KR20150018491A - 줄기세포로부터 il-22를 생산하는 자연살해세포 분화 방법 - Google Patents

줄기세포로부터 il-22를 생산하는 자연살해세포 분화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 IL-22를 생산하는 자연살해세포 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 골수로부터 유래 된 조혈 줄기세포로부터 유도된 전구체 세포에 낮은 농도의 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합 처리함으로써, IL-22을 생산하는 NK-22 세포로의 분화를 유도할 수 있으므로 상기 유도된 NK-22를 이용하여 염증, 간염 및 암 등의 질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포로부터 IL-22를 생산하는 자연살해세포 분화 방법{A method of differentiating stem cells into IL-22-producing natural killer cells}
본 발명은 줄기세포로부터 IL-22(interleukin-22)를 생산하는 NK-22로의 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 조혈 줄기세포로부터 낮은 농도의 IL-15 및 IL-23을 혼합처리하여 IL-22를 생산하는 NK-22로의 분화 방법에 관한 것이다.
면역체계를 구성하는 세포들 중 자연살해세포(natural killer cell, 이하 "NK 세포"라 약칭함)는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있는 세포로 알려져 있다. 이러한 NK 세포의 살해능은 림포카인 활성세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구(tumor infiltration lymphocytes, TIL)을 이용하여 고형암(solid tumor) 치료에 이용하거나, 공여자 임파구 주입(donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법(Tilden. A. B. et al., J. Immunol ., 136: 3910-3915, 1986; Bordignon C, et al., Hematologia 84: 1110-1149, 1999)을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요법으로 응용이 시도되고 있다. 또한, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Konjevic G, et al., Breast Cancer Res . Treat ., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al., Melanoma Res ., 13: 349-356, 2003), 폐암(Villegas FR, et al., Lung Cancer , 35: 23-28, 2002) 등 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되어 이러한 질환들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.
사이토카인(Cytokine) 수용체의 γc의 발현이 결핍된 쥐에서 B세포와 T세포는 발견이 되지만 NK 세포는 발견되지 않는 점에서 γc를 지닌 수용체들이 NK 분화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Singer, B et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92, 377-381, 1995). 수용체의 γc 형태는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21의 수용체이며, 이 중 IL-2는 성숙된 NK 세포의 증식과 활성화를 증진시키는 기능을 지니고 있음이 보고되고 있다(Shibuya, A. et al., Blood 85, 3538-3546, 1995). IL-2가 결핍된 인간과 마우스에서는 NK 세포의 수가 현저히 감소한다는 보고가 전해지고 있으나(DiSanto, J. P. et al., J. Exp . Med . 171, 1697-1704, 1990), 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은 간접적으로 NK 세포의 수와 활성화에 영향을 미친다는 연구 결과도 있다. 게다가, IL-2R 사슬은 IL-15의 수용체를 형성하는데 관여한다고 알려져 있다.
IL-15는 NK 세포 분화에 관여하고, 이것은 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론(transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍되며(Kouetsu et al., Nature 391, 700-703, 1998), IL-15 또는 IL-15Ra가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 것에 의해 알게 되었다. 이로써 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 보고되었다(MrozekE et al., Blood 87, 2632-2640,1Ⅱ996).
IL-23은 IL-12 패밀리의 한 멤버로서 p40과 p19로 이루어져 있으며, IL-12와 같이 주로 활성화된 단핵구세포, 대식세포, 그리고 수지상 세포 등과 같은 APC(항원제시세포)로부터 분비된다. IL-23은 APC에 적용함으로써 이들을 활성화시키고 INF-γ 와 IL-12의 분비를 유도할 뿐만 아니라, 메모리 T 세포에 작용하여 증식과 INF-γ의 분비를 유도하는 것으로 알려져 있다. 특히 IL-12와 IL-23에 의해서 유도되는 INF-γ는 APC의 MHC(major histocomatibility complex) 분자의 발현을 증가시키는 동시에 항원제시 능력을 강화시킴으로써, 암 세포에 면역원성을 부여함으로써 CTL 및 헬퍼 T 림프구의 활성을 유도하고, 아울러, NK 세포의 암 세포 살상 능력도 증가시킨다.
