WO2024101862A1 - Nk 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법 - Google Patents

Nk 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법 Download PDF

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WO2024101862A1
WO2024101862A1 PCT/KR2023/017797 KR2023017797W WO2024101862A1 WO 2024101862 A1 WO2024101862 A1 WO 2024101862A1 KR 2023017797 W KR2023017797 W KR 2023017797W WO 2024101862 A1 WO2024101862 A1 WO 2024101862A1
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WO
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cells
differentiation
clause
medium
cell differentiation
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/017797
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English (en)
French (fr)
Inventor
강경선
권대기
문보경
Original Assignee
마루테라퓨틱스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a culture method for increasing differentiation efficiency and functionality of NK cells.
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells recognize abnormally modified cell membranes, such as virus-infected cells or cancer cells.
  • NK cells play an important role in the early stages of viral infection or tumor formation, before large numbers of activated cytotoxic T lymphocytes are produced.
  • Histologically, NK cells are macrogranular lymphocytes. Intracellular granules contain pre-formed molecules with powerful biological functions and are secreted when NK cells contact target cells. Some of these molecules form holes in the membrane of the target cell and lyse the cell, or invade the target cell and increase nuclear DNA fragmentation, causing apoptosis or programmed cell death.
  • NK cells are known to be cells that have the ability to non-specifically kill cancer. This killing ability of NK cells can be used to treat solid tumors using lymphokine activated killer cells (LAK) and tumor infiltrating lymphocytes (TIL), or through injection of donor lymphocytes. By performing immunotherapy through infusion, attempts are being made to apply it as a new cell therapy therapy to prevent rejection that occurs during bone marrow transplantation or organ transplantation.
  • LAK lymphokine activated killer cells
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • NK cell differentiation and activity are associated with various cancer diseases such as breast cancer, melanoma cancer, and lung cancer, and NK cell therapy is emerging to treat these diseases.
  • NK cells In order to effectively use NK cells as an anti-cancer immune cell therapy, it is necessary to secure a large number of NK cells.
  • NK cells account for 10 to 15% of lymphocytes in the blood, and in cancer patients, the number, differentiation, and function of NK cells are often reduced, making it virtually difficult to secure a sufficient number of cells. Therefore, in order to apply NK cell therapy, mass production of NK cells through proliferation or differentiation of NK cells is required.
  • One object of the present invention is to provide a method for differentiating NK cells from stem cells, comprising the step of selecting hematopoietic progenitor cells expressing APC (Allophycocyanin) among hematopoietic progenitor cells cultured from stem cells:
  • Another object of the present invention is a stem cell comprising culturing and differentiating NK cells from hematopoietic progenitor cells in a first NK cell differentiation medium or a second NK cell differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of To provide a method for differentiating NK cells from cells:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine ethanolamine
  • ascorbic acid sodium selenite
  • Another object of the present invention is to provide a medium composition for differentiation of NK cells from stem cells, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine sodium selenite
  • ascorbic acid IL-3
  • Adezmapimod SB203580
  • Another object of the present invention is to provide a kit for differentiation from stem cells to NK cells, including the composition and instructions.
  • the present invention provides a method for differentiating NK cells from stem cells, comprising the step of selecting hematopoietic progenitor cells expressing APC (Allophycocyanin) among hematopoietic progenitor cells cultured from stem cells.
  • APC Allophycocyanin
  • the hematopoietic progenitor cells may additionally express one or more markers selected from the group consisting of CD34, CD31, CD43, and CD45, but are not limited thereto.
  • the differentiation efficiency of NK cells differentiated from the hematopoietic progenitor cells may be increased, but is not limited thereto.
  • NK cells differentiated from the hematopoietic progenitor cells may have increased cytotoxic function, but are not limited thereto.
  • the present invention relates to NK cells from stem cells, comprising the step of culturing and differentiating NK cells from hematopoietic progenitor cells in a first NK cell differentiation medium or a second NK cell differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of the following.
  • a method for differentiating cells Provided is a method for differentiating cells:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine ethanolamine
  • ascorbic acid sodium selenite
  • the medium for secondary NK cell differentiation may not contain IL-3, but is not limited thereto.
  • the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium contains 0.1 to 20 ⁇ M of ⁇ -mercaptoethanol and 0.1 to 50 ng/mL of selenic acid based on the total composition. It may include, but is not limited to, sodium, 1 to 600 ⁇ M of ethanolamine, and 1 to 200 mg/L of ascorbic acid.
  • the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium is selected from the group consisting of stemline, stempro-34, SCF, IL-7, IL-15, and FLT3 ligand. Any one or more may be included, but are not limited thereto.
  • the NK cells may have increased expression of activation receptors, but are not limited thereto.
  • the activating receptor may be one or more of CD16 or NKG2D, but is not limited thereto.
  • the second NK cell differentiation medium may additionally include a p38 MAPK inhibitor, but is not limited thereto.
  • the p38 MAPK inhibitor is Adezmapimod (SB203580), losmapimod, doramapimod, Ralimetinib, and neflamapimod. It may be one or more selected from the group consisting of (Neflamapimod, VX-745), but is not limited thereto.
  • the NK cells may have reduced expression of inhibitory receptors, but are not limited thereto.
  • the inhibitory receptor may be NKG2A, but is not limited thereto.
  • the NK cells may maintain or increase the expression level of one or more activation receptors selected from the group consisting of CD16, NKG2D, NKp30, and NKp44, but are not limited thereto.
  • the culture step performed in the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium is performed from 10 to 14 days to 52 to 56 days based on the entire culture process. It may be, but is not limited to this.
  • the culture step performed in the first NK cell differentiation medium may be performed from 10 to 14 days to 16 to 20 days based on the entire culture process, but is not limited thereto. no.
  • the culture step performed in the second NK cell differentiation medium may be performed from 16 to 20 days to 46 to 52 days based on the entire culture process, but is not limited thereto. no.
  • the NK cells may be characterized by increased cytotoxicity, but are not limited thereto.
  • the stem cells may be any one or more selected from the group consisting of induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and adult stem cells, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a medium composition for differentiation from stem cells to NK cells, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine sodium selenite
  • ascorbic acid IL-3
  • Adezmapimod SB203580
  • the present invention provides a kit for differentiation from stem cells to NK cells, including the composition and instructions.
  • the present invention provides a use for differentiation or enhancement of differentiation from stem cells to NK cells of a composition containing any one or more of the following as active ingredients:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine sodium selenite
  • ascorbic acid IL-3
  • Adezmapimod SB203580
  • the present invention provides the use of a composition containing any one or more of the following as an active ingredient for producing an agent for differentiation from stem cells to NK cells or an agent for enhancing differentiation:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine sodium selenite
  • ascorbic acid IL-3
  • Adezmapimod SB203580
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune diseases, comprising NK cells expressing APC differentiated by the above method as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer or immune disease, an anticancer agent, or an immune system comprising the step of administering NK cells expressing APC differentiated by the above method or a composition containing the same as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • a method to improve the function of disease treatment is provided.
  • the present invention provides the use of NK cells expressing APC differentiated by the above method or a composition containing them as an active ingredient for preventing or treating cancer or immune diseases.
  • the present invention provides the use of NK cells expressing APC differentiated by the above method or a composition containing them as an active ingredient for preparing a preparation for preventing or treating cancer or immune diseases.
  • NK cell differentiation efficiency was increased by changing the conditions for specific steps in the differentiation process from induced pluripotent stem cells to NK cells, conditions for the composition of the medium composition for each step used, and the processing method of the composition. In addition to this quantitative increase, it can be usefully used as a method of qualitative increase in that functional NK cells can be obtained.
  • Figure 1a is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficiency of NK cell differentiation depending on the expression of autofluorescent APC (Allophycocyanin) among hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSC).
  • APC Allophycocyanin
  • Figure 1b shows markers expressed by HPCs expressing autofluorescent APCs on day 12 of HPC differentiation
  • Figure 1c shows the results of an experiment sorting them using a FACS sorter.
  • Figure 1d is an experimental result showing the differentiation efficiency of total cells, APC (+), and APC (-) into NK cells after the differentiation process is completed.
  • Figure 1e is a photograph showing the results of a cytotoxicity test for total cells, APC (+), and APC (-) after the differentiation process was completed, and Figure 1f is a graph and table quantifying this.
  • Figure 2a is a schematic diagram of an experiment to confirm the effect of enhancing the expression of active receptors by changing the composition of the medium for NK cell differentiation.
  • Figure 2b shows markers on days 10 to 14 of hematopoietic progenitor cell differentiation.
  • Figure 2c shows changes in the expression levels of various markers and active receptors of NK cells obtained in Experiments 1 and 2 after completion of the differentiation process into NK cells.
  • Figure 2d is a graph and table showing the cytotoxic effect of functional NK cells obtained according to experiment 2 in Figure 2a.
  • Figure 3a is a schematic diagram of an experiment to confirm the effect of reducing inhibitory receptor expression by changing the composition of the medium for NK cell differentiation.
  • Figure 3b shows markers on days 10 to 14 of hematopoietic progenitor cell differentiation.
  • Figure 3c shows changes in the expression levels of various markers and inhibitory receptors of NK cells obtained in Experiments 1 and 2 after completion of the differentiation process into NK cells.
