained in at least one chamber.
  • FIG. 3C shows a drug evaluation device 42 in which a first liquid 38 is housed in a first chamber 34 and a second liquid 40 is housed in a second chamber 36.
  • Drug 50 is added to at least one of first liquid 38 and second liquid 40.
  • the drug 50 can come into contact with the cultured cells 16 in both the state accommodated in the first chamber 34 and the state accommodated in the second chamber 36 .
  • the drug evaluation method includes evaluating the transport of drug 50 by cultured cells 16 included in cell support complex 10 using drug evaluation device 42 obtained by the above-described manufacturing method. That is, according to the drug evaluation device 42, the uptake and discharge of the drug 50 by the first transporter 18 and the second transporter 20 can be evaluated. Moreover, the influence of the drug 50 on the kidneys can be predicted by the evaluation.
  • the drug 50 is transferred to the first transporter 18. Uptake capacity of 50 can be evaluated.
  • the drug 50 is transferred to the second transporter 20. Uptake capacity of 50 can be evaluated.
  • the cultured cells 16 can The absorption ability of the drug 50 from the apical membrane side to the cell basal membrane side can be evaluated.
  • the cultured cells 16 can The ability to excrete the drug 50 from the proximal membrane side to the cell apical membrane side can be evaluated.
  • the physiological function of the kidney is maintained in a good state and the cells are substantially free from drug leakage. It is possible to obtain a monolayer film of. Therefore, drug evaluation is preferably carried out within a period of 12 hours or more and 48 hours or less after seeding the cultured cells 16 on the substrate 12 and starting the culture.
  • the cell support complex 10 can also be used in devices other than the Transwell described above.
  • 4(A) to FIG. 4(E) are diagrams schematically showing examples of employing the cell support complex 10. Note that each figure shows a part of the structure in which the cell support complex 10 is incorporated.
  • FIG. 4(A) illustrates a device incorporating a cell support composite 10 in which a hollow fiber membrane is used as the base material 12.
  • a monolayer membrane of cultured cells 16 is formed within the lumen of the hollow fiber membrane.
  • this device can take a predetermined substance contained in the liquid into the cultured cells 16 and move it out of the lumen of the hollow fiber membrane.
  • This device can be used, for example, as a bioartificial kidney module that recovers useful substances from plasma components filtered with a hemofilter.
  • FIG. 4(B) illustrates how the cell support complex 10 is incorporated into the microchannel chip.
  • the base material 12 constitutes the microchannel.
  • a monolayer film of cultured cells 16 is formed on the inner wall of the microchannel.
  • a small amount of liquid is flowed into the channel, that is, on the side where the cultured cells 16 are placed. Then, the predetermined substance in the liquid is taken into the cultured cells 16.
  • the microchannel chip can be used, for example, as a drug evaluation module that examines cell functions and drug uptake and excretion using minute amounts of liquid.
  • the microchannel chip can be used while being housed in a cartridge.
  • FIG. 4(C) illustrates how the cell support complex 10 constitutes a hollow microcarrier.
  • FIG. 4(D) illustrates how the cell support complex 10 constitutes a solid microcarrier.
  • the base material 12 constitutes the carrier body.
  • a monolayer film of cultured cells 16 is formed on the outer surface of the base material 12.
  • a small amount of liquid is flowed on the side where cultured cells 16 are placed. Then, the predetermined substance in the liquid is taken into the cultured cells 16.
  • Each microcarrier can be used, for example, as a drug evaluation module for investigating cell functions and drug uptake and excretion using minute amounts of liquid.
  • Each microcarrier can be used housed in a cartridge.
  • FIG. 4(E) illustrates how the cell support complex 10 is incorporated into the bottom of the well of the well plate.
  • the cultured cells 16 face the top of the well.
  • a small amount of liquid 49 is injected into the wells.
  • the predetermined substance in the liquid 49 is taken into the cultured cells 16.
  • the well plate can be used, for example, as a drug evaluation module that examines cell functions and drug uptake and excretion using minute amounts of liquid.
  • the cell support complex 10 may be incorporated into a culture dish (petri dish, etc.) instead of a well plate.
  • the kidney cells 24 are cultured in the state of aggregates 30 to produce the cultured cells 16, and the cultured cells 16 are divided into 5 ⁇ 10
  • the cells are sown on the substrate 12 at a seeding density of 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, and the cultured cells 16 are cultured on the substrate 12 for a period of 12 hours or more and 48 hours or less. including forming a layer film.
  • the physiological function of the kidney is improved and the drug can be evaluated using a monolayer film of the cultured cells 16 with substantially no drug leakage. Therefore, it is possible to improve the accuracy of drug evaluation assays.
  • the seeding density of the cultured cells 16 by setting the seeding density of the cultured cells 16 to 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 12 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, it is possible to easily extend the period during which the cell support complex 10 can be used for drug evaluation. can.
  • the manufacturing method of the drug evaluation device 42 according to the present embodiment is performed by installing the cell support complex 10 according to the present embodiment on the support section 32 or with the base material 12 installed on the support section 32.
  • Preparing the cell support complex 10 includes forming a first chamber 34 and a second chamber 36 that are lined up with the cell support complex 10 in between and at least one of which accommodates the drug 50 to be evaluated.
  • a drug evaluation device 42 is obtained that includes the cell support complex 10, the support section 32, and the first chamber 34 and the second chamber 36, at least one of which accommodates the drug 50.
  • the drug evaluation method according to the present embodiment includes evaluating the transport of the drug 50 by the cultured cells 16 using the drug evaluation device 42.
  • membrane transport evaluation using Transwell which is a general pharmacokinetic evaluation method, can be performed with higher accuracy.
  • Embodiments may be specified by the items described below.
  • (1st item) Culturing kidney cells (24) in the state of aggregates (30), Separating the aggregate (30) into individual cultured cells (16), Seeding the cultured cells (16) on the substrate (12) at a seeding density of 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, Cultivating the cultured cells (16) on the substrate (12) for a period of 12 hours or more and 48 hours or less to form a monolayer film of the cultured cells (16), Method for producing cell support complex (10).
  • a method for producing a cell support complex according to item 1. (3rd item) The cell support complex (10) produced by the method for producing a cell support complex (10) according to the first or second item is installed on the support section (32), or the base material (12) is placed on the support section (32). 32) and seeding the cultured cells (16) on the substrate (12) by the method for producing a cell support complex (10) described in the first or second item to form a cell support complex (10).
  • Method for manufacturing a drug evaluation device (42) Transport of the drug (50) by the cultured cells (16) included in the cell support complex (10) is carried out using the drug evaluation device (42) obtained by the method for manufacturing the drug evaluation device (42) described in the third item. including evaluating Drug evaluation methods.
  • a suspension of dedifferentiated cells was prepared.
  • the cell concentration in the suspension was 10,000 cells/ml.
  • Cells were seeded by dropping 100 ⁇ l of the cell suspension onto a 96-well U-bottom plate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) that had been subjected to cell non-adhesion treatment. Therefore, the seeding density is 1000 cells/well.
  • the cells were cultured at 37° C. and 5% CO 2 using REGM (model number CC-3190, Lonza) as a culture medium. The culture medium was replaced every two days. This culture caused the cells to form aggregates.
  • REGM model number CC-3190, Lonza
  • RNeasy Mini Kit QIAGEN
  • cells were cultured immediately after seeding (i.e., 0 hours) and on days 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, and 14 days (i.e., 72, 96, 120, 144 days).
  • 168, 192, 240, 288, 336 hours mRNA was extracted and purified from the cells constituting the aggregates.
  • cDNA was synthesized from the purified mRNA using QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN).
  • QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit
  • the AQP1 (aquaporin 1) gene is a gene that encodes the AQP1 protein involved in water transport.
  • the SGLT2 sodium glucose cotransporter 2 gene is a gene that encodes the SGLT2 protein involved in the transport of sodium and glucose.
  • the OAT1 organic anion transporter 1 gene is a gene encoding the OAT1 protein, which is involved in the transport of drugs, particularly in the transport of relatively low molecular weight compounds.
  • FIG. 5 is a diagram showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates. As shown in FIG. 5, it was confirmed that the expression levels of each gene were increased by culturing human proximal tubular epithelial cells in an aggregated state. In other words, it was confirmed that aggregation culture restores the physiological functions of cells. In particular, it was confirmed that the expression level of the OAT1 gene significantly increases when cultured for 5 days or more.
  • the aggregates were cultured for a longer period of time, and the expression levels of kidney-related genes in the cells constituting the aggregates were analyzed over time.
  • 1000 dedifferentiated human proximal tubular epithelial cells (model number CC-2553, Lonza) were placed in a 96-well plate treated with cell non-adhesion, and 100 ⁇ l of REGM (model number CC-3190, Lonza) was added. ) under conditions of 37°C and 5% CO2 . The medium was replaced every two days. This culture caused the cells to form aggregates.
  • OAT1, OAT3 organic anion transporter 3
  • OCT2 organic cation transporter 2
  • MDR1 multiple drug
  • resistance 1 MATE1 (multidrug and toxin extrusion 1)
  • MATE2 multidrug and toxin extrusion 2
  • URAT1 urate transporter 1
  • PEPT2 peptide transporter 2
  • SGLT2 SGLT2.
  • renal cortex mRNA directly collected from human kidneys was used as a positive control.
  • FIGS. 6(A) to 8(C) are diagrams showing changes over time in gene expression levels in cells constituting aggregates.
  • the genes OAT1, OAT3, OCT2, MDR1, MATE1, and MATE2 encode drug transporter proteins involved in drug excretion from the blood vessel side to the renal tubule side. It was confirmed that the expression level was increased by aggregation culture. Furthermore, it was confirmed that the state in which the expression level was increased could be maintained for up to 90 days in culture. Similarly, the expression levels of the URAT1, PEPT2, and SGLT2 genes, which encode endogenous transporter proteins involved in the reabsorption of substances from the renal tubule side to the blood vessel side, were increased by aggregation culture, and the expression levels also increased. It was confirmed that the condition could be maintained for up to 90 days of culture.
  • test 2 Human proximal tubular epithelial cells (model number CC-2553, LONZA) were awakened, seeded in an adhesive-treated petri dish, and incubated at 37°C using REGM (model number CC-3190, LONZA). Two-dimensional culture was performed under 5% CO2 conditions. The culture medium was replaced every two days. Before the cells became confluent, Accutase (Innovative Cell Technologies) was added to the petri dish, reacted for 3 minutes at room temperature, and dedifferentiated cells were collected.
  • REGM model number CC-3190, LONZA
  • the cells were seeded by dropping this cell suspension onto a 96-well V-bottom plate (PrimeSurface plate 96V, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) that had been subjected to cell non-adhesion treatment.
