FR2847268A1 - Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress - Google Patents

Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress Download PDF

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique.La présente invention concerne essentiellement un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, caractérisé en ce qu'il comprenant l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée :a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées,b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence,c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel,permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.L'invention comprend l'utilisation de ce procédé pour le criblage de principes actifs.

Description

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La présente invention concerne essentiellement un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, comprenant l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée : a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence, c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel, permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.
La présente invention concerne encore un procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress, ou prévenir la modification d'au moins, un paramètre biologique modifié au cours d'un stress.
La présente invention concerne encore l'utilisation d'une substance active sélectionnée par un tel procédé, pour la préparation d'au moins une composition cosmétique et/ou pharmaceutique.
La présente invention concerne encore une substance active dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie sélectionnée par un tel procédé.
ETAT DE L'ART
Le rayonnement solaire est formé de radiations électromagnétiques dont 56% d'infrarouges (longueur d'onde de 5000 à 800nm) qui génèrent de la chaleur, 39% de lumière visible (de 800 à 400nm) et 5%
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d'ultraviolets A, B, C (de 400 à 190nm), dont environ 4,9% d'UVA et 0,1% d'UVB + UVB.
- Les UVC, très nocifs, sont en général filtrés par la couche d'ozone.
- Les UVB sont partiellement arrêtés en traversant l'atmosphère et le verre. Ils atteignent l'épiderme, mais sont arrêtés avant le derme. Ils sont responsables de la formation d'un érythème solaire est caractérisé par la présence de sunburn cells, qui sont des kératinocytes qui ont entamé un processus d'apoptose du fait des lésions de l'ADN de leur noyau. Leur nombre est d'autant plus important que la dose d'UVB reçue est forte. En effet, un processus naturel de défense permet la réparation ou l'élimination des.cellules atteintes, cependant la faillite de ce système par saturation ou défaut génétique joue un rôle fondamental dans l'apparition de cancers cutanés.
- Les UVA traversent facilement l'atmosphère, été comme hiver, pénètrent le derme et l'épiderme et bien que moins nocifs que les UVB, ils sont néanmoins responsables de dommages du fait des quantités reçues. Les UVA ne produisent pas ou peu de sunburn cells et ils peuvent léser l'ADN cellulaire, mais également les lipides et les protéines cellulaires, via la formation de radicaux libres. Les UVA sont responsables d'un vieillissement cutané accéléré avec une dégradation accrue des fibres collagéniques et élastiques mais également des autres constituants de la matrice extracellulaire au sein du derme. Par ailleurs, de nombreux travaux ont montré les effets immunosuppresseurs des UVA via les cellules de Langerhans épidermiques qui après irradiation interagissent avec les lymphocytes T et ont un effet systémique par le biais des cytokines et des neuromédiateurs produits en cascade par les cellules épidermiques et les fibres nerveuses (Meunier L., Eur. J. Dermatol. 1999,9 : 269-275)
A long terme, le risque de cancer cutané est augmenté, les cellules
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précancéreuses n'étant plus reconnues comme étrangères et donc plus éliminées par le système immunitaire.
Une enquête européenne Helios (Zanetti R. et al, Br. J. Canc. 1996, 73 : 1440-1454) démontre les relations entre exposition aux UV, phénotype cutané et carcinomes et définit la notion de risque direct lié aux UV.
Parmi les autres dommages connus liés aux radiations, on peut citer ceux dus à une augmentation de la température par les infrarouges, qui induisent sur des mélanocytes la production des protéines de choc thermique ainsi que des effets similaires aux effets UVB-induits (Nakazawa et al , J Invest Dermatol 1998, 110: 972-977) ; ceux dus aux radiations proche-infrarouge affectant la viabilité cellulaire des cellules de la peau (YOO B. H. et al, J Cosmet Sci 2002,53(3) : 175-184) ; ceux dus à des expositions de lumière visible (doses répétées) qui induisent une mutagénicité (Larko 0., Lakartidningen 2002,99(18) : 2036-2040) ; ceux dus aux radiations ionisantes générant ulcérations et cancers (Lorette G., Machet L., Cancer Radiother 2001, 5(1) : 116s-120s) ou modifications du métabolisme cellulaire comme la synthèse de collagène de type I et III dans la peau (Riekki R et al, Arch Dermatol Res 2002,294(4) : 178-184) ou encore des modifications de la prolifération et de la différenciation épidermique (Sivan V. et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002, 53(2) : 385-393) mais également ceux dus aux effets cytogénétiques des microondes (Zotti-Martelli L et al, Mutat Res 2000,472(1-2) : 51-58) ou aux effets oncogéniques par inhibition de la voie des Heat Shock Proteins (HSP70 et HSP27) ou par génération de radicaux libres par des champs électromagnétiques et notamment ceux générés par les téléphones portables (French P. W et al, Différenciation 2001, 67(4-5) : 93-97 ; Di Carlo et al, J Cell Biochem 2002 ; 447-454 ; D. et al ,
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Différenciation 2002 70(2-3) : 120-129 ; Moustafa Y. M. et al, J Pharm Biomed Anal 2001,26(4) : 605-608).
Il existe également d'autres facteurs comme certains agents chimiques (peroxyde d'hydrogène, oxyde nitrique, métaux lourds...), ou biologiques (virus, bactéries...), voire des facteurs mécaniques (étirement, compression...) susceptibles d'induire un stress cellulaire.
A l'heure actuelle toutes les fonctions cellulaires, incluant la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire, contrôlées par de nombreux gènes et voies de signalisation cellulaire, sont analysées ex vivo (biopsie) ou in vitro sur des cultures cellulaires en monocouche, généralement de fibroblastes, kératinocytes ou mélanocytes issus de donneurs sains, pathologiques ou de lignées. Par ailleurs, il n'est pas toujours possible de trouver des données sur l'expression et les synthèses cellulaires en fonction d'un stress particulier, ou les résultats obtenus in vitro se révèlent parfois contradictoires à ce que l'on peut observer in vivo du fait du modèle simplifié utilisé dans l'expérimentation.
Depuis quelques années, différents modèles cellulaires tridimensionnels ont été développés principalement pour de la thérapie cellulaire, des tests de cytotoxicité et d'efficacité alternatifs à l'expérimentation animale. On peut citer des modèles d'épidermes (EP 0 789 074 Al de l'Oréal ; A. de Brugerolle de Fraissinette et al. 1999, Cell Biol. Tox. 15 : 121-135) utilisé pour la prédictivité d'irritation cutanée aiguë ou chronique mais également des modèles d'épithélia reconstruits (Schmalz G. et al., Eur. J. Oral Sci. 2000,108 : 442-448 ; Nielsen et al., Int. J. Pharm. 2000,200 : 261-270), ainsi que de peaux reconstruites ou de peau reconstruites pigmentées et/ou immunocompétentes par exemple (Régnier M. et al dans Pour la science (1999) 266 :
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Si certains de ces modèles sont aujourd'hui très largement utilisés pour les évaluations pharmaco-toxicologiques et les études d'efficacité d'ingrédients pharmaceutiques et cosmétiques, les méthodes d'analyses mises en #uvre sont essentiellement des techniques d'histologie combinées à l'analyse d'image, des analyses de synthèses métaboliques et de leur régulation par analyse électrophorétique, Western-blot Northernblot ou RT-PCR. Les techniques de protéine array (ou MAPPing) et DNA arrays , d'électrophorèse bi-dimensionelle ou de dosage combinés de cytokines (cytokine-MAP) en particulier n'ont pas été appliquées à ces modèles tri-dimensionnels cultivés dans des conditions de culture standard, en comparaison à des conditions de culture où ces modèles ont subi un stress qu'il soit de nature physique, chimique, biologique ou mécanique.
Ces technologies ont par contre été mises au point et utilisées sur des systèmes cellulaires en monocouche comme par exemple dans l'étude du rôle modulateur d'un stress ultraviolet sur des mélanocytes humains normaux ou malins (lignée cellulaire ou mélanocytes extraits de tissu tumoral) cultivés en monocouche (Valéry C., Grob J.J. and Verrando P. dans J. Invest. Dermatol. (2001) 117 : 1471-1482).
BUTS DE L'INVENTION
L'invention a pour but principal de résoudre de manière inattendue le problème technique qui consiste à fournir un modèle d'étude du métabolisme cellulaire, reflétant la situation observée in vivo, lorsque les cellules ont subi un stress.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique qui consiste à fournir un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, comprenant
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l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée : a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence, c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel, permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.
Cette protéomique ou transcriptomique ou génomique permet de définir des cibles d'action afin de reverser ou prévenir la modification d'au moins un paramètre modifié au cours du stress appliqué.
La présente invention a encore pour but de fournir une solution qui permette l'utilisation des modèles tissulaires tridimensionnels décrits précédemment dans le but d'évaluer l'effet sur le profil génomique ou protéique d'un principe actif, en particulier cosmétique ou pharmaceutique.
La présente invention a encore pour but de fournir une solution qui permette l'utilisation des modèles tissulaires tridimensionnels décrits précédemment dans le but d'évaluer l'effet sur le profil génomique ou transcriptomique ou protéique d'une formulation, en particulier cosmétique ou pharmaceutique contenant un tel principe actif.
La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'un procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de reverser ou prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress.
La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une substance active
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sélectionnée par un tel procédé et son utilisation pour la préparation d'une composition cométique ou pharmaceutique.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques énoncés ci-dessus.
Dans le cadre de cette invention, les inventeurs entendent par étude génomique : le fait de dresser l'inventaire et d'effectuer l'étude d'au moins une partie de l'ensemble des gènes d'un organisme pour étudier leur fonction.
Les inventeurs entendent par étude transcriptomique : le fait de dresser l'inventaire et d'effectuer l'étude d'au moins une partie de l'ensemble des ARN transcrits à partir du génome.
Les inventeurs entendent par étude protéomique : le fait de dresser l'inventaire et d'effectuer l'étude d'au moins une partie des protéines exprimées.
L'invention consiste principalement en la fourniture d'un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, caractérisé en ce qu'il comprend l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée : a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence, c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel,
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permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.