  • Figure 3d is a graph and table quantitatively confirming changes in expression levels of various markers identified in Figure 3c.
  • Figure 3e is a graph and table showing that the decrease in NKG2A expression level was statistically significant.
  • Figure 3f is a photograph showing the cytotoxicity test results of Experiment 1 and Experiment 2
  • Figure 3g is a graph and table quantifying the results.
  • Figure 3h is a photograph showing the results of the IFN-gamma ELISA analysis of Experiment 1 and Experiment 2, and Figure 3i is a graph and table quantifying the results.
  • the present invention provides a method for differentiating NK cells from stem cells, comprising the step of selecting hematopoietic progenitor cells expressing APC (Allophycocyanin) among hematopoietic progenitor cells cultured from stem cells.
  • the method of the present invention may be a method for highly efficient differentiation of NK cells from stem cells.
  • the hematopoietic progenitor cells may additionally express one or more markers selected from the group consisting of CD34, CD31, CD43, and CD45, but are not limited thereto.
  • the cytotoxic function of NK cells differentiated from cells expressing autofluorescent APC and expressing at least one marker selected from the group consisting of CD34, CD31, CD43, and CD45, which are markers of hematopoietic stem cells, is significantly reduced. It is excellent and can be usefully used as immunotherapy, cell therapy, etc.
  • Autofluorescent APC (Allophycocyanin)” or “APC (Allophycocyanin)” may refer to a very bright phycobiliprotein isolated from red algae, which exhibits far-infrared fluorescence with a high quantum yield. It is excited by laser lines of 594 and 633 nm and may be characterized as having a maximum absorbance of 650 nm and a fluorescence emission peak of 660 nm, but is not limited thereto. In general, it is known that the larger the cell and the more granular the cell, the greater the number of fluorescent compounds and thus the increase in autofluorescence, but this is not limited.
  • selection may mean distinguishing hematopoietic progenitor cells from hematopoietic progenitor cells that exhibit one or more characteristics of the APC or the above marker and classifying them to differentiate NK cells from the hematopoietic progenitor cells. It is not limited.
  • the differentiation efficiency of NK cells differentiated from the hematopoietic progenitor cells may be increased, but is not limited thereto.
  • NK cells differentiated from the hematopoietic progenitor cells may have increased cytotoxic function, but are not limited thereto.
  • the method for differentiating NK cells from stem cells includes 1) culturing stem cells into hematopoietic progenitor cells; and 2) culturing and differentiating hematopoietic progenitor cells into NK cells.
  • Step 1 of selecting hematopoietic progenitor cells expressing APC (Allophycocyanin) among hematopoietic progenitor cells cultured from stem cells of the present invention. ) may be added between step and 2) and may be expressed, for example, as follows, but are not limited thereto.
  • the method further includes the step of selecting 1-1) hematopoietic progenitor cells between steps 1) and 2):
  • the method for differentiating NK cells from stem cells includes steps generally applied to those skilled in the art of the present invention, for example, pretreating stem cells, hematopoietic progenitor cells, etc. to make them suitable for culture, It may include obtaining differentiated NK cells.
  • the present invention relates to NK cells from stem cells, comprising the step of culturing and differentiating NK cells from hematopoietic progenitor cells in a first NK cell differentiation medium or a second NK cell differentiation medium containing at least one selected from the group consisting of the following.
  • a method for differentiating cells Provided is a method for differentiating cells:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine ethanolamine
  • ascorbic acid sodium selenite
  • the medium for secondary NK cell differentiation may not contain IL-3, but is not limited thereto.
  • the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium contains 0.1 to 20 ⁇ M of ⁇ -mercaptoethanol and 0.1 to 50 ng/mL of selenic acid based on the total composition. It may include, but is not limited to, sodium, 1 to 600 ⁇ M of ethanolamine, and 1 to 200 mg/L of ascorbic acid.
  • ⁇ -mercaptoethanol is 0.1 to 15 ⁇ M, 0.1 to 10 ⁇ M, 0.1 to 5 ⁇ M, 0.1 to 4 ⁇ M, 0.1 to 3 ⁇ M, 0.1 to 2 ⁇ M, 0.3 to 15 ⁇ M, 0.3 to 10 ⁇ M, 0.3 to 5 ⁇ M, 0.3 to 4 ⁇ M, It may be 0.3 to 3 ⁇ M, 0.3 to 2 ⁇ M, 0.5 to 15 ⁇ M, 0.5 to 10 ⁇ M, 0.5 to 5 ⁇ M, 0.5 to 4 ⁇ M, 0.5 to 3 ⁇ M, or preferably 0.5 to 2 ⁇ M, but is not limited thereto.
  • sodium selenite is 0.1 to 25ng/mL, 0.1 to 10ng/mL, 0.1 to 8ng/mL, 0.1 to 5ng/mL, 0.5 to 50ng/mL, 0.5 to 25ng/mL, 0.5 to 10ng/mL. , 0.5 to 8 ng/mL, 0.5 to 5 ng/mL, 1 to 50 ng/mL, 1 to 25 ng/mL, 1 to 10 ng/mL, 1 to 8 ng/mL, or preferably 1 to 5 ng/mL. , but is not limited to this.
  • ethanolamine is 1 to 600 ⁇ M, 1 to 300 ⁇ M, 1 to 100 ⁇ M, 1 to 80 ⁇ M, 1 to 70 ⁇ M, 1 to 60 ⁇ M, 10 to 600 ⁇ M, 10 to 300 ⁇ M, 10 to 100 ⁇ M, 10 to 80 ⁇ M, 10 to 70 ⁇ M. , 10 to 60 ⁇ M, 20 to 600 ⁇ M, 20 to 300 ⁇ M, 20 to 100 ⁇ M, 20 to 80 ⁇ M, 20 to 70 ⁇ M, 20 to 60 ⁇ M, 30 to 600 ⁇ M, 30 to 300 ⁇ M, 30 to 100 ⁇ M, 30 to 80 ⁇ M, 30 to 70 ⁇ M, or , preferably 30 to 60 ⁇ M, but is not limited thereto.
  • ascorbic acid is 1 to 200 mg/L, 1 to 100 mg/L, 1 to 80 mg/L, 1 to 70 mg/L, 1 to 60 mg/L, 1 to 200 mg/L, 5 to 100 mg/L, 5 to 80 mg/L, 5 to 70 mg/L, 5 to 60 mg/L, 10 to 200 mg/L, 10 to 100 mg/L, 10 to 80 mg/L, 10 to 70 mg/L, or, preferably 10 to 60 mg It may be /L, but is not limited thereto.
  • the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium is selected from the group consisting of stemline, stempro-34, SCF, IL-7, IL-15, and FLT3 ligand. Any one or more may be included, but are not limited thereto.
  • the NK cells may have increased expression of activation receptors, but are not limited thereto.
  • the activating receptor may be one or more of CD16 or NKG2D, but is not limited thereto.
  • CD16 is an Fc ⁇ receptor that recognizes the Fc portion of an IgG antibody specific for unhealthy cells and can function as an activating receptor that causes antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • NKG2D is a key stimulatory cell surface receptor, and when the NKG2D receptor binds to one of the ligands, an activation step to activate each immune cell begins and can function as an activating receptor.
  • the second NK cell differentiation medium may additionally include a p38 MAPK inhibitor, but is not limited thereto.
  • the p38 MAPK inhibitor is Adezmapimod (SB203580), losmapimod, doramapimod, Ralimetinib, and neflamapimod. It may be one or more selected from the group consisting of (Neflamapimod, VX-745), but is not limited thereto.
  • p38 MAPK refers to what is known to play an essential role in the regulation of inflammatory signaling networks and the biosynthesis of cytokines, including tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • the NK cells may have reduced expression of inhibitory receptors, but are not limited thereto.
  • the inhibitory receptor may be NKG2A, but is not limited thereto.
  • the NK cells may maintain or increase the expression level of one or more activation receptors selected from the group consisting of CD16, NKG2D, NKp30, and NKp44, but are not limited thereto.
  • NKG2 also known as CD159 (cluster of differentiation 159), is a receptor for natural killer cells (NK cells).
  • NK cells natural killer cells
  • NKG2D is an activating receptor on the surface of NK cells
  • NKG2A may refer to an inhibitory receptor that dimerizes with CD94 to form an inhibitory receptor (CD94/NKG2), but is not limited thereto.
  • the culture step performed in the first NK cell differentiation medium or the second NK cell differentiation medium is performed from 10 to 14 days to 52 to 56 days based on the entire culture process. It may be, but is not limited to this.
  • the culture step performed in the first NK cell differentiation medium may be performed from 10 to 14 days to 16 to 20 days based on the entire culture process, but is not limited thereto. no.
  • the first medium for NK cell differentiation was used in the first two times and 15 ml each was added, but it is not limited thereto and can be used in an appropriate volume, concentration, and number of times within the above performance period.
  • the culture step performed in the second NK cell differentiation medium may be performed from 16 to 20 days to 46 to 52 days based on the entire culture process, but is not limited thereto. no.
  • the second NK cell differentiation medium does not contain IL-3 or additionally contains a p38 MAPK inhibitor, thereby improving the differentiation efficiency of NK cells and increasing the cytotoxic function of differentiated NK cells.
  • the NK cells may be characterized by increased cytotoxicity, but are not limited thereto.