  • the seeding density was 1000 cells/well.
  • the cells were cultured using REGM at 37° C. and 5% CO 2 for 10 days. The culture medium was replaced every two days. This culture caused the cells to form aggregates.
  • a Transwell was prepared in which a cell culture insert (model number 662-641, Greiner) was placed in each well of a 24-well plate (model number 662-160, Greiner).
  • the insert used was one in which a coating solution containing 3.3 ⁇ L/well of laminin (iMatrix-511 silk, Nippi Co., Ltd.) and 100 ⁇ L/well of PBS was dropped onto the insert the day before use, and the insert was allowed to stand overnight under refrigeration.
  • the coating liquid dropped onto the insert was removed immediately before cell seeding, and the cells were seeded again by dropping the cell suspension onto the insert.
  • the amount of cell suspension dropped was 150 ⁇ L/well.
  • the seeding density was 4 ⁇ 10 4 cells/well (12 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ).
  • FIG. 9 is an optical microscopic image of cells separated from aggregates the day after reseeding. From Figure 9, it was confirmed that cells could be unified by enzymatic treatment of the aggregates, that the unified cells could be uniformly dispersed on the insert, and that the cells could grow to a confluent state. . In other words, it was confirmed that cells isolated from aggregates could be used to form cell support complexes.
  • TEER was measured on the day of reseeding until 13 hours after reseeding, and every 24 hours until 72 hours after the day after reseeding.
  • TEER is an electrical resistance value that is an indicator of the formation of a monolayer membrane of cells, and when TEER is 100 ⁇ cm2 or more, a uniform monolayer membrane with virtually no drug leakage is formed. means that The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 is a diagram showing TEER at each elapsed time after reseeding. As shown in FIG. 10, TEER was 100 ⁇ cm 2 or more from 12 to 48 hours after reseeding. Therefore, it was confirmed that by setting the culture period of the cultured cells 16 on the substrate 12 to 12 hours or more and 48 hours or less, a cell monolayer film with substantially no drug leakage could be obtained.
  • FIG. 10 also shows the TEER when two-dimensionally cultured cells were re-seeded onto the insert (24 hours after re-seeding).
  • the TEER did not rise above 100 ⁇ cm 2 . This is thought to be because the two-dimensional culture did not restore the physiological functions of the cells and did not increase the expression level of binding proteins that contribute to binding between cells.
  • the expression level of binding proteins increased, so it is thought that a uniform monolayer was formed and the TEER increased to 100 ⁇ cm 2 or more.
  • FIG. 11(A) and FIG. 11(B) are diagrams showing changes in TEER over time at each seeding density.
  • the seeding density is 6.5 ⁇ 10 4 cells/well (19 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ) or more
  • the TEER is 100 ⁇ cm 2 or more. It didn't rise.
  • the seeding density is 2 ⁇ 10 4 cells/well to 6 ⁇ 10 4 cells/well (5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 )
  • the TEER is 100 ⁇ cm 2 or more. Rose.
  • the seeding density is 2 ⁇ 10 4 cells/well to 4 ⁇ 10 4 cells/well (5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 to 12 ⁇ 10 4 cells/cm 2 )
  • the seeding density is 6 ⁇ 10 4 cells/cm 2 /well (18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 )
  • the state in which the TEER was 100 ⁇ cm 2 or more was maintained for a longer period of time. Therefore, it has been confirmed that by setting the seeding density to 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 12 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, the usable period of the cell support complex 10 or the drug evaluation device 42 can be easily extended. Ta.
  • the TEER at a seeding density of 4 ⁇ 10 4 cells/well does not necessarily match.
  • the TEER becomes 100 ⁇ cm 2 or more after 21 hours after reseeding.
  • the TEER becomes 100 ⁇ cm 2 or more after 19 hours after reseeding. It is presumed that this is because the TEER measurement start times are different. Further, the maximum value of TEER is different between FIG. 11(A) and FIG. 11(B).
  • the present inventor found that when the seeding density is 5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more and 18 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less and the culture period is 12 hours or more and 48 hours or less, the TEER is 100 ⁇ cm 2 or more. This has been confirmed with high reproducibility.
  • cDNA was synthesized from the purified mRNA using QuantiTect Whole Transcriptome Kit (QIAGEN). Using these cDNAs as templates, the expression level of the OAT1 gene was measured by real-time PCR using Thermal Cycler Dice Real Time System I (Takara Bio Inc.). Then, the relative value of the expression level of the OAT1 gene to the expression level of the GAPDH gene, which is a housekeeping gene, was calculated. Furthermore, as a control, the expression level of the OAT1 gene in human renal cortex was also measured, and the relative value to the expression level of the GAPDH gene was calculated. The results are shown in FIG.
  • FIG. 12 is a diagram showing changes over time in the expression level of the OAT1 gene.
  • the expression level of the OAT1 gene decreased over time after reseeding.
  • the expression level of the OAT1 gene had decreased to about 1/100 of the expression level of the OAT1 gene in aggregates and human renal cortex.
  • the physiological function required for drug evaluation significantly deteriorates 48 hours after re-inoculation.
  • Test 6 (Analysis of changes over time in protein expression levels in cells after reseeding 1: Test 6) Test 5 confirmed that 48 hours after re-inoculation, genes related to kidney physiological functions disappeared to an extent unsuitable for drug evaluation. However, even if a gene related to the physiological function of the kidney is lost, if the expression of the protein encoded by the gene is maintained, it can be said that the cell maintains a state suitable for use in drug evaluation. Generally, the expression level of a protein decreases with a delay from the decrease in the expression level of a gene. Therefore, the present inventor observed the expression of OAT1 protein in cells after reseeding by immunocytostaining.
  • FIGS. 13(A) to 13(F) are diagrams showing changes over time in the expression level of OAT1 protein.
  • FIG. 13(A) is a fluorescence microscope image obtained when two-dimensionally cultured cells were re-seeded (24 hours after re-seeding) as a reference.
  • FIG. 13(B) to FIG. 13(F) are fluorescence microscopic images when the aggregated cultured cells were re-seeded (2, 6, 24, 48, and 120 hours after re-seeding). As shown in FIG. 13(A), no expression of OAT1 protein could be observed in the two-dimensionally cultured cells. On the other hand, as shown in FIGS.
  • FIG. 14(A) and FIG. 14(B) are diagrams showing the expression levels of kidney-related transporter proteins in cell membrane proteins.
  • FIG. 14(C) is a diagram showing changes over time in the expression level of kidney-related transporter proteins in all proteins.
  • FIGS. 14(A) to 14(C) show relative values for the expression levels of transporter proteins 0 hours after reseeding.
  • FIG. 14(A) and FIG. 14(B) show the expression level up to 24 hours after reseeding.
  • FIG. 14(C) shows the expression level up to 48 hours after reseeding.
  • the SLC transporter (solute carrier transporter) proteins of the uptake system are GLUT2 (glucose transporter 2), GLUT9 (glucose transporter 9), OCTN1 (organinc cation/carnitine transporter 1), and OCTN2 ( Expression levels of organinc cation/carnitine transporter 2), PEPT1 (peptide transporter 1), OAT1, OCT2, MATE1, MATE2-K (multidrug and toxin extrusion 2-K), and OATP4C1 (organic anion-transporting polypeptide 4C1) are shown. .
  • FIG. 14(B) shows the expression levels of ABCA3, ABCB1 (MDR1), ABCC1, ABCC2, ABCC3, and ABCC4, which are excretion system ABC transporter (ATP binding cassette transporter) proteins.
  • FIG. 14(C) shows the expression levels of each protein: OAT1, OCT2, MATE1, MATE2, and ABCB1.
  • each SLC transporter protein was maintained at 40% or more in the cells 24 hours after reseeding.
  • the expression level of each ABC transporter protein was maintained at 60% or more in the cells 24 hours after re-seeding.
  • the expression level of each transporter protein was maintained at 25% or more until 48 hours after re-seeding. If the expression level of the transporter protein remains 20% or more of the expression level in the aggregate, it can be said that the cell maintains the physiological function required for drug evaluation. Therefore, it was confirmed that the cultured cells 16 retained physiological functions necessary for drug evaluation even 48 hours after reseeding.
  • Assay buffer in which each substrate was added to HBSS buffer was added to the Transwell insert and treated for a certain period of time.
  • the treatment time was 2 minutes.
  • the treatment time for the Metformin test was 10 minutes.
  • the cells were collected, a cell suspension was prepared, and the radioactive isotope in the cell suspension was quantified.
  • the amount of substrate taken into the cell from the apical membrane side of the cell was evaluated.
  • the amount of substrate uptake was evaluated in the same manner in the case where the OAT1 inhibitor Probenecid was added to the assay buffer and the case where the OCT2 inhibitor Cimetidine was added.
  • assay buffer was added to the wells of the Transwell and treated for a certain period of time.
  • the treatment time was 2 minutes.
  • the treatment time for the Metformin test was 10 minutes.
  • the cells were collected, a cell suspension was prepared, and the radioactive isotope in the cell suspension was quantified. This evaluated the amount of substrate taken into the cells from the cell basement membrane side. Furthermore, the amount of substrate uptake was evaluated in the same manner in the case where the inhibitor Probenecid was added to the assay buffer and the case where the inhibitor Cimetidine was added. The results are shown in FIG. 15(A) and FIG. 15(B).
  • FIG. 15(A) is a diagram showing the results of membrane transport of Adefovir.
  • FIG. 15(B) is a diagram showing the results of membrane transport of Metformin.
  • a to C indicates the amount of substrate taken into the cell from the cell apical membrane side.
  • B to C indicates the amount of substrate taken into the cell from the cell basement membrane side.
  • the present invention can be utilized in a method for manufacturing a cell support complex, a method for manufacturing a drug evaluation device, a drug evaluation method, and a drug evaluation device.