Les cellules dites de références sont des cellules qui n'ont pas subi le stress étudié. Il sera aisément compris par l'homme de l'art que pour optimiser l'invention décrite, les cellules de références sont des cellules exposées le moins possible à quelque stress que ce soit. Ces cellules seront notamment soit des cellules prélevées sur des biopsies protégées c'est à dire peu exposées au rayonnement solaire (sein, abdomen, etc...), soit des cellules non exposées à quelque stress que ce soit (stress physico-chimique, biologique ou mécanique).
Les cellules dites stressées sont alors des cellules issues de biopsies prélevées dans des zones exposées au soleil (main, visage, etc...), soit des cellules exposées à un stress (stress physique chimique ou biologique), dont les stress UVA, UVB, lumière solaire, infra-rouge, proche infra-rouge, thermique, champ magnétique, rayonnement hertziens dont micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, tels que ceux subis au cours d'une exposition accidentelle ou non à de tels rayonnements, etc...). Les cellules peuvent être issues de plusieurs biopsies, d'un même donneur ou de donneurs différents.
Le paramètre biologique correspond de manière générale à toute modification de l'expression d'un gène, à toute modification de la sécrétion d'une protéine, ou à toute modification qui pourrait être constatée dans le métabolisme d'une cellule de référence.
Le modèle tissulaire est défini comme étant un modèle tissulaire dit également modèle tridimensionnel, pouvant être ensemencé par des cellules vivantes, notamment dans le but de reconstituer un tissu d'un être vivant, en particulier le modèle tissulaire est défini comme pouvant être un modèle de matrice conjonctive, appelé derme dans la cas de la peau et
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appelé chorion dans le cas d'une muqueuse, contenant principalement des cellules stromales, un modèle d'épithélium constitué principalement de cellules épithéliales, un modèle d'épiderme constitué principalement de kératinocytes, un modèle de peau constitué d'un épiderme et d'un derme, un modèle de muqueuse constitué d'un épithélium et d'un chorion, un modèle de biopsies (ou explants) maintenu en survie, ainsi que les modèles en monocouche ou en suspension mettant en #uvre les cellules présentes dans les modèles décrits ci-dessus.
On peut utiliser dans ces modèles, des cellules normales, saines ou pathologiques, ou des cellules issues de lignées ; ces cellules peuvent être d'origine humaine ou animale.
Selon une variante de cette dernière caractéristique, le modèle de culture tridimensionnel de matrices conjonctives (derme ou chorion), comprend un support ensemencé par des cellules stromales pour former des dermes reconstruits ou des chorions reconstruits.
Le modèle de culture tridimensionnel d'épiderme ou d'épithélium comprend un support ensemencé ou non au préalable par des cellules stroma les, en particulier des fibroblastes, puis par des cellules épithéliales et en particulier des kératinocytes afin d'obtenir des épithélia ou épidermes reconstruits.
Le modèle de culture tridimensionnel de peau ou de muqueuse reconstruite comprend un support matriciel (dermique ou de chorion) ensemencé par des cellules épithéliales pour obtenir une muqueuse reconstruite ou des kératinocytes pour obtenir une peau reconstruite.
Selon une variante, le modèle de culture tridimensionnel utilisé comprend un modèle dans lequel a été incorporé au moins un type cellulaire complémentaire, par exemple des cellules endothéliales (CE) et/ou des lymphocytes et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées.
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Selon une variante, le support tridimensionnel peut également permettre la colonisation par tout autre type cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales, neurones, cellules musculaires, hépatocytes, etc...).
Avantageusement, on peut introduire en plus au niveau de la partie épithéliale : des cellules pigmentaires, des cellules immunocompétentes (cellules de Langerhans et/ou cellules dendritiques), des cellules nerveuses...
Les différents types cellulaires (fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes...) extraits sont amplifiés séparément et peuvent être utilisés séparément ou en pool de plusieurs donneurs pour la reconstruction des modèles tridimensionnels ainsi que pour les cultures en monocouches ou en suspension.
Les modèles tissulaires définis précédemment sont utilisés au terme de la culture pour réaliser des analyses génomiques et protéomiques, qui permettent en particulier la sélection, l'identification et la caractérisation de cibles potentielles pour lutter contre les effets d'un stress.
Les cibles potentielles correspondent aux paramètres biologiques, à reverser ou dont la modification est à prévenir.
Après définition des cibles, ces mêmes modèles et méthodes de détection peuvent être utilisés pour le criblage de principes actifs cosmétiques ou pharmaceutiques. Ces mêmes modèles et méthodes de détection peuvent être utilisés pour la démonstration d'efficacité de formulations cosmétiques ou pharmaceutiques contenant ou non les actifs.
Ces modèles et méthodes de détection peuvent également être utilisés pour la mise en évidence de toxicité d'actifs, cosmétiques ou pharmaceutiques, ou de formulations cosmétiques ou pharmaceutique, cette toxicité étant induite par un stress, en particulier par phototoxicité.
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Parmi les techniques analytiques utilisées, on peut citer en particulier : - pour les analyses du profil du protéome : électrophorèse bidimensionnelle, et/ou matrice différentielle de protéine (Protein arrays) et/ou matrice différentielle de cytokine (cytokine array), et/ou dosages Elisa combinés, - pour les analyses du profil génomique : matrice différentielle d'ADN (DNA Arrays), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (PCR-multiplex), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (PCR en temps réel), - les analyses du profil transcriptomique : matrice différentielle d'ARN (RNA Arrays), matrice différentielle d'ADNc (cDNA Arrays) et/ou Réverse Transcription de Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (RTPCR-Multiplex) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne (RT-PCR) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (RT-PCR en temps réel).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION:
Selon un premier aspect, invention concerne un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique comprenant l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée : a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence, c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel,
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permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.
Notamment, l'invention concerne un procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, comprenant: a) L'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, ensemencées dans un modèle tissulaire ; b) La comparaison de l'analyse effectuée au a) avec l'analyse protéomique et/ou génomique, partielle ou complète, de cellules vivantes non soumises audit stress, dites cellules de références ; et c) L'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite audit stress.
Avantageusement, les cellules de références et les cellules stressées sont utilisées dans un modèle tissulaire tridimensionnel.
Avantageusement, ledit paramètre biologique, modifié au cours d'un stress, est défini par au moins une différence entre le métabolisme des cellules dites stressées et le métabolisme des cellules dites de référence.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'étape a) précitée comprend les étapes suivantes : al) ensemencement de un ou plusieurs type de cellules dites de référence dans un modèle cellulaire c'est-à-dire en monocouche ou en suspension, et/ou tissulaire c'est à dire tridimensionnel ; a2) exposition de ce modèle à un stress, lesdites cellules étant alors dénommées cellules stressées.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'étape a) comprend les étapes suivantes : al) exposition de un ou plusieurs type de cellules vivantes à un stress, les cellules étant alors appelées cellules stressées :
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a2) utilisation de ces cellules stressées, dans un modèle cellulaire c'est- à-dire en monocouche ou en suspension, et/ou tissulaire c'est à dire tridimensionnel ;
Avantageusement, le stress est un stress physique, ce stress étant choisi parmi les stress UVA, UVB, lumière solaire, infra-rouge, proche infra-rouge, thermique, champ magnétique, rayonnement hertzien dont micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, tels que ceux subis au cours d'une exposition accidentelle ou non à de tels rayonnements, et/ou un stress physicochimique, et/ou biologique, et/ou mécanique.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules stressées sont soit : # des cellules issues de biopsies prélevées dans des zones exposées au soleil, l'homme de l'art saura apprécier de la zone à prélever, qui sera par exemple la main, le visage.
# des cellules stressées par un stress physique, ce stress étant choisi parmi les stress UVA, UVB, lumière solaire, infra-rouge, proche infra- rouge, thermique, champ magnétique, rayonnement hertziens dont micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, , tels que ceux subis au cours d'une exposition accidentelle ou non à de tels rayonnements, et/ou un stress physico-chimique, et/ou biologique, et/ou mécanique.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules de référence sont soit des cellules prélevées sur des biopsies peu stressées au rayonnement solaire tel que le sein, l'abdomen, le prépuce, soit des cellules non stressées par un stress tel qu'un stress physique de type rayonnement UVA et/ou UVB ou solaire, et/ou rayonnement d'un champ magnétique, et/ou stress chimique, et/ou biologique et/ou mécanique.
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Avantageusement, lesdites cellules stressées sont des cellules d'au moins un être humain ou d'au moins un animal.
Avantageusement, ladite étude comprend au moins une analyse choisie parmi les méthodes d'analyses suivantes : - pour les analyses du profil du protéome : électrophorèse bidimensionnelle, et/ou matrice différentielle de protéine (Protein arrays) et/ou matrice différentielle de cytokine (cytokine array), et/ou dosages Elisa combinés, - pour les analyses du profil génomique : matrice différentielle d'ADN (DNA Arrays), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (PCR-multiplex), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (PCR en temps réel), - les analyses du profil transcriptomique : matrice différentielle d'ARN (RNA Arrays), matrice différentielle d'ADNc (cDNA arrays) et/ou Réverse Transcription de Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (RTPCR-Multiplex) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne (RT-PCR) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (RT-PCR en temps réel).
Avantageusement, ledit modèle tissulaire est cultivé et/ou conservé dans des conditions maintenant, au moins partiellement, un métabolisme cellulaire.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire comprend au moins des fibroblastes ou des kératinocytes.
Avantageusement, ledit modèle comprend : des cellules normales, saines ou pathologiques, ou des cellules issues de lignées, de préférence ces cellules sont d'origine humaine ou animale.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire est choisi parmi les modèles suivant :
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un modèle de matrice conjonctive, appelé derme dans la cas de la peau et appelé chorion dans le cas d'une muqueuse, contenant principalement des cellules stromales, un modèle d'épithélium constitué principalement des cellules épithéliales, un modèle d'épiderme constitué principalement de kératinocytes, un modèle de peau constitué d'un épiderme et d'un derme, d'un modèle de muqueuse constitué d'un épithélium et d'un chorion.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire de matrice conjonctive (derme ou de chorion) comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique
Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, une membrane ou un film d'acide polyglycolique.
