FR3132146A1 - Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition - Google Patents

Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition Download PDF

Info

Publication number
FR3132146A1
FR3132146A1 FR2200690A FR2200690A FR3132146A1 FR 3132146 A1 FR3132146 A1 FR 3132146A1 FR 2200690 A FR2200690 A FR 2200690A FR 2200690 A FR2200690 A FR 2200690A FR 3132146 A1 FR3132146 A1 FR 3132146A1
Authority
FR
France
Prior art keywords
composition
antigen
cells
activation
skin explant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
FR2200690A
Other languages
English (en)
Inventor
Manon SCHOLAERT
Nicolas GAUDENZIO
Emeline Pages
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoskin SAS
Original Assignee
Genoskin SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genoskin SAS filed Critical Genoskin SAS
Priority to FR2200690A priority Critical patent/FR3132146A1/fr
Priority to PCT/EP2023/052096 priority patent/WO2023144355A1/fr
Publication of FR3132146A1 publication Critical patent/FR3132146A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel vaccinal d’une composition comprenant les étapes de: ia) administration transcutanée de la composition à un explant de peau, comprenant l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; ib) du statut d’activation des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau ; etii) détermination du potentiel vaccinal de la composition.

Description

Modèle humainex vivodestiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition
La présente invention est relative au domaine de la vaccination et propose, plus spécifiquement, le premier modèle humainex vivopermettant de déterminer le potentiel vaccinal d’une composition.
 Art antérieur
Pour assurer sa protection, le corps humain possède 2 types de mécanismes de défense qui sont l’immunité innée et l’immunité adaptative.
L’immunité innée permet la défense de l'organisme contre les agents infectieux de façon immédiate. À l'inverse, l’immunité adaptative (ou acquise) confère une protection plus tardive à l’organisme, mais plus durable.
En lien avec l’immunité innée, celle-ci est immédiate en cas d’agression par un agent infectieux. Maintenant, il s’agit d’une réponse indépendante des antigènes dudit agent infectieux. En outre, cette réponse immunitaire est d’intensité comparable à chaque exposition avec un même agent infectieux.
L’immunité adaptative nécessite une phase d’apprentissage pour l’organisme. À la suite de l’interaction entre un agent infectieux et l’immunité innée, l’immunité adaptative entre en action dans les tissus lymphoïdes, surtout dans les ganglions et la rate. Plusieurs mécanismes entrent alors en jeu :
1- L’antigène (agent infectieux) active directement les lymphocytes B, qui possèdent des récepteurs spécifiques. Les lymphocytes B activés deviennent alors des plasmocytes, qui vont sécréter des anticorps spécifiques pour la destruction de l’antigène (immunité humorale).
2 - L’antigène (agent infectieux) est présenté à des lymphocytes T par des cellules présentatrices d’antigènes (ex. : cellules dendritiques). Les cellules présentatrices d’antigènes activent les lymphocytes T, qui se différencient en :
  • Lymphocytes T cytotoxiques (CD8+), qui détruisent les cellules infectées (immunité cellulaire);
  • Lymphocytes T auxiliaires (CD4+), ouT follicular helper cells ,qui stimulent les lymphocytes B pour produire une plus grande quantité d’anticorps et de cellules mémoire, qui iront ensuite se loger dans la moelle osseuse.
L’immunité adaptative nécessite donc, après un 1ercontact avec un agent infectieux, au moins 2 à 3 semaines pour se mettre en place. Cette immunité est dépendante et spécifique des antigènes d’un agent infectieux. La réponse immunitaire associée à celle-ci augmente en intensité suite à chaque contact avec un même agent infectieux.
La stratégie vaccinale vise à développer une immunité adaptative en utilisant des antigènes d’un agent infectieux spécifique. Maintenant, bénéficier d’une composition présentant un bon potentiel vaccinal est un exercice complexe. En effet, il importe en premier lieu que cette composition permette la bonne activation des cellules présentatrices de l’antigène, de sorte à pouvoir induire une réponse immunitaire spécifique. Simultanément, il est souhaitable que cette composition n’induise pas une réponse inflammatoire trop élevée (c’est-à-dire une dégranulation limitée des mastocytes).
Aujourd’hui, la seule option permettant d’estimer le potentiel vaccinal d’une composition réside dans les modèles animaux qui laissent subsister malgré tout de nombreuses inconnues sur le potentiel vaccinal réel d’une composition donnée chez l’homme.
Aussi, il existe un besoin pour un outil qui permettrait de déterminer facilement et rapidement, et sans recourir à l’animal, le potentiel vaccinal chez l’homme d’une composition injectable.
Les inventeurs ont préalablement développé un modèleex vivode peau humaine qui permet de tester l’injection sous-cutanée d’une solution sans recourir à l’animal.
Les inventeurs avaient également mis en évidence que, non seulement les mastocytes étaient présents stablement dans ce modèle de peau humaine, mais encore qu’ils restaient fonctionnels avec une capacité de dégranulation intacte.
Maintenant, les inventeurs ont mis en évidence que les cellules présentatrices de l’antigène sont également présentes dans ce modèle de peau et en outre qu’elles présentaient une capacité de maturation intacte. Ce résultat était d’autant plus inattendu que, suite à la mise en culture de peau humaine, les cellules présentatrices étaient décrites comme migrant hors de l’explant de peau vers le milieu de culture (LENZet al., J. Clin. Invest., vol.92, p :2587-2596, 1993 ; POPEet al., J. Invest. Dermatol .,vol.104(1), p :11-17, 1995 ; RATZINGERet al., J. Immunol .,vol.168, p : 4361-4371; 2002 ; KIVINENet al., Experimental Dermatology, vol.12, p: 53–60, 2003).
Au regard de cette découverte, les inventeurs ont eu l’idée d’orienter ce modèle de sorte à déterminer le potentiel vaccinal d’une composition en suivant la réponse de ces cellules présentatrices de l’antigène suite à l’injection de cette composition.
Les inventeurs ont finalement mis en évidence que ce nouveau modèle permet effectivement de déterminer le potentiel vaccinal d’une compositionex vivo, ce qui constitue une avancée majeure pour ce domaine technologique.
Aussi, un premier objet de l’invention concerne un procédéin vitrodestiné à déterminer le potentiel vaccinal d’une composition comprenant les étapes de :
ia) administration transcutanée de la composition à un explant de peau comprenant l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ;
ib) détermination du statut d’activation des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau; et
ii) détermination du potentiel vaccinal de la composition.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape ic) de détermination de la migration éventuelle des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) de détermination du profil d’expression de gène liés au système immunitaire, notamment des cytokines, au sein de l’explant de peau et en ce que l’étape ii) permet en outre de déterminer le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
Selon un dernier mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau et en ce que l’étape ii) permet aussi de déterminer le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
 Description des dessins
représente présente les différentes populations de cellules présentatrices de l’antigène (APC) et les marqueurs associés à chacune d’entre elles.
 Description détaillée de l’invention
Par « composition vaccinale », on entend une composition comprenant au moins un antigène (lipidique, glucidique, protéique voir peptidique) ou un acide nucléique codant pour au moins un antigène et, potentiellement, au moins un adjuvant.
Par « explant de peau », on désigne un fragment de peau qui comprend, outre l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques, une épaisseur d’au moins 5 mm d’hypoderme (de préférence entre 5 et 15 mm d’hypoderme et, préférentiellement encore, entre 5 et 10 mm d’hypoderme).
Les annexes épidermiques correspondent aux follicules pileux, aux glandes sébacées et aux glandes sudoripares. L'hypoderme est la couche de tissu qui est située immédiatement sous le derme de la peau. L’hypoderme un tissu conjonctif lâche qui est richement vascularisé et qui contient en outre du tissu adipeux et des cellules immunitaires.
Si cet explant de peau est prélevé chez un mammifère, on pourra opter pour l’humain ou le porc. Maintenant, eu égard à la destination privilégiée du procédé selon l’invention, on optera plutôt pour un explant de peau humaine.