IL-22는 Ⅱ형 사이토카인이고 IL-10과 서열 상동성을 나타냈다. 이의 발현은 IL-9 또는 ConA에 의해 T 세포에서 상향조절된다(Dumoutier L. et al.(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(18):10144-9). 추가의 연구는 IL-22 mRNA의 발현이 생체 내에서 LPS 투여에 응답하여 유도되고 IL-22가 급성 상 반응의 징후인 파라미터를 조절함을 보여주었다(Dumoutier L. et al.(2000); Pittman D. et al.(2001) Genes and Immunity 2:172). 추가로, IL-22는 β-데펜신, S100A7, S100A8, 및 S100A를 포함하는 숙주 방어와 관련된 항미생물 펩타이드의 발현을 증진시킨다(Wolk et al., Immunity, 21:241-54 (2004); Boniface et al., J. Immunol. 174:3659-3702(2005); Liang et al., J. Exp . Med., 203(10)2271-79(2006)). 따라서, IL-22가 염증에서 특정 역할을 수행함을 알 수 있다(Kotenko S.V.(2002) Cytokine ＆ Growth Factor Reviews 13(3):223-40).
NK 세포는 골수의 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell, HSC)로부터 유래 된다고 알려져 있다. In vitro 배양의 방법으로는 조혈 줄기세포를 분리하여 적당한 사이토카인들을 처리하여 배양함으로써 NK세포로 분화시키는 방법들이 보고되었다(Immunity 3: 459-473, 1995; Blood 87:2632-2640, 1996; Eur J Immunol. 33:3439-3447, 2003; Blood 108: 3824-3833, 2006). 즉, HSC에 Flt-3L, IL-7, SCF, IL-15등을 첨가하여 배양 후 일반적인 NK(cNK) 세포로 분화시킬 수 있다. In vivo NK 세포는 골수에서 분화 과정을 거치며 골수의 미세환경은 NK 세포의 분화에 필수적이다. NK 세포는 분화 과정을 거침에 따라 다양한 표면 분자들을 순차적으로 획득하는 것을 특징으로 한다. 마우스 모델에서 NK 세포는 분화 과정 중에 CD122, NK1.1, NKG2 family, Ly49 family, DX5(CD49b), 그리고 CD43을 순차적으로 발현한다 (Nat Immunol, 3: 523-528, 2008).
최근 연구결과들에 의하면 cNK와는 다른 성격의 NK subset인 IL-22를 생산하는 NK 세포(NK-22)가 동정이 되었다(Nature 457:722-725, 2009; Nat Immunol. 10:75-82, 2009; Nat Immunol. 10:83-91, 2009). 특히 IL-22는 염증, 감염, 암 조절에서 중요한 면역반응을 유도하는 역할을 수행하는 한편, NK-22 세포는 IL-22를 분비하는 NK 세포로 cNK 세포와는 달리 낮은 양의 IFN-γ, granzyme와 perforin을 발현하고 낮은 살상능을 갖고 있다(Semin Immunopathol. 32:17-31, 2010; Nature 457:722-725, 2009; Nat Immunol. 10:83-91, 2009). 생체에서는 NK-22 세포가 소장에 존재하는 lymphoid tissue inducer(LTi) 세포로부터 분화하는 것으로 알려져 있다(J Exp Med. 207:281-290, 2010; Nat Immunol. 10:66-74, 2009). 그러나 아직 in vitro에서 어떤 방법에 의해 특히 줄기세포로부터 NK-22 세포가 분화되는지는 아직 안 알려져 있다. 이러한 새로운 방법에 의해 NK-22 세포가 얻어진다면 이 세포의 특성을 이용한 염증, 감염, 암 등의 질환 치료에 적극적으로 응용이 가능하다.