Dans ce groupe on trouve par exemple les modèles dermiques Skin 2
TM modèle ZK1100 et Dermagraft et Transcyte# (Advanced Tissue
Sciences) ; - un plastique traité culture cellulaire (formation d'un feuillet dermique :
Michel M. et al dans In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35 :
318-326) ; - un gel ou une membrane à base d'acide hyaluronique (Hyalograft 3D - Fidia Advanced Biopolymers) et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine ; dans ce groupe on trouve par exemple modèle dermique Vitrix (Organogenesis) ;
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- une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane (EP0296078A1 du CNRS, WO
01/911821 et WO 01/92322 de Coletica) ; dans ce groupe on trouve par exemple modèle dermique Mimederm (Coletica), ces supports matriciels comprenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire d'épiderme ou d'épithélium comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique
Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable ; dans ce groupe on trouve les modèles Epiderme et
Epithelia reconstruits (Skinethic) ainsi que les modèles EpiDerm, EpiAirway, EpiOccular# (Mattek Corporation) ; - un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine. Dans ce groupe on peut citer particulèrement les modèles : Mimetop (Coletica), Laserskin (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin (L'Oréal).
Ces modèles sont ensemencés au préalable par des cellules stromales, en particulier des fibroblasts, puis par des cellules épithéliales et en particulier des kératinocytes.
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Avantageusement, au niveau de la partie épithéliale, on introduit en plus des cellules épithéliales, des cellules pigmentaires, des cellules immunocompétentes, des cellules nerveuses, de préférence les cellules immunocompétentes sont des cellules de Langerhans.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire de peau ou de muqueuse reconstruite comprenant un support matriciel dermique ou de chorion de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique
Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un gel à base de collagène et/ou acide hyaluronique et/ou fibronectine, et/ou de fibrine comprenant des cellules stromales en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses intégrant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un derme désépidermisé ou derme mort, humain ou animal.
Dans ce groupe, on peut citer particulièrement les modèles Mimeskin (Coletica), Apligraf# (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems# Biotechnologie Vertrieb) ainsi que Skin 2TM (ZK1200-1300-2000 Advanced Tissue Science).
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Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également faire l'objet de telles études. On peut citer les modèles Epidex TM (Modex Thérapeutiques), Epibase# (Laboratoire Genévrier), EpicellTM (Genzyme), AutodermTM et TransdermTM (Innogenetics).
Le support matriciel est ensuite ensemencé par des cellules épithéliales pour obtenir une muqueuse reconstruite ou des kératinocytes pour obtenir une peau reconstruite.
Avantageusement, ledit modèle tissulaire utilisé comprend un modèle dans lequel a été incorporé au moins un type cellulaire complémentaire, de préférence des cellules endothéliales (CE) et/ou des cellules immunitaires telles que lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées.
Selon un second aspect, invention concerne l'utilisation d'un procédé tel que défini précédemment pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress tel que défini précédemment.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un procédé pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress tel que défini précédemment.
Avantageusement, la présente invention concerne un procédé pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement active capable de prévenir ou reverser la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress tel que défini précédemment, comprenant :
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A/ la mise en contact de ladite substance potentiellement active avec des cellules de référence telles que définies précédemment, ensemencées dans un modèle tissulaire tel que défini précédemment, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir ; application d'un stress tel que défini précédemment ; B/ analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète pour la réalisation de l'étude de l'action de ladite substance sur le métabolisme cellulaire desdites cellules ; C/ la comparaison du métabolisme cellulaire desdites cellules en présence de la substance potentiellement active avec le métabolisme desdites cellules sans la présence de ladite substance, dites cellules témoins, et ; D/ l'identification de la présence ou l'absence d'activité de ladite substance potentiellement active, notamment comprend l'identification d'un effet positif ou négatif de ladite substance pour prévenir la modification du paramètre biologique.
Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress comprenant : a) la culture de cellules soumises à un stress, dites cellules stressées de préférence telles que définies précédemment, ayant un paramètre biologique modifié, en présence d'au moins une substance éventuellement active, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir éventuellement sur le métabolisme cellulaire desdites cellules, lesdites cellules stressées étant ensemencées dans un modèle tissulaire tel que défini précédemment ;
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b) l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie précédemment, des cellules stressées cultivées à l'étape a) ; c) La comparaison de l'analyse effectuée au b) avec l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie précédemment, de cellules vivantes cultivées sans la présence de ladite substance potentiellement active, dites cellules témoins ; d) Suite à la comparaison des analyses effectuées au c), l'identification éventuelle d'au moins une substance active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié par le stress.
Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress comprenant : a) la mise en contact de ladite substance potentiellement active avec des cellules de référence telles que définies précédemment, ensemencées dans un modèle tissulaire tel que défini précédemment, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir ; application d'un stress tel que défini précédemment ; b) l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie précédemment, des cellules stressées cultivées à l'étape a) ; c) La comparaison de l'analyse effectuée au b) avec l'analyse protéomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie à la revendication 10, de cellules vivantes cultivées sans la présence de ladite substance potentiellement active, dites cellules témoins ;
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d) Suite à la comparaison des analyses effectuées au c), l'identitication éventuelle d'au moins une substance active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié par le stress.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une substance active sélectionnée par un procédé tel que défini précédemment, pour la préparation d'au moins une composition cosmétique et/ou pharmaceutique.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une substance active dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie sélectionnée par un procédé défini précédemment.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une substance active capable de reverser un paramètre biologique qui est identifié comme étant modifié au cours d'un stress physique, chimique ou biologique, et/ou d'en prévenir la modification, ce paramètre ayant été identifié par réalisation d'études comparées réalisées entre des modèles cellulaires mettant en #uvre des cellules dites stressées et des modèles cellulaires mettant en #uvre des cellules dites de référence , l'un au moins de ces modèles étant un modèle tissulaire comprenant au moins soit des fibroblastes, soit des kératinocytes.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative, qui va suivre, faite en référence aux exemples donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention, et toute caractéristique, qui apparaît être nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque est revendiquée comme partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, la température est donnée en
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degré Celsius, la pression est la pression atmosphérique, sauf indications contraires.
EXEMPLE 1 Extraction et culture de cellules dites stressées ou de cellules dites de référence Les cellules dites de référence sont soit : # des cellules extraites de biopsies de donneurs d'âges variables non stressées au soleil, obtenues à partir de chirurgie plastique de préférence abdominale ou mammaire ou éventuellement gingivale ou vaginale.
Les cellules dites stressées sont soit : # des cellules extraites de biopsies de donneurs d'âge variable, obtenues de chirurgie plastique de zones stressées au soleil (visage, cou, main).
Les types cellulaires obtenus peuvent être des fibroblastes extraits par la technique des explants ou par digestion enzymatique, par exemple à la collagénase, des kératinocytes ou des mélanocytes extraits après dissociation dermo-épidermique enzymatique en particulier avec la dispase ou la thermolysine ou la trypsine-EDTA...
Après extraction, les fibroblastes sont amplifiés en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) /Ham F12 glutamax 50/50 volume/volume, supplémenté de 10% de sérum de veau, de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre. Les fibroblastes sont amplifiés par trypsination dès l'obtention d'une confluence de 90%.
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Après extraction, les kératinocytes sont amplities en milieu K-SFM (Keratinocyte Sérum Free Medium - Invitrogen) contenant de l'extrait de glande pituitaire bovine supplémenté de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre. Les kératinocytes sont amplifiés par trypsination dès l'obtention d'une confluence de 90%.
Après extraction, les mélanocytes sont amplifiés en milieu MMK2 (Melanocyte Medium Kit - Sigma) supplémenté de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre et de généticine à raison de 100microgrammes/millilitre pendant 3 jours afin d'éliminer les kératinocytes résiduels. La culture est ensuite poursuivie dans le même milieu excepté la généticine. Les mélanocytes sont amplifiés par trypsination dès l'obtention d'une confluence de 90%.
EXEMPLE 2 Préparation de dermes reconstruits à partir de cellules dites stressées ou de cellules dites de référence
500 000 fibroblastes issus d'un pool de trois biopsies de référence (biopsie mammaire) et d'un pool de trois biopsies stressées (lifting) amplifiés tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencés dans des substrats dermiques composés de collagène réticulé au diphénylphosphorylazide, dans un milieu DMEM-glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou facteur de croissance épidermique à une concentration finale de 10 nanogramme/millilitre, de
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pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre pour une période de 21 jours.
EXEMPLE 3 Quantification de cytokines dans des dermes reconstruits ensemencés au Préalable de cellules dites stressées ou de cellules dites de référence , le stress étant une irradiation aux UVA.
500 000 fibroblastes issus d'une biopsie de référence (biopsie mammaire) amplifiés tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencés dans des substrats dermiques composés de collagène réticulé au diphénylphosphorylazide, dans un milieu DMEM-glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau, d'acide ascorbique-2-phophate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou facteur de croissance épidermique à une concentration finale de 10 nanogramme/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, de gentamicine à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre pour une période de 15 jours. Ils sont ensuite cultivés pendant une semaine supplémentaire en milieu sans sérum (FBM, Fibroblast Basal Medium - Promocell).
En fin d'expérimentation, les dermes reconstruits sont rincés en tampon phosphate (PBS) pH 7,4 puis placés dans des petites boites de pétri contenant 1ml de PBS à pH 7,4. Certains échantillons sont conservés à température ambiante (dermes reconstruits dits de référence) et
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d'autres sont irradiés en UVA (365nm) à des doses croissantes (0-5-10-15- 20-25-30J/cm2).
Les dermes reconstruits comprenant les cellules dites stressées ou des cellules de référence sont ensuite incubés dans un milieu sans sérum (FBM, Promocell) pendant 24 heures. La viabilité cellulaire dans les matrices est évaluée par un test au MTT (methylthiazoletetrazolium) et exprimé en pourcentage du témoin non irradié. Les milieux sont collectés, centrifugés et le contenu en cytokines est dosé par le kit Fluorokine MAP (R&D Systems). Brièvement 50 l de standards ou d'échantillons sont pipetés dans des puits identifiés. 50 l de microparticules immobilisant des anticorps spécifiques de différentes cytokines sont rajoutés dans les puits en fonction d'un plan de plaque préalablement défini. Après une heure d'incubation sous agitation orbitale, et élimination des substances non fixées par lavage, des anticorps marqués spécifiques des différentes cytokines sont ajoutés dans les puits et incubés 2 heures sous agitation orbitale. Après lavage, les microparticules sont suspendues dans du tampon de lavage, agitées pendant lmn sous agitation orbitale. La lecture est réalisée immédiatement sur un Luminex 100 Analyser (R&D Systems).