  • 10 cell support complex 10 cell support complex, 12 substrate, 16 cultured cells, 24 kidney cells, 30 aggregates, 32 support section, 34 first chamber, 36 second chamber, 42 drug evaluation device, 50 drug.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

細胞支持複合体１０の製造方法は、腎臓細胞を凝集体の状態で培養し、凝集体を個々の培養細胞１６に分離し、５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材１２に培養細胞１６を播種し、基材１２上で培養細胞１６を１２時間以上４８時間以下の期間培養して、培養細胞１６の単層膜を形成することを含む。

Description

細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置
　本発明は、細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置に関する。
　生体に投与された薬剤は生体内で作用した後に、腎臓で血液から尿中に排泄される。この血液から尿への薬剤の輸送は、腎臓細胞のトランスポータータンパク質によって行われる。このため、腎臓細胞は薬剤が持つ腎毒性の影響を受けやすい。特に、近位尿細管上皮細胞（Renal Proximal Tubule Epithelial Cells：ＲＰＴＥＣ）は、腎臓において最も薬剤の影響を受ける傾向にある。したがって、腎臓細胞を用いて薬物の動態や腎毒性を評価することは、薬剤の作用を明らかにする上で重要である。
　腎臓細胞を用いて薬剤の動態や腎毒性を評価するアッセイを開発する上で、多量の腎臓細胞が必要となり得る。これに対し、例えば特許文献１には、細胞周期制御因子の遺伝子発現を抑制することで、十分な数の近位尿細管上皮細胞を得る培養技術が開示されている。
特開２０１１－５０３５８号公報
　従来の培養技術では、培養により腎臓細胞の生理機能が低下してしまうという課題があった。このため従来の方法で培養した細胞を組み込んだ薬剤評価アッセイでは、高精度の薬剤評価が困難であった。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、細胞を用いた薬物評価アッセイの精度向上を図る技術を提供することにある。
　本発明のある態様は、細胞支持複合体の製造方法である。この製造方法は、腎臓細胞を凝集体の状態で培養し、凝集体を個々の培養細胞に分離し、５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材に培養細胞を播種し、基材上で培養細胞を１２時間以上４８時間以下の期間培養して、培養細胞の単層膜を形成することを含む。
　本発明の他の態様は、薬剤評価装置の製造方法である。この製造方法は、上記態様の細胞支持複合体の製造方法により作製した細胞支持複合体を支持部に設置するか、基材を支持部に設置するとともに上記態様の細胞支持複合体の製造方法により基材に培養細胞を播種して細胞支持複合体を作製し、細胞支持複合体を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤を収容する第１チャンバーおよび第２チャンバーを形成することを含む。
　本発明の他の態様は、薬剤評価方法である。この方法は、上記態様の薬剤評価装置の製造方法により得られる薬剤評価装置を用いて、細胞支持複合体が備える培養細胞による薬剤の輸送を評価することを含む。
　本発明の他の態様は、薬剤評価装置である。この装置は、上記態様の細胞支持複合体の製造方法により製造された細胞支持複合体と、細胞支持複合体を支持する支持部と、細胞支持複合体を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤を収容する第１チャンバーおよび第２チャンバーと、を備える。
　なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
　本発明によれば、細胞を用いた薬物評価アッセイの精度向上を図ることができる。
実施の形態に係る細胞支持複合体を模式的に示す図である。 図２（Ａ）～図２（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の製造方法および薬剤評価装置の製造方法の工程図である。 図３（Ａ）～図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体の製造方法および薬剤評価装置の製造方法の工程図である。 図４（Ａ）～図４（Ｅ）は、細胞支持複合体の採用例を模式的に示す図である。 凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。 図６（Ａ）～図６（Ｃ）は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。 図７（Ａ）～図７（Ｃ）は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。 図８（Ａ）～図８（Ｃ）は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。 凝集体から分離した細胞の再播種翌日の光学顕微鏡像である。 再播種後からの各経過時間におけるＴＥＥＲを示す図である。 図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）は、各播種密度におけるＴＥＥＲの経時変化を示す図である。 ＯＡＴ１遺伝子の発現量の経時変化を示す図である。 図１３（Ａ）～図１３（Ｆ）は、ＯＡＴ１タンパク質の発現量の経時変化を示す図である。 図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）は、細胞膜タンパク質における腎臓関連トランスポータータンパク質の発現量を示す図である。図１４（Ｃ）は、全タンパク質における腎臓関連トランスポータータンパク質の発現量の経時変化を示す図である。 図１５（Ａ）は、Ａｄｅｆｏｖｉｒの膜輸送の結果を示す図である。図１５（Ｂ）は、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎの膜輸送の結果を示す図である。
　以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。
　本発明者は、細胞を用いた薬物評価アッセイについて考察し、以下のような認識を得た。すなわち、腎臓から単離された近位尿細管上皮細胞等の腎臓細胞（初代培養細胞）は、生体内環境の消失や、シャーレ上での二次元培養といった培養環境により、脱分化して機能が徐々に低下あるいは消失する。このため、腎臓細胞を単に培養するだけでは、腎臓の生理機能が不十分な細胞が増えるだけである。生理機能が不十分な細胞は、薬物の正常な輸送や薬物の毒性に対する正常な反応を示さない可能性がある。このため、創薬研究への腎臓細胞の利用が滞っていた。
　本出願人は、生理機能が消失した腎臓細胞を凝集体の状態で培養することで、腎臓の生理機能が大きく改善した培養細胞を生成する技術を見出した（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０１１３９２）。この技術で得られる細胞を薬剤評価アッセイに組み込むことで、薬剤評価を高精度に実施できると期待される。
　薬剤評価アッセイ、特に腎臓における薬剤の再吸収や排泄に関する薬剤動態評価（トランスポーター活性測定）では、トランズウェルを用いた膜輸送評価が一般的である。培養細胞の凝集体をそのまま用いると、トランズウェルのセルカルチャーインサート（以下では適宜、インサートという）に細胞の均一な単層膜を形成することができない。培養細胞の単層膜が得られなければ、トランズウェルを用いた薬剤動態評価を精度良く実施することは困難である。このため、凝集体をタンパク質分解酵素で処理して個々の培養細胞に分離し、分離された培養細胞をインサート上に播種する必要がある。
　しかしながら、単離した培養細胞をインサート上で二次元培養すると、凝集培養（三次元培養）によって上昇した生理機能が再び低下してしまうおそれがある。また、インサート上に低密度で培養細胞を播種した場合、隙間のない単層膜が形成されるまで長い期間を要してしまう。このため、ますます生理機能が低下しやすくなる。そこで、培養細胞の播種から単層膜の形成までの時間の短縮を狙って、インサート上に隙間無く培養細胞を播種することが考えられる。しかしながら、このように高密度に培養細胞を播種しても、薬物動態評価に適した、実質的に薬剤漏れのない単層膜が得られないことを本発明者は確認した。このため、創薬研究において、良好な生理機能を持つ細胞の単層膜を用いた薬剤評価アッセイの開発が切に望まれている。
　これに対し本発明者は、凝集培養によって上昇した生理機能の低下を抑制しながら、基材上に培養細胞の単層膜を形成する技術を見出した。本実施の形態は、このような思索に基づいて案出されたものである。図１は、実施の形態に係る細胞支持複合体１０を模式的に示す図である。細胞支持複合体１０は、基材１２と、培養細胞１６の単層とを備える。また、本実施の形態の細胞支持複合体１０は、コーティング剤層１４も備える。
（基材）
　基材１２は、例えば人工材料で構成される。基材１２は、水や各種イオンに対する透過性を有する。また、基材１２は、糖や低分子タンパク質等に対する透過性も有する。細胞頂端膜側に存在する薬剤５０は、培養細胞１６が備える細胞頂端膜側の第１トランスポーター１８および細胞基底膜側の第２トランスポーター２０と、基材１２とを介して細胞支持複合体１０を通過し、細胞基底膜側に移動する。なお、培養細胞１６による薬剤５０の輸送には、細胞頂端膜側に存在する薬剤５０を細胞基底膜側に移動させる場合だけでなく、細胞基底膜側に存在する薬剤５０を細胞頂端膜側に移動させる場合も含まれる。
　各種の物質に対する透過性を持たせるために、基材１２には、例えば孔が設けられる。基材１２に設けられる孔の平均孔径は、好ましくは５μｍ以下である。平均孔径を５μｍ以下とすることで、培養細胞１６が基材１２を通過するおそれを低減することができる。このような基材１２として、例えばトランズウェルのインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４μｍまたは３．０μｍ）を用いることができる。
　なお、各種の物質に対する透過性を有しない基材１２が用いられてもよい。この場合、細胞頂端膜側に存在する薬剤５０は、培養細胞１６の第１トランスポーター１８を介して培養細胞１６の内部に取り込まれる。使用開始から短時間のうちは、培養細胞１６の第２トランスポーター２０を介した薬剤５０の細胞基底膜側への移動が少ない。このため、培養細胞１６の層に変形は生じない。長時間経過すると、第２トランスポーター２０を介した薬剤５０の移動量が増えるが、薬剤５０は基材１２を通過できない。このため、培養細胞１６の層が浮き上がってドームが形成される。
　基材１２を構成する素材としては、特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、エチレン－ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレン、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）等が例示される。
（培養細胞）
　培養細胞１６は、基材１２に付着する。本実施の形態の培養細胞１６は、コーティング剤層１４によって基材１２に固定される。なお、コーティング剤層１４が省略される場合は、培養細胞１６は直に基材１２に接着する。上述のように、培養細胞１６は、細胞頂端膜側に位置する第１トランスポーター１８と、細胞基底膜側に位置する第２トランスポーター２０とを有する。
　培養細胞１６は、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養することで作製される。培養細胞１６は、薬剤評価に使用される上で、生理機能を保持している必要がある。一方で、腎臓細胞を生体内環境とは異なる環境で培養すると、脱分化して生理機能が低下していく。これに対し、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養することで、腎臓細胞の低下した生理機能を回復させることができる。具体的には、腎臓細胞を培養容器に非接着の状態で培養すると、培養期間中に腎臓細胞が凝集体を形成する。例えば、凝集体は培養１日目（すなわち２４時間以内）に形成される。そして、少なくとも一部の期間は凝集体の状態で腎臓細胞を培養することで、腎臓細胞の生理機能を回復させることができる。細胞の培養方法については後に詳細に説明する。なお、凝集体には、オルガノイドも含まれる。
　培養細胞１６の基になる腎臓細胞には、組織由来の腎臓細胞が含まれる。また、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞またはＭｕｓｅ細胞等の幹細胞由来の腎臓細胞が含まれる。また、腎臓細胞には、例えば近位尿細管系、遠位尿細管系および集合管系の上皮細胞の少なくとも１つが含まれる。より具体的には、腎臓細胞としては、例えば腎臓から採取、単離したヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞およびヒト集合管上皮細胞が例示される。また、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞またはヒトＭｕｓｅ細部から分化誘導した近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞および集合管上皮細胞が例示される。好ましくは、腎臓細胞は近位尿細管上皮細胞である。また、腎臓細胞には、上述した腎臓細胞の不死化細胞、株化細胞（ＨＫ－２細胞等）、特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために腎臓細胞に遺伝子導入した形質転換細胞、および腎前駆細胞が含まれる。さらに、腎臓細胞としては、ヒト由来の腎臓細胞に代えて、他動物種由来の細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＪＴＣ－１２細胞等）を用いることもできる。