이에 본 발명자들은 보다 효율적으로 줄기세포로부터 IL-22를 생산하는 자연살해세포를 분화시키기 위한 방법을 개발하던 중, 조혈 줄기세포로부터 낮은 농도의 IL-15 및 IL-23을 혼합처리하여 조혈 줄기세포로부터 분화된 IL-22를 생산하는 NK-22를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 조혈 줄기세포로부터 IL-22(Interleukin-22)를 생산하는 자연살해세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
1) 조혈 줄기세포에 NK(natural killer) 세포 전구체 유도제를 첨가하여 NK 전구체 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
2) 상기 NK 전구체 세포에 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합처리하여 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 조혈 줄기세포에 SCF(stem cell factor), Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(Interleukin-7)로 구성된 CD127+CD117+ NK(natural killer) 세포 전구체 유도제를 첨가하여 NK 전구체 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
2) 상기 NK 전구체 세포에 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합처리하여 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈 줄기세포를 IL-22(Interleukin-22)를 생산하는 NK 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 조혈 줄기세포로부터 IL-22(Interleukin-22)를 생산하는 NK-22 세포로의 분화키는 방법에 관한 것으로, 조혈 줄기세포로부터 유도된 전구체 세포에 낮은 농도의 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합처리함으로써, IL-22을 생산하는 NK-22 세포로의 분화를 유도할 수 있으므로 상기 유도된 NK-22를 이용하여 염증, 간염 및 암 등의 질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 생쥐의 조혈 줄기세포로부터 NK-22 세포로 분화한 결과를 나타낸 도이다;
(A)는 100 ng/ml IL-15로 분화시킨 NK 세포(cNK); 및
(B)는 5 ng/ml IL-15 및 20 ng/ml IL-23으로 분화시킨 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low/neg 세포.
도 2는 cNK와 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포를 정제한 후, RORγt와 IL-22 발현을 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 cNK와 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포에서 RORγt 발현을 형광세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 생쥐의 조혈 줄기세포로부터 분화된 NK-22 세포의 RORγt 와 IL-22 발현을 측정한 결과를 나타낸 도이다;
(A)는 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+, CD127-CD117- 세포들의 RORγt 발현을 형광세포분석기로 측정한 결과;
(B)는 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+, CD127-CD117- 세포들의 RORγt와 IL-22 발현을 RT-PCR로 측정한 결과; 및
(C)는 cNK, 생쥐 소장에서 분리한 LTi 세포(LP CD127+CD117+) 및 줄기세포에서 분화된 CD127+CD117+ 세포(7d-CD127+CD117+)의 RORγt와 IL-22 발현을 RT-PCR로 측정한 결과.
도 5는 CD127+CD117+ 세포로부터 배양된 NK-22 세포의 분화를 측정한 결과를 나타낸 도이다;
(A)는 줄기세포로부터 분화 후 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+, CD127-CD117- 세포를 100 ng/ml IL-15로 분화시킨 결과;
(B)는 줄기세포로부터 분화 후 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+ 및 CD127-CD117- 세포를 5 ng/ml IL-15 과 20 ng/ml IL-23로 분화한 후 형광세포분석기로 분석한 결과; 및
(C)는 CD127+CD117+ 세포로부터 분화된 NK-22 세포의 RORγt 발현을 분석한 결과.