Les teneurs en différentes cytokines présentes dans les milieux analysés sont déterminés grâce aux gammes d'étalonnage réalisées avec des cytokines humaines recombinantes hautement purifiées. Cette technique permet en une expérimentation d'analyser la sécrétion cellulaire de différentes cytokines (IL-lp, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF, G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF, IFNy).
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Tableau 1
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<tb>
<tb> Cytokine <SEP> (pg/ml) <SEP> Cellules <SEP> Cellules <SEP> stressées
<tb> Non <SEP> stressées <SEP> par <SEP> les <SEP> UVA <SEP> : <SEP> 20J/cm2
<tb> MTT <SEP> 100% <SEP> 72% <SEP>
<tb> IL1 <SEP> beta <SEP> (pg/ml) <SEP> 2410 <SEP> 5619
<tb> IL6 <SEP> (pg/ml) <SEP> 570142 <SEP> 1210342
<tb> IL8 <SEP> (pg/ml) <SEP> 12217 <SEP> 17323
<tb> TNF <SEP> alpha <SEP> (pg/ml) <SEP> 18~6 <SEP> 11042
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici une irradiation UVA), induit une diminution de la viabilité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la synthèse d'interleukines pro-inflammatoires : il pourrait donc être intéressant de diminuer ces augmentations de synthèse en utilisant des principes actifs sélectionnés correctement.
EXEMPLE 4 Quantification de cytokines dans des épidermes reconstruits comprenant des cellules dites stressées ou des cellules dites de référence . pour l'identification de modulations éventuelles des cvtokines, le stress étant par exemple une exposition à des rayonnements UVB
4.106 kératinocytes de référence, ici non exposés aux UVB (biopsie mammaire) et amplifiés tel que décrit dans l'exemple 1 jusqu'au passage 1 (première amplification par trypsination) sont ensemencés dans des inserts type chambre de Boyden (membrane de porosité 0,4 m et diamètre 25mm) préalablement ensemencés par une sous couche nourricière de fibroblastes, dans un milieu de culture DMEM-Glutamax /
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Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou facteur de croissance épidermique à une concentration finale de 10 ng/mL, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre,d' isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10"9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 3 à 8 jours.
Les cultures de kératinocytes sont ensuite placées à l'interface airliquide pendant 12 à 18 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline.
6 échantillons ne subissent aucun traitement en fin de culture (modèle comprenant les cellules de référence = contrôle) Différents stress peuvent être réalisés sur un ensemble de 6 épidermes reconstruits. Pour chaque type de stress, différents protocoles choisis parmi la liste suivante peuvent être utilisés par exemple : Stress chimique : Pendant 10 minutes à une heure, différents agents sont appliqués sur les épidermes reconstruits puis éliminés par rinçage en PBS, pH 7,4 comme par exemple : sulfate de lauryle de sodium (SLS) 2%, trétinoine 0,05%, péroxyde d'hydrogène (3 à 300 M), oxyde nitreux (NO) (MAHMA nonoate 0,1 à 1 M), hypoxie par saturation en C02 ou par fumée de cigarette.
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Stress biologique : Pendant une heure, différents agents sont appliqué sur les épidermes reconstruits puis éliminés par rinçage en PBS, pH 7,4 comme par exemple : TGFss (5-10ng/ml), TNFa (50-100-200UI/ml), IL1 (5-10ng/ml), LPS (lipopolysaccharide 5-10ng/ml).
Stress mécanique : les épidermes reconstruits sont coupés ou comprimés pendant 1 heure.
Stress thermique : les épidermes reconstruits sont placés pendant une heure à 37 C, 40 C et 43 C.
Champ magnétique : les épidermes reconstruits sont placés pendant une heure sous un champs magnétique par exemple de 835MHz/0,6W et 1800MHz/0,125W (radiofréquence des téléphones portables).
Micro-ondes : les épidermes reconstruits sont soumis à des micro-ondes : fréquences 2,45 et 7,7 GHz et puissance 30mW/cm2 .
Radiations ionisantes : les épidermes reconstruits sont soumis à des doses de 0,2 à lOmGy de Rayons X.
Stress UV : UVA (0-60J/cm2), UVB (0-100mJ/cm2), lumière solaire (0- 3500kJ/m2)
Dans cette expérimentation, nous avons choisi de réaliser une irradiation de type UVB. Pour cela, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du PBS pH 7,4 et certains épidermes reconstruits présents dans les inserts sont irradiés à des doses croissantes d'UVB (312nm) de 0 à 100 mJ/cm2. D'autres sont conservés dans les mêmes conditions sans irradiation (épidermes dits de référence non stressé). Les épidermes reconstruits ainsi traités sont ensuite incubés pendant 24 heures supplémentaires en milieu d'émersion. Le dosage des cytokines est réalisé par Florokine MAP tel que décrit dans l'exemple 3. La viabilité cellulaire est évaluée par dosage de protéines (bicinchoninic acid kit for protein détermination - Sigma St Louis USA) ou par un autre test de viabilité
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cellulaire permettant le dosage de l'activité enzymatique phosphatase alcaline (incubation pendant 2 heures à 37 C dans une solution contenant 5 mM de p-nitrophényl phosphate, 0,1 M d'acétate de sodium, 0,1% de Triton X100 pH5 puis neutralisation par 10% NaOH 1N et lecture de l'absorbance à 405nm).
Les résultats sont exprimés en pourcentage du témoin non irradié dans le tableau suivant :
Tableau II
Figure img00290001
<tb>
<tb> Cytokine <SEP> (pg/ml) <SEP> Cellules <SEP> Cellules <SEP> stressées
<tb> Non <SEP> stressées <SEP> par <SEP> les <SEP> UVB <SEP> : <SEP> 21 <SEP> mJ/cm2
<tb> BCA <SEP> 100% <SEP> 58% <SEP>
<tb> IL1 <SEP> beta <SEP> (pg/ml) <SEP> 25~8 <SEP> 13739
<tb> IL6 <SEP> (pg/ml) <SEP> 12030 <SEP> 70229
<tb> IL8 <SEP> (pg/ml) <SEP> 35257 <SEP> 47372
<tb> TNF <SEP> alpha <SEP> (pg/ml) <SEP> 1711 <SEP> 125~42
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici une irradiation UVB), induit une diminution importante de la viabilité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la synthèse d'interleukines proinflammatoires : il pourrait donc être intéressant de diminuer ces augmentations de synthèse et de limiter la mortalité cellulaire en utilisant des principes actifs sélectionnés correctement.
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EXEMPLE 5 Préparation d'épithélia de muqueuse gingivale reconstruits comprenant des cellules dites stressées ou des cellules dites de référence , pour quantification des ARNm de cytokines, chemokines et facteurs d'immunomodulation.
1 à 2.106 cellules épithéliales de muqueuse gingivale dites de références (Biopsie gingivale, Passage 3 (3ème amplification par trypsination)) extraites tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencées dans des inserts type chambre de Boyden (membrane de porosité 0,4 m et diamètre 10mm - sous couche nourricière de fibroblaste), dans un milieu de culture DMEM-Glutamax / Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF à une concentration finale de 10 ng/mL, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre, d'isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10-9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 3 à 8 jours.
Les cultures de cellules épithéliales sont ensuite maintenues en immersion pendant 12 à 18 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le pourcentage de sérum de veau qui est abaissé de 10% jusqu'à 1%.
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En fin d'expérimentation, le milieu est éliminé et remplacé par du PBS pH 7,4, et les épithelia reconstruits présents dans les inserts sont stressés par différents agents potentiellement irritants ou sensibilisant à raison de 20 l par épithelium et pendant une heure : Sodium Lauryle Sulfate 5% (SLS), Lipopolysaccharide (LPS) 1000U/ml, un agent antiinflammatoire Prednisolone lOmM (Sigma) et un actif Inhipase# 3% (extrait de racine de pueraria lobata, Coletica) également à raison de 20 l par épithélium pendant 1 heure. Les agents appliqués sur les épithelia reconstruits sont ensuite éliminés puis les épithelia reconstruits sont incubés pendant 24 heures supplémentaires en milieu d'immersion sans sérum de veau. Certains épithelia reconstruits sont analysés en terme de viabilité cellulaire par un test au MTT (methylthiazoletetrazolium). D'autres épithélia reconstruits sont grattés et repris dans du Tri Reagent# (T9424 Sigma, St Louis USA) puis extraits par du chloroforme. Après centrifugation à 12000g pendant 15 minutes à 4 C, les ARNs se trouvent dans la phase supérieure.
Le dosage des ARNm des épithelia est réalisé par Expression Array (R&D System), selon le protocole défini par le fournisseur. Les résultats sont exprimés en facteur de variation par rapport au témoin non stressé : [(résultats cellules stressées/résultats cellules non stressées) x 100].
Tableau III
Figure img00310001
<tb>
<tb> Marqueurs <SEP> Stress <SEP> au <SEP> SLS <SEP> Stress <SEP> aux <SEP> LPS <SEP> Effet <SEP> de <SEP> la <SEP> Effet <SEP> de
<tb> Prednisolone <SEP> Inhipase
<tb> PLA2 <SEP> 102 <SEP> 168 <SEP> 93 <SEP> 50 <SEP>
<tb> IL1[alpha] <SEP> 241 <SEP> 131 <SEP> 62 <SEP> 52
<tb> IL1ss <SEP> 114 <SEP> 182 <SEP> 75 <SEP> 69
<tb>
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Figure img00320001
<tb>
<tb> IL-lra <SEP> 82 <SEP> 75 <SEP> 112 <SEP> 98
<tb> IL-1R <SEP> AcP <SEP> 102 <SEP> 124 <SEP> 95 <SEP> 119 <SEP>
<tb> IL-1RI <SEP> 154 <SEP> 254 <SEP> 83 <SEP> 107
<tb> IL-1RII <SEP> 137 <SEP> 262 <SEP> 88 <SEP> 102
<tb> TNF[alpha] <SEP> 213 <SEP> 134 <SEP> 67 <SEP> 72
<tb> IL6 <SEP> 163 <SEP> 342 <SEP> 81 <SEP> 135 <SEP>
<tb> IL7 <SEP> 127 <SEP> 201 <SEP> 102 <SEP> 109
<tb> ILS <SEP> 183 <SEP> 287 <SEP> 105 <SEP> 92
<tb> IL10 <SEP> 75 <SEP> 72 <SEP> 152 <SEP> 148 <SEP>
<tb> III <SEP> 112 <SEP> 125 <SEP> 101 <SEP> 108
<tb> IL12 <SEP> 132 <SEP> 178 <SEP> 67 <SEP> 66 <SEP>
<tb> IL15 <SEP> 147 <SEP> 189 <SEP> 99 <SEP> 108
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici application d'un agent de type irritant ou sensibilisant), induit une modification de différents marqueurs de l'inflammation. L'efficacité d'un principe actif Inhipase# est démontrée en comparaison avec un antiinflammatoire de référence.