  • stem cell refers to a broad concept that collectively refers to undifferentiated cells with stemness, that is, the ability to differentiate into various types of body tissue cells. These stem cells are broadly classified into embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, adult stem cells, and induced pluripotent stem cells, which can be produced using embryos. ), and mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells, etc. Embryonic stem cells refer to the cell mass stage before forming specific organs less than 14 days after fertilization, and recently, through dedifferentiation. Embryonic stem cells are also manufactured from normal cells. Therefore, any cell that can differentiate into all cells and tissues that make up the body is not limited thereto.
  • Mesenchymal stem cells are extracted from umbilical cord blood, bone marrow, blood, etc. and refer to primitive cells just before differentiation into cells of specific organs such as bone, liver, and blood.
  • Induced pluripotent stem cells refer to differentiated pluripotent stem cells produced by dedifferentiating adult cells.
  • the stem cells may be any one or more selected from the group consisting of induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and adult stem cells, but are not limited thereto.
  • proliferation means increasing the number of NK cells differentiated from stem cells or hematopoietic progenitor cells according to the NK cell differentiation method of the present invention, and promoting/activating the increase phenomenon. You can. Additionally, in the present invention, “differentiation” may mean changing from stem cells or hematopoietic progenitor cells to NK cells according to the NK cell differentiation method of the present invention.
  • the present invention provides a medium composition for differentiation of NK cells from stem cells, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of:
  • ⁇ -mercaptoethanol BME, 2BME, 2-ME or ⁇ -met
  • sodium selenite sodium selenite
  • ethanolamine sodium selenite
  • ascorbic acid IL-3
  • Adezmapimod SB203580
  • the present invention provides a kit for differentiation from stem cells to NK cells, including the differentiation composition and instructions.
  • kit refers to a tool that allows differentiation of NK cells by the method of the present invention.
  • the kit of the present invention may include other components, compositions, solutions, devices, etc. commonly required for storage and processing methods.
  • each component can be applied one or more times without limit, there is no limit to the order or sequence of application of each material, and the application of each material may be carried out simultaneously or at a microscopic level.
  • the kit includes a container; directions; It may include etc.
  • the container may serve to package the material, and may also serve to store and secure the material.
  • the material of the container may take the form of, for example, a bottle, tub, sachet, envelope, tube, ampoule, etc., which may be partially or entirely made of plastic, glass, paper, foil, etc. , wax, etc.
  • the container may be equipped with a completely or partially removable closure that may initially be part of the container or may be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means, and may also provide access to the contents by needle. A stopper can be installed.
  • the kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of the components.
  • the present invention provides NK cells differentiated by the above method or using the above medium composition, or a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune diseases containing the same as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune diseases according to the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, humectants, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared as powder, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, solutions, eye drops, ellipsis, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese according to conventional methods.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, and calcium. These include phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives to tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, white sugar, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, and phosphoric acid.
  • Excipients such as cellulose (HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin.
  • binders can be used, Hydroxypropyl methyl cellulose, corn starch, agar powder, methyl cellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, sodium alginate, calcium carboxymethyl cellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, silicic anhydride, 1-hydroxy Propylcellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, Disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl cellulose
  • soybean oil (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, Macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acids, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, Lubricants such as starch, sodium chloride, sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.
  • Additives for the liquid according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc. can be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, etc. may be used in the syrup according to the present invention, and if necessary, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickening agents, etc. may be used.
  • Purified water can be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. can be used as needed.
  • Suspensions according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Topics may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV solution, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil - sesame oil.
  • solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristic acid, and benzene benzoate;
  • Solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nicotinic acid amide, hexamine, and dimethylacetamide;
  • Weak acids and their salts acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and buffering agents such as gums
  • Isotonic agents such as sodium chloride
  • Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ) carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N
  • Suppositories according to the present invention include cacao oil, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, lecithin, Lanet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydrocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Massaupol, Masupol-15, Neosupostal-
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, or sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • excipient such as starch, calcium carbonate, or sucrose.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type and severity of the patient's disease. It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, vaginal injection. It can be administered by internal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined depending on the type of drug as the active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, gender, weight, and severity of the disease.
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, etc. refers to mammals of
  • “administration” means providing a given composition of the present invention to an individual by any appropriate method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of the desired disease
  • treatment refers to the improvement or improvement of the desired disease and its associated metabolic abnormalities by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions that are beneficially changed, and “improvement” refers to all actions that reduce parameters related to the target disease, such as the degree of symptoms, by administering the composition according to the present invention.
  • NK cells can exhibit a therapeutic effect even in a single form, and when administered simultaneously or sequentially with other drugs, such as chemical anticancer agents, targeted anticancer agents, immune anticancer agents, or metabolic anticancer agents when the disease is cancer, anticancer The effect may be increased.
  • drugs such as chemical anticancer agents, targeted anticancer agents, immune anticancer agents, or metabolic anticancer agents when the disease is cancer, anticancer The effect may be increased.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for anticancer assistance containing NK cells as an active ingredient.
  • the anti-cancer auxiliary pharmaceutical composition may mean that it generates or enhances the anti-cancer effect when administered in combination with an anti-cancer agent, but is not limited thereto.
  • anti-cancer effect may mean the effect of the anti-cancer agent itself, generating or enhancing reactivity to the anti-cancer agent, and generating or enhancing the effect of combined treatment with other anti-cancer agents or anti-cancer treatment methods. However, it is not limited to this.
  • the anti-cancer adjuvant pharmaceutical composition of the present invention can be administered in combination with an anti-cancer agent, and the timing, cycle, dose, concentration, method, etc. of combined use depend on the clinical condition of the patient to whom the composition is administered, the type of cancer, and the type of anti-cancer agent administered in combination. , can be administered together in the most preferable method considering the circumstances such as the type of composition, etc.
  • compositions for anticancer adjuvants can be prepared with other substances that can generally be added to enhance the adjuvant effect on anticancer drugs, and can be administered in combination with other compositions.
  • pre- or post-treatment methods, storage methods, and usage methods generally performed to enhance the auxiliary effect may be applied without limitation.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for combined anticancer drug administration containing NK cells as an active ingredient.
  • Example 1 Enhancement of iNK differentiation efficiency through autofluorescence-based sorting during differentiation
  • Example 1-1 Induced pluripotent stem cell culture
  • iMatrix-511 (175 ⁇ g) was taken out, 9.6ul was added to 1.5ml DPBS per well of 6 wells, and coated in a coating incubator for 1 hour. Afterwards, subculture was performed.
  • the culture medium was thawed at room temperature (never warming to 37°C), and 1ml of antibiotic Primocin was added to stemfit004 and mixed to prepare complete medium.
  • y-27632 was prepared to 10mM in DW, then aliquoted into EP tubes and stored at -20°C.
  • the complete medium was prepared by warming it at room temperature for more than 30 minutes.
  • the culture medium was replaced at a rate of 2.5 ml every day.
  • 10mM y-27632 was dissolved at room temperature and then added to the complete medium warmed at room temperature at 1000x. The culture medium from the plate containing the cells to be subcultured was removed.
  • Example 1-2 Differentiation from induced pluripotent stem cells to NK cells
  • iMatrix-511 (175 ⁇ g) was taken out, 75ul was added to 15ml DPBS in a T-75 flask, and coated in a coating incubator for 1 hour.
  • the culture medium was thawed at room temperature (never warming to 37°C), and 1ml of antibiotic Primocin was added to stemfit004 and mixed to create proliferation complete medium.
  • y-27632 was prepared to 10mM in DW, then aliquoted into EP tubes and stored at -20°C.
  • Proliferation complete medium was prepared by warming at room temperature for more than 30 minutes.
  • SPHERICAL PLATE A spheroid was produced using a 5D plate. 7.5x10 ⁇ 5 cells were seeded per well. The seeding method was applied in the same way as in 1.4.2. Afterwards, it was incubated at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the produced spheroid was seeded into a coded T-75 flask. Media was seeded into 7 T-75 flasks per well for a total of 15ml. Afterwards, culture was performed until the colony size reached 750um to 100um (normal culture for 3 to 5 days).
  • the harvested cells were classified into cells expressing APC and cells not expressing APC. Afterwards, add 15ml of Differentiation Media 4 and seed into the original flask.
  • Day 18 ⁇ 48 Media half changed once every 4 days. Put 15ml per T75 into a 50ml tube, centrifuge at 300g for 5 minutes, remove the media, add 15ml of new differentiation media 4, loosen the cells, and add to the flask.
  • Example 1-3 Confirmation of the effect of increasing NK cell differentiation efficiency depending on the expression of autofluorescent APC
  • cytotoxicity of all NK cells that had completed differentiation including APC-expressing NK cells (APC+) and APC-non-expressing NK cells (APC-), was analyzed.
  • Example 2 Confirmation of the effect of enhancing activation receptor expression by changing the composition of NK cell differentiation medium
  • Example 2-1 Human induced pluripotent stem cell culture
  • iPSCs were cultured in the same manner as Example 1-1 in Example 1.
  • Example 2-2 Differentiation from human induced pluripotent stem cells to NK cells
  • Example 1 The same method as the method from 2.1 to 2.4.2 of Example 1-2 in Example 1 was applied.