　培養細胞１６は、基材１２上で実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成する。前記「単層」は、好ましくは培養細胞１６の重層化が全く生じていない層である。しかしながら、前記「単層」には、重層化による物質の移動効率の低下が問題とならない程度に一部が重層化した構造（実質的な単層）も含めることができる。また、前記「コンフルエント」とは、好ましくは観察画像の全面積に対する観察画像内の培養細胞１６の占有領域の面積が１００％の状態である。例えば、前記「コンフルエント」とは、基材１２の培養面全体に対して細胞の占める面積の割合が１００％であること、すなわち培養面いっぱいに隙間なく細胞が増殖した状態を意味する。しかしながら、前記「コンフルエント」には、隣り合う細胞の隙間における濃度依存性の物質移動の発生が問題とならない程度に一部に隙間を有する状態（実質的なコンフルエント）も含めることができる。単層か否かおよびコンフルエントか否かは、当業者であれば容易に判断することができる。
（コーティング剤層）
　コーティング剤層１４は、コーティング剤で構成される。コーティング剤層１４は、基材１２の少なくとも一部を被覆する。コーティング剤層１４は、基材１２の表面に接着して基材１２に固定される。コーディング剤は、ラミニン分子、ラミニン分子の断片、基底膜マトリックス混合物、基底膜マトリックス混合物の断片、コラーゲン分子およびコラーゲン分子の断片からなる群から選択される１種以上の接着分子を含む。ラミニン分子、基底膜マトリックス混合物、コラーゲン分子、およびこれらの断片は、それぞれ単独で用いられてもよいし、２種以上が混合されて用いられてもよい。コーティング剤層１４がこれらの接着分子を含有することで、培養細胞１６の単層膜をより形成しやすくすることができる。また、コーティング剤は、上述の接着分子に加えてまたは代えて、ゼラチン、フィブロネクチン、およびこれらの断片等の他の接着タンパク質を含んでもよい。
（ラミニン分子）
　ラミニン分子は、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造をとる。現時点では５種類のα鎖、３種類のβ鎖、３種類のγ鎖が同定されている。ラミニン分子は、これらの組合せによって少なくとも１２種類のアイソフォームを形成することが知られている。例えばラミニン分子は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１およびラミニン５２１のうち１つ以上から選択される。
　ラミニン分子には、上述したアイソフォームの１か所以上に所定の修飾基が付加された、ラミニンの改変体（改変ラミニン）も含まれる。改変体には、遺伝子組み換え体、すなわち組み換え遺伝子から得られたタンパク質に変異を導入したタンパク質や、遺伝子組み換え体の部分タンパク質、遺伝子組み換え体由来のペプチドを有するタンパク質も含まれる。改変ラミニンの修飾基は、例えば増殖因子結合分子または細胞接着分子である。
　コーティング剤におけるラミニン分子の濃度と、基材１２に対するラミニン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。ラミニン分子の接着量は、コーティング剤におけるラミニン分子の濃度を調整することで、制御することができる。基材１２に対するラミニン分子の接着量は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。
　ラミニン分子の断片としては、ラミニン分子（完全長ラミニン）のうちドメインＩの細胞接着部位（インテグリン結合部位）を含むＥ８領域の改変体（ラミニン＊＊＊－Ｅ８と表記する）が例示される。このような改変体として、ラミニン１１１－Ｅ８、ラミニン２１１－Ｅ８、ラミニン４２１－Ｅ８、ラミニン５１１－Ｅ８およびラミニン５２１－Ｅ８が例示される。ラミニン分子の断片としては、Ｅ８領域の改変体だけでなく、細胞接着活性を有するラミニンペプチド、あるいは細胞活性部位のみをペプチド合成したものを用いることもできる。このようなラミニンペプチドとしては、ＹＩＧＳＲ含有ペプチド、ＰＤＳＧＲ含有ペプチド、ＲＹＶＶＬＰＲ含有ペプチド、ＲＧＤ含有ペプチド、ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ含有ペプチド、ＩＫＶＡＶ含有ペプチドおよびＬＲＥ含有ペプチド等が例示される。なお、ラミニン分子の断片の大きさは、特に制限されない。
　ラミニン分子と断片とはそれぞれ、複数のアイソフォームが混合されて用いられてもよい。また、ラミニン分子と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類のラミニン分子および／または断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するラミニン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
（基底膜マトリックス混合物）
　基底膜マトリックス混合物は、マウス肉腫から抽出された細胞外マトリックスタンパク質の混合物である。基底膜マトリックス混合物は、ラミニンと、コラーゲンＩＶと、エンタクチンとを主な構成成分として含む。基底膜マトリックス混合物としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標：Ｃｏｒｎｉｎｇ社）が例示される。Ｍａｔｒｉｇｅｌとは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された、可溶性の基底膜マトリックスをいう。Ｍａｔｒｉｇｅｌには、成長因子を含む通常のＭａｔｒｉｇｅｌに加えて、このＭａｔｒｉｇｅｌと比べて成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌ（Growth Factor Reduced Matrigel Matrix）も含まれる。
　コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度と、基材１２に対する基底膜マトリックス混合物の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。基底膜マトリックス混合物の接着量は、コーティング剤における基底膜マトリックス混合物の濃度を調整することで、制御することができる。基材１２に対する基底膜マトリックス混合物の接着量は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。
　基底膜マトリックス混合物の断片は、ラミニンの断片、コラーゲンＩＶの断片およびエンタクチンの断片の少なくとも１つが混合されたものである。また、基底膜マトリックス混合物と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、基底膜マトリックス混合物と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類の基底膜マトリックス混合物および／または断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有する混合物種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
（コラーゲン分子）
　コラーゲン分子としては、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＶ等が例示される。これらは、例えば新田ゼラチン株式会社から入手することができる。コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度と、基材１２に対するコラーゲン分子の接着量とは、細胞支持複合体１０が実用期間の間その性能を維持できるように、適宜調整される。コラーゲン分子の接着量は、コーティング剤におけるコラーゲン分子の濃度を調整することで、制御することができる。基材１２に対するコラーゲン分子の接着量は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。
　コラーゲン分子と断片とはそれぞれ、複数種が混合されて用いられてもよい。また、コラーゲン分子と断片とが混合されて用いられてもよい。また、異なる種類のコラーゲン分子および／または断片を含む複数のコーティング剤を基材１２に塗布して、含有するコラーゲン種の異なる複数のコーティング剤層１４が積層されてもよい。
（細胞支持複合体の製造方法および薬剤評価装置の製造方法）
　図２（Ａ）～図２（Ｃ）、図３（Ａ）～図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法および薬剤評価装置４２（薬剤評価モジュール）の製造方法の工程図である。なお、図３（Ａ）および図３（Ｂ）では、基材１２の一部分のみを図示している。
　本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法は、腎臓細胞２４を凝集体３０の状態で培養し、凝集体３０を個々の培養細胞１６に分離し、所定の播種密度で基材１２に培養細胞１６を播種し、基材１２上で培養細胞１６を所定の期間培養して、培養細胞１６の単層膜を形成することを含む。また、本実施の形態に係る薬剤評価装置４２の製造方法は、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法により作製した細胞支持複合体１０を支持部３２に設置するか、基材１２を支持部３２に設置するとともに本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法により基材１２に培養細胞１６を播種して細胞支持複合体１０を作製することで、細胞支持複合体１０を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤５０を収容する第１チャンバー３４および第２チャンバー３６を形成することを含む。
　一例として図２（Ａ）に示すように、腎臓細胞２４を培養容器２６に播種する。また、培養容器２６に培養液２８を添加する。培養容器２６は、腎臓細胞２４の浮遊培養が可能であれば特に限定されない。一例としての培養容器２６は、Ｕ底またはＶ底の９６ウェルプレート、Ｕ底の３８４ウェルプレート、ウェル数のさらに多いマイクロウェルプレート、スピナーフラスコ、シャーレ、中空糸、培養ボトル、培養バック、微細流路、培養槽等が例示される。
　培養容器２６は、高密度スフェロイド作製プレートであってもよい。これにより、凝集体３０を大量に作製することができる。高密度スフェロイド作製プレートとしては、ＥＬＰＬＡＳＩＡ（登録商標）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）プレート（ＡＧＣテクノグラス社）などが例示される。例えばＥＬＰＬＡＳＩＡプレートには、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート等のタイプがある。ウェル数によってウェルの底面積が異なる。この底面積の大きさに応じて、作製される凝集体３０の数が変わる。高密度スフェロイド作製プレートで作製した凝集体は、続いて振盪浮遊培養してもよい。振盪浮遊培養の一例では、細胞非接着処理が施されたディッシュまたはプレートに凝集体が収容され、このディッシュ等がシェーカー上に載置されて凝集体が培養される。シェーカーとしては、往復型シェーカーや旋回型シェーカーを用いることができる。
　培養液２８は、腎臓細胞２４を培養可能であれば特に限定されず、培養する細胞の種類等に応じて、公知の培養液から適宜選択することができる。例えば近位尿細管細胞を培養する場合であれば、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等を用いることができる。また、市販の尿細管細胞培養培地、上皮系細胞培養培地、血管内皮細胞培養培地等も用いることができる。
　続いて、腎臓細胞２４を培養する。腎臓細胞２４は、培養容器２６の表面に非接着の状態で培養される。このため、図２（Ｂ）に示すように、培養期間中に腎臓細胞２４の凝集体３０が形成される。凝集体３０の状態で腎臓細胞２４を培養することで、生理機能がより良好な状態にある培養細胞１６を得ることができる。凝集体３０の大きさは、例えば約１００μｍ以上約３５０μｍ以下である。凝集体３０の大きさは、凝集体３０の最大幅と定義される。すなわち、凝集体３０の大きさは、凝集体３０の外縁上の２点をつなぐ直線のうち最大のものの長さである。
　凝集体３０の大きさは、培養容器２６に播種する細胞数を調整することで制御できる。例えば培養容器２６としてウェルプレートが用いられる場合、１ウェルあたりの腎臓細胞２４の播種数は、好ましくは５００個以上５０００個以下である。ウェルプレートでの培養では、１つのウェルに１つの凝集体３０が形成される。このため、１ウェルあたりの腎臓細胞２４の播種数が５００個以上５０００個以下のとき、凝集体３０を構成する腎臓細胞の数は、５００個以上５０００個以下となる。凝集体３０の大きさは、構成細胞数が５００個以上５０００個以下のとき、１００μｍ以上３５０μｍ以下となる。凝集体３０の構成細胞数を５００個以上、あるいは大きさを１００μｍ以上とすることで、培地交換の際などに凝集体３０が古い培養液とともに吸引されてしまうことを回避しやすくすることができる。また、構成細胞数を５０００個以下、あるいは大きさを３５０μｍ以下とすることで、より良好な生理機能を有する培養細胞１６を得ることができる。