도 6은 CD127+CD117+ 세포를 생쥐에 투여 후 생성된 NK-22 세포의 분화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 조혈 줄기세포에 NK(natural killer) 세포 전구체 유도제를 첨가하여 NK 전구체 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
2) 상기 NK 전구체 세포에 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합처리하여 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 조혈 줄기세포는 골수 유래인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 NK 세포 전구체 유도제는 SCF(stem cell factor), Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(Interleukin-7)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 NK 세포 전구체는 CD127+CD117+ 전구체 세포인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 IL-15는 1 ng/ml - 20 ng/ml로 처리하는 것이 바람직하고, 5 ng/ml - 10 ng/ml로 처리하는 것이 보다 바람직하고, 5 ng/ml로 처리하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 IL-23는 10 ng/ml - 30 ng/ml인 것이 바람직하고, 20 ng/ml - 25 ng/ml로 처리하는 것이 보다 바람직하고, 20 ng/ml로 처리하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 NK 세포는 IL-22(Interleukin-22)를 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 한가지 측면에서, 골수에서 조혈 줄기세포를 분리하기 위하여, 마우스에서 분리한 골수에서 추출한 세포에 ACK 용액을 처리하여 적혈구를 제거한 후, B220, CD2, NK1.1, CD11b, Gr-1, 및 TER-119 항체를 처리하여 각각에 해당하는 B 세포, T 세포, NK/NKT 세포, 단핵구, 과립구, 및 적혈구에 붙이고, 이를 MACS(magnetic-activated cell sorting) 세포 분리 키트(Cell Separation Kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 이용하여 음성선택(negative selection)으로 제거하였다. 이와 같이 분화된 면역세포들을 제거한 후, 조혈 줄기세포의 특이 표면 분자인 CD117(c-kit)에 대한 마이크로비즈(microbeads)와 MACS를 이용하여 양성선택(positive selection)으로 조혈 줄기세포를 분리하였다.
본 발명의 한가지 측면에서, 조혈 줄기세포로부터 IL-22를 생산하는 NK-22의 분화 유도를 위하여, 조혈 줄기세포에 SCF, Flt3L 및 IL-7을 첨가하여 NK 전구체 세포로의 분화를 유도한 후, 다양한 농도의 IL-15 및 IL-23을 혼합처리한 다음 NK 세포 분화 정도를 확인한 결과, 조혈 줄기세포로부터 cNK 세포를 분화시켰을 경우 약 75%가 cNK로 분화되었고(도 1A 참조), 조혈 줄기세포를 5 ng/ml IL-15 와 20 ng/ml IL-23로 분화시킨 경우 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포가 약 37%가 되는 것을 확인하였다(도 1B 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포 분석을 위하여, RORγt 와 IL-22 발현을 RT-PCR 및 형광세포분석기로 측정한 결과, CD3-CD127+NKp46+NK1.1low/neg 세포에서의 RORγt 와 IL-22 유전자 발현은 cNK세포와 비교하여 현저히 증가되는 것을 확인하였고(도 2 참조), RORγt 발현은 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low/neg 세포에서 약 2% 정도의 세포가 가지고 있음을 확인하였다(도 3 참조). 따라서, CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / negRORγt+ 세포가 조혈 줄기세포로부터 분화된 NK-22 세포임을 확인하였다.
본 발명의 한가지 측면에서, NK-22 세포의 전구체 세포를 알아보기 위하여, 줄기세포로부터 7일간 분화된 전구체 세포들을 형광세포분석기 및 RT-PCR을 통해 분석한 결과, CD127+CD117+ 세포만이 RORγt 및 IL-22 유전자를 발현하였다(도 4 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, CD127+CD117+ 전구체 세포로부터 NK-22 세포가 분화되는지 확인하기 위하여, CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+, CD127-CD117- 세포를 5 ng/ml IL-15 및 20 ng/ml IL-23으로 분화시킨 결과, CD127+CD117+ 세포는 약 60%가 NK-22 세포로 분화되는 것을 확인하였다(도 5 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, In vivo 모델에서 CD127+CD117+ 전구체 세포로부터 NK-22 세포가 분화되는지 확인하기 위하여, 전구체 세포를 생쥐에 투여 14일 후, 소장에서 분리된 NK-22 세포들의 표현형과 RORγt 발현을 형광세포분석기를 이용하여 분석한 결과, 소장의 약 10% 세포가 RORγt+ 세포였고 CD127+CD117+RORγt+는 약 0.6%로 측정되었다. 따라서, In vivo에서 줄기세포로부터 NK-22 세포가 분화됨을 확인하였다(도 6 참조).