  • Day 16 ⁇ 46 Media half change once every 4 days thereafter. Place 15ml per T75 in a 50ml tube, centrifuge at 300g for 5 minutes, remove media, add 15ml of new differentiation media 4-1 to release the cells, and add to the flask.
  • Day 26 ⁇ 48 Media half changed once every 4 days. Put 15ml per T75 into a 50ml tube, centrifuge at 300g for 5 minutes, remove media, add 15ml of new differentiation media 4-3, loosen the cells, and add to the flask.
  • the differentiation verification process was performed by applying the same method as the method of 2.4.3.2 and 2.4.3.3 of Example 1-2 in Example 1.
  • Example 2-3 Confirmation of the effect of enhancing activation receptor expression by changing the composition of NK cell differentiation medium
  • NK cell differentiation media 4-1, 4-2, and 4-3 The effect of enhancing activation receptor expression by changing the composition of NK cell differentiation media 4-1, 4-2, and 4-3 was analyzed using the differentiated HPC. At this time, CD16 and NKG2D were analyzed as activating receptors. In addition, changes in the expression levels of each marker after the NK cell differentiation process was completed according to the medium composition in Experiment 1 (Exp 1) and Experiment 2 (Exp 2) were analyzed.
  • NK cells could be obtained by changing the composition of the medium composition for NK cell differentiation and the method of using the medium applied in step 3 of the present invention.
  • Example 3-1 Human induced pluripotent stem cell culture
  • iPSCs were cultured in the same manner as Example 1-1 in Example 1.
  • Example 3-2 Differentiation from human induced pluripotent stem cells to NK cells
  • Example 1 The same method as the method from 2.1 to 2.4.2 of Example 1-2 in Example 1 was applied.
  • Day 26 ⁇ 48 Media half changed once every 4 days. Put 15ml per T75 into a 50ml tube, centrifuge at 300g for 5 minutes, remove the media, add 15ml of new differentiation media 5, loosen the cells, and add to the flask.
  • Day 26 ⁇ 48 Media half change once every 4 days thereafter. Put 15ml per T75 into a 50ml tube, centrifuge at 300g for 5 minutes, remove media, add 15ml of new differentiation media 5-1 to loosen the cells, and add to the flask.
  • the differentiation verification process was performed by applying the same method as the method of 2.4.3.2 and 2.4.3.3 of Example 1-2 in Example 1.
  • Example 3-3 Confirmation of the effect of reducing inhibitory receptor expression by changing the composition of NK cell differentiation medium
  • NK cells could be obtained by changing the composition of the medium composition for NK cell differentiation applied in step 3 of the present invention.
  • NK cell differentiation efficiency was increased by changing the conditions for specific steps in the differentiation process from induced pluripotent stem cells to NK cells, conditions for the composition of the medium composition for each step used, and the processing method of the composition.
  • NK cell differentiation efficiency was increased by changing the conditions for specific steps in the differentiation process from induced pluripotent stem cells to NK cells, conditions for the composition of the medium composition for each step used, and the processing method of the composition.
  • it can be usefully used as a method for qualitative increase in that functional NK cells can be obtained, and its industrial applicability is recognized.

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Abstract

본 발명은 NK 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법에 관한 것으로, 특정한 특징을 나타내는 세포를 선별하여 분화시킴에 따라 NK 세포 분화 효율을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로 분화하는 과정의 특정 단계에 대한 조건 변화, 이에 사용되는 단계별 배지용 조성물의 조성에 대한 조건, 상기 조성물의 처리 방법 등에 의해 NK 세포 분화 효율을 증가시켰다. 이와 같은 양적 증가뿐만 아니라 기능성 NK 세포를 수득할 수 있다는 점에서 질적 증가를 나타내는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

NK 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법
본 발명은 NK 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2022년 11월 07일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0146970호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 출원은 2023년 11월 07일에 출원된 한국특허출원 제10-2023-0153063호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
면역체계를 구성하는 세포 중 자연살해세포 (natural killer cell, 이하 "NK 세포")는 바이러스에 감염된 세포 혹은 암세포와 같이 세포막이 비정상적으로 변형된 특징을 인식한다. NK 세포는 활성 세포 독성 T 림프구가 다량 생성되기 전인 바이러스 감염 혹은 종양 형성 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 조직학적으로, NK 세포는 거대과립 림프구이다. 세포내 과립은 이미 형성된 강력한 생물학적 기능을 갖는 분자를 포함하고 있다가 NK 세포가 표적 세포와 접촉했을 때 분비된다. 이들 중 몇몇 분자는 표적 세포의 막에 구멍을 형성하여 세포를 용해시키거나 표적세포에 침입하여 핵 DNA의 분절을 증가시켜 세포 자멸 (Apotosis)또는 세포 예정사 (Programmed cell death)를 야기한다.
NK 세포는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있는 세포로 알려져 있다. 이러한 NK 세포의 살해능은 림포카인 활성세포 (lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구 (tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이용하여 고형암 (solid tumor)치료에 이용하거나, 공여자 임파구 주입 (donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식 시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요법으로 응용이 시도되고 있다.
또한, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암, 흑색종암, 폐암 등 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되어 이러한 질환들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.
NK 세포를 항암 면역세포치료제로 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 필요하다. 그러나 NK 세포는 혈액 내 림프구의 10 내지 15%를 차지하고 있고 암 환자에서는 종종 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 사실상 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 그러므로 NK 세포치료제로 적용하기 위해서는 NK 세포의 증식이나 분화를 통한 NK 세포의 대량 생산이 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 줄기세포로부터 배양된 조혈전구세포 중 APC (Allophycocyanin)를 발현하는 조혈전구세포를 선별하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공하는 것이다:
본 발명의 다른 목적은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 조혈전구세포로부터 NK 세포를 배양하여 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공하는 것이다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 및 IL-3.
본 발명의 또다른 목적은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포의 분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물, 및 설명서를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 줄기세포로부터 배양된 조혈전구세포 중 APC (Allophycocyanin)를 발현하는 조혈전구세포를 선별하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포는 CD34, CD31, CD43, 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 추가적으로 더 발현할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포의 분화 효율이 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포는 세포 독성 기능이 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 조혈전구세포로부터 NK 세포를 배양하여 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 및 IL-3.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 제2 NK 세포 분화용 배지는 IL-3을 포함하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 전체 조성물을 기준으로 0.1 내지 20μM의 β-메르캅토에탄올, 0.1 내지 50ng/mL의 아셀렌산나트륨, 1 내지 600μM의 에탄올아민, 및 1 내지 200mg/L의 아스코르빈산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 stemline, stempro-34, SCF, IL-7, IL-15, 및 FLT3 ligand로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 활성화 수용체의 발현이 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 활성화 수용체는 CD16, 또는 NKG2D 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2 NK 세포 분화용 배지는 p38 MAPK 억제제를 추가적으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 p38 MAPK 억제제는 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580), 로스마피모드(losmapimod), 도라마피모드 (doramapimod), 랄리메티닙 (Ralimetinib), 및 네플라마피모드 (Neflamapimod, VX-745)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 억제 수용체의 발현이 감소될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 억제 수용체는 NKG2A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 CD16, NKG2D, NKp30, 및 NKp44로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 활성화 수용체 발현 수준이 유지 또는 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 52일 내지 56일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 16일 내지 20일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 16일 내지 20일부터 46일 내지 52일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 세포 독성이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포, 배아 줄기세포, 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 배지 조성물을 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
본 발명은 상기 조성물, 및 설명서를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화 용도 또는 분화 증진 용도를 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
또한, 본 발명은 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 제제 또는 분화 증진용 제제를 제조하기 위한 하기 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된, APC를 발현하는 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된, APC를 발현하는 NK 세포 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료 방법, 항암제 또는 면역 질환 치료제 기능 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된, APC를 발현하는 NK 세포 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된, APC를 발현하는 NK 세포 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
NK 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법은 특정한 특징을 나타내는 세포를 선별하여 분화시킴에 따라 NK 세포 분화 효율을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로 분화하는 과정의 특정 단계에 대한 조건 변화, 이에 사용되는 단계별 배지용 조성물의 조성에 대한 조건, 상기 조성물의 처리 방법 등에 의해 NK 세포 분화 효율을 증가시켰다. 이와 같은 양적 증가뿐만 아니라 기능성 NK 세포를 수득할 수 있다는 점에서 질적 증가를 나타내는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 인간유도만능줄기세포 (iPSC)에서 분화된 조혈전구세포 (HPC) 중 자가형광 APC (Allophycocyanin)의 발현 여부에 따라 NK 세포 분화 효율을 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 1b는 HPC 분화 12일차, 자가형광 APC를 발현하는 HPC가 발현하는 마커를 나타낸 것이며, 도 1c는 FACS sorter를 이용하여 이를 분류한 실험 결과이다.
도 1d는 분화 과정이 모두 종료된 후 전체 세포, APC (+), APC (-)의 NK 세포로의 분화 효율을 나타내는 실험 결과이다.
도 1e는 분화 과정이 모두 종료된 후 전체 세포, APC (+), APC (-)의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 사진이고, 도 1f는 이를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 2a는 NK 세포 분화용 배지 조성 변경에 따른 활성 수용체 발현 증진 효과를 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 2b는 조혈전구세포 분화 10일 내지 14일차의 마커를 확인한 것이다.