　より多くの凝集体３０を形成したい場合は、シャーレやスピナーフラスコ等の容器を用いて培養することが好ましい。この場合、凝集体３０の大きさ、言い換えれば１つの凝集体３０を構成する腎臓細胞２４の数は、容器中の細胞密度を調整することで制御することができる。例えば、６０ｍｍシャーレ（住友ベークライト社）上で、大きさが約１００μｍ以上約３５０μｍ以下、あるいは構成細胞数が５００個以上５０００個以下の凝集体３０を形成する場合、シャーレ中の細胞密度は１５００個／ｃｍ２以上１５０００個／ｃｍ２以下に調整される。そして、腎臓細胞２４を静置培養、振盪培養または撹拌培養することで、所望の大きさや構成細胞数を有する複数の凝集体３０を一度に形成することができる。
　培養液２８には、コラーゲンＩを添加してもよい。コラーゲンＩは、腎臓細胞２４どうしを接着させる機能を有する。このため、コラーゲンＩを含む培養液２８で腎臓細胞２４を培養することで、凝集体３０をより形成しやすくすることができる。添加するコラーゲンＩは、完全長のコラーゲンＩであることが好ましいが、コラーゲンＩを構成するα１鎖やα２鎖、さらには各鎖を断片化したコラーゲンペプチド等であってもよい。また、コラーゲンＩの動物種は特に限定されず、ヒト由来だけでなく、他の動物由来のものも用いることができる。
　培養容器２６は、細胞非接着処理が施されているか、細胞非接着材料で構成されていることが好ましい。これにより、凝集体３０をより形成しやすくすることができる。細胞非接着処理としては、容器表面への細胞非接着ハイドロゲルコーティング処理、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)コーティング処理、プロテオセーブ（登録商標）ＳＳコーティング処理、鏡面研磨処理等が例示される。細胞非接着材料としては、ガラス等が例示される。また、細胞非接着材料としては、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン－ビニルアセテートコポリマー、ポリ（エチレン－エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン－メタアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン酢酸ビニル）コポリマー、およびこれらのポリマーの２種以上の混合物といった高分子材料が例示される。
　腎臓細胞２４の培養期間は、好ましくは５日以上である。また、培養期間は、好ましくは９０日以下（すなわち２１６０時間以下）であり、より好ましくは１４日以下（すなわち３３６時間以下）である。培養期間を５日以上とすることで、生理機能のより高い発現状態にある培養細胞１６が得やすくなる。また、培養期間を９０日以下とすることで、生理機能のより高い発現状態にある培養細胞１６が得やすくなる。また、培養期間を１４日以下とすることで、凝集体から培養細胞を分離しやすくなる。培養条件は、例えば３７℃、５％ＣＯ２である。培養期間中、培養液２８は定期的に交換することが好ましい。例えば、培養液２８は２日毎に交換される。
　続いて、図２（Ｃ）に示すように、凝集体３０を個々の培養細胞１６に分離する。凝集体３０からの培養細胞１６の分離は、Ａｃｃｕｍａｘ、トリプシン／ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、コラゲナーゼ、ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ等を用いて凝集体３０を酵素処理することで行うことができる。酵素分散処理の一例では、３７℃で１０分間以上のインキュベーション、およびマイクロピペットによるピペッティングが施される。これにより、単一の培養細胞１６が分散する細胞懸濁液が得られる。処理に用いる酵素の濃度は、培養細胞１６の種類に応じて適宜設定することができる。しかしながら、酵素濃度が高い場合、培養細胞１６の単離が容易になる一方、培養細胞１６の細胞表面タンパク質が損傷するおそれが高まる。このため、酵素濃度はできるだけ低いことが望ましい。
　また、図３（Ａ）に示すように、コーティング剤を基材１２の少なくとも一部に塗布する。これにより、基材１２の表面にコーティング剤層１４が形成される。なお、培養細胞１６の調製および単離と、コーティング剤の塗布とは、互いに独立に実施することができる。すなわち、両工程はいずれが先に実施されてもよく、また並行して実施されてもよい。
　続いて図３（Ｂ）に示すように、基材１２に培養細胞１６を播種する。例えば、酵素分散処理で得られた細胞懸濁液を基材１２に塗布することで、基材１２に培養細胞１６を播種することができる。そして、基材１２上で培養細胞１６を培養して、培養細胞１６の単層膜を形成する。
　培養細胞１６は、５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材１２に播種される。例えば、播種面積が０．３３６ｃｍ２である、２４ウェルプレート用のセルカルチャーインサートを基材１２として用いる場合、培養細胞１６は、２×１０４個／ウェル以上６×１０４個／ウェル以下の播種密度で基材１２に播種される。なお、播種面積が１．１３１ｃｍ２である、１２ウェルプレート用のセルカルチャーインサート等も基材１２として用いることができる。
　また、培養細胞１６は、基材１２上で１２時間以上４８時間以下の期間培養される。培養細胞１６は、例えば培養液としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養される。培養細胞１６は、基材１２上でコンフルエントになるまで増殖した後、コンフルエントの状態を維持する。以上の工程により、細胞支持複合体１０が得られる。
　播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下とし、且つ培養期間を１２時間以上４８時間以下とすることで、良好な生理機能を保持した培養細胞１６で構成される、実質的に薬剤漏れのない単層膜を得ることができる。より好ましくは、培養細胞１６は、５×１０４個／ｃｍ２以上１２×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材１２に播種される。播種面積０．３３６ｃｍ２のセルカルチャーインサートの場合、培養細胞１６は、２×１０４個／ウェル以上４×１０４個／ウェル以下の播種密度で基材１２に播種される。これにより、培養細胞１６の単層膜が良好に維持される期間、言い換えれば細胞支持複合体１０を薬剤評価に使用できる期間を延ばしやすくすることができる。
　続いて、図３（Ｃ）に示すように、細胞支持複合体１０を支持部３２に設置する。本実施の形態の薬剤評価装置４２は、トランズウェルの態様をとる。したがって、基材１２はセルカルチャーインサートであり、支持部３２はウェルプレートのウェルである。基材１２としてのインサートが支持部３２としてのウェルに収容される。これにより、ウェル内の空間が細胞支持複合体１０によって２つに区切られ、細胞支持複合体１０を挟んで並ぶ第１チャンバー３４および第２チャンバー３６が形成される。
　第１チャンバー３４は細胞支持複合体１０の上方、つまり細胞の単層膜側に配置され、第２チャンバー３６は細胞支持複合体１０の下方、つまり基材１２側に配置される。以上の工程により、細胞支持複合体１０、支持部３２、第１チャンバー３４および第２チャンバー３６を備える薬剤評価装置４２が得られる。なお上述の説明では、基材１２を支持部３２に設置する前に、基材１２に培養細胞１６を播種して細胞支持複合体１０を作製しているが、基材１２を支持部３２に設置した後に、基材１２に培養細胞１６を播種して細胞支持複合体１０を作製してもよい。
　第１チャンバー３４および第２チャンバー３６の少なくとも一方は、評価対象となる薬剤５０を収容する。一例として、ＨＢＳＳ緩衝液等の平衡塩類溶液に薬剤５０を添加して得られる液体が、少なくとも一方のチャンバーに収容される。図３（Ｃ）には、第１チャンバー３４に第１液体３８が収容され、第２チャンバー３６に第２液体４０が収容された薬剤評価装置４２が図示されている。薬剤５０は、第１液体３８および第２液体４０の少なくとも一方に添加される。第１チャンバー３４に収容された状態および第２チャンバー３６に収容された状態のそれぞれで、薬剤５０は培養細胞１６に接することができる。
（薬剤評価方法）
　本実施の形態に係る薬剤評価方法は、上述の製造方法により得られる薬剤評価装置４２を用いて、細胞支持複合体１０が備える培養細胞１６による薬剤５０の輸送を評価することを含む。つまり、薬剤評価装置４２によれば、第１トランスポーター１８や第２トランスポーター２０による薬剤５０の取り込みや排出を評価することができる。また、当該評価によって薬剤５０が腎臓に与える影響を予測することができる。
　例えば、培養細胞１６の細胞頂端膜側に位置する第１液体３８に薬剤５０を添加し、所定時間後に培養細胞１６に含まれる薬剤５０の量を測定することで、第１トランスポーター１８による薬剤５０の取り込み能を評価することができる。また、培養細胞１６の細胞基底膜側に位置する第２液体４０に薬剤５０を添加し、所定時間後に培養細胞１６に含まれる薬剤５０の量を測定することで、第２トランスポーター２０による薬剤５０の取り込み能を評価することができる。また、第１液体３８および第２液体４０のうち第１液体３８のみに薬剤５０を添加し、所定時間後に第２液体４０に含まれる薬剤５０の量を測定することで、培養細胞１６による細胞頂端膜側から細胞基端膜側への薬剤５０の吸収能を評価することができる。また、第１液体３８および第２液体４０のうち第２液体４０のみに薬剤５０を添加し、所定時間後に第１液体３８に含まれる薬剤５０の量を測定することで、培養細胞１６による細胞基端膜側から細胞頂端膜側への薬剤５０の排出能を評価することができる。
　上述のとおり、基材１２上での培養細胞１６の培養期間を播種後１２時間以上４８時間以下とすることで、腎臓の生理機能が良好な状態に保持され且つ実質的に薬剤漏れのない細胞の単層膜を得ることができる。したがって薬剤評価は、基材１２上に培養細胞１６を播種して培養を開始してから１２時間以上４８時間以下の期間内に実施されることが好ましい。
（細胞支持複合体が用いられる他の装置）
　細胞支持複合体１０は、上述したトランズウェル以外の装置にも用いることができる。図４（Ａ）～図４（Ｅ）は、細胞支持複合体１０の採用例を模式的に示す図である。なお、各図では、細胞支持複合体１０が組み込まれた構造の一部を図示している。
　図４（Ａ）は、基材１２として中空糸膜が用いられた細胞支持複合体１０が組み込まれた装置を図示している。この装置では、中空糸膜の管腔内に培養細胞１６の単層膜が形成されている。この装置は、中空糸膜の管腔内に液体を流すことによって、この液体に含まれる所定物質を培養細胞１６に取り込んで、中空糸膜の管腔外へ移動させることができる。この装置は、例えば血液濾過器で濾過した血漿成分中から有用物質を回収するバイオ人工腎臓モジュールとして使用可能である。
　図４（Ｂ）は、微細流路チップに細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。微細流路チップでは、基材１２が微細流路を構成している。そして、微細流路の内壁に培養細胞１６の単層膜が形成されている。微細流路チップでは、流路内、すなわち培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。微細流路チップは例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。微細流路チップは、カートリッジに収容されて使用され得る。
　図４（Ｃ）は、細胞支持複合体１０が中空マイクロキャリアを構成している様子を図示している。また、図４（Ｄ）は、細胞支持複合体１０が中実マイクロキャリアを構成している様子を図示している。中空マイクロキャリアおよび中実マイクロキャリアでは、基材１２がキャリア本体を構成している。そして、基材１２の外表面に培養細胞１６の単層膜が形成されている。中空マイクロキャリアおよび中実マイクロキャリアでは、培養細胞１６が配置された側に微量の液体が流される。そして、液体中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。各マイクロキャリアは例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。各マイクロキャリアは、カートリッジに収容されて使用され得る。
　図４（Ｅ）は、ウェルプレートのウェル底面に細胞支持複合体１０が組み込まれた様子を図示している。細胞支持複合体１０がウェル底面に配置された状態で、培養細胞１６はウェルの上側を向く。ウェルプレートでは、ウェル内に微量の液体４９が注入される。そして、液体４９中の所定物質が培養細胞１６に取り込まれる。ウェルプレートは例えば、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。なお、ウェルプレートに代えて、培養ディッシュ（シャーレ等）に細胞支持複合体１０が組み込まれてもよい。
　以上説明したように、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０の製造方法は、腎臓細胞２４を凝集体３０の状態で培養して培養細胞１６を作製し、この培養細胞１６を５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材１２に播種し、基材１２上で培養細胞を１２時間以上４８時間以下の期間培養して培養細胞１６の単層膜を形成することを含む。これにより、腎臓の生理機能が向上し且つ実質的に薬剤漏れのない培養細胞１６の単層膜を用いて薬剤を評価することができる。よって、薬剤評価アッセイの精度向上を図ることができる。また、培養細胞１６の播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１２×１０４個／ｃｍ２以下とすることで、細胞支持複合体１０を薬剤評価に使用できる期間を延ばしやすくすることができる。