따라서, 조혈 줄기세포로부터 분화된 전구체 세포에 낮은 농도의 IL-15 및 IL-23을 혼합처리하여 IL-22를 생산하는 NK-22 세포의 분화가 유도됨을 확인하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의하여 제조된 NK-22 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암, 대장암 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 조혈 줄기세포로부터 분화된 전구체 세포에 낮은 농도의 IL-15 및 IL-23을 혼합처리하여 IL-22를 생산하는 NK-22 세포의 분화가 유도됨을 확인하였으므로, 상기 NK-22 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 NK-22 세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 IL-15 및 IL-23을 유효성분으로 함유하는 조혈 줄기세포에서 NK 세포로의 분화 유도제를 제공한다.
상기 조혈 줄기세포는 골수 유래인 것인 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 NK 세포는 IL-22를 생산하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명은 조혈 줄기세포로부터 IL-15 및 IL-23을 혼합처리하여 IL-22를 생산하는 NK-22 세포의 분화가 유도됨을 확인하였으므로, IL-15 및 IL-23을 유효성분으로 함유하는 분화 유도제는 조혈 줄기세포에서 NK 세포로의 분화를 유도하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 마우스 골수로부터 조혈 줄기세포의 분리
실험용 마우스(중앙실험동물(주), 한국)의 종아리뼈, 넓적다리뼈, 골반뼈를 분리하고 이로부터 당업계에서 알려진 방법에 의해 총 골수 세포를 추출하였다. 골수에서 추출한 세포에 ACK 용액을 처리하여 적혈구를 제거한 후, B220, CD2, NK1.1, CD11b, Gr-1, 및 TER-119 항체를 처리하여 각각에 해당하는 B 세포, T 세포, NK/NKT 세포, 단핵구, 과립구, 및 적혈구에 붙이고, 이를 MACS(magnetic-activated cell sorting) 세포 분리 키트(Cell Separation Kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 이용하여 음성선택(negative selection)으로 제거하였다. 이와 같이 분화된 면역세포들을 제거한 후, 조혈 줄기세포의 특이 표면 분자인 CD117(c-kit)에 대한 마이크로비즈(microbeads)와 MACS를 이용하여 양성선택(positive selection)으로 조혈 줄기세포를 분리하였다.
< 실시예 2> 골수로부터 분리된 조혈 줄기세포로부터 NK -22 세포의 분화유도
상기 <실시예 1>에서 분리한 조혈 줄기세포를 24-웰(well) 플레이트(plate)(Becton and Dickinson Bioscience, 미국)에 1.5 x 106 세포/웰(cells/well)의 농도로 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 2 μg/ml 인도메타산(indometacin)(Sigma-Aldrich, St. 미국), 20 μg/ml 켄다마이신(gentamicin)(Sigma-Aldrich. 미국), 30 ng/ml murine SCF(stem cell factor)(PeproTech, Rocky Hill, 미국), 50 ng/ml 쥐(murine) Flt3L(PeproTech, 미국), 0.5 ng/ml 쥐(murine) IL-7(PeproTech, 미국)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2에서 7일간 배양하였다. 최초 배양 3일 후 절반의 배양 상층액을 같은 조성의 사이토카인이 함유된 새로운 배지로 갈아주었다. NK 세포로의 분화를 위해 7일간 배양한 중간단계의 전구체 세포들을 회수하여 다양한 농도의 ㅈ쥐(murine) IL-15 와 쥐(murine) IL-23(PeproTech. 미국)을 포함하는 배지에서 7일간 추가 배양하였다. 3일 간격으로 절반의 배지를 같은 조성의 사이토카인이 함유된 새로운 배지로 갈아주었다. 14일째, 항-NK1.1와 항-CD3 항체를 이용하여 NK1.1+CD3-인 NK 세포의 순도를 분석하고, 다양한 NK 세포 표면 분자에 대한 항체를 이용하여 NK 세포의 분화 정도를 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 조혈 줄기세포로부터 cNK 세포를 분화시켰을 경우 약 75%가 cNK로 분화되었고(도 1A), 조혈 줄기세포를 5 ng/ml IL-15 와 20 ng/ml IL-23로 분화시킨 경우 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포가 약 37%가 되는 것을 확인하였다(도 1B).