En lien avec l’origine de l’explant de peau, celui-ci peut provenir d’une plastie provenant de n’importe quelle partie du corps, avec notamment des plasties de l’abdomen, de la poitrine, des fesses, du dos, voire, pourquoi pas, du cuir chevelu ou de tout autre partie du corps comprenant de la peau.
L’explant de peau est préparé comme décrit dans la demande internationale WO 2019/170281.
Dans le détail, cet explant de peau a été inclus, à l’exception de l’épiderme, dans une matrice liquide apte à se solidifier comme le plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin (ex. une dilution de plasma sanguin dans du tampon physiologique, notamment une dilution de plasma sanguin à au moins 10%, 20%, 30%, voire à au moins 40% (poids/poids total de la matrice)), une solution de fibrinogène, une solution de collagène, une solution de gélatine, des solutions de polymères synthétiques, des solutions de polymères naturels (ex. agarose (agarose ou agar-agar à faible/bas points de fusion), amidon, polysaccharides), et leurs mélanges. Pour plus de détail en lien avec les matrices aptes à se solidifier et les méthodes pour y placer les explants de peau, on pourra consulter le brevet Européen n° EP 2 882 290 B1. Maintenant, ces matrices et ces méthodes décrites aux paragraphes [0024] à [0042] et [0067] à [0080] du brevet Européen n° EP 2 882 290 B1.
Dans le cas d’un explant de peau de forme cylindrique, on optera ainsi plutôt pour un explant de peau présentant un diamètre compris entre 10 mm et 50 mm, de préférence entre 15 mm et 40 mm.
Avantageusement, l’explant de peau est positionné au sein d’un insert qui peut prendre des formes multiples et notamment correspondre à un insert suspendu ou à un insert sur pilotis. Maintenant, on optera de préférence pour un insert suspendu. Le fond de cet insert est constitué d’une membrane poreuse dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm et de manière plus préférée entre 9,5 et 30 mm. Pour ce qui est de la porosité de cette membrane, elle doit permettre d’empêcher à la matrice liquide de la traverser avant sa solidification. Typiquement, cette membrane poreuse présentera une porosité comprise entre 0,4 et 8 µm, de manière préférée entre 0,4 µm et 1,5 µm, avec l’intervalle allant de 0,8 µm et 1,2 µm comme intervalle de porosité préféré. En termes de matière, on pourra ainsi choisir une membrane poreuse choisie parmi les membranes en polyéthylène téréphtalate (PET), en nitrocellulose et en polycarbonate. Finalement, et à titre d’exemple de tels inserts, on pourra citer ceux fournis par les sociétésNUNC, CORNING,BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL),qui peuvent prendre la forme d’inserts avec membrane en polycarbonate, en PET ou en nitrocellulose, lesquels sont pré-emballés dans des plaques multi-puits pour plaque de culture 6, 8, 12 ou 24 puits, et dont la porosité de la membrane peut varier de 0,4 et 8µm.
Par administration transcutanée, on entend une administration d’une composition qui permet à celle-ci de pénétrer la barrière cutanée. Une telle administration transcutanée peut se faire par la voie sous-cutanée (c’est-à-dire par une injection sous-cutanée (une aiguille), par la voie transdermique (via un patch simple ou un avec microaiguilles) ou par la voie topique.
Par « administration par voie topique », on entend une application de la composition à tester sur l’épiderme de l’explant de peau sous la forme d’une crème ou d’un gel par exemple.
Par « administration sous-cutanée », on entend une injection sous-cutanée, qui est donc réalisée dans l'hypoderme de l’explant de peau à l’aide d’une aiguille, ce qui lui vaut également l’appellation d’injection « hypodermique ». Ce type d’injection, qui est bien connue de l’homme du métier, nécessite généralement de pratiquer un pli cutané à l'aide des doigts et l’injection sous-cutanée est alors réalisée dans le pli cutané.
Par « administration transdermique », on parle également de « administration transépidermique », on entend une administration qui utilise un patch intégrant ou non des microaiguilles (lesquelles microaiguilles peuvent être biodégradables).
Selon un mode de réalisation préféré, l’étape ia) consiste en une administration sous-cutanée ou transdermique d’une composition comprenant la substance dans un explant de peau.
La composition en question est une composition à tester qui est sous forme liquide. Avantageusement, le volume de cette composition est compris entre 10 µl et 1 ml, de préférence entre 10 µl et 500 µl et, de manière particulièrement préférée, entre 10 µl et 200 µl.
L’aiguille pour l’injection de la composition présente typiquement une longueur suffisante pour atteindre l’hypoderme. Ainsi, on utilisera de préférence des aiguilles présentant une longueur supérieure ou égale à 10 mm. A titre d’exemple de telles aiguilles, on pourra utiliser des aiguilles présentant une longueur de 12, 16, 20, 25, 30, 35, 40 ou encore 45 mm. Avantageusement donc, l’aiguille présente une longueur comprise entre 16 et 45 mm, de préférence une longueur allant de 20 à 40 mm. Pour ce qui est du diamètre de l’aiguille à utiliser, il peut être identifié simplement par l’homme de l’art au regard de ses connaissances générales. Typiquement, de telles aiguilles hypodermiques sont du type 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G voire 31G.
Cette étape d’injection peut être réalisée par un expérimentateur, lequel effectue un pincement de sorte de permettre la formation d’un pli cutané et ainsi de faciliter l’injection sous-cutanée. Maintenant, cette étape d’injection peut également être réalisée par un dispositif d’injection automatique. Typiquement, le dispositif permet une injection à une profondeur déterminée, par rapport à la surface de l’épiderme, de sorte d’obtenir une injection sous-cutanée.
Avantageusement, une seule étape ia) d’administration d’une composition est réalisé par explant de peau.
L’étape ib) de détermination du statut d’activation des cellules immunitaires et notamment des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau s’effectue par le suivi de l’expression de marqueurs d’activation au sein de ces cellules.
Pour se faire, on pourra utiliser les méthodes bien connues d’immunohistochimie qui utilise la fixation de l’explant de peau, l’inclusion de l’explant (par ex. paraffine, O.C.T., EPON) avant sa conservation, et enfin la réalisation de coupes histologiques sur le bloc d’inclusion. Le détail de telles méthodes est décrit par exemple dans « Immunohistochemistry: Basics and Methods » de Igor BUCHWALOW (Editions SPRINGER).
On pourra également utiliser des méthodes telles que la cytométrie en flux et les analyses transcriptomiques de type BULK et SINGLE-CELL.
Les coupes histologiques utilisables pourront présenter une épaisseur très importante allant jusqu’à 500 µm. Avantageusement, la coupe histologique présentera ainsi une épaisseur comprise entre 1 et 500 µm. Maintenant, il est possible d’utiliser des coupes présentant des dimensions plus classiques avec une épaisseur comprise entre 2 et 25µm.
Par cellules présentatrices de l’antigène, on entend une cellule exprimant les marqueurs CD45 et HLA-DR. Pour plus de détail, l’ensemble des cellules présentatrices de l’antigène est décrit à la .
Avantageusement, les cellules présentatrices de l’antigène (APC) sont choisies parmi les cellules cDC1 dermiques, les cellules cDC2 Langérine-dermiques, les cellules cDC2 Langérine+dermiques et les cellules de Langerhans (LCs). Le détail du profil de marqueurs exprimés par ces cellules est donné dans le tableau 1 ci-après.
Cellules
 marqueurs
cDC1 dermiques HLA-DR+, CD141++, CD1c-/faible, CD11cfaible, CD14-, Langérine-, CADM1+, Clec9a+, XCR1+, SIRPα-
cDC2 Langérine-dermiques HLA-DR+, CD1a+, CD11c+, CD141-, SIRPα+, Langérine-, DC-SIGN-, CD11b+, CD1c+
cDC2 Langérine+dermiques HLA-DR+, CD1a+, CD11c+, CD141-, SIRPα+, Langérine+, DC-SIGN-, CD11b+, CD1c+
cellules de Langerhans (LCs) HLA-DR+, CD1a++, Langérine+, CD11cfaible, CD1c+, granules de Birbeck+, E-Cadhérine+, DC-SIGN-, EpCAM+
Par marqueurs d’activation, on entend l’ensemble des marqueurs décrits dans le tableau 2.
Marqueurs d’activation des cellules présentatrices de l’antigène
CD40
CCR7
CD86
CD83
CD80
HLA-DR
Une cellule présentatrice de l’antigène est considérée comme activée dès lors qu’au moins 2 marqueurs d’activation sont surexprimés dans cette cellule, de préférence au moins 3 marqueurs d’activation et, de manière particulièrement préférée, au moins 5 marqueurs d’activation.
Par surexpression d’un marqueur d’activation, on entend une augmentation de son expression d’au moins 20%, de préférence une augmentation d’au moins 30% par rapport au niveau basal d’expression. Une telle augmentation est mesurée entre les cellules présentatrices de l’antigène de deux explants de peau d’un même donneur dont l’un seulement a été injecté avec la composition dont on veut déterminer le potentiel vaccinal et l’autre a été injecté avec une composition contrôle (eau pour injection ou PBS).