EXEMPLE 6 Préparation d'un modèle tissulaire de peau reconstruite et étude d'un stress thermique sur les synthèses d'ARNm et comparaison entre des donneurs jeunes et âgés.
Les cellules extraites sont obtenues à partir d'une biopsie mammaire photoprotégée.
400 000 fibroblastes dits jeunes (pool de trois donneurs de moins de 35 ans) et âgés (pool de trois donneurs de plus de 55 ans) sont extraits et amplifiés jusqu'au passage 5 (Sème amplification par
<Desc/Clms Page number 33>
trypsination) tel que décrit dans l'exemple 1 puis sont ensemencés sur les deux faces de substrats dermiques surfacés.
Brièvement, les substrats dermiques sont préparés selon le protocole suivant : -Séchage à 25 C d'un gel de collagène à 0,75% pour former un film -Dépôt du film de collagène sur un gel de collagène à 0,75% -Lyophilisation pendant 24h et réticulation au DPPA (diphénylphosphorylazide 50 l/g de collagène en solvant diméthylformamide puis tampon borate pH 8,9) -Après rinçage à l'eau déminéralisée, les substrats dermiques surfacés sont de nouveau lyophilisés.
Le milieu utilisé pour la culture des fibroblastes est un milieu DMEM-Glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou Facteur de croissance épidermique à une concentration finale de 10 ng/mL, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre. L'obtention de dermes reconstruits nécessite une période de culture de 14 jours.
Puis 400 000 kératinocytes dits jeunes (pool de trois donneurs de moins de 35 ans) et âgés (pool de trois donneurs de plus de 55 ans) extraits et amplifiés jusqu'au passage 2 (2eme amplification par trypsination) tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencés sur les équivalents dermiques surfacés, du côté film, dans un milieu de culture
DMEM-Glutamax / Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF à une concentration finale de
<Desc/Clms Page number 34>
10 ng/mL, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre, d'isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10-9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 7 jours.
Les cultures sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 14 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline.
En fin d'expérimentation, le milieu est éliminé et remplacé par du PBS à pH 7,4, et les peaux reconstruites présentes dans les inserts sont incubées pendant une heure à 37 C (modèle comprenant les cellules de référence) et une heure à 43 C (modèle comprenant les cellules stressées). Les épidermes reconstruits ainsi traités sont ensuite incubés pendant 24 heures supplémentaires en milieu d'émersion. Les échantillons comprenant les cellules stressés et les cellules de référence au choc thermique sont analysées par matrice différentielle d'ADNc (cDNA array).
- Brièvement, les ARNs des échantillons sont extraits (éventuellement après broyage dans l'azote liquide à l'aide d'un Biopulverizer) et purifiés selon le protocole du fournisseur de Tri Reagent# (Sigma), pour élimination totale de l'ADN.
- Les ARNs purifiés sont analysés qualitativement et quantitativement.
<Desc/Clms Page number 35>
- L'étape suivante a été la purification des pools d'ARN messagers (ARNm) par hybridation des extrémités poly(A) des ARNm à des amorces oligo(dT) biotinylées et capture sélective sur billes de streptavidine, selon le protocole Atlas Pure (Clontech). Les sondes ADN multiple marquées au 33P ont été réalisées par réverse transcription des ARNm liés sur billes de poly(dT), à l'aide d'un pool de primers spécifiques des séquences immobilisées sur les arrays , en présence de [a33P]-dATP. Les sondes marquées ont été purifiées par chromatographie sur colonne d'exclusion, la qualité et l'équivalence des sondes marquées ont été évaluées par comptage en scintillation liquide.
- Les membranes Custom ATLAS ont été pré-traitées puis les ADNc immobilisés sur chaque membrane ont été hybridés (68 C une nuit) avec les sondes marquées correspondantes ; les filtres ont ensuite été lavés avant analyse.
- Analyse par autoradiographie et quantification de la radioactivité des spots à l'aide d'un Phosphorimager Cyclone (Packard instrument ; 3h puis 72h d'acquisition) et du logiciel QuantArray, Packard.
- Identification des gènes d'intérêt variant entre les différentes conditions expérimentales : donneurs jeunes versus donneurs âgés ayant ou non subi un stress thermique. Les résultats sont exprimés en pourcentage de variation entre le modèle âgé et jeune, en condition non stressée et stressée.
<Desc/Clms Page number 36>
Tableau IV
Figure img00360001
<tb>
<tb> Marqueurs <SEP> Agé <SEP> /Jeune <SEP> Agé/Jeune
<tb> non <SEP> stressé <SEP> stressé
<tb> Phospholipase <SEP> A2, <SEP> protéine <SEP> kinase <SEP> C <SEP> inhibiteur <SEP> 101 <SEP> 136
<tb> protéine <SEP> 1, <SEP> facteur <SEP> d'activation <SEP> d'exoenzyme <SEP> S
<tb> (FAS)
<tb> Antigène <SEP> de <SEP> la <SEP> pemphigoide <SEP> bulleuse <SEP> 1 <SEP> 232 <SEP> 187
<tb> Protéine <SEP> du <SEP> protéoglycanne <SEP> spécifique <SEP> du <SEP> 53 <SEP> 82
<tb> cartilage
<tb> COLLAI <SEP> Nd <SEP> 142
<tb> COL1A2 <SEP> Nd <SEP> 124
<tb> COL3A1 <SEP> 46 <SEP> 85
<tb> COL6A1 <SEP> 64 <SEP> 62
<tb> COL6A3 <SEP> 62 <SEP> 51
<tb> Précurseur <SEP> de <SEP> la <SEP> fibronectine <SEP> 57 <SEP> 43
<tb> Hyaluronanne <SEP> synthase <SEP> 189 <SEP> 154
<tb> Involucrine <SEP> 260 <SEP> 159
<tb> MMP1 <SEP> 68 <SEP> 125
<tb> MMP11 <SEP> 63 <SEP> 92
<tb> MMP16 <SEP> 135 <SEP> 195
<tb> TIMP1 <SEP> 74 <SEP> 86
<tb> TIMP3 <SEP> 173 <SEP> 152
<tb> SPARC <SEP> 50 <SEP> 51
<tb> Précurseur <SEP> du <SEP> facteur <SEP> de <SEP> croissance <SEP> du <SEP> tissu <SEP> 56 <SEP> 45
<tb> Récepteur <SEP> type <SEP> B <SEP> de <SEP> l'endotheline <SEP> 51 <SEP> 47
<tb> Facteur <SEP> qlial <SEP> de <SEP> croissance <SEP> des <SEP> neurites <SEP> 53 <SEP> 69
<tb> Protéine <SEP> chémotactique <SEP> de <SEP> type <SEP> 2 <SEP> des <SEP> 562 <SEP> 489
<tb> Facteur <SEP> d'inhibition <SEP> de <SEP> croissance, <SEP> 161 <SEP> 142
<tb> Précurseur <SEP> IL-1 <SEP> alpha <SEP> 162 <SEP> 398
<tb> IL-1R1 <SEP> 54 <SEP> 64
<tb> IL-1R2 <SEP> 512 <SEP> 242
<tb> IL-1RA <SEP> 156 <SEP> 168
<tb> IL-3 <SEP> 75 <SEP> 52
<tb> IL-6 <SEP> 84 <SEP> 121
<tb> IL-8 <SEP> 737 <SEP> 917
<tb> IL-12B <SEP> 81 <SEP> 91
<tb> KGF <SEP> 50 <SEP> 42
<tb> Calgranuline <SEP> B, <SEP> MIF <SEP> 14, <SEP> S100 <SEP> calcium <SEP> protéine <SEP> A9 <SEP> 1981 <SEP> 1402
<tb> MIF <SEP> 8, <SEP> calgranulin <SEP> A, <SEP> S100 <SEP> calcium <SEP> protéine <SEP> A8, <SEP> 4593 <SEP> 2567
<tb> Antigène <SEP> de <SEP> la <SEP> fibrose <SEP> cystique
<tb> Protéine <SEP> chémotactique <SEP> de <SEP> type <SEP> 1 <SEP> des <SEP> 289 <SEP> 425
<tb> monocytes, <SEP> facteur <SEP> d'activation <SEP> chémotactique <SEP> et
<tb> d'activation <SEP> des <SEP> monocytes, <SEP> cytokine <SEP> A2 <SEP> SI
<tb> Facteur <SEP> de <SEP> croissance <SEP> placentaire <SEP> 1 <SEP> et <SEP> 2 <SEP> 388 <SEP> 142
<tb> PDGF <SEP> A <SEP> 397 <SEP> 152
<tb> Sous <SEP> unité <SEP> alpha <SEP> du <SEP> récepteur <SEP> au <SEP> PDGF <SEP> 50 <SEP> 89
<tb> Précurseur <SEP> de <SEP> la <SEP> pleiotrophine, <SEP> HBF <SEP> 49 <SEP> 58
<tb> Protéine <SEP> précoce <SEP> TGF <SEP> beta <SEP> induite <SEP> 48 <SEP> 102
<tb> Prostaglandine <SEP> G/H <SEP> synthase <SEP> 1 <SEP> 113 <SEP> 158
<tb> Prostaglandine <SEP> G/H <SEP> synthase <SEP> 2 <SEP> 68 <SEP> 125
<tb>
<Desc/Clms Page number 37>
Figure img00370001
<tb>
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> choc <SEP> thermique <SEP> 47 <SEP> kDa, <SEP> protéine <SEP> 1 <SEP> 84 <SEP> 289
<tb> de <SEP> liaison <SEP> au <SEP> collagène
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> choc <SEP> thermique <SEP> 70 <SEP> kDa <SEP> 131 <SEP> 587
<tb> Protéine <SEP> de <SEP> choc <SEP> thermique <SEP> 90 <SEP> kDa <SEP> 107 <SEP> 412
<tb> Bax <SEP> 104 <SEP> 158
<tb> bcl2 <SEP> nd <SEP> Nd
<tb> Liqand <SEP> antigénique <SEP> de <SEP> FAS <SEP> (FASL) <SEP> nd <SEP> 289
<tb> Récepteur <SEP> du <SEP> ligand <SEP> antigénique <SEP> de <SEP> FAS <SEP> nd <SEP> 452
<tb> Ligand <SEP> TNF-RAI <SEP> RAIL <SEP> ligand <SEP> apo2 <SEP> nd <SEP> 197
<tb> Précurseur <SEP> de <SEP> la <SEP> ténacine <SEP> hexabrachion, <SEP> 64 <SEP> 75
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici choc thermique), induit d'une part la modification de nombreux marqueurs et d'autre part une réponse différente au stress en fonction de l'âge des donneurs. Ce modèle permet donc de définir des cibles d'action afin de prévenir ou réverser l'effet d'un choc thermique. Par ailleurs, ce modèle permet de définir une stratégie de mise au point de principes actifs différente en fonction de la tranche d'âge visée.