　また、本実施の形態に係る薬剤評価装置４２の製造方法は、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０を支持部３２に設置するか、基材１２が支持部３２に設置された状態で細胞支持複合体１０を作製することで、細胞支持複合体１０を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤５０を収容する第１チャンバー３４および第２チャンバー３６を形成することを含む。これにより、細胞支持複合体１０、支持部３２、ならびに少なくとも一方が薬剤５０を収容する第１チャンバー３４および第２チャンバー３６を備える薬剤評価装置４２が得られる。また、本実施の形態に係る薬剤評価方法は、この薬剤評価装置４２を用いて培養細胞１６による薬剤５０の輸送を評価することを含む。以上より、本実施の形態によれば、一般的な薬剤動態評価の手法であるトランズウェルを用いた膜輸送評価をより高精度に実施することが可能となる。
　以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。
　実施の形態は、以下に記載する項目によって特定されてもよい。
（第１項目）
　腎臓細胞（２４）を凝集体（３０）の状態で培養し、
　凝集体（３０）を個々の培養細胞（１６）に分離し、
　５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材（１２）に培養細胞（１６）を播種し、
　基材（１２）上で培養細胞（１６）を１２時間以上４８時間以下の期間培養して、培養細胞（１６）の単層膜を形成することを含む、
細胞支持複合体（１０）の製造方法。
（第２項目）
　播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１２×１０４個／ｃｍ２以下とすることを含む、
第１項目に記載の細胞支持複合体の製造方法。
（第３項目）
　第１項目または第２項目に記載の細胞支持複合体（１０）の製造方法により作製した細胞支持複合体（１０）を支持部（３２）に設置するか、基材（１２）を支持部（３２）に設置するとともに第１項目または第２項目に記載の細胞支持複合体（１０）の製造方法により基材（１２）に培養細胞（１６）を播種して細胞支持複合体（１０）を作製し、
　細胞支持複合体（１０）を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤（５０）を収容する第１チャンバー（３４）および第２チャンバー（３６）を形成することを含む、
薬剤評価装置（４２）の製造方法。
（第４項目）
　第３項目に記載の薬剤評価装置（４２）の製造方法により得られる薬剤評価装置（４２）を用いて、細胞支持複合体（１０）が備える培養細胞（１６）による薬剤（５０）の輸送を評価することを含む、
薬剤評価方法。
（第５項目）
　第１項目または第２項目に記載の細胞支持複合体（１０）の製造方法により製造された細胞支持複合体（１０）と、
　細胞支持複合体（１０）を支持する支持部（３２）と、
　細胞支持複合体（１０）を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤（５０）を収容する第１チャンバー（３４）および第２チャンバー（３６）と、を備える、
薬剤評価装置（４２）。
　以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
（凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化の解析：試験１）
　まず、腎臓細胞の一例としてのヒト近位尿細管上皮細胞（型番ＣＣ－２５５３、Ｌｏｎｚａ社）を６０ｍｍシャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１０００００個播種した。シャーレは、ゼラチン溶液（シグマ社）のコーティングによる接着処理を施したものを用いた。そして、培養液としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。シャーレには接着処理が施されているため、培養中に細胞は凝集化しなかった。このシャーレでの二次元培養により、脱分化して生理機能が低下した近位尿細管上皮細胞を得た。
　脱分化した細胞の懸濁液を調製した。懸濁液における細胞濃度は、１００００個／ｍｌとした。細胞非接着処理が施された９６ウェルＵ底プレート（住友ベークライト社）に細胞懸濁液を１００μｌ滴下することで細胞を播種した。したがって、播種密度は１０００個／ウェルである。そして、培養液としてＲＥＧＭ（型番ＣＣ－３１９０、Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培養液は２日毎に交換した。この培養により、細胞は凝集体を形成した。
　RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、播種直後（すなわち０時間）の細胞と、培養３，４，５，６，７，８，１０，１２，１４日（すなわち７２，９６，１２０，１４４，１６８，１９２，２４０，２８８，３３６時間）の凝集体を構成する細胞とからｍＲＮＡを抽出して精製した。続いて、QuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＡＱＰ１、ＳＧＬＴ２およびＯＡＴ１の各遺伝子の発現量を測定した。
　これらの遺伝子は、腎臓の生理機能に関連する遺伝子である。具体的には、ＡＱＰ１（aquaporin 1）遺伝子は、水の輸送に関与するＡＱＰ１タンパク質をコードする遺伝子である。ＳＧＬＴ２（sodium glucose cotransporter 2）遺伝子は、ナトリウムおよびグルコースの輸送に関与するＳＧＬＴ２タンパク質をコードする遺伝子である。ＯＡＴ１（organic anion transporter 1）遺伝子は、薬剤の輸送、特に比較的低分子量の化合物の輸送に関与するＯＡＴ１タンパク質をコードする遺伝子である。
　各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養Ｍ日（Ｍ＝３，４，５，６，７，８，１０，１２，１４）の発現量の比率（ｄａｙＭ／ｄａｙ０）を算出した。結果を図５に示す。図５は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。図５に示すように、ヒト近位尿細管上皮細胞を凝集体の状態で培養することで、各遺伝子の発現量が上昇することが確認された。つまり、凝集培養によって細胞の生理機能が回復することが確認された。特に、ＯＡＴ１遺伝子は、５日以上の培養で発現量が顕著に上昇することが確認された。
　また、凝集体をより長期間培養して、凝集体を構成する細胞における腎臓関連遺伝子の発現量を経時的に解析した。まず、細胞非接着処理が施された９６ウェルプレートに、脱分化したヒト近位尿細管上皮細胞（型番ＣＣ－２５５３、Ｌｏｎｚａ社）を１０００個入れ、１００μｌのＲＥＧＭ（型番ＣＣ－３１９０、Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。この培養により、細胞は凝集体を形成した。
　RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養０，４，８，１０，１２，１４，１６，２０，２５，３０，３５，４０，５０，６０，９０日（すなわち、０，９６，１９２，２４０，２８８，３３６，３８４，４８０，６００，７２０，８４０，９６０，１２００，１４４０，２１６０時間）の細胞からｍＲＮＡを抽出して精製した。続いて、QuantiTect Multiplex RT-PCR Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
　これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I(タカラバイオ社)を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯＡＴ１、ＯＡＴ３（organic anion transporter 3）、ＯＣＴ２（organic cation transporter 2）、ＭＤＲ１（multiple drug resistance 1）、ＭＡＴＥ１（multidrug and toxin extrusion 1）、ＭＡＴＥ２（multidrug and toxin extrusion 2）、ＵＲＡＴ１（urate transporter 1）、ＰＥＰＴ２（peptide transporter 2）およびＳＧＬＴ２の各遺伝子の発現量を測定した。また、ポジティブコントロールとして、ヒトの腎臓から直接採取した腎皮質のｍＲＮＡを用いた。
　各遺伝子について、播種直後の発現量に対する培養Ｍ日（Ｍ＝４，８，１０，１２，１４，１６，２０，２５，３０，３５，４０，５０，６０，９０）の発現量の比率（ｄａｙＭ／ｄａｙ０）を算出した。結果を図６（Ａ）、図６（Ｂ）、図６（Ｃ）、図７（Ａ）、図７（Ｂ）、図７（Ｃ）、図８（Ａ）、図８（Ｂ）および図８（Ｃ）に示す。図６（Ａ）～図８（Ｃ）は、凝集体を構成する細胞における遺伝子発現量の経時変化を示す図である。
　図６（Ａ）～図８（Ｃ）に示すように、血管側から尿細管側への薬物の排出に関わる薬物トランスポータータンパク質をコードするＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＯＣＴ２、ＭＤＲ１、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２の各遺伝子は、凝集培養によって発現量が上昇することが確認された。また、発現量が上昇した状態を培養９０日まで維持できることが確認された。尿細管側から血管側への物質の再吸収に関わる内因性トランスポータータンパク質をコードするＵＲＡＴ１、ＰＥＰＴ２、ＳＧＬＴ２の各遺伝子についても同様に、凝集培養によって発現量が上昇するとともに、発現量が上昇した状態を培養９０日まで維持できることが確認された。
（凝集体からの細胞の単離と再播種：試験２）
　まず、ヒト近位尿細管上皮細胞（型番ＣＣ－２５５３、ＬＯＮＺＡ社）を起眠し、接着処理が施されたシャーレに播種し、ＲＥＧＭ（型番ＣＣ－３１９０、ＬＯＮＺＡ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で二次元培養した。培養液は２日毎に交換した。細胞がコンフルエントになる前に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Innovative Cell Technologies社）をシャーレに添加して室温で３分間反応させ、脱分化した細胞を回収した。そして、細胞非接着処理が施された９６ウェルＶ底プレート（PrimeSurfaceプレート９６Ｖ、住友ベークライト社）に、この細胞の懸濁液を滴下することで細胞を播種した。播種密度は１０００個／ウェルとした。そして、ＲＥＧＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１０日間培養した。培養液は２日毎に交換した。この培養により、細胞は凝集体を形成した。
　１０日間の培養後、凝集体を回収してＰＢＳで洗浄した。そして、凝集体にＡｃｃｕｍａｘ（Innovative Cell Technologies社）を添加して３７℃で１０分間反応させ、ピペッティングして個々の細胞に分離した。さらに３～５分間反応を継続させて、ほぼ全ての細胞が単離した細胞懸濁液を得た。
　２４ウェルプレート（型番６６２－１６０、Ｇｒｅｉｎｅｒ社）の各ウェル内にセルカルチャーインサート（型番６６２－６４１、Ｇｒｅｉｎｅｒ社）を設置したトランズウェルを用意した。インサートは、使用前日に３．３μＬ／ウェルのラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ、ニッピ社）および１００μＬ／ウェルのＰＢＳを混合したコーティング液を滴下して冷蔵下で一晩静置したものを用いた。インサートに滴下したコーティング液を細胞播種の直前に除去し、インサートに細胞懸濁液を滴下することで細胞を再播種した。細胞懸濁液の滴下量は１５０μＬ／ウェルとした。播種密度は４×１０４個／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。
　トランズウェルのウェル底（第２チャンバー３６）に６００μＬ／ウェルのＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を添加し、細胞を培養した。培養液は毎日交換した。再播種翌日（再播種から２１時間後）の細胞の光学顕微鏡像を図９に示す。図９は、凝集体から分離した細胞の再播種翌日の光学顕微鏡像である。図９から、凝集体に酵素処理を施すことで細胞を単一化できること、単一化した細胞をインサート上に均一に分散させられること、および細胞がコンフルエントの状態まで増殖することが確認された。つまり、凝集体から単離した細胞を用いて細胞支持複合体を形成し得ることが確認された。
（単層膜の経時的変化の解析：試験３）
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体の形成、細胞懸濁液の調製および細胞の再播種を実施した。播種密度は４×１０４個／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。トランズウェルのウェル底にＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を添加して細胞を培養した。培養液は毎日交換した。細胞を再播種した後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＥＲＳ－２抵抗値測定システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、インサート上の細胞のＴＥＥＲ（transepithelial electrical resistance）を経時的に測定した。具体的には、再播種当日は再播種から１３時間後まで、再播種翌日以降は２４時間毎に７２時間まで、ＴＥＥＲを測定した。ＴＥＥＲは、細胞の単層膜が形成されていることの指標となる電気抵抗値であり、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上であるとき、実質的に薬剤漏れのない均一な単層膜が形成されていることを意味する。結果を図１０に示す。