L’étape ic) de détermination de la migration éventuelle des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau est réalisée également par des méthodes bien connues d’immunohistochimie telles que décrites précédemment.
Pour se faire, on détermine la relocalisation ou non des cellules présentatrices de l’antigène à proximité ou non des vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques. La détermination d’une telle relocalisation peut être réalisée simplement dans la mesure où les vaisseaux sanguins et lymphatiques présentent des structures caractéristiques aisément identifiables au sein de la coupe histologique de l’explant de peau.
Par relocalisation des cellules présentatrices de l’antigène à proximité ou non des vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques, on entend une augmentation d’au moins 10% de la population de cellules présentatrices de l’antigène à proximité des vaisseaux sanguins et lymphatiques, de préférence d’au moins 20%.
L’étape ii) de détermination du potentiel vaccinal de la composition peut alors être simplement réalisée au regard du résultat des étapes ib) et, éventuellement ic).
Ainsi, il sera possible de déterminer si la composition présente un potentiel vaccinal au regard d’une augmentation de l’activation des cellules présentatrices de l’antigène.
Ainsi, une composition associée à une activation d’au plus 10 % des cellules présentatrices de l’antigène présentera un potentiel vaccinal faible, voire nul.
A l’inverse, une composition associée à une activation d’au moins 40 % des cellules présentatrices de l’antigène présentera un potentiel vaccinal élevé.
De préférence, une augmentation d’au moins 20% sur au moins deux des marqueurs d’activation (HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD40 et CCR7) est observé chez les cellules présentatrices d’antigènes dans le cas d’une composition associée à un potentiel vaccinal élevé.
Finalement, une composition associée à une activation intermédiaire des cellules présentatrices de l’antigène et ne dépassant aucun des deux précédents seuils, présentera un potentiel vaccinal, intermédiaire, voir modéré.
Ainsi, il sera également possible de préciser le potentiel vaccinal de la composition au regard d’une migration éventuelle des cellules présentatrices de l’antigène.
Ainsi, une composition associée à une relocalisation d’au plus 2 % des cellules présentatrices de l’antigène à proximité des vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques présentera un potentiel vaccinal faible, voire nul.
A l’inverse, une composition associée à une relocalisation d’au moins 10 % des cellules présentatrices de l’antigène à proximité des vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques présentera un potentiel vaccinal élevé.
Aux fins de contrôle, les même étape ia), ib), ic) pourront être réalisées avec un contrôle négatif (ex. PBS) et/ou avec une composition comprenant un contrôle positif correspondant à une composition connue pour bénéficier d’un potentiel vaccinal élevé.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) détermination du profil d’expression de gènes liés au système immunitaire au sein de l’explant de peau.
A titre d’exemples de gènes liés au système immunitaire et de façon non limitative, on peut citer les gènes suivants :
ABCB1, ABCF1, ABL1, ACKR4, ADA, ADGRE5, AHR, AICDA, AIRE, ALAS1, APP, ARG1, ARG2, ARHGDIB, ATG10, ATG12, ATG16L1, ATG5, ATG7, ATM, B2M, B3GAT1, BATF, BATF3, BAX, BCAP31, BCL10, BCL2, BCL2L11, BCL3, BCL6, BID, BLNK, BST1, BST2, BTK, BTLA, C1QA, C1QB, C1QBP, C1R, C1S, C2, C3, C4A/B, C4BPA, C5, C6, C7, C8A, C8B, C8G, C9, CAMP, CARD9, CASP1, CASP10, CASP2, CASP3, CASP8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL22, CCL23, CCL24, CCL26, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCND3, CCR1, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL2, CD14, CD160, CD163, CD164, CD19, CD1A, CD1D, CD2, CD209, CD22, CD24, CD244, CD247, CD27, CD274, CD276, CD28, CD34, CD36, CD3D, CD3E, CD3EAP, CD4, CD40, CD40LG, CD44, CD45R0, CD45RA, CD45RB, CD46, CD48, CD5, CD53, CD55, CD58, CD59, CD6, CD7, CD70, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD81, CD82, CD83, CD86, CD8A, CD8B, CD9, CD96, CD99, CDH5, CDKN1A, CEACAM1, CEACAM6, CEACAM8, CEBPB, CFB, CFD, CFH, CFI, CFP, CHUK, CIITA, CISH, CLEC4A, CLEC4E, CLEC5A, CLEC6A, CLEC7A, CLU, CMKLR1, CR1, CR2, CRADD, CSF1, CSF1R, CSF2, CSF2RB, CSF3R, CTLA4, CTLA4-TM, CTNNB1, CTSC, CTSG, CTSS, CUL9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CYBB, DEFB1, DEFB103A, DEFB103B, DEFB4A, DPP4, DUSP4, EBI3, EDNRB, EEF1G, EGR1, EGR2, ELP1, ENTPD1, EOMES, ETS1, FADD, FAS, FCAR, FCER1A, FCER1G, FCGR1A/B, FCGR2A, FCGR2A/C, FCGR2B, FCGR3A/B, FCGRT, FKBP5, FN1, FOXP3, FYN, G6PD, GAPDH, GATA3, GBP1, GBP5, GFI1, GNLY, GP1BB, GPI, GPR183, GUSB, GZMA, GZMB, GZMK, HAMP, HAVCR2, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HPRT1, HRAS, ICAM1, ICAM2, ICAM3, ICAM4, ICAM5, ICOS, ICOSLG, IDO1, IFI16, IFI35, IFIH1, IFIT2, IFITM1, IFNA1/13, IFNA2, IFNAR1, IFNAR2, IFNB1, IFNG, IFNGR1, IFNL1, IFNL2, IFNL2/3, IGF2R, IKBKB, IKBKE, IKBKG, IKZF1, IKZF2, IKZF3, IL10, IL10RA, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL13, IL13RA1, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17F, IL18, IL18R1, IL18RAP, IL19, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL1RAP, IL1RL1, IL1RL2, IL1RN, IL2, IL20, IL21, IL21R, IL22, IL22RA2, IL23A, IL23R, IL26, IL27, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL32, IL4, IL4R, IL5, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL7R, IL9, ILF3, IRAK1, IRAK2, IRAK3, IRAK4, IRF1, IRF3, IRF4, IRF5, IRF7, IRF8, IRGM, ITGA2B, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITLN1, ITLN2, JAK1, JAK2, JAK3, KCNJ2, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR_Activating_Subgroup_1, KIR_Activating_Subgroup_2, KIR_Inhibiting_Subgroup_1, KIR_Inhibiting_Subgroup_2, KIT, KLRA1P, KLRB1, KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRD1, KLRF1, KLRF2, KLRG1, KLRG2, KLRK1, LAG3, LAIR1, LAMP3, LCK, LCP2, LEF1, LGALS3, LIF, LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LITAF, LTA, LTB4R, LTB4R2, LTBR, LTF, LY96, MAF, MALT1, MAP4K1, MAP4K2, MAP4K4, MAPK1, MAPK11, MAPK14, MAPKAPK2, MARCO, MASP1, MASP2, MBL2, MBP, MCL1, MIF, MME, MR1, MRC1, MS4A1, MSR1, MUC1, MX1, MYD88, NCAM1, NCF4, NCR1, NFATC1, NFATC2, NFATC3, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIZ, NLRP3, NOD1, NOD2, NOS2, NOTCH1, NOTCH2, NT5E, OAZ1, PAX5, PDCD1, PDCD1LG2, PDCD2, PDGFB, PDGFRB, PECAM1, PIGR, PLA2G2A, PLA2G2E, PLAAT4, PLAU, PLAUR, PML, POLR1B, POLR2A, POU2F2, PPARG, PPBP, PPIA, PRDM1, PRF1, PRKCD, PSMB10, PSMB5, PSMB7, PSMB8, PSMB9, PSMC2, PSMD7, PTAFR, PTGER4, PTGS2, PTK2, PTPN2, PTPN22, PTPN6, PTPRC, PYCARD, RAF1, RAG1, RAG2, RELA, RELB, RORC, RPL19, RTRAF, RUNX1, S100A8, S100A9, S1PR1, SDHA, SELE, SELL, SELPLG, SERPING1, SH2D1A, SIGIRR, SKI, SLAMF1, SLAMF6, SLAMF7, SLC2A1, SMAD3, SMAD5, SOCS1, SOCS3, SPP1, SRC, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, STING1, SYK, TAGAP, TAL1, TAP1, TAP2, TAPBP, TBK1, TBP, TBX21, TCF4, TCF7, TFRC, TGFB1, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, THY1, TICAM1, TIGIT, TIRAP, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, TNF, TNFAIP3, TNFAIP6, TNFRSF10C, TNFRSF11A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF1B, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13B, TNFSF15, TNFSF4, TNFSF8, TOLLIP, TP53, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TUBB, TYK2, UBE2L3, VCAM1, VTN, XBP1, XCL1, XCR1, ZAP70, ZBTB16, ZEB1 et sCTLA4.
L’étape ii) de détermination du potentiel vaccinal de la composition permettra alors en lien avec cette étape id), de préciser le potentiel vaccinal de la composition.
De préférence, les gènes liés au système immunitaire sont des cytokines.
L’étape ii) de détermination du potentiel vaccinal de la composition permettra alors en lien avec cette étape id), de déterminer le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
A titre de cytokines utilisables, on peut citer les interleukines et leurs récepteurs. A titre d’exemple d’interleukines, on peut citer IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31 et IL-33, et à titre d’exemple de récepteurs d'interleukines, on peut citer IL-10RA, IL-10RB, IL-1R1, IL-5RA (CD125) et IL-9R.
A titre de cytokines utilisables, on peut également citer les chimiokines qui sont des cytokines chimiotactiques qui contrôlent les motifs de migration et le positionnement des cellules immunitaires, mais également leurs récepteurs. A titre d’exemples de cytokines, on peut citer C5, Eotaxin, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MIP-1B, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10, L8RB et CXCL3 Concernant les récepteurs de chimiokines, on peut citer CCL13 (MCP-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCR1 et CXCR2.