EXEMPLE 7 Préparation d'un modèle tissulaire de peau reconstruite pluricellulaire contenant des cellules de Langerhans, des cellules dendritiques interstitielles, des macrophages et des cellules endothéliales, étude d'un stress biologique, qui est une agression bactérienne au lipopolysaccharide bactérien # Génération des cellules dendritiques indifférenciées et immatures capables de s'orienter préférentiellement dans la voie de différenciation des cellules de Langerhans :
Le sang circulant périphérique a été récolté par prise de sang veineux sur un ou plusieurs donneurs humains, dans des vacutainers
<Desc/Clms Page number 38>
supplémentés en produits anti-coagulants habituels tel que le lithiumhéparine.
La séparation des monocytes (CD14+) à partir de ce sang circulant peut-être réalisée avantageusement selon le protocole décrit par Geissmann et al. dans J. EXP. MED. Vol 187, No 6, 16 mars 1998, pages 961-966 publié par The Rockefeller University Press de la manière suivante : - après centrifugation sur un gradient Ficoll (sodiumdiatrizoate/ polysucchrose densité 1,077 ; Abcys 1053980), les cellules mononuclées du sang circulant sont récupérées et marquées indirectement avec un cocktail d'anticorps (principalement anti-CD3, antiCD7, anti-CD19, anti-CD45RA, anti-CD56, anti-IgE) couplés à des billes magnétiques.
- après passage sur une colonne aimantée, seuls les monocytes non marqués magnétiquement sont élués.
Les monocytes CD14+ sont récupérés dans l'éluat en procédant par tout procédé physique de séparation bien connu de l'homme de l'art et notamment par sédimentation ou centrifugation et sont élues tels quels pour les cultures ultérieures.
Les monocytes CD14+, sont ensuite mis en culture, à raison d'environ 1 million par millilitre, dans un milieu de culture RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal décomplémenté et contenant initialement deux cytokines, à savoir la cytokine GM-CSF à raison de 400 UI/mL et la cytokine TGFpl à raison de 10 ng/mL.
On réalise la culture à 37 C dans une atmosphère humide contenant 5% de C02.
Le milieu de culture est supplémenté initialement d'une troisième cytokine, à savoir la cytokine IL-13 à raison de 10 ng/mL. Avant au plus 2
<Desc/Clms Page number 39>
jours de culture, on rajoute le même milieu de culture mais ne contenant pas l'IL-13 jusqu'au 6ème jour de culture. Au 6ème jour, on génère des cellules dendritiques indifférenciées et immatures capables de s'orienter préférentiellement dans la voie de différenciation en cellules de Langerhans : - environ 60 à 80% des cellules dendritiques générées in vitro expriment la Langerine au niveau intracellulaire, et CCR6 qui est le récepteur spécifique de MIP-3a, - les cellules dendritiques générées in vitro sont fortement chimioattractées par MIP-3a, ce qui démontre la fonctionnalité du récepteur CCR6, - les cellules dendritiques générées in vitro sont immatures car elles n'expriment pas les marqueurs de maturité CD83, DC-LAMP et CCR7.
# Le modèle tissulaire est ensuite réalisé selon le protocole :
2.105 fibroblastes extraits de biopsie abdominale dite cellules de référence sont amplifiés, tels qu'il est décrit dans l'exemple 1, puis sont ensemencés sur des substrats dermiques à base de collagèneglycosaminoglycanne-chitosane, dans un milieu de culture DMEM-
Glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou Facteur de croissance épidermique à une concentration finale de
10 ng/mL, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture de 21 jours. La culture est poursuivie une semaine supplémentaire dans le milieu décrit précédemment excepté l'EGF.
<Desc/Clms Page number 40>
Puis 2.105 kératinocytes extraits de biopsie abdominale, comprenant les cellules dites de référence et amplifiés jusqu' au passage 1 (lère amplification ) tels que décrits dans l'exemple 1, et 1 à 3.105 cellules dendritiques indifférenciées générées in vitro, sont ensemencées sur les équivalents dermiques dans un milieu de culture DMEM-Glutamax / Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF à une concentration finale de 10 ng/mL, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre, d'isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10-9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 7 jours.
Les cultures sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 20 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline.
Dans ces conditions, les cellules de Langerhans sont localisées dans l'épiderme, les cellules dendritiques interstitielles, les macrophages et les cellules endothéliales dans le derme.
Le lipopolysaccharide bactérien (LPS) est ajouté ou non au milieu d'émersion à raison lOng/mi pendant 6 et 24 heures.
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En fin d'expérimentation, les peaux reconstruites immunocompétentes sont analysées par matrice différentielle d'ADNc (cDNA array) tel qu'il est décrit dans l'exemple 6. Les milieux de culture collectés et congelés sont ensuite analysés par Florokine MAP tel qu'il est décrit dans l'exemple 3. Les résultats sont présentés particulièrement pour la partie régulation précoce par interleukine 1 et TNFa en pg/ml et en pourcentage pour la synthèse de cytokines ([(résultats cellules stressées/résultats cellules non stressées) x 100 ]) pour les DNAarray.
Tableau V
Figure img00410001
<tb>
<tb> Fluorokine <SEP> MAP <SEP> Absence <SEP> de <SEP> Stressé/référence <SEP> Stressé/référence
<tb> stress <SEP> 6h <SEP> 24h
<tb> IL1 <SEP> beta <SEP> (pg/ml) <SEP> 7617 <SEP> 12528 <SEP> 20759
<tb> TNF <SEP> alpha <SEP> (pg/ml) <SEP> 5321 <SEP> 8719 <SEP> 9522
<tb> cDNA <SEP> array
<tb> Interleukine-1 <SEP> alpha <SEP> (IL-1 <SEP> alpha <SEP> ; <SEP> IL1A); <SEP> 100 <SEP> 138
<tb> hématopoiétine-1
<tb> Interleukine-1 <SEP> beta <SEP> (IL-1 <SEP> ; <SEP> IL1B); <SEP> 117 <SEP> 198
<tb> cataboline
<tb> Enzyme <SEP> de <SEP> conversion <SEP> de <SEP> l'interleukine-1 <SEP> 100 <SEP> 125
<tb> beta <SEP> (IL1BCE)
<tb> Interleukin-1 <SEP> receptor <SEP> antagonist <SEP> protein <SEP> 72 <SEP> 335
<tb> (IL-1RA; <SEP> IRAP)
<tb> Récepteur <SEP> interleukine-1 <SEP> type <SEP> I <SEP> (IL-1R1); <SEP> 119 <SEP> 164
<tb> IL-lR-alpha; <SEP> p80; <SEP> antigène <SEP> CDW121A
<tb> Récepteur <SEP> interleukine-1 <SEP> type <SEP> II <SEP> (IL-1R2); <SEP> 100 <SEP> 103
<tb> IL-lR-beta
<tb> Kinase <SEP> associée <SEP> au <SEP> récepteur <SEP> interleukine- <SEP> 73 <SEP> 152
<tb> 1 <SEP> (IRAK)
<tb> TNF-alpha <SEP> (TNFA), <SEP> cachectine <SEP> 152 <SEP> 287
<tb> TNFA-protéine <SEP> induite <SEP> 1, <SEP> endothéliale <SEP> ; <SEP> 123 <SEP> 100
<tb> protéine <SEP> B12
<tb> Récepteur <SEP> TNF <SEP> (TNFR) <SEP> + <SEP> Récepteur <SEP> TNF <SEP> 2 <SEP> 83 <SEP> 119
<tb> (TNFR2); <SEP> protéine <SEP> de <SEP> liaison <SEP> 2 <SEP> au <SEP> TNF
<tb> (TBP2)
<tb> Récepteur <SEP> TNF <SEP> 1 <SEP> (TNFR1); <SEP> protéine <SEP> de <SEP> 108 <SEP> 176
<tb> liaison <SEP> 1 <SEP> au <SEP> TNF <SEP> (TBP1); <SEP> antigène <SEP> CD120A
<tb> Protéine <SEP> 6 <SEP> TNF <SEP> inductible <SEP> (TSG-6); <SEP> 100 <SEP> 129
<tb> protéine <SEP> de <SEP> liaison <SEP> au <SEP> hyaluronate
<tb>
<Desc/Clms Page number 42>
Figure img00420001
<tb>
<tb> Enzyme <SEP> de <SEP> conversion <SEP> du <SEP> TNF-alpha <SEP> 74 <SEP> 124
<tb> (TACE) <SEP> ; <SEP> a <SEP> disintégrine <SEP> & <SEP> métalloprotéinase
<tb> domaine <SEP> 17 <SEP> (ADAM17)
<tb> Ligand <SEP> TNF-RAI <SEP> (TRAIL) <SEP> ; <SEP> ligand <SEP> APO-2 <SEP> 96 <SEP> 98
<tb> (APO2L)
<tb> Précurseur <SEP> CD1a <SEP> 82 <SEP> 52
<tb> Précurseur <SEP> antigénique <SEP> CD86 <SEP> 56 <SEP> 39
<tb> Précurseur <SEP> antigénique <SEP> CD40 <SEP> 89 <SEP> 45
<tb>
Ces résultats démontrent une activation plus ou moins rapide des gènes codant pour la régulation de la réponse inflammatoire par l'interleukine 1 et le TNF alpha. La diminution observée dans le cas des marqueurs CD1a, CD40 et CD86 n'est pas due à un phénomène de régulation génique mais à une disparition des cellules dendritiques initialement présentes dans les modèles tridimensionnels sous l'effet du stress par le lipopolysaccharide, suite à leur migration dans le milieu de culture présent sous l'insert.