도 2c는 NK 세포로의 분화 과정 종료 후 실험 1 및 실험 2에서 수득된 NK 세포의 다양한 마커 및 활성 수용체의 발현 수준 변화를 나타낸 것이다.
도 2d는 도 2a의 실험 2에 따라 수득된 기능성 NK 세포의 세포 독성 효과를 나타낸 그래프 및 표이다.
도 3a는 NK 세포 분화용 배지 조성 변경에 따른 억제 수용체 발현 감소 효과를 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 3b는 조혈전구세포 분화 10일 내지 14일차의 마커를 확인한 것이다.
도 3c는 NK 세포로의 분화 과정 종료 후 실험 1 및 실험 2에서 수득된 NK 세포의 다양한 마커 및 억제 수용체의 발현 수준 변화를 나타낸 것이다.
도 3d는 상기 도 3c에서 확인된 다양한 마커의 발현 수준 변화를 정량적으로 확인한 그래프 및 표이다.
도 3e는 NKG2A 발현 수준 감소가 통계적으로 유의한 수준임을 나타낸 그래프 및 표이다.
도 3f는 실험 1 및 실험 2의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 사진이고, 도 3g는 이를 정량화한 그래프 및 표이다.
도 3h는 실험 1 및 실험 2의 IFN-gamma ELISA 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 3i는 이를 정량화한 그래프 및 표이다.
본 발명은 줄기세포로부터 배양된 조혈전구세포 중 APC (Allophycocyanin)를 발현하는 조혈전구세포를 선별하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 줄기세포로부터 NK세포를 고효율로 분화하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포는 CD34, CD31, CD43, 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 추가적으로 더 발현할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 조혈모세포의 마커인 CD34, CD31, CD43, 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 발현하고, 자가형광인 APC를 발현하는 세포로부터 분화된 NK 세포의 세포 독성 기능이 현저히 우수하여 면역 치료제, 세포 치료제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서, “자가형광 APC (Allophycocyanin)” 또는 “APC (Allophycocyanin)”란 홍조류에서 분리된 매우 밝은 피코빌리단백질 (phycobiliprotein)로, 높은 양자 수율로 원적외선 형광을 나타나는 것을 의미할 수 있다. 이는 594 및 633nm의 레이저 라인에 의해 여기되며 최대 흡광도는 650nm이고 형광 방출 피크는 660nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 세포가 크고 과립형 세포일수록 형광 화합물의 수가 증가하여 자가형광이 증가하는 것으로 알려져 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “선별”이란 조혈전구세포에서 상기 APC 또는 상기 마커 중 어느 하나 이상의 특징을 나타내는 조혈전구세포를 구분하여 상기 조혈전구세포로부터 NK 세포를 분화시키기 위하여 분류하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포의 분화 효율이 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포는 세포 독성 기능이 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법은 1) 줄기세포로부터 조혈전구세포로 배양하는 단계; 및 2) 조혈전구세포로부터 NK 세포로 배양하여 분화하는 단계;를 포함할 수 있고, 본 발명의 줄기세포로부터 배양된 조혈전구세포 중 APC (Allophycocyanin)를 발현하는 조혈전구세포를 선별하는 단계는 1) 단계와 2) 단계 사이에 추가될 수 있고, 예를 들어, 하기와 같이 표현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 단계를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법에서, 1) 단계와 2) 단계 사이에 1-1) 조혈전구세포를 선별하는 단계를 더 포함하는, 방법:
1) 줄기세포에서 배양된 조혈전구세포를 배양하는 단계; 및
2) 상기 조혈전구세포로부터 NK 세포를 분화시키는 단계.
또한, 본 발명에서, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법은 본 발명의 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 적용되는 단계, 예를 들어, 줄기세포, 조혈전구세포 등을 배양에 적합하도록 전처리하는 단계, 분화된 NK 세포를 수득하는 단계 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 조혈전구세포로부터 NK 세포를 배양하여 분화시키는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법을 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 및 IL-3.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 제2 NK 세포 분화용 배지는 IL-3을 포함하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 전체 조성물을 기준으로 0.1 내지 20μM의 β-메르캅토에탄올, 0.1 내지 50ng/mL의 아셀렌산나트륨, 1 내지 600μM의 에탄올아민, 및 1 내지 200mg/L의 아스코르빈산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, β-메르캅토에탄올은 0.1 내지 15μM, 0.1 내지 10μM, 0.1 내지 5μM, 0.1 내지 4μM, 0.1 내지 3μM, 0.1 내지 2μM, 0.3 내지 15μM, 0.3 내지 10μM, 0.3 내지 5μM, 0.3 내지 4μM, 0.3 내지 3μM, 0.3 내지 2μM, 0.5 내지 15μM, 0.5 내지 10μM, 0.5 내지 5μM, 0.5 내지 4μM, 0.5 내지 3μM, 또는, 바람직하게는 0.5 내지 2μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 아셀렌산나트륨은 0.1 내지 25ng/mL, 0.1 내지 10ng/mL, 0.1 내지 8ng/mL, 0.1 내지 5ng/mL, 0.5 내지 50ng/mL, 0.5 내지 25ng/mL, 0.5 내지 10ng/mL, 0.5 내지 8ng/mL, 0.5 내지 5ng/mL, 1 내지 50ng/mL, 1 내지 25ng/mL, 1 내지 10ng/mL, 1 내지 8ng/mL, 또는, 바람직하게는 1 내지 5ng/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 에탄올아민은 1 내지 600μM, 1 내지 300μM, 1 내지 100μM, 1 내지 80μM, 1 내지 70μM, 1 내지 60μM, 10 내지 600μM, 10 내지 300μM, 10 내지 100μM, 10 내지 80μM, 10 내지 70μM, 10 내지 60μM, 20 내지 600μM, 20 내지 300μM, 20 내지 100μM, 20 내지 80μM, 20 내지 70μM, 20 내지 60μM, 30 내지 600μM, 30 내지 300μM, 30 내지 100μM, 30 내지 80μM, 30 내지 70μM, 또는, 바람직하게는 30 내지 60μM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 아스코르빈산은 1 내지 200mg/L, 1 내지 100mg/L, 1 내지 80mg/L, 1 내지 70mg/L, 1 내지 60mg/L, 1 내지 200mg/L, 5 내지 100mg/L, 5 내지 80mg/L, 5 내지 70mg/L, 5 내지 60mg/L, 10 내지 200mg/L, 10 내지 100mg/L, 10 내지 80mg/L, 10 내지 70mg/L, 또는, 바람직하게는 10 내지 60mg/L일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 stemline, stempro-34, SCF, IL-7, IL-15, 및 FLT3 ligand로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 활성화 수용체의 발현이 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 활성화 수용체는 CD16, 또는 NKG2D 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, CD16은 건강에 해로운 세포에 특이적인 IgG 항체의 Fc 부분을 인식하는 Fcγ 수용체로 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 유발하는 기능을 수행하는 활성화 수용체로 기능할 수 있다.
본 발명에서, NKG2D는 핵심 자극 세포 표면 수용체로, NKG2D 수용체가 리간드 중 하나에 결합하면 각 면역 세포를 활성화하기 위한 활성화 단계가 시작하여 활성화 수용체로 기능할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2 NK 세포 분화용 배지는 p38 MAPK 억제제를 추가적으로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 p38 MAPK 억제제는 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580), 로스마피모드(losmapimod), 도라마피모드 (doramapimod), 랄리메티닙 (Ralimetinib), 및 네플라마피모드 (Neflamapimod, VX-745)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, p38 MAPK는 염증성 신호 전달 네트워크의 조절과 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 인터루킨-1β (IL-1β)를 포함한 사이토카인의 생합성에 필수적인 역할을 하는 것으로 공지된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 억제 수용체의 발현이 감소될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 억제 수용체는 NKG2A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 CD16, NKG2D, NKp30, 및 NKp44로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 활성화 수용체 발현 수준이 유지 또는 증가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, CD159 (분화 클러스터 159)로도 알려진 NKG2는 자연살해세포(NK 세포)에 대한 수용체이다. NKG2 유형은 A, B, C, D, E, F 및 H의 7가지가 있다. NKG2D는 NK 세포 표면의 활성화 수용체이며, NKG2A는 CD94와 이량체화하여 억제 수용체 (CD94/NKG2)를 형성하는 억제 수용체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 52일 내지 56일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 16일 내지 20일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 제1 NK 세포 분화용 배지는 최초의 2회에 사용되었고 각각 15ml씩 첨가되었으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 수행기간 내에 적합한 부피, 농도, 회수로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 16일 내지 20일부터 46일 내지 52일까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 제2 NK 세포 분화용 배지는 IL-3이 포함되지 않거나, p38 MAPK 억제제를 추가적으로 더 포함함으로써 NK 세포의 분화효율을 증진시키면서도 분화된 NK 세포의 세포 독성 기능이 증대될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NK 세포는 세포 독성이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, “줄기세포 (stem cell)”란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성 (stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포 (embryonic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 성체 줄기세포 (adult stem cell), 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell), 및 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽줄기세포 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 수정 후 14일이 안 된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 중간엽줄기세포는 제대혈, 골수, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로서 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 유도만능줄기세포란 성체 세포로부터 역분화시켜 제조되는 분화만능 줄기세포를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포, 배아 줄기세포, 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “증식 (또는 확장)”이란, 본 발명의 NK 세포 분화 방법에 따라 줄기세포 또는 조혈전구세포로부터 분화되는 NK 세포의 수가 증가하는 것, 상기 증가 현상이 촉진/활성화되는 것을 의미할 수 있다. 또한 본 발명에서 “분화”이란, 본 발명의 NK 세포 분화 방법에 따라 줄기세포 또는 조혈전구세포로부터 NK 세포로의 변하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포의 분화용 배지 조성물을 제공한다:
β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
본 발명은 상기 분화용 조성물, 및 설명서를 포함하는 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 키트를 제공한다.