Il est à noter que d'autres cytokines (que les interleukines et les chimiokines) sont envisageables en tant que marqueurs de l’inflammation. A titre d’exemples de tels cytokines, on peut citer MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1.
Avantageusement, les cytokines sont choisies parmi GM-CSF,MIP-1a, MCP-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13, IL-12, IL-15, IL-16, MIP-3a, IP-10, MIP-1a, MIP-1b, MDC, IL-27, et Eotaxin-3.
Le profil d’expression des cytokines peut être déterminé au sein de l’explant de peau, du milieu de culture ou même encore au sein de la matrice.
Maintenant, les inventeurs ont mis en évidence que le profil d’expression des cytokines au sein de la matrice montrait tout à la fois une plus grande diversité et des niveaux d’expression supérieurs.
Avantageusement donc, la détermination du profil d’expression des cytokines est faite au sein de la matrice de l’explant de peau.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau.
L’étape ii) de détermination du potentiel vaccinal de la composition permettra alors en lien avec cette étape ie), de déterminer là encore le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
L’étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes peut être réalisée à l’aide de techniques bien connues de l’homme du métier. Des techniques utilisables pour cette étape incluent des techniques d’ELISA ou colorimétriques permettant de mesurer la présence de médiateurs inflammatoires contenus dans les granules des mastocytes, comme l’histamine ou la tryptase, ou secrétésde novocomme des médiateurs lipidiques ou des cytokines/chimiokines, ou encore sur des techniques de fluorescence, immunofluorescence ou fluorochromes spécifiques des granules des mastocytes.
Avantageusement, cette étape ie) est réalisée dans un délai maximum de 6 heures suivant l’étape ie) d’administration, de préférence dans un délai maximum de 4 heures.
Selon un mode de réalisation préférée, l’étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau est effectuée par une analyse de la fluorescence.
Avantageusement, cette étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes utilise l’avidine.
L’avidine est en effet une glycoprotéine qui se fixe très spécifiquement à l’héparine contenue dans les granules des mastocytes (THARPet al., J. Histochem . Cytochem ., vol.33, p :27-32, 1985). Ainsi, durant le processus de dégranulation, les granules, dès lors qu’ils sont externalisés, deviennent directement accessibles à l’avidine. Maintenant, et dans le cas d’une fixation des tissus, les granules intracellulaires sont accessibles à l’avidine dès lors que l’on opère une perméabilisation des tissus. Cette avidine peut être complexée à un fluorochrome (avidine-FITC, avidine-Alexa488, avidine-sulfurhodamine 101 ou tout autre molécule fluorescente) ou à une molécule bioluminescente. Maintenant, il est également possible d’utiliser l’avidine seule (non complexée) et en combinaison avec une molécule qui lui est complémentaire. On peut citer, à titre d’exemple d’une telle molécule de la biotine complexée à un fluorochrome, à une molécule bioluminescente ou à tout autre molécules identifiable.
Maintenant, la détermination du niveau de dégranulation des mastocytes pourra utiliser d’autres marqueurs, notamment du noyau ou de la membrane plasmique, de sorte à faciliter l’identification des granulocytes externalisés des mastocytes. Il sera aussi possible de doser dans le milieu de culture de la tryptase, de l’histamine, de la beta-hexosaminidase, de la chymase ou bien tout autres molécules préformées au sein des granules du mastocytes et relarguées lors de la dégranulation.
Typiquement, la détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau pourra être réalisée en suivant le protocole décrit dans GAUDENZIOet al.(J. Clin.Invest., vol.126, p :3981-3998, 2016)
Avantageusement, l’étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes s’effectuera sur au moins une coupe histologique réalisée à partir de l’explant de peau.
Pour se faire, on pourra utiliser les méthodes bien connues d’immunohistochimie qui utilise la fixation de l’explant de peau, l’inclusion de l’explant (par ex. paraffine, O.C.T., EPON) avant sa conservation, et enfin la réalisation de coupes histologiques sur le bloc d’inclusion. Le détail de telles méthodes est décrit par exemple dans « Immunohistochemistry: Basics and Methods » de Igor BUCHWALOW (Editions SPRINGER).
Les coupes histologiques utilisables pourront présenter une épaisseur très importante allant jusqu’à 500 µm. Avantageusement, la coupe histologique présentera ainsi une épaisseur comprise entre 1 et 500 µm. Maintenant, il est possible d’utiliser des coupes présentant des dimensions plus classiques avec une épaisseur comprise entre 2 et 25µm.
Pour ce qui est de la détermination du niveau de granulation des mastocytes au sein de l’explant à proprement parler, on détermine, pour chaque mastocyte identifié, s’il est associé à une dégranulation faible, modérée ou forte, puis la proportion (pourcentage) de mastocytes associée à chacun de ces types de dégranulation (faible, modérée et forte). Le niveau de dégranulation pourra aussi être analysé de manière automatisée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image ou bien d’un algorithme informatique ou bien de techniques d’intelligence artificielle dite de « machine-learning » ou « deep-learning ».
Dans le détail, un mastocyte présentant un faible niveau de dégranulation correspond à un mastocyte présentant de 0 à 2 granules autour de lui (ou à une cellule présentant un contour lisse) ; un mastocyte présentant un niveau de dégranulation modéré correspond à un mastocyte présentant de 3 à 6 granules autour de lui (ou à une cellule présentant un contour avec un aspect granuleux) ; et un mastocyte présentant un haut niveau de dégranulation correspond à un mastocyte présentant plus de 6 granules autour de lui (ou à une cellule présentant une forme exposée).
Ainsi, il sera possible de déterminer si la composition présente un potentiel inflammatoire au regard du pourcentage de dégranulation des mastocytes tel que déterminé l’issu de l’étape ie).
Ainsi, une composition associée à une proportion de mastocytes présentant pour plus de 50% un faible niveau de dégranulation et/ou pour moins de 10% un fort niveau de dégranulation présentera un potentiel inflammatoire faible, voire nul.
A l’inverse, une composition associée à une proportion de mastocytes présentant pour plus de 50% un fort niveau de dégranulation présentera elle un potentiel inflammatoire élevé.
Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d’illustration de l’objet de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemples
1-Préparation des explants de peau
Des explants de peau sont préparés à partir de prélèvements complets de peau issus de différents donneurs, lesquels prélèvements comprenaient l’épiderme, le derme et l’hypoderme (1,5 à 2cm). Les explants (épiderme, derme et hypoderme) ont ensuite été découpés à l’aide d’un emporte-pièce métallique pour obtenir des cylindres de 11 à 20 mm de diamètre dans lesquels l’épaisseur d’hypoderme est ajustée à la valeur voulue (0,5 à 1cm). Enfin, ces explants ont été maintenus en flottaison dans une solution saline tamponnée jusqu’à l’étape de « inclusion » dans la matrice solidifiée. Cette étape d’inclusion a été faite avec un procédé similaire à celui utilisé pour le modèleNATIVESKIN™. Brièvement, l’explant de peau est délicatement déposé sur un insert (cupuleMILLICELL TM8 puits) disposant au fond d’une membrane poreuse (en PET, porosité 1 µm) et contenant une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles en présence d’ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d’une solution de NaCl à 0,9 %, 8 % d’une solution saline de CaCl2 à 1%, un agent anti-fibrinolytique (acide tranexamique ou aprotinine), et de l’agarose fondu à bas point de fusion à 0,7% (Agarose LMP GIBCOBRL,LIFE TECHNOLOGIES) (fondu à l’étuve à 65,5 °C). L’agent anti-fibrinolytique a pour fonction d’inhiber les enzymes susceptibles de dégrader la matrice de plasma, ces enzymes étant sécrétées par l’explant de peau, et ainsi de maintenir l’intégrité de l’explant.
2-Cellules présentatrices de l’antigène et explant de peau
2.1-Identification de cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau
La présence de cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant a été analysée lors de la mise en culture et dans les jours suivant celle-ci par plusieurs techniques : immunohistochimie couplée à de l’intelligence artificielle (imagerie multiplexée), analyse transcriptomique en cellule unique et cytométrie en flux. Ainsi, l’analyse transcriptomique en cellule unique a permis de mettre en évidence la présence, dans le modèle et par rapport à la peau humaine, de proportions comparables de cellules immunitaires (exprimantPTPRC), de cellules stromales (exprimantVIM), de mélanocytes (exprimantMLANA), de kératinocytes (exprimantKRT14etKRT1) et d’adipocytes pendant une période de 10 jours. D’éventuels changements au niveau du transcriptome de toutes ces cellules ont été recherché au cours du temps. Sur les 2,000 gènes détectés lors de l’expérience seule une faible variation de seulement 55 gènes dans le compartiment immunitaire a été détecté entre jour 0 et jour 5 de culture avec un retour à la normale entre jour 5 et jour 10 de culture. Ces données indiquent que les cellules structurales et immunitaires contenues dans les modèles HYPOSKIN restent stables phénotypiquement et fonctionnellement pendant une période d’au moins 10 jours
En conclusion, les résultats ont montré que de façon inattendue les cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau présentent un nombre et une diversité similaires à ceux observés au sein de la peauin vivo.De surcroît, les résultats ont également montré que ce nombre et cette diversité des cellules présentatrices se maintient du premier au dixième jour de culture.
2.2-Mise en évidence d’une maturation des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau
Au vu du résultat précédent, les inventeurs se sont questionnés sur la capacité de maturation des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau.
Aussi, et pour tester cette capacité de maturation, plusieurs techniques ont été utilisées : immunohistochimie couplée à de l’intelligence artificielle (imagerie multiplexée), analyse transcriptomique en cellule unique et cytométrie en flux.
Là encore et de façon inattendue, les résultats ont montré qu’outre la préservation de leur nombre et de leur diversité, les cellules présentatrices de l’antigène présentent également une capacité de maturation intacte.
Dès lors, l’explant de peau peut être utilisé pour tester la capacité d’une composition antigénique à activer les cellules présentatrices de l’antigène. Dans le même temps, et comme cela a été démontré précédemment par les inventeurs, il est possible de tester le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
3-Confirmation du potentiel vaccinal de la composition INFLUVAC TETRA
125 µL d’une solution vaccinale INFLUVAC TERTR ont été injectés dans le tissu adipeux d’explants de peau provenant de 3 donneurs distincts à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 27G de 12 mm de longueur. A titre de contrôle négatif, 100 µL d’eau a été injecté dans le tissu adipeux d’explants de peau des mêmes donneurs.
Les explants ont ensuite été cultivé (incubateur à 37°C, 5% de CO2 et atmosphère saturée en eau) pendant 8h, 24h et 48h.
Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a été effectuée sur les explants de peau de chacun des donneurs avant l’injection et 48h après l’injection d’eau ou de la composition vaccinale. Dans le même temps, la présence d’une éventuelle fragmentation de l’ADN a été testé sur ces mêmes explants peau.
Les résultats n’ont montré, pour les 3 donneurs, aucune altération de l’intégrité cellulaire 48h après injection de la composition vaccinale.
Après évaluation de la stabilité et viabilité du modèle au cours de l’étude, la production de cytokines par les modèles a été étudiée. Afin d’obtenir des résultats optimaux, le dosage a été réalisé sur le milieu de culture, la matrice et le lysat des modèles injectés avec de l’eau et du vaccin à 8h de culture pour les trois donneurs de l’étude.
On observe de nombreuses valeurs de concentrations de cytokines non renseignées pour le lysat, car leur concentration se trouve sous la limite de détection de l’appareil MSD. Concernant le dosage sur le milieu de culture, il permet de mesurer la concentration de la plupart des cytokines du panel, mais en quantité nettement inférieure au dosage sur la matrice, même si les tendances de concentration sont les mêmes pour ces deux supports de dosage. En conséquence, la matrice sera utilisée pour les futures analyses de dosage de cytokines, car elle permet de détecter la plupart des cytokines en concentrations suffisantes.
Suite à l’optimisation du dosage MSD, les concentrations en 36 cytokines ont été mesurées dans la matrice des modèles de l’étude. Les modèles non injectés semblent être les moins inflammés et présentent globalement les plus faibles concentrations de cytokines. A 8h après injection, on observe une faible augmentation de la concentration en cytokines. Une nette augmentation de la production de cytokines est observée chez les 3 donneurs testés 24h après injection avec des concentrations en cytokines supérieures dans les modèles vaccinés, notamment IFN-g, TNF-a, IL-1a, IP-10, eotaxin-3, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-16, MCP-4, MIP-1a, MIP-1b, MIP-3a, IL-1b, GM-CSF, MCP-1 et TARC.
Finalement, la concentration en cytokines augmente légèrement 48h après injection, en particulier dans les modèles vaccinés. Globalement, on observe donc une réponse biologique suite à la vaccination par la production de cytokines et chimiokines liées à l’activation du système immunitaire dans les modèles au cours du temps, notamment avec un pic 24h après l’injection
En vue de déterminer la présence de cellules présentatrices de l’antigène, les explants de peau de chacun des donneurs avant l’injection, 8h, 24h et 48h après l’injection d’eau ou de la composition vaccinale ont été cryopréservés à -80°C pour l’analyse immunohistochimique, soit inclus dans la paraffine pour l’analyse de la dégranulation des mastocytes..
Des coupes cryopréservées ont alors été marquées avec différents anticorps spécifiques des cellules présentatrices de l’antigène (anti CD45, CD207, CD1c, CD40, CCR7, CD80, CD86, CD83, et HLA-DR).
L’analyse de ces coupes a montré que l’injection de la composition vaccinale entraîne l’activation des cellules présentatrices de l’antigène (APC) au sein de l’explant, de même que la migration d’un certain nombre d’entre elles. En conséquence, les résultats montrent donc que le vaccin administré est associé à la mise en place d’une immunité adaptative.
Des coupes paraffinées ont été utilisés dans le même temps pour déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes au sein du tissu dans les différentes conditions. Pour se faire, on effectue un marquage à l’aide d’avidine couplée à un fluorochrome qui permet de détecter les granules des mastocytes. La première étape permet de déparaffiner et une réhydrater les coupes fixées et imprégnées en paraffine. Les coupes sont incubées 30 minutes à température ambiante en tampon Citrate pH6, puis saturées et perméabilisées pendant 40 minutes à 37°C avec une solution de sérum de chèvre et de Triton à 0.1%. Les coupes sont ensuite incubées pendant une heure à température ambiante en chambre humide avec 5μg/mL Avidin-Sulforhodamin 101 (Avidine TEXAS RED ; MERCK). Une coloration des noyaux cellulaires est alors effectuée en incubant les coupes avec du DAPI (D9542, SIGMA) au 1/1000 pendant 3 minutes à température ambiante. Le milieu de montage est ajouté et une lamelle est déposée sur les coupes. Les lames sont ensuite analysées au microscope à fluorescence de sorte à déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes dans les différents explantes.
Les résultats de ces expériences de dégranulation sont présentés dans le tableau 3.
Pourcentage de granulocytes avec Eau Composition vaccinale
Faible niveau de
dégranulation		 15% 15%
niveau de
dégranulation intermédiaire		 30% 30%
Fort niveau de
dégranulation		 60% 60%
Potentiel inflammatoire 30% 30%
Les résultats ont permis de déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes identifiés dans les échantillons et, après intégration, d’en déduire le potentiel inflammatoire de la composition injectée. En l’espèce, les résultats montrent que le vaccin administré n’est pas associé avec un risque inflammatoire due à la dégranulation des mastocytes.
4-Confirmation du potentiel vaccinal de la composition INFLUVAC TETRA
L’analyse de la composition vaccinale INFLUVAC TETRA a permis de mettre en évidence que ce vaccin induit l’expression d’une signature cytokinique qui témoigne de l’activation du système immunitaire cutané avec notamment l’expression de GM-CSF, MIP-1a, MCP-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 8, IL-13, IL-12, IL-15, IL-16, MIP-3a, IP-10, MIP-1a, MIP-1b, MDC, IL-27, Eotaxin-3 entre 8h et 24h de culture. En utilisant la technique d’imagerie multiplexée, il a été mis en évidence que le vaccin induit l’activation des cellules dendritiques dermiques et des cellules de Langerhans via une augmentation de l’expression des marqueurs de maturation/activation CD40, CCR7, CD80, CD86, CD83, HLA-DR.