Les méthodes de l'invention permettent également de réaliser une sélection de principes actifs susceptibles de prévenir ou moduler les différentes modifications observées suite au stress généré.
EXEMPLE 8 Préparation de peaux reconstruites pigmentées exposées à un stress défini par une irradiation solaire répétée, et étude de l'efficacité de principes actifs anti-oxvdants Les cellules extraites sont obtenues à partir d'une biopsie mammaire non exposée au stress étudié. 400 000 fibroblastes amplifiés jusqu'au passage 5 (Sème amplification par trypsination) tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencés sur des substrats dermiques à base d'éponges de collagène surfacées, dans un milieu de culture DMEM-Glutamax supplémenté avec
10% de sérum de veau hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une
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concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF ou Facteur de croissance épidermique à une concentration finale de 10 ng/mL, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture de 14 jours.
Puis 400 000 kératinocytes et 10 000 mélanocytes amplifiés jusqu'au passage 2 (2ème amplification par trypsination) tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencés sur les équivalents dermiques dans un milieu de culture DMEM-Glutamax / Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF à une concentration finale de 10 ng/mL, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre, d'isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10-9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100 UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 7 jours.
Les cultures sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 14 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline.
Deux fois par semaine et pendant 2 semaines, le milieu d'émersion est éliminé et remplacé par du PBS à pH 7,4. Certaines peaux reconstruites pigmentées présentes dans les inserts sont conservées à
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température ambiante ; ce modèle comprend les cellules dites de référence. D'autres peaux reconstruites pigmentées présentes dans les inserts sont irradiées à 561KJ/m2 (correspondant à une heure moyenne d'exposition Europe centrale) à l'aide d'un irradiateur solaire Suntest CPS+ (ATLAS) ; ce modèle comprend les cellules dites stressées. En dehors des périodes d'irradiation, les peaux reconstruites sont cultivées à 37 C sous 5% de C02 en milieu d'émersion.
8 l d'une formulation cosmétique contenant ou non un actif anti-oxydant à 3%, par exemple Flavagrum (Hesperitine Laurate, Coletica), Flavenger# (Quercitine Caprylate, Coletica), sont appliqués sur les peaux reconstruites pigmentées pendant 10 jours.
En fin de traitement, les peaux reconstruites pigmentées sont immergées pendant 24 heures supplémentaires en milieu d'émersion puis l'efficacité du traitement antioxydant est évaluée par analyse de : - la viabilité cellulaire (test au MTT - methylthiazoletetrazolium) dans les peaux reconstruites pigmentées comprenant les cellules stressées ou les cellules de référence . Les résultats sont exprimés en pourcentage de variation par rapport au témoin non irradié.
- la sécrétion d'interleukine quantifiée par kit Fluorokine MAP dans le milieu de culture collecté tel que décrit dans l'exemple 3. Les résultats sont exprimés en picogramme/ml.
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Tableau VI
Figure img00450001
<tb>
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> Cellules <SEP> Irradiation <SEP> + <SEP> Irradiation <SEP> +
<tb> stressées <SEP> stressées <SEP> Flavagrum <SEP> Flavenger
<tb> (Irradiation)
<tb> MTT <SEP> 100 <SEP> 76% <SEP> 88% <SEP> 92%
<tb> IL1 <SEP> beta <SEP> (pg/ml) <SEP> 76 <SEP> 179 <SEP> 125 <SEP> 97
<tb> IL6 <SEP> (pg/ml) <SEP> 379 <SEP> 649 <SEP> 452 <SEP> 426
<tb> IL8 <SEP> (pg/ml) <SEP> 275 <SEP> 395 <SEP> 312 <SEP> 294
<tb> TNF <SEP> alpha <SEP> (pg/ml) <SEP> 53 <SEP> 152 <SEP> 105 <SEP> 89
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici une irradiation solaire), induit une diminution de la viabilité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la synthèse d'interleukines pro-inflammatoires : il est donc être intéressant de limiter la synthèse de molécules proinflammatoires et la mortalité cellulaire en utilisant des principes actifs sélectionnés correctement. Parmi les principes actifs criblés, deux d'entre eux Flavagrum# et Flavenger ont démontré une efficacité capable de tendre à la restauration du niveau de référence pour ces deux paramètres.
EXEMPLE 9 Etude d'un stress physique défini par une irradiation aux UVB, sur une peau reconstruite et étude d'efficacité d'un principe actif, l'analyse étant effectuée par RT-PCR en temps réel.
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Des peaux reconstruites sont réalisées selon le protocole décrit dans l'exemple 6.
L'irradiation UVB à raison de 50 mJ/cm2 est réalisée pour la moitié des échantillons comprenant les cellules stressées . Les autres échantillons sont conservés à température ambiante dans les mêmes conditions, et constituent les échantillons comprenant les cellules de référence . Les échantillons sont ensuite incubés pendant 24 heures supplémentaires en présence ou non d'actif (1 et 3% de Flavenger# c'est-à-dire de la quercitine acylée, Coletica, France).
En fin d'expérimentation, la teneur en ARNm de tropoélastine, collagène de type 1 et collagène de type III est évaluée par une technique de RT-PCR en temps réel. Pour cela, des couples d'amorces (primers) permettant l'amplification de fragments spécifiques de tropoélastine, de collagène de type 1 et de collagène de type III (sens 18/antisens 19 et sens 18/antisens 20 respectivement) et des amorces de séquence d'actine (541 paires de bases) ont été utilisés. Après extraction en TriReagent (Sigma) et purification des ARNs selon le protocole du fournisseur, les réactions de RT-PCR (Reverse Polymerase Transcription Chain Reactions) sont réalisées par RT-PCR quantitative en temps réel à l'aide du système Opticon (MJ Research).
COLL1 sens CAGAGGGAAGCCGCAAGA COLL1 antisens CTGGCCGCCATACTCGAAC COLL3 sens AAGGAGAGCCCGGACCAC COLL3 antisens GGACCTCCAGGGACGCCATC ELASTINE sens CCTTCCCCGCAGTTACCTTTC ELASTINE antisens GCACGCCACCTGGGTATACAC ACTINE sens GTGGGGCGCCCCAGGCACCA ACTINE antisens CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
<Desc/Clms Page number 47>
Le mélange réactionnel (50 l) introduit dans les puits est le suivant, pour chaque échantillon : - 10 l d'ARN à la concentration de 5ng/ l.
- Les amorces des différents marqueurs utilisés - Mélange réactionnel (Qiagen - 25 l 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix contenant 5mM MgCI2 + 0,5 l QuantiTect RT mix), le marqueur SYBR Green I s'intercalant dans l'ADN double brin au cours de l'étape d'élongation).
Les conditions de RT-PCR sont les suivantes : - Reverse transcription : 30 min à 50 C, - Réactions de PCR : sec à 94 C, 30 sec à 60 C et 30 sec à 72 C], 50 cycles.
L'absence de contamination et la pureté des produits amplifiés sont vérifiées via les courbes de fusion des produits de PCR amplifiés. Les produits présentant un double pic ou une température de fusion anormale sont éliminés.
Analyse et Méthode de calcul : L'incorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié a été évaluée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système permet d'obtenir des courbes de mesure de la fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR et ainsi d'évaluer une quantité relative d'ADN amplifié.
Afin de tenir compte de la population cellulaire présente dans les peaux reconstruites, tous les résultats ont été rapportés au signal actine , utilisé comme gène domestique (Housekeeping gene).
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Selon l'expérimentation , le seuil de mesure du C (T) (=cycle threshold) est fixé pour T compris entre 0,05 et 0,01 puis une unité arbitraire de mesure est calculée pour chaque gène selon la formule : Sgène x = 107 x (1/2)c(T)gène X C (T)gène x signifiant seuil de mesure du C(T) (Cycle Threshold) du gène x .
Les valeurs des gènes d'intérêt sont rapportées au signal actine par calcul du rapport : R = Sgène x / Sactine.
Ces rapports sont comparés entre les échantillons traités et non traités.
Tableau VII
Figure img00480001
<tb>
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> Cellules <SEP> Irradiées <SEP> + <SEP> Irradiées <SEP> +
<tb> stressées <SEP> stressées <SEP> Flavenger <SEP> 1% <SEP> Flavenger# <SEP> 3%
<tb> (Irradiées)
<tb> Collagène <SEP> I <SEP> 0,86 <SEP> 1,08 <SEP> 0,94 <SEP> 0,92
<tb> Collagène <SEP> III <SEP> 1,20 <SEP> 1,47 <SEP> 1,37 <SEP> 1,26
<tb> Elastine <SEP> 4,20 <SEP> 5,2 <SEP> 4,87 <SEP> 4,61
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici une irradiation UVB), induit une augmentation rapide des ARN codant pour la synthèse de molécules de la matrice extracellulaire telles que le collagène de type I, de type III et l'élastine. L'application d'un principe actif Flavenger permet de limiter les effets du stress UVB induit en restaurant de façon dose dépendante la synthèse de ces molécules.
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EXEMPLE 10 Etude d'un stress physique défini par une irradiation solaire sur dermes reconstruits et criblage de principes actifs, l'analyse étant effectuée par RT-PCR Multiplex en temps réel.
Les dermes reconstruits sont réalisés tels que décrit dans l'exemple 3 pendant 3 semaines.
Certains dermes reconstruits sont conservés à température ambiante ; ce modèle comprend les cellules dites de référence. D'autres dermes reconstruits sont irradiés à 561KJ/m2 (correspondant à une heure moyenne d'exposition Europe centrale) à l'aide d'un irradiateur solaire Suntest CPS+ (ATLAS) ; ce modèle comprend les cellules dites stressées.
Les dermes reconstruits sont irradiés en présence ou non d'actif (3%) puis incubés pendant 24 heures.
Les ARN sont finalement extraits tel que décrit dans l'exemple 5.