　図１０は、再播種後からの各経過時間におけるＴＥＥＲを示す図である。図１０に示すように、再播種後１２時間から４８時間では、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上であった。よって、基材１２上での培養細胞１６の培養期間を１２時間以上４８時間以下とすることで、実質的に薬剤漏れのない細胞の単層膜が得られることが確認された。
　なお、図１０には、参考として二次元培養した細胞をインサートに再播種した場合（再播種後２４時間）のＴＥＥＲも示している。二次元培養した細胞を再播種した場合も、見た目はコンフルエントな単層が得られた。しかしながら、ＴＥＥＲは１００Ω・ｃｍ２以上に上昇しなかった。これは、二次元培養では細胞の生理機能が回復せず、細胞どうしの結合に寄与する結合タンパク質の発現量も増加しなかったためと考えられる。一方、凝集培養によって生理機能の回復した細胞では結合タンパク質の発現量も増加したため、均一な単層膜が形成されてＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上に上昇したと考えられる。
（播種密度と単層膜との関係の解析：試験４）
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体の形成、細胞懸濁液の調製および細胞の再播種を実施した。播種密度は２×１０４個／ウェル（５×１０４個／ｃｍ２）、４×１０４個／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）、６×１０４個／ウェル（１８×１０４個／ｃｍ２）、６．５×１０４個／ウェル（１９×１０４個／ｃｍ２）、８×１０４個／ウェル（２４×１０４個／ｃｍ２）とした。トランズウェルのウェル底にＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を添加して細胞を培養した。培養液は毎日交換した。細胞を再播種した後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＥＲＳ－２抵抗値測定システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、インサート上の細胞のＴＥＥＲを経時的に測定した。結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。
　図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）は、各播種密度におけるＴＥＥＲの経時変化を示す図である。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示すように、播種密度が６．５×１０４個／ウェル（１９×１０４個／ｃｍ２）以上の場合、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上に上昇しなかった。一方、播種密度が２×１０４個／ウェル～６×１０４個／ウェル（５×１０４個／ｃｍ２～１８×１０４個／ｃｍ２）の場合、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上に上昇した。よって、基材１２への培養細胞１６の播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下とすることで、実質的に薬剤漏れのない細胞の単層膜が得られることが確認された。
　また、播種密度が２×１０４個／ウェル～４×１０４個／ウェル（５×１０４個／ｃｍ２～１２×１０４個／ｃｍ２）の場合、播種密度が６×１０４個／ウェル（１８×１０４個／ｃｍ２）の場合に比べて、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上である状態がより長期間維持された。よって、播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１２×１０４個／ｃｍ２以下とすることで、細胞支持複合体１０あるいは薬剤評価装置４２の使用可能期間を延ばしやすくなることが確認された。
　なお、図１０、図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）では、播種密度４×１０４個／ウェルのＴＥＥＲが必ずしも一致していない。例えば、図１１（Ａ）では、再播種後２１時間以降にＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上となっている。また、図１１（Ｂ）では、再播種後１９時間以降にＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上となっている。これは、ＴＥＥＲの測定開始時間が異なるためであると推測される。また、図１１（Ａ）と図１１（Ｂ）とでは、ＴＥＥＲの最大値が異なっている。これは、ＴＥＥＲがウェル内の測定位置、ウェル中の培養液の量、トランズウェルの状態等によって値が変動しやすいためであると推測される。しかしながら、本発明者は、５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で且つ培養期間が１２時間以上４８時間以下であるとき、ＴＥＥＲが１００Ω・ｃｍ２以上となることを高い再現性をもって確認している。
（再播種後の細胞における遺伝子発現量の経時変化の解析：試験５）
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体の形成、細胞懸濁液の調製および細胞の再播種を実施した。播種密度は４×１０４／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。トランズウェルのウェル底にＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を添加して細胞を培養した。培養液は毎日交換した。再播種から０，４，２４，４８，７２時間後にインサート上の細胞を回収した。再播種から０時間後の細胞の回収は、凝集体からの細胞の回収と同義である。RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、回収した細胞からｍＲＮＡを抽出して精製した。続いて、QuantiTect Whole Transcriptome Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、Thermal Cycler Dice Real Time System I（タカラバイオ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＯＡＴ１遺伝子の発現量を測定した。そして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対するＯＡＴ１遺伝子の発現量の相対値を算出した。また、コントロールとしてヒト腎皮質におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量も測定し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に対する相対値を算出した。結果を図１２に示す。
　図１２は、ＯＡＴ１遺伝子の発現量の経時変化を示す図である。図１２に示すように、ＯＡＴ１遺伝子の発現量は、再播種後に時間の経過とともに減少した。再播種から４８時間の時点で、ＯＡＴ１遺伝子の発現量は、凝集体やヒト腎皮質におけるＯＡＴ１遺伝子の発現量の１／１００程度に減少した。つまり、遺伝子発現量の観点では、薬剤評価に求められる生理機能は再播種後４８時間で著しく低下してしまうことが確認された。
（再播種後の細胞におけるタンパク質発現量の経時変化の解析１：試験６）
　試験５によって、再播種後４８時間で腎臓の生理機能に関する遺伝子が薬剤評価に適さない程度まで消失してしまうことが確認された。しかしながら、腎臓の生理機能に関する遺伝子が消失しても、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現が維持されていれば、細胞は薬剤評価への使用に適した状態を維持しているといえる。そして、一般にタンパク質の発現量は、遺伝子の発現量の低下から遅れて低下する。そこで、本発明者は、再播種後の細胞におけるＯＡＴ１タンパク質の発現を免疫細胞染色により観察した。
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体の形成、細胞懸濁液の調製および細胞の再播種を実施した。播種密度は４×１０４個／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。トランズウェルのウェル底にＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を添加して細胞を培養した。培養液は毎日交換した。また、ＯＡＴ１抗体（型番ＫＥ０３８、ウサギ由来、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ社）をブロッキング溶液で５０倍に希釈した１次抗体溶液と、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ標識抗ウサギ抗体をブロッキング溶液で５００倍に希釈した２次抗体溶液とを用意した。
　再播種から２，６，２４，４８，１２０時間後の細胞をＰＢＳで洗浄してパラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（ＰＦＡ）で固定した。３０分以上固定した後、細胞をＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳをブロッキング溶液に置換して室温で１時間処理した。ブロッキング溶液は、０．１％ＰＢＴにロバ血清を濃度５％となるように混和した溶液である。０．１％ＰＢＴは、ＰＢＳにＴｒｉｔｏｎ　Ｘを濃度０．１％となるように添加した溶液である。続いて、ブロッキング溶液を１次抗体溶液に置換し、冷蔵下で一晩処理した。その後、細胞を０．１％ＰＢＴで３回洗浄した。そして、ＰＢＴを２次抗体溶液に置換し、室温で１時間処理した。また、細胞の確認用にＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２を用いて核を染色した。その後、細胞を０．１％ＰＢＴで３回洗浄した。ＰＢＴをＰＢＳに置換し、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社）を用いて細胞を観察した。結果を図１３（Ａ）～図１３（Ｆ）に示す。
　図１３（Ａ）～図１３（Ｆ）は、ＯＡＴ１タンパク質の発現量の経時変化を示す図である。図１３（Ａ）は、参考として二次元培養した細胞を再播種した場合（再播種後２４時間）の蛍光顕微鏡画像である。図１３（Ｂ）～図１３（Ｆ）は、凝集培養した細胞を再播種した場合（再播種後２，６，２４，４８，１２０時間）の蛍光顕微鏡画像である。図１３（Ａ）に示すように、二次元培養した細胞では、ＯＡＴ１タンパク質の発現を観察できなかった。一方、図１３（Ｂ）～図１３（Ｆ）に示すように、凝集体培養した細胞では、再播種後４８時間までＯＡＴ１タンパク質の発現を観察できた。また、ＯＡＴ１タンパク質は、インサート上で均一に発現していた。よって、再播種後４８時間においても培養細胞１６が薬剤評価に必要な生理機能を保持することが確認された。
（再播種後の細胞におけるタンパク質発現量の経時変化の解析２：試験６）
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体の形成、細胞懸濁液の調製および細胞の再播種を実施した。播種密度は４×１０４個／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。再播種から０，４，２４，２８，４８時間後にインサート上の細胞を回収した。回収した細胞からタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質を用いて公知のプロテオミクス解析を実施した。プロテオミクス解析では、回収した細胞の全タンパク質（Total Lysate）および細胞膜タンパク質（Plasma membrane）について、網羅的に発現を解析した。そして、プロテオミクス解析の結果から、腎臓の主要なトランスポータータンパク質の発現量を算出した。結果を図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）および図１４（Ｃ）に示す。
　図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）は、細胞膜タンパク質における腎臓関連トランスポータータンパク質の発現量を示す図である。図１４（Ｃ）は、全タンパク質における腎臓関連トランスポータータンパク質の発現量の経時変化を示す図である。図１４（Ａ）～図１４（Ｃ）では、再播種から０時間後のトランスポータータンパク質の発現量に対する相対値を示している。また、図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）では、再播種後２４時間までの発現量を示している。図１４（Ｃ）では、再播種後４８時間までの発現量を示している。