Claims (10)

  1. Un procédéin vitrodestiné à déterminer le potentiel vaccinal d’une composition comprenant les étapes de :
    ia) administration transcutanée de la composition à un explant de peau, comprenant l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ;
    ib) détermination du statut d’activation des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau ; et
    ii) détermination du potentiel vaccinal de la composition.
  2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules présentatrices de l’antigène sont choisies parmi les cellules cDC1 dermiques, les cellules cDC2 Langérine-dermiques, les cellules cDC2 Langérine+dermiques et les cellules de Langerhans.
  3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape ia) consiste en une administration sous-cutanée ou transdermique d’une composition comprenant la substance dans un explant de peau.
  4. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’une cellule présentatrice de l’antigène est considérée comme activée dès lors qu’au moins 2 marqueurs d’activation sont surexprimés dans cette cellule, lesquels marqueurs d’activation sont choisis parmi ceux décrits dans le tableau 2.
    Marqueurs d’activation des cellules présentatrices de l’antigène CD40 CCR7 CD86 CD83 CD80 HLA-DR
  5. Le procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la surexpression d’un marqueur d’activation correspond à une augmentation de son expression d’au moins 20%.
  6. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel vaccinal de la composition est réalisée au regard de la proportion de cellules présentatrices de l’antigène activées au terme de l’étape ia), avec :
    * une composition associée à une activation d’au plus 10 % des cellules présentatrices de l’antigène présentera un potentiel vaccinal faible, voire nul ;
    * une composition associée à une activation d’au moins 40 % des cellules présentatrices de l’antigène présentera un potentiel vaccinal élevé.
  7. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape ic) de détermination de la migration éventuelle des cellules présentatrices de l’antigène au sein de l’explant de peau.
  8. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape id) de détermination du profil d’expression des cytokines au sein de l’explant de peau et en ce que l’étape ii) permet en outre de déterminer le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
  9. Le procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la détermination du profil d’expression des cytokines est faite au sein de la matrice de l’explant de peau.
  10. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape ie) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau et en ce que l’étape ii) permet en outre de déterminer le potentiel inflammatoire associé à cette même composition.
FR2200690A 2022-01-27 2022-01-27 Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition Pending FR3132146A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2200690A FR3132146A1 (fr) 2022-01-27 2022-01-27 Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition
PCT/EP2023/052096 WO2023144355A1 (fr) 2022-01-27 2023-01-27 Modèle humain ex vivo destiné à l'évaluation du potentiel vaccinal d'une composition