< 실시예 3> NK -22 세포의 분화 확인
cNK 와 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포를 분리정제한 후 RORγt 와 IL-22 발현을 RT-PCR로 측정하였다.
구체적으로, 분화 과정 중의 NK 세포를 회수하고 Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, 미국)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 1-3 μg의 RNA를 2.5 U의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus; M-MLV) 역전사 효소(reverse transcriptase)(Roche Diagnostics, Basel, 스위스)와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA의 전사체는 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio, 일본)와 Real-time system TP 800(Takara Bio, 일본)을 이용하여 정량하였으며, 시료의 표준화를 위해 GAPDH를 사용하였다. 각각의 프라이머(primer)는 Primer3 software를 사용하여 제작하였다. 사용된 프라이머는 RORγt 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호: 1(5'-CATCATCTCTGCAAGACTCATCGAC-3') 및 RORγt 역방향 프라이머(reverse primer) 서열번호: 2(5'-TTTCCACATGTTGGCTGCAC-3'), IFN-γ 정방향 프라이머 서열번호: 3(5'-GATGCATTCATGAGTATTGCCAAGT-3') 및 IFN-γ 역방향 프라이머 서열번호 : 4(5'-GTGGACCACTCGGATGAGCTC-3'), IL-22 정방향 프라이머 서열번호: 5(5'-GTGAGAAGCTAACGTCCATC-3') 및 IL-22 역방향 프라이머 서열번호: 6(5'-GTCTACCTCTGGTCTCATGG-3'), 퍼포린(Perforin) 정방향 프라이머 서열번호: 7(5'-TTCGGGAACCAAGCTACACCA-3') 및 퍼포린 역방향 프라이머 서열번호: 8(5'-CAGGCTGTAGTCCACCAGACCA-3') 및 GranzymeA 정방향 프라이머 서열번호: 9(5'-AAGAACTGGGTGTTGACTGCTG-3') GranzymeA 역방향 프라이머 서열번호: 10(5'-CACGTGTATATTCATCATAGCATGG-3')을 각각 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포에서의 RORγt 와 IL-22 유전자 발현은 cNK세포와 비교하여 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 2).
또한, cNK 와 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / neg 세포에서 RORγt 발현을 형광세포분석기로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 RORγt 발현은 CD3-CD127+NKp46+NK1.1low/neg 세포에서 약 2% 정도의 세포가 가지고 있음을 확인하였다(도 3). 따라서, CD3-CD127+NKp46+NK1.1low / negRORγt+ 세포가 조혈 줄기세포로부터 분화된 NK-22 세포임을 확인하였다.
< 실시예 4> NK -22 세포의 전구체 세포 분석
NK-22가 어떤 전구체 세포로부터 분화되는지를 알아보기 위해 줄기세포로부터 7일간 분화된 전구체 세포들인 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+ 및 CD127-CD117- 세포를 형광세포분석기를 이용하여 분리한 후, 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+ 및 CD127-CD117- 세포들의 RORγt 발현을 형광세포분석기로 측정하였다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이 CD127+CD117+ 세포만이 RORγt를 발현하였다(도 4A).
또한, RORγt 와 IL-22 유전자 발현을 real-time PCR로 확인하였다.
그 결과, 그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이 CD127+CD117+ 세포만이 RORγt과 IL-22 유전자를 많이 발현하는 것을 확인하였다(도 4B).
또한 생쥐 소장에서 분리한 LTi 세포(LP CD127+CD117+) 및 줄기세포에서 분화된 CD127+CD117+ 세포(7d-CD127+CD117+)의 RORγt 와 IL-22 발현을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이 LTi 세포가 더 많은 RORγt 와 IL-22를 발현하는 것을 확인하였다(도 4C).