본 발명에서, 상기 설명서는 본 발명의 상기 방법이 기재되어 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “키트”는 본 발명의 방법으로 NK 세포를 분화할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 물질 외에도 이들의 보관, 처리 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 구체적인 예로는 이때, 각 구성은 1회 이상 횟수에 제한 없이 적용될 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 등을 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 물질을 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “포함하는”이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로, 또는 상기 배지 조성물을 이용하여 분화된 NK 세포 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 암 또는 면역 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스 (HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무 (Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유 (Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 (PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유 (Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골 (Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류 (트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스 (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지 (PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염 (초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염 (암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨 (NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨 (Na2S2O5), 아황산나트륨 (Na2SO3), 질소가스 (N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날 (Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠 (Imhausen), 모놀렌 (모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스 (Adeps solidus), 부티룸 태고-G (Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마 (Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), 히드록코테 (Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움 (Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로 (OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간 (경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, NK 세포는 단일 형태로도 치료 효과를 나타낼 수 있고, 다른 약물, 예를 들어, 질환이 암인 경우 화학 항암제, 표적 항암제, 면역 항암제, 또는 대사 항암제 등과 동시 또는 순차적으로 투여되었을 때 항암 효과가 증대될 수 있다.
따라서, 본 발명은 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 항암 보조용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 이 때 항암 보조용 약학적 조성물이란 항암제와 병용 투여시 항암 효과를 발생시키거나, 증진시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 “항암 효과”는 항암제 그 자체 효과, 항암제에 대한 반응성을 발생시키거나 증진시키는 것을 의미할 수 있고, 기타 항암제 또는 항암 치료 방법과의 병용 치료 효과를 발생시키거나 증진시키는 것을 모두 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항암 보조용 약학적 조성물은 항암제와 병용 투여될 수 있고, 병용 시기, 주기, 용량, 농도, 방법 등은 상기 조성물이 투여되는 환자의 임상 상태, 암의 종류, 병용 투여되는 항암제의 종류, 기타 조성물의 종류 등의 상황을 고려하여 가장 바람직한 방법으로 병용 투여될 수 있다.
또한, 항암 보조용 약학적 조성물은 항암제에 대한 보조 효과를 증진시키기 위하여 일반적으로 첨가될 수 있는 기타 물질과 함께 제조될 수 있고, 기타 조성물과 병용 투여될 수 있다.
또한, 보조 효과 증진을 위해 일반적으로 수행되는 전처리 또는 후처리 방법, 보관 방법, 사용 방법은 제한되지 않고 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 병용 투여용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 분화 중 자가형광 기반 sorting을 통한 iNK 분화효율 증진
실시예 1-1. 유도만능줄기세포 배양
1.1. 배양 용기 코팅
iMatrix-511 (175 μg)을 꺼내서, 6well 1well 당 DPBS 1.5ml에 9.6ul을 첨가하여 coating 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅하였다. 그 후 계대배양을 실행하였다.
1.2. 배양 배지 제조 (stemfit004)
배양 배지를 상온에서 녹이고 (절대로 37℃ warming하지 않음), stemfit004에 항생제 Primocin 1ml을 첨가 및 혼합하여 complete medium을 제조하였다.
1.3. 10mM y-27632 제조
DW에 y-27632를 10mM이 되도록 제조하였다, 이후 EP tube에 Aliquot하여 -20℃에 보관하였다.
1.4. 유도만능줄기세포 배양 방법
complete medium를 상온에서 30분 이상 warming하여 준비하였다.
1.4.1 일반 배양
6well plate에서 배양하는 세포의 배지를 제거 후 배양액을 매일 2.5ml씩 교체하였다.
1.4.2 계대 배양
10mM y-27632를 상온에서 녹인 후 상온에서 warming된 complete medium에 1000x로 첨가하였다. 계대배양할 세포가 있는 plate의 배양 배지를 제거하였다.
6-well plate에 well 1칸 당 DPBS 1mL씩 넣고 워싱하였다. TrypLE reagents 1ml을 넣고 15분 incubation 하였다 (37℃, 5% CO2). 세포가 떨어지는 것을 확인한 후 complete media 8ml이 들어있는 15ml tube에 반응시킨 TrypLE reagents 1ml를 넣어주고 한번더 media를 넣어 다시 cell을 모아 15ml tube에 넣어주었다. 이후 원심 분리기 300g에 5분 돌리고, 세포만 남긴 후 media를 제거하였다. 이후 media + y-26532를 3ml 넣어 세포를 계수하였다. 6well 기준 3x10^4 cells/well/2.5ml로 seeding하였다.
실시예 1-2. 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
2.1. 배양 용기 코팅
iMatrix-511 (175 μg)을 꺼내서, T-75 flask에 DPBS 15ml에 75ul을 첨가하여 coating 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅하였다.
2.2. stemfit004
배양 배지를 상온에서 녹이고 (절대로 37℃ warming 하지 않음), stemfit004에 항생제 Primocin 1ml을 넣고 섞어 proliferation complete medium을 만들었다.
2.3. 10mM y-27632 제조
DW에 y-27632를 10mM이 되도록 제조하였다, 이후 EP tube에 Aliquot하여 -20℃에 보관한다.
2.4. 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
proliferation complete medium을 상온에서 30min이상 warming하여 준비하였다.
2.4.1 spheroid 제작
SPHERICAL PLATE 5D plate를 사용하여 spheroid를 제작하였다. 1well 당 7.5x10^5 cells를 seeding하였다. Seeding 방법은 1.4.2의 방법과 동일하게 적용하였다. 이후 24시간, 37℃, 5% CO2에 incubation하였다.
2.4.2 spheroid seeding
제작된 spheroid를 코딩된 T-75 flask에 seeding하였다. 1well 당 T-75 flask 7장에 media는 총 15ml에 맞춰서 seeding하였다. 이후 colony size가 750um~100um이 될 때까지 culture를 진행하였다 (day 3~5일 동안 일반 배양).
2.4.3 NK 세포로의 분화 모식도 (Scheme, 도 1a)
2.4.3.1. NK 세포로의 분화 과정
2.4.3.1.1. 0 내지 52 day 분화 과정
Day 0 : Growth media (stemfit 004)를 suction 하여 제거, 이후 Essential 8 media로 washing, 분화 미디어 1 vol 15ml을 첨가 후 incubation
Day 2~3 : 분화 미디어 1 suction하여 제거, 분화 미디어 2 vol 15ml을 첨가 후 incubation
Day 4~5 : 분화 미디어 2 suction하여 제거, 분화 미디어3 vol 15ml을 첨가 후 incubation
Day 8~9 : 분화 미디어 3 vol 15ml 첨가 (total vol 30ml)
Day 10~14 :분화 중인 T75에 있는 media를 harvest (30ml/T75).
-group 1 : 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4를 15ml 첨가 (15ml/T75)
-group 2 및 group 3 : FACS sorting 기능을 이용하여 harvest한 세포 중 APC를 발현하는 세포와 APC를 발현하지 않는 세포로 분류하였다. 이후 분화 미디어 4를 15ml를 넣어 원래 flask에 seeding
Day 12~16 : 분화 미디어 4를 15ml첨가 (total vol 30ml)
Day 18~48 : 이후 4일에 한번씩 media half change. T75당 15ml 씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심 분리 이후 media 제거, 새로운 분화미디어 4를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 첨가.
Day 46~52: 분화 종료, 분석을 위해 cell harvest. Flask에 있는 media를 harvest하여 50ml tube에 넣은 후 300g에 5분 원심분리 후 분화 media를 넣어 cell counting (cell counter X, manual counting으로 진행)하였으며, 각각의 분석을 위한 세포 수 확인.