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2200690 2022-01-27
FR2200690A FR3132146A1 (fr) 2022-01-27 2022-01-27 Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
FR3132146A1 true FR3132146A1 (fr) 2023-07-28

Family

ID=82594883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FR2200690A Pending FR3132146A1 (fr) 2022-01-27 2022-01-27 Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3132146A1 (fr)
WO (1) WO2023144355A1 (fr)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050271A2 (fr) * 2001-12-10 2003-06-19 Coletica Production in vitro de cellules dendritiques a partir de monocytes cd14+ en particulier pour la preparation de modeles tissulaires et/ou cellulaires monocouches et tridimensionnels, ainsi que l'utilisation de ces modeles
EP1688483A1 (fr) * 2003-07-22 2006-08-09 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Procede de preparation de cellules de langerhans a partir de cellules positives cd14 qui sont des cellules mononucleaires du sang humain a l'aide d'un ligand notch delta-1, gm-csf et tgf-beta
FR2887457A1 (fr) * 2005-06-23 2006-12-29 Fond Bettencourt Schueller Vaccination par ciblage transcutane
WO2007031273A2 (fr) * 2005-09-16 2007-03-22 Universität Bern Equivalents epidermiques artificiels a immunite reconstituee
FR2905380A1 (fr) * 2006-09-04 2008-03-07 Engelhard Lyon Sa Procede de production de cellules de langerhans et/ou de cellules de dentritiques interstitielles/dermiques a partir de monocytes cd14+
EP2207031A1 (fr) * 2009-05-18 2010-07-14 Abbott Biologicals B.V. Test d'adjuvant pour les préparations de vaccins
EP2882290B1 (fr) 2012-05-03 2019-08-14 Genoskin Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications
WO2019170281A1 (fr) 2018-03-05 2019-09-12 Genoskin Modele d'injection sous cutanee ex vivo
KR20210034733A (ko) * 2019-09-20 2021-03-31 주식회사 필메카 동물실험 대체를 위한 3차원 인공 조직 및 모니터링 세포의 공동배양 시스템 및 이의 제조방법
EP3940058A1 (fr) * 2020-07-16 2022-01-19 Genoskin Système microfluidique pour contrôler la perfusion, la diffusion et la collecte de molécules sur de longues périodes dans un modèle de peau ex-vivo