< 실시예 5> 전구체로부터 NK -22 세포의 분화 확인
CD127+CD117+ 전구체 세포로부터 NK-22 세포가 분화됨을 확인하기 위하여 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+ 및 CD127-CD117- 세포를 각각 100 ng/ml IL-15, 및 5 ng/ml IL-15 및 20 ng/ml IL-23으로 분화시킨 후, 형광세포분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이 100 ng/ml IL-15로 분화시킨 결과CD127+CD117+ 세포는 약 20%가 cNK 세포로 분화되었고, CD127-CD117+,세포는 약 50%가 cNK 세포로 분화되는 것을 확인하였다(도 5A).
또한, 정제된 CD127+CD117+, CD127+CD117-, CD127-CD117+, CD127-CD117- 세포를 5 ng/ml IL-15 및 20 ng/ml IL-23으로 분화시킨 후, 형광세포분석기로 분석하였다.
그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이 CD127+CD117+ 세포는 약 60%가 NK-22 세포로 분화되었고, CD127-CD117+세포는 거의 NK-22 세포로 분화되지 않는 것을 확인하였다(도 5B).
또한, CD127+CD117+ 세포로부터 분화된 NK-22 세포의 RORγt 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 5C에 나타낸 바와 같이 13%가 최종 NK-22 세포로 분화됨을 확인하였다(도 5C).
< 실시예 6> ( in vivo ) 생쥐에서 NK -22의 분화 확인
In vivo 모델에서도 상기 <실시예 5>와 같이 NK-22 세포가 분화되는지 확인하기 위하여, CD127+CD117+ 세포를 생쥐에 투여한 후, 생성된 NK-22 세포의 분화를 측정하였다.
구체적으로 2 x 104 개의 CD127+CD117+ 전구체 세포를 Rag2-/-IL2rg-/- 생쥐에 정맥으로 투여한 후, 상기 전구체세포로부터 분화된 NK-22 세포를 분석하기 위해, 상기 전구체세포를 생쥐에 투여 14일 후 소장에서 분리된 NK-22 세포들의 표현형과 RORγt 발현을 형광세포분석기를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 소장의 약 10% 세포가 RORγt+ 세포였고 CD127+CD117+RORγt+는 약 0.6%로 측정되었다. 따라서, in vivo에서 줄기세포로부터 NK-22 세포가 분화됨을 확인하였다(도 6).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A method of differentiating stem cells into IL-22-producing natural killer cells <130> 14p-12-051 <150> KR 10-2011-0037846 <151> 2011-04-22 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROR gamma t forward primer <400> 1 catcatctct gcaagactca tcgac 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROR gamma t reverse primer <400> 2 tttccacatg ttggctgcac 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma forward primer <400> 3 gatgcattca tgagtattgc caagt 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma reverse primer <400> 4 gtggaccact cggatgagct c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-22 forward primer <400> 5 gtgagaagct aacgtccatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Interleukin-22 reverse primer <400> 6 gtctacctct ggtctcatgg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perforin forward primer <400> 7 ttcgggaacc aagctacacc a 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perforin reverse primer <400> 8 caggctgtag tccaccagac ca 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GranzymeA forward primer <400> 9 aagaactggg tgttgactgc tg 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GranzymeA reverse primer <400> 10 cacgtgtata ttcatcatag catgg 25

Claims (6)

1) 조혈 줄기세포에 SCF(stem cell factor), Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(Interleukin-7)로 구성된 CD127+CD117+ NK(natural killer) 세포 전구체 유도제를 첨가하여 NK 전구체 세포로의 분화를 유도하는 단계; 및
2) 상기 NK 전구체 세포에 IL-15(Interleukin-15) 및 IL-23(Interleukin-23)을 혼합처리하여 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈 줄기세포를 IL-22(Interleukin-22)를 생산하는 NK 세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 조혈 줄기세포는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 IL-15는 1 ~ 20 ng/ml로 처리하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 IL-15는 5 ~ 10 ng/ml로 처리하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 IL-23는 10 ~ 30 ng/ml로 처리하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 IL-23는 20 ~ 25 ng/ml로 처리하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포를 NK 세포로 분화시키는 방법.
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