분석 Day tube 개수 maker 형광 비고
day 0 tube 1 no 　 　
tube 2 IgGM PE isotype
tube 3 TRA-1-81 PE iPSC marker
tube 4 TRA-1-60 PE iPSC marker
tube 5 IgG3 PE isotype
tube 6 SSEA4 PE iPSC marker
day10~14 tube 1 no 　 compensation
tube 2 CD31 PE compensation
tube 3 CD34 APC compensation
tube 4 IgGK1 APC/PE isotype
tube 5 CD34KDR APC/PE HPC marker
tube 6 CD34CD31 APC/PE HPC marker
tube 7 CD34CD43 APC/PE HPC marker
tube 8 CD34CD45 APC/PE HPC marker
tube 9 CD56CD45 APC/PE NK marker
day34~38 tube 1 no 　 compensation
tube 2 CD45 PE compensation
tube 3 CD56 APC compensation
tube 4 IgGK1 APC/PE isotype
tube 5 CD34CD31 APC/PE HPC marker
tube 6 CD34CD43 APC/PE HPC marker
tube 7 CD34CD45 APC/PE HPC marker
tube 8 CD56CD45 APC/PE NK marker
tube 9 CD56NKG2A APC/PE NK marker
tube 10 CD56NKG2D APC/PE NK marker
tube 11 CD56NKp30 APC/PE NK marker
tube 12 CD56NKp44 APC/PE NK marker
tube 13 CD56NKp46 APC/PE NK marker
tube 14 CD56CD7 APC/PE NK marker
tube 15 CD56CD16 APC/PE NK marker
tube 16 CD56CD3 APC/PE NK marker
day46~52 tube 1 no 　 compensation
tube 2 CD45 PE compensation
tube 3 CD56 APC compensation
tube 4 IgGK1 APC/PE isotype
tube 5 CD56CD45 APC/PE NK marker
tube 6 CD56NKG2A APC/PE NK marker
tube 7 CD56NKG2D APC/PE NK marker
tube 8 CD56NKp30 APC/PE NK marker
tube 9 CD56NKp44 APC/PE NK marker
tube 10 CD56NKp46 APC/PE NK marker
tube 11 CD56CD7 APC/PE NK marker
tube 12 CD56CD16 APC/PE NK marker
tube 13 CD56CD3 APC/PE NK marker
tube 14 CD56KIR(a,h,g) APC/PE NK marker
tube 15 CD56KIR(b1,b2) APC/PE NK marker
tube 16 CD56KIR(e1, e2) APC/PE NK marker
tube 17 IgGM PE isotype
tube 18 TRA-1-81 PE iPSC marker
tube 19 TRA-1-60 PE iPSC marker
tube 20 IgG3 PE isotype
tube 21 SSEA4 PE iPSC marker
2.4.3.2 줄기세포로부터 NK 세포로 분화 검증 과정 FACS (표 1)
2.4.3.2.1 각각의 단계에서 분화 중인 세포를 harvest 한 후, 300g에 5분에 원심 분리하였다.
2.4.3.2.2 이후, media를 제거 후 FACS buffer를 10ml 첨가하여 300g에 5분에 원심 분리기를 돌려 washing하였다.
2.4.3.2.3 tube에 1x10^5cells를 첨가하였다
2.4.3.2.4 tube에 각각의 antibody, isotype 에 1ul씩 첨가하였다.
2.4.3.2.5 Ice에 1시간 incubation하였다.
2.4.3.2.6 이후 FACS buffer를 1ml씩 넣어 첨가하여 300g에 5분에 원심 분리기를 돌려 washing하였다.
2.4.3.2.7 2.4.3.2.6 방법을 3번 반복하였다.
2.4.3.2.8 이후 FASC 기기로 측정하였다.
2.4.3.3 줄기세포로부터 NK 세포로 분화 검증 과정 (cell cytotoxicity) (도 1b)
2.4.3.3.1 Target cell number : K562 1x10^4/well/Effector cell : iNK cells 1x10^5 cells/well, E: T ratio = 10:1
2.4.3.3.2 Media : stempro-34 + SCF + FLT3-L + IL7+ IL15
2.4.3.3.3 U bottom 96 well plate에 도 1b에 따른 세포 독성 분석 모식도 (Cytotoxicity Scheme)에 따라 세포를 seeding하였다.
2.4.3.3.4 이후 3시간 15분 incubation하였다.
2.4.3.3.5 Incubation한 plate를 꺼내서 10ul씩 lysis buffer 첨가하였다 (이때, 일정한 파이펫팅 수 유지)
2.4.3.3.6 이후 45분 incubation하였다.
2.4.3.3.7 incubation이 끝나면, 300g에 5분 원심분리하였다.
2.4.3.3.8 원심 분리 후 새로운 flat 96 well plate에 50ul씩 옮겼다.
2.4.3.3.9 미리 녹여 놓은 substrate solution을 50ul 첨가하였다.
2.4.3.3.10 이후 30분 incubation하였다.
2.4.3.3.11 incubation 후 stop solution 50ul을 첨가한 후 마이크로플레이트 리더기 (microplate reader)로 490nm로 측정하였다 (이때, well에 공기방울이 있으면, 측정값이 튀기 때문에 공기방울을 제거하였다).
실시예 1-3. 자가형광 APC 발현 여부에 따른 NK 세포 분화효율 증가 효과 확인
인간유도만능줄기세포의 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cell, HPC) 분화 10~14일 (diff day 10~14)에 자가형광 (Autofluorescence)에 따라 iPSC - HPC 분화 과정에서 autofluorescence APC가 확인되었다 (도 1b). 발현여부에 따라 APC 발현(+) 및 APC 미발현(-)으로 각각 구분하여 FACS 분류 (Sorting)를 수행하였다. 또한, FACS sorter를 이용하여 APC + (P4), APC - (P5)으로 분류하였다 (도 1c).
그 결과, APC 발현 HPC에서 NK 세포로의 분화효율이 APC 미발현 HPC에서 NK 세포로의 분화효율 대비 우수한 것으로 확인되었다 (도 1d).
또한, 상기 분화가 완료된 모든 NK 세포, 그 중 APC 발현 NK 세포(APC+), 및 APC 미발현 NK 세포 (APC-)의 세포 독성 (cell cytotoxicity)을 분석하였다.
그 결과, APC 발현 HPC에서 분화된 NK 세포의 세포 독성이 높은 것으로 확인되었다 (도 1e, 및 도 1f).
실시예 2. NK 세포 분화 배지 조성 변경에 따른 활성화 수용체 발현 증진 효과 확인
실시예 2-1. 인간유도만능줄기세포 배양
실시예 1에서의 실시예 1-1과 동일한 방법으로 iPSC를 배양하였다.
실시예 2-2. 인간유도만능줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
실시예 1에서의 실시예 1-2의 2.1 내지 2.4.2까지의 방법과 동일한 방법을 적용하였다.
2.4.3 NK 세포로의 분화 모식도 (도 2a)
2.4.3.1 NK 세포로의 분화 과정
2.4.3.1.1 Day 0 : Growth media (stemfit 004)를 suction 하여 제거, 이후 Essential 8 media로 washing, 분화 미디어 1 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 2~3 : 분화 미디어 1 suction 하여 제거, 분화 미디어 2 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 4~5 : 분화 미디어 2 suction 하여 제거, 분화 미디어3 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 8~9 : 분화 미디어3 vol 15ml 첨가 (total vol 30ml).
Day 10~14 :분화 중인 T75에 있는 media를 harvest (30ml/T75).
-Exp 1
: 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4-1 15ml 첨가 (15ml/T75).
: Day 12~16 : 분화 미디어 4-1를 15ml 첨가 (15ml/T75).
: Day 16~46 :이후 4일에 한번씩 media half change. T75당 15ml씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심 분리 이후 media 제거, 새로운 분화 미디어 4-1를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 첨가.
-Exp 2
: 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4-2를 15ml 첨가 (15ml/T75).
: Day 12~16 : 분화 미디어 4-2를 15ml 첨가 (total vol 30ml).
: Day 16~20 : 분화 미디어 4-3으로 미디어 full change. 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4-3 (IL-3 제외)를 15ml 첨가.
Day 18~22 : 분화 미디어 4-3을 15ml 첨가.
Day 26~48 : 이후 4일에 한번씩 media half change. T75당 15ml 씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심분리 이후 media 제거, 새로운 분화 미디어 4-3를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 첨가.
공통 Day 46~52 : 분화 종료, 여러가지 분석을 위해 cell harvest. Flask에 있는 media를 harvest하여 50ml tube에 첨가. 이후 300g에 5분 원심분리 후 분화 media를 넣어 cell counting (cell counter X, manual counting으로 진행)한 후 각각의 분석을 위한 세포 수 확인.
실시예 1에서의 실시예 1-2의 2.4.3.2, 2.4.3.3의 방법과 동일한 방법을 적용하여 분화 검증 과정을 수행하였다.
실시예 2-3. NK 세포 분화 배지 조성 변경에 따른 활성화 수용체 발현 증진 효과 확인
조혈전구세포 분화 10 내지 14일 차의 각 마커 발현은 도 2b와 같았다. 이에 따르면 HPC 단계에서의 분화에 문제없이 HPC 분화가 진행되는 것으로 확인되었다.
이렇게 분화된 HPC로 NK 세포의 분화 미디어 4-1과, 4-2 및 4-3의 조성 변경에 따른 활성화 수용체 발현 증진 효과를 분석하였다. 이 때, 활성화 수용체 (activating receptor)로는 CD16, NKG2D를 분석하였다. 또한, 실험 1 (Exp 1) 및 실험 2 (Exp 2)의 배지 조성에 따라 NK 세포 분화과정이 종료된 후의 각 마커의 발현 수준 변화를 분석하였다.
그 결과, 각 마커의 발현 수준 변화는 도 2c와 같이 확인되었다. 이에 따르면 CD16 및 NKG2D의 발현이 약 5배, 및 2배로 현저히 증가한 것이 확인되었다.
또한, 세포 독성 분석 결과, CD16, 및 NKG2D 발현이 현저히 증가한 기능성 NK 세포의 세포 독성이 약 4.5배로 증가한 것이 확인되었다 (도 2d).