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3862440A (en) 1972-09-14 1975-01-21 Tokyo Shibaura Electric Co Pulse transforming circuit arrangements using a clock pulse responsive delayed inverter means

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050271A2 (fr) * 2001-12-10 2003-06-19 Coletica Production in vitro de cellules dendritiques a partir de monocytes cd14+ en particulier pour la preparation de modeles tissulaires et/ou cellulaires monocouches et tridimensionnels, ainsi que l'utilisation de ces modeles
EP1688483A1 (fr) * 2003-07-22 2006-08-09 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Procede de preparation de cellules de langerhans a partir de cellules positives cd14 qui sont des cellules mononucleaires du sang humain a l'aide d'un ligand notch delta-1, gm-csf et tgf-beta
FR2887457A1 (fr) * 2005-06-23 2006-12-29 Fond Bettencourt Schueller Vaccination par ciblage transcutane
WO2007031273A2 (fr) * 2005-09-16 2007-03-22 Universität Bern Equivalents epidermiques artificiels a immunite reconstituee
FR2905380A1 (fr) * 2006-09-04 2008-03-07 Engelhard Lyon Sa Procede de production de cellules de langerhans et/ou de cellules de dentritiques interstitielles/dermiques a partir de monocytes cd14+
EP2207031A1 (fr) * 2009-05-18 2010-07-14 Abbott Biologicals B.V. Test d'adjuvant pour les préparations de vaccins
EP2882290B1 (fr) 2012-05-03 2019-08-14 Genoskin Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications
WO2019170281A1 (fr) 2018-03-05 2019-09-12 Genoskin Modele d'injection sous cutanee ex vivo
KR20210034733A (ko) * 2019-09-20 2021-03-31 주식회사 필메카 동물실험 대체를 위한 3차원 인공 조직 및 모니터링 세포의 공동배양 시스템 및 이의 제조방법
EP3940058A1 (fr) * 2020-07-16 2022-01-19 Genoskin Système microfluidique pour contrôler la perfusion, la diffusion et la collecte de molécules sur de longues périodes dans un modèle de peau ex-vivo

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1S5 ET AL: "Derme et vieillissement Histologie fonctionnelle du derme Histologie fonctionnelle du derme Mots clés : Peau @BULLET Tissu conjonctif @BULLET Derme @BULLET Fibres de collagène @BULLET Fibres élastiques @BULLET Fibroblaste @BULLET Macrophage @BULLET Mastocyte @BULLET Acide hyaluronique @BULLET Protéo", ANN DERMATOL VENEROL, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 1 - 5, XP055887202, Retrieved from the Internet <URL:https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S0151963808702060?token=4EDDC9918EA464F9BEA81870DA0AF4A7A143CB8B96E6A0DD1985B99EB1C38F0376B1E87B9BAB9785CF51B894F6D6EDE0&originRegion=eu-west-1&originCreation=20221219201256> [retrieved on 20220203] *
GAUDENZIO ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 126, 2016, pages 3981 - 3998
KIVINEN ET AL., EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, vol. 12, 2003, pages 53 - 60
LENZ ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 92, 1993, pages 2587 - 2596
POPE ET AL., J. INVEST. DERMATOL., vol. 104, no. 1, 17 November 1995 (1995-11-17)
RATZINGER ET AL., J. IMMUNOL., vol. 168, 2002, pages 4361 - 4371
THARP ET AL., J. HISTOCHEM. CYTOCHEM., vol. 33, 1985, pages 27 - 32

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023144355A1 (fr) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Edwards et al. Adjuvant effects of a sequence-engineered mRNA vaccine: translational profiling demonstrates similar human and murine innate response
EP3443123B1 (fr) Procédés et compositions pour détecter la séquence et l&#39;affinité vis-à-vis d&#39;un récepteur unique de lymphocyte t
Czesnikiewicz-Guzik et al. T cell subset-specific susceptibility to aging
JP2023036929A (ja) 改変された免疫細胞およびその使用
Rad et al. Toll-like receptor–dependent activation of antigen-presenting cells affects adaptive immunity to Helicobacter pylori
FR2908999A1 (fr) Nouveau medicament destine a l&#39;inhibition, la prevention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoide.
US20210254097A1 (en) Engineering of immune cells for ex vivo cell therapy applications
US20200332258A1 (en) Treatment of type 1 diabetes and autoimmune diseases or disorders
WO2019238023A1 (fr) Vaccins néoantigènes et leurs utilisations
WO2019238022A1 (fr) Cellules immunitaires modifiées et leurs utilisations
Talker et al. Monocyte biology conserved across species: Functional insights from cattle
FR2847268A1 (fr) Procede d&#39;identification d&#39;une modification eventuelle d&#39;au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress
FR3132146A1 (fr) Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel vaccinal d’une composition
EP2668293A1 (fr) Procede et kit pour determiner in vitro le statut immunitaire d&#39;un individu
CN1043569A (zh) 用作病毒感染标记的RNase L抑制剂
US20210100897A1 (en) Methods for the stimulation of dendritic cell (dc) precursor population &#34;pre-dc&#34; and their uses thereof
Cavatorta et al. Ex vivo generation of mature equine monocyte-derived dendritic cells
JP2022061491A (ja) 慢性副鼻腔炎の患者を分類するためのデータの取得方法、およびその利用
WO2021064327A1 (fr) Procédé pour déterminer la capacité d&#39;un individu à répondre à un stimulus
AU2020453180A1 (en) Allogeneic tumor cell vaccine
US20090110639A1 (en) Predicting vaccine efficacy
Publicover Regulation of human graft versus host disease by innate lymphoidcells
Tsyklauri et al. Regulatory T cells suppress the formation of super-effector CD8 T cells by limiting IL-2
US20210299201A1 (en) Polyphenol blend of curcumin extract and pomegranate extract and methods of improving immune response
FR3056990A1 (fr) Marqueurs cellulaires

Legal Events

Date Code Title Description
PLFP Fee payment

Year of fee payment: 2

PLSC Publication of the preliminary search report

Effective date: 20230728

PLFP Fee payment

Year of fee payment: 3