　また、図１４（Ａ）では、取込み系のＳＬＣトランスポーター（solute carrier transporter）タンパク質である、ＧＬＵＴ２（glucose transporter 2）、ＧＬＵＴ９（glucose transporter 9）、ＯＣＴＮ１（organinc cation／carnitine transporter 1）、ＯＣＴＮ２（organinc cation／carnitine　transporter 2）、ＰＥＰＴ１（peptide transporter 1）、ＯＡＴ１、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２－Ｋ（multidrug and toxin extrusion 2-K）およびＯＡＴＰ４Ｃ１（organic anion-transporting polypeptide 4C1）の発現量を示している。図１４（Ｂ）では、排出系のＡＢＣトランスポーター（ATP Binding Cassette transporter）タンパク質である、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３およびＡＢＣＣ４の発現量を示している。図１４（Ｃ）では、ＯＡＴ１，ＯＣＴ２，ＭＡＴＥ１，ＭＡＴＥ２，ＡＢＣＢ１の各タンパク質の発現量を示している。
　図１４（Ａ）に示すように、再播種から２４時間後の細胞において、各ＳＬＣトランスポータータンパク質の発現量は、いずれも４０％以上維持されていた。また、図１４（Ｂ）に示すように、再播種から２４時間後の細胞において、各ＡＢＣトランスポータータンパク質の発現量は、いずれも６０％以上維持されていた。また、図１４（Ｃ）に示すように、再播種から４８時間後まで、各トランスポータータンパク質の発現量は、いずれも２５％以上維持されていた。トランスポータータンパク質の発現量が、凝集体における発現量に対して２０％以上残っていれば、薬剤評価に求められる生理機能を細胞が維持しているといえる。よって、再播種後４８時間においても培養細胞１６が薬剤評価に必要な生理機能を保持することが確認された。
（トランズウェルを用いた膜輸送評価：試験７）
　まず、試験２と同様の方法で、凝集体を形成するとともに凝集体から細胞懸濁液を調製してインサートに細胞を再播種した。播種密度は４×１０４／ウェル（１２×１０４個／ｃｍ２）とした。そして、再播種翌日（再播種から１８～２４時間以内）にトランズウェルを用いて膜輸送評価を実施した。膜輸送評価では、放射性同位体標識されたＡｄｅｆｏｖｉｒと、放射性同位体標識されたＭｅｔｆｏｒｍｉｎとを用いた。Ａｄｅｆｏｖｉｒは、ＯＡＴ１の基質となる薬剤、つまりＯＡＴ１が輸送する薬剤である。Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎは、ＯＣＴ２の基質となる薬剤、つまりＯＣＴ２が輸送する薬剤である。
　各基質をＨＢＳＳ緩衝液に添加したアッセイバッファーをトランズウェルのインサートに添加し、一定時間処理した。Ａｄｅｆｏｖｉｒの試験では処理時間を２分間とした。Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎの試験では処理時間を１０分間とした。その後、細胞を回収して細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液における放射性同位体を定量した。これにより、細胞頂端膜側から細胞内への基質の取り込み量を評価した。また、アッセイバッファーにＯＡＴ１の阻害剤Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加した場合と、ＯＣＴ２の阻害剤Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅを添加した場合とのそれぞれについて、同様に基質の取り込み量を評価した。
　また、アッセイバッファーをトランズウェルのウェル内に添加し、一定時間処理した。Ａｄｅｆｏｖｉｒの試験では処理時間を２分間とした。Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎの試験では処理時間を１０分間とした。その後、細胞を回収して細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液における放射性同位体を定量した。これにより、細胞基底膜側から細胞内への基質の取り込み量を評価した。また、アッセイバッファーに阻害剤Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加した場合と、阻害剤Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅを添加した場合とのそれぞれについて、同様に基質の取り込み量を評価した。結果を図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示す。
　図１５（Ａ）は、Ａｄｅｆｏｖｉｒの膜輸送の結果を示す図である。図１５（Ｂ）は、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎの膜輸送の結果を示す図である。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）において、「A to C」は細胞頂端膜側から細胞内への基質の取り込み量を示す。「B to C」は細胞基底膜側から細胞内への基質の取り込み量を示す。
　図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示すように、ＡｄｅｆｏｖｉｒおよびＭｅｔｆｏｒｍｉｎのいずれも細胞内に取り込まれることが確認された。また、ＯＡＴ１およびＯＣＴ２は、細胞基底膜側に多く発現するタンパク質である。このため、ＡｄｅｆｏｖｉｒおよびＭｅｔｆｏｒｍｉｎのいずれについても、細胞頂端膜側からよりも細胞基底膜側からの方が細胞内への取り込み量が多かった。なお、基材上では、一部の細胞は頂端膜側と基端膜側とが逆向きになる場合がある。このため、インサートに基質を添加した場合の基質の取り込み（図中のA to C）も観測された。
　また、各阻害剤の添加によって、添加しない場合に比べて基質の取り込み量が有意に低下した。このことから、Ａｄｅｆｏｖｉｒの取り込みがＯＡＴ１によるものであり、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎの取り込みがＯＣＴ２によるものであることが確認された。以上より、本実施の形態に係る細胞支持複合体１０および薬剤評価装置４２を用いて高精度な薬剤動態評価を実施できることが確認された。
　本発明は、細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置に利用することができる。
　１０　細胞支持複合体、　１２　基材、　１６　培養細胞、　２４　腎臓細胞、　３０　凝集体、　３２　支持部、　３４　第１チャンバー、　３６　第２チャンバー、　４２　薬剤評価装置、　５０　薬剤。

Claims (5)

  1. 　腎臓細胞を凝集体の状態で培養し、
    　前記凝集体を個々の培養細胞に分離し、
    　５×１０４個／ｃｍ２以上１８×１０４個／ｃｍ２以下の播種密度で基材に前記培養細胞を播種し、
    　前記基材上で前記培養細胞を１２時間以上４８時間以下の期間培養して、前記培養細胞の単層膜を形成することを含む、
    細胞支持複合体の製造方法。
  2. 　前記播種密度を５×１０４個／ｃｍ２以上１２×１０４個／ｃｍ２以下とすることを含む、
    請求項１に記載の細胞支持複合体の製造方法。
  3. 　請求項１または２に記載の細胞支持複合体の製造方法により作製した前記細胞支持複合体を支持部に載置するか、基材を支持部に設置するとともに請求項１または２に記載の細胞支持複合体の製造方法により前記基材に培養細胞を播種して細胞支持複合体を作製し、
    　前記細胞支持複合体を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤を収容する第１チャンバーおよび第２チャンバーを形成することを含む、
    薬剤評価装置の製造方法。
  4. 　請求項３に記載の薬剤評価装置の製造方法により得られる薬剤評価装置を用いて、前記細胞支持複合体が備える培養細胞による薬剤の輸送を評価することを含む、
    薬剤評価方法。
  5. 　請求項１または２に記載の細胞支持複合体の製造方法により製造された細胞支持複合体と、
    　前記細胞支持複合体を支持する支持部と、
    　前記細胞支持複合体を挟んで並ぶとともに少なくとも一方が評価対象となる薬剤を収容する第１チャンバーおよび第２チャンバーと、を備える、
    薬剤評価装置。
PCT/JP2023/022327 2022-06-20 2023-06-15 細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置 WO2023248934A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022098744 2022-06-20
JP2022-098744 2022-06-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023248934A1 true WO2023248934A1 (ja) 2023-12-28

Family

ID=89379911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/022327 WO2023248934A1 (ja) 2022-06-20 2023-06-15 細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023248934A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018186185A1 (ja) * 2017-04-06 2018-10-11 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体
JP2019041714A (ja) * 2017-09-05 2019-03-22 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体
WO2019181920A1 (ja) * 2018-03-22 2019-09-26 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞および細胞支持複合体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018186185A1 (ja) * 2017-04-06 2018-10-11 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体
JP2019041714A (ja) * 2017-09-05 2019-03-22 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞及び細胞支持複合体
WO2019181920A1 (ja) * 2018-03-22 2019-09-26 日機装株式会社 細胞の培養方法、細胞支持複合体の製造方法、培養細胞および細胞支持複合体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6995112B2 (ja) 細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法
US20200392442A1 (en) Method of culturing cell, method of manufacturing cell support complex, cultured cell, and cell support complex
Arai et al. Fabrication of 3D‐culture platform with sandwich architecture for preserving liver‐specific functions of hepatocytes using 3D bioprinter
US8993322B2 (en) Methods and kits for cell release
WO2017082024A1 (ja) 細胞支持複合体および細胞支持複合体の製造方法
JP2022501041A (ja) 細胞スフェロイドの製造
US10870824B2 (en) Cell support composite and method for producing cell support composite
CA3071436A1 (en) Artificial cartilage and method for its production
Pellowe et al. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices
WO2023248934A1 (ja) 細胞支持複合体の製造方法、薬剤評価装置の製造方法、薬剤評価方法および薬剤評価装置
WO2017082025A1 (ja) 細胞支持複合体および細胞支持複合体の製造方法
US12031158B2 (en) Method of culturing cells, method of manufacturing cell support composite, cultured cells, and cell support composite
US7267982B2 (en) Carrier for cell culture
JP6932051B2 (ja) 細胞の培養方法及び細胞支持複合体の製造方法
Morimoto et al. Latent nature of collagen in promoting three-dimensional adherent spheroid formation of fibroblasts
JP2014057527A (ja) 三次元細胞培養体の製造方法
WO2023120573A1 (ja) 立体的細胞組織の培養方法
EP3313985A1 (en) A multilayer sheet of cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23827120

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1