따라서, 본 발명의 단계 3에 적용되는 NK 세포 분화용 배지 조성물의 조성 변경 및 배지 사용 방법에 따라 기능적으로 우수한 NK 세포를 수득할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 3. NK 세포 분화 배지 조성 변경에 따른 억제 수용체 발현 감소 효과 확인
실시예 3-1. 인간유도만능줄기세포 배양
실시예 1에서의 실시예 1-1과 동일한 방법으로 iPSC를 배양하였다.
실시예 3-2. 인간유도만능줄기세포로부터 NK 세포로의 분화
실시예 1에서의 실시예 1-2의 2.1 내지 2.4.2까지의 방법과 동일한 방법을 적용하였다.
2.4.3 NK 세포로의 분화 모식도 (도 3a)
2.4.3.1 NK 세포로의 분화 과정
2.4.3.1.1 Day 0 : Growth media (stemfit 004)를 suction하여 제거, 이후 Essential 8 media로 washing, 분화 미디어 1 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 2~3: 분화 미디어 1 suction하여 제거, 분화 미디어 2 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 4~5 : 분화 미디어 2 suction하여 제거, 분화 미디어 3-1 vol 15ml을 첨가 후 incubation.
Day 6~7 : 분화 미디어3-1 vol 15ml 첨가 (total vol 30ml).
Day 8~10 : media half change. Flask에 있는 media를 15ml harvest하여 50ml tube에 첨가. 이후 300g에 5분 원심분리 후 media 제거 분화 3-1 media를 분화 중인 flask에 첨가. 이후 incubation.
Day 10~14 :분화 중인 T75에 있는 media를 harvest (30ml/T75), 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 4를 15ml 첨가 (15ml/T75).
2.4.3.1.1 Day 12~16 : 분화 미디어 4를 15ml첨가 (total vol 30ml)
-Exp 1
Day 16~20 : 분화 미디어 4에서 분화 미디어 5로 full change. 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 5를 15ml 첨가.
Day 18~22 : 분화 미디어 5를 15ml 첨가.
Day 26~48 : 이후 4일에 한 번씩 media half change. T75당 15ml 씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심 분리 이후 media 제거, 새로운 분화미디어 5를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 첨가.
Day 46~52 : 분화 종료, 분석을 위해 cell harvest. Flask에 있는 media를 harvest하여 50ml tube에 첨가. 이후 300g에 5분 원심 분리 후 분화 media를 넣어 cell counting (cell counter X, manual counting으로 진행)한 후, 각각의 분석을 위한 세포 수 확인.
-Exp 2
Day 16~20 : 분화 미디어 4에서 분화 미디어 5-1로 full change. 300g 5min 원심 분리 후 분화 미디어 5-1를 15ml 첨가.
Day 18~22 : 분화 미디어 5-1를 15ml 첨가.
Day 26~48 : :이후 4일에 한 번씩 media half change. T75당 15ml 씩 50ml tube에 넣어 300g에 5분 원심 분리 이후 media 제거, 새로운 분화미디어 5-1를 15ml 넣어 세포를 풀어주고 flask에 첨가.
Day 46~52 : 분화 종료, 분석을 위해 cell harvest. Flask에 있는 media를 harvest하여 50ml tube에 첨가. 이후 300g에 5분 원심분리 후 분화 media를 넣어 cell counting (cell counter X, manual counting으로 진행)한 후 각각의 분석을 위한 세포 수 확인.
실시예 1에서의 실시예 1-2의 2.4.3.2, 2.4.3.3의 방법과 동일한 방법을 적용하여 분화 검증 과정을 수행하였다
2.4.3.4 줄기세포로부터 NK 세포로 분화 검증 과정 (IFN-gramma EILSA)
2.4.3.4.1 Target cell number : : K562 5x10^4/well, Effector cell : iNK cells 1x10^6 cells/well, E: T ratio = 20:1
2.4.3.4.2 Media : stempro-34 + SCF + FLT3-L + IL7+ IL15
2.4.3.4.3 24 well에 K562 (target cells) 와 iNK cells (effector cells)를 분주한 후 4hr incubation.
2.4.3.4.4 반응이 끝난 후, media를 harvest.
2.4.3.4.5 harves한 media를, 300g에 5분 원심 분리, 새로운 EP Tube에 pellet만 남기고 media를 교체.
2.4.3.4.6 이후 Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit (R&D, Cat. DIF50C)을 이용 하여, Kit protocol에 따라 IFN-gramma를 측정.
실시예 3-3. NK 세포 분화 배지 조성 변경에 따른 억제 수용체 발현 감소 효과 확인
그 결과, 조혈전구세포 분화 10 내지 14일 차의 각 마커 발현은 도 3b와 같았다. 실시예 2-3의 실험 결과와 마찬가지로 HPC 단계에서의 분화에 문제없이 HPC 분화가 진행되는 것으로 확인되었다.
또한, 실험 1 (Exp 1)및 실험 2 (Exp 2)의 배지 조성에 따라 NK 세포 분화과정이 종료된 후의 각 마커의 수준 변화는 도 3c와 같이 확인되었다. 또한, 이를 정량화한 결과는 도 3d와 같다. 이에 따르면 NKG2A의 수준이 70%에서 65%로 미미하게 감소하였지만, NKG2A에 대하여 MFI 값을 확인한 결과 실시예 3에 따라 배지 조성을 변경한 경우 NKG2A의 감소 수준은 통계적으로 유의한 수준인 것으로 확인되었다 (도 3e).
또한, 세포 독성 분석 결과, 본 실시예에 따라 배지 조성을 변경한 경우 수득된 NK 세포의 세포 독성이 증가하는 것으로 나타났다 (도 3f 및 도 3g). 이에 더하여, IFN-gamma ELISA 분석 결과, 상기 수득된 NK 세포의 기능성이 현저히 증대되는 것으로 확인되었다 (도 3h 및 도 3i).
따라서, 본 발명의 단계 3에 적용되는 NK 세포 분화용 배지 조성물의 조성 변경에 따라 기능적으로 우수한 NK 세포를 수득할 수 있는 것이 확인되었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
NK 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법은 특정한 특징을 나타내는 세포를 선별하여 분화시킴에 따라 NK 세포 분화 효율을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 유도만능줄기세포로부터 NK 세포로 분화하는 과정의 특정 단계에 대한 조건 변화, 이에 사용되는 단계별 배지용 조성물의 조성에 대한 조건, 상기 조성물의 처리 방법 등에 의해 NK 세포 분화 효율을 증가시켰다. 이와 같은 양적 증가뿐만 아니라 기능성 NK 세포를 수득할 수 있다는 점에서 질적 증가를 나타내는 방법으로 유용하게 활용될 수 있는 바, 산업상 이용가능성이 인정된다.

Claims (23)

  1. 줄기세포로부터 배양된 조혈전구세포 중 APC (Allophycocyanin)를 발현하는 조혈전구세포를 선별하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조혈전구세포는 CD34, CD31, CD43, 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커를 추가적으로 더 발현하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포의 분화 효율이 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조혈전구세포로부터 분화된 NK 세포는 세포 독성 기능이 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 조혈전구세포로부터 NK 세포를 배양하여 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포를 분화하는 방법:
    β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), 및 IL-3.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 NK 세포 분화용 배지는 IL-3을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 전체 조성물을 기준으로 0.1 내지 20μM의 β-mercaptoethanol, 0.1 내지 50ng/mL의 sodium selenite, 1 내지 600μM의 ethanolamine, 및 1 내지 200mg/L의 ascorbic acid를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지는 stemline, stempro-34, SCF, IL-7, IL-15, 및 FLT3 ligand로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인, 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 NK 세포는 활성화 수용체의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 활성화 수용체는 CD16, 또는 NKG2D 중 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 제2 NK 세포 분화용 배지는 p38 MAPK 억제제를 추가적으로 더 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 p38 MAPK 억제제는 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580), 로스마피모드(losmapimod), 도라마피모드 (doramapimod), 랄리메티닙 (Ralimetinib), 및 네플라마피모드 (Neflamapimod, VX-745)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 NK 세포는 억제 수용체의 발현이 감소된 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 억제 수용체는 NKG2A인 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 NK 세포는 CD16, NKG2D, NKp30, 및 NKp44로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 활성화 수용체 발현 수준이 유지 또는 증가된 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  16. 제5항에 있어서,
    상기 제1 NK 세포 분화용 배지 또는 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 46일 내지 52일까지 수행되는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 10일 내지 14일부터 16일 내지 20일까지 수행되는 것인, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 제2 NK 세포 분화용 배지에서 수행되는 배양 단계는 전체 배양 과정을 기준으로 16일 내지 20일부터 46일 내지 52일까지 수행되는 것인, 방법.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 NK 세포는 세포 독성이 증가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 줄기세포는 유도만능줄기세포, 배아 줄기세포, 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  21. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 배지 조성물:
    β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
  22. 제21항의 조성물, 및 설명서를 포함하는, 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 키트.
  23. 하기 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 줄기세포로부터 NK 세포로의 분화용 제제 또는 분화 증진용 제제를 제조하기 위한 용도:
    β-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol, BME, 2BME, 2-ME 또는 β-met), 아셀렌산나트륨 (sodium selenite), 에탄올아민 (ethanolamine), 아스코르빈산 (ascorbic acid), IL-3, 및 아데즈마피모드 (Adezmapimod, SB203580).
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