L'expression des gènes du TGF latent et du collagène de type 1 (COL1) est analysée simultanément par RT-PCR Multiplex en temps réel après sélection rigoureuse des amorces (rendement, spécificité et compatibilité multiplex) et optimisation de l'expérimentation de RT-PCR en temps réel (concentrations des composants, paramètres des cycles, conditions de détection en fluorescence).
Les sondes d'hydrolyse d'actine (20 à 30 mer) sont marquées à l'extrémité 5' par le reporter fluorescent JOE (Excitation 520-Emission 548) et en 3' par le quencher TAMRA (Applied Biosystems - Foster City, CA).
Les sondes d'hydrolyse des gènes à analyser (20 à 30 mer) sont marquées à l'extrémité 5' par le reporter fluorescent FAM (Excitation 495-Emission 520) et en 3' par le quencher TAMRA (Excitation 555-Emission 576 Applied Biosystem).
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TGF latent sens AGCGGGAGGAGGGACGAG TGF latent antisens TGAGGGACGCCGTGTAGG COL1 sens CAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTA COL1 antisens CTTGTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA Les conditions de RT-PCR sont les suivantes : kit Superscript one step RT-PCR with platinum Taq (Invitrogen) ABI PRISM# 7000 Séquence Détection System (Applied Biosystems) Mélange réactionnel : 10 l ARN à la concentration de 5ng/pl 25 l 2x reaction mix 2,5 l primers sens et antisens 10 M 1,8 l MgS04 50mM 2 l dNTP 5mM lui de la sonde d'hydrolyse de chaque couple de gène (actine/TGFI et actine/collagène I) 10 M lui RT/Taq mix eau qsp 50 l
Protocole de RT-PCR
RT 48 C 30mn
Dénaturation de la RT et activation de la polymérase 95 C 5mn
50 CYCLES DE : 94 c 15 sec - 60 C 30 sec - 72 C 30 sec
L'analyse des résultats (calcul du rapport R = Sgène x / Sactine) est pratiquée tel que décrit dans l'exemple 10. L'effet des actifs est analysé en terme de potentialisation de l'activation du TGF latent induit par irradiation solaire par les actifs ainsi qu'en terme d'effet direct et/ou d'effet rebond (via TGF-pl actif libéré) sur le collagène de type I. Les résultats de
<Desc/Clms Page number 51>
quelques actifs intéressants (Extrait de blé, Soft Roe, Coletica) sont présentés en pourcentage de variation par rapport au témoin non irradié et non traité par actif.
Tableau VIII
Figure img00510001
<tb>
<tb> TGF <SEP> Latent <SEP> COL <SEP> 1
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> stressées <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Cellules <SEP> stressées <SEP> (irradiées) <SEP> 124 <SEP> 107
<tb>
Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress (ici une irradiation UV), induit une augmentation de la synthèse de TGF beta et de collagène 1 : il pourrait donc être intéressant de mimer ces augmentation de synthèse en utilisant des principes actifs sélectionnés correctement.
Ainsi, voici les résultats obtenus pour les deux extraits sélectionnés :
Tableau IX
Figure img00510002
<tb>
<tb> TGF <SEP> - <SEP> latent <SEP> Collagène <SEP> I
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> Cellules <SEP> Cellules <SEP> non <SEP> Cellules
<tb> stressées <SEP> stressées <SEP> stressées <SEP> stressées
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> blé <SEP> 129 <SEP> 187 <SEP> 153 <SEP> 213 <SEP>
<tb> Extrait <SEP> Soft <SEP> Roe <SEP> 111 <SEP> 154 <SEP> 99 <SEP> 147 <SEP>
<tb>
EXEMPLE 11 Utilisation d'épiderme reconstruit et de cultures en monocouche, comprenant des cellules stressées et des cellules de
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référence pour la recherche de la modulation des capacités antibactériennes cutanées Les peptides antibiotiques sont des molécules de petites tailles (10 à 50 acides aminés) capables de détruire des micro-organismes tels que bactéries, champignons ou virus, en perméabilisant leur membrane cellulaire. La majorité des peptides antibactériens sont retrouvés dans les tissus épithéliaux des animaux, où ils jouent un rôle prépondérant de première barrière immunitaire. Chez l'homme plus particulièrement, ils ont été mis en évidence dans l'appareil gastro-intestinal et respiratoire ainsi que dans la peau et les muqueuses. Les défensines constituent une des classes de peptides antimicrobiens les plus étudiées. Chez l'homme, on distingue deux classes de défensines, les a-défensines (6 représentants), et les p-défensines présentes sous trois formes, hBD1, hBD2 et hBD3 (Human p-defensin 1,2 et 3).
Sous un stress mimant une attaque microbienne (lipopolysaccharide ou LPS, TNF alpha, Interféron gamma, etc...), les cellules peuvent synthétiser ces molécules, comme moyen de défense.
Pour démontrer cela, des cultures de kératinocytes en monocouche et sous la forme d'épidermes reconstruits sont réalisées à partir de cellules extraites de la même biopsie de prépuce. Les kératinocytes humains normaux sont cultivés en monocouche sur plaques de culture 96 puits, en milieu défini sans sérum et enrichi en calcium (concentration finale l,7mM).
A 80% de confluence, les cellules sont mises en contact avec un stress chimique c'est-à-dire des molécules mimant une attaque microbienne tels que TNFa (100 ng/ml) ou IFNy (100 ng/ml), pendant 16h. Des kératinocytes non stressés c'est-à-dire non placés en contact des substances chimiques mimant une attaque microbienne, sont utilisés dans un modèle en épiderme reconstruit.
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Après 16h, les surnageants sont collectés et les cellules sont congelées à sec à -80 C après un rinçage au PBS.
Les ARN totaux sont extraits à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260 et 280nm. Les ARN sont dilués à 5ng/ l.
La RT-PCR qualitative en 1 étape est réalisée sur 50 ng d'ARN initial en 96 puits, sur actine, hBD2 et hBD3. Les primers sont utilisés à 0,5 M et sont issus de la littérature : hBD2sens : 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3' ; hBD2antisens : 5'-GGAGCCCTTTCTGAATC CGCA-3' (Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997 ; 861) ; 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', hBD3 antisens : 5'-CTTCGGCAGCATT TTCGGCCA-3' ; actine sens : 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', actine antisens : 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. et al., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic.
J. Biol. Chem. 2001 ; 5707-5713).
Les échantillons sont placés dans un thermocycleur et suivent un programme d'amplification commun : 50 C, 30 min ; 94 C, 2 min ; (94 C, 30 s ; 60 C, 30s ; 68 C, 30s) 32 cycles pour les défensines et 30 cycles pour l'actine ; 72 C, 10 min ; 14 C, infini.
Après amplification, les produits sont mélangés à raison de 3 l de produits d'amplification de l'actine + 6 l de produits d'amplification de hBD2 + 6 l de produits d'amplification de hBD3.5 l d'un mélange de tampon de charge et d'eau (2/3) sont ajoutés et les 20 (il finaux sont déposés sur un gel précoulé d'agarose à 2%. Les échantillons migrent en 30 min et les bandes sont visualisées sous UV en chambre noire et photographiées numériquement.
2ème étape de la méthode de criblage
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1 à 2.106 kératinocytes de prépuce extraits tel que décrit dans l'exemple 1 sont ensemencées dans des inserts type chambre de Boyden (membrane de porosité 0,4 um et diamètre 10mm) préalablement ensemencés par une sous couche nouricière de fibroblastes, dans un milieu de culture DMEM-Glutamax / Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec 10% de sérum de veau Hyclone II, d'acide ascorbique-2-phosphate à une concentration finale de 1 millimolaire, d'EGF à une concentration finale de 10 nanogrammes/millilitre, d'hydrocortisone à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, d'umuline à une concentration finale de 0,12 UI/millilitre, d'isuprel à une concentration finale de 0,4 microgrammes/millilitre, de triiodothyronine à une concentration finale de 2.10-9 molaire, d'adénine à une concentration finale de 24,3 microgrammes/millilitre, de pénicilline à une concentration finale de 100UI/millilitre, d'amphotéricine B à une concentration finale de 1 microgramme/millilitre, et de gentamicine à une concentration finale de 20 microgrammes/millilitre, et pour une période de culture en immersion de 3 jours.
Les cultures de kératinocytes sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 11 jours dans le même milieu de culture que celui utilisé pour la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline.
En fin d'expérimentation les épidermes reconstruits sont traités de la façon suivante : -1 échantillon ne subit aucun traitement (modèle comprenant des cellules de référence = témoin négatif).
-1 échantillon ne subit aucun traitement par les actifs mais subit différents types de stress en fin de culture (modèle comprenant des cellules
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stressées = témoin positif) par exemple incubation en présence de TNFa à 100 ng/ml, IFN y 100 ng/ml.
-1 échantillon subit le traitement par l'actif (1% dans le milieu de culture pendant 24 heures) puis un stress (équivalent au témoin positif).
Les épidermes reconstruits sont ensuite incubés pendant 24 heures supplémentaires, en présence ou non d'actifs, rincés en PBS puis les ARN totaux sont extraits et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260 et 280nm. Les ARN sont dilués à 5ng/ l et traités comme décrit précédemment.
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Analyse : Les photos des gels sont analysées par un logiciel de traitement d'images qui quantifie l'intensité des bandes. Les rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine sont comparés d'une part entre le modèle en monocouche et le modèle 3D (épiderme reconstruit) en condition non stressante et d'autre part, suite à l'effet d'un stress (cellules traitées par TNFss ou IFNy).
Expression de hBD2 et hBD3 en monocouche, comparativement à un modèle 3D d'épiderme reconstruit, modèles utilisant des cellules de référence non stressées :
Tableau X
Figure img00560001
<tb>
<tb> HBD2HBD3
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> stressées <SEP> en <SEP> monocouche <SEP> 0,318 <SEP> 0
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> stressées <SEP> en <SEP> 3D <SEP> épiderme <SEP> reconstruit <SEP> 0,525 <SEP> 0,015
<tb>
Effets du stress sur l'expression de hBD2 et hBD3 en monocouche, comparativement à un modèle 3D d'épiderme reconstruit :
Tableau XI
Figure img00560002
<tb>
<tb> HBD2 <SEP> HBD3
<tb> Cellules <SEP> stressées <SEP> ar <SEP> TNFa <SEP> en <SEP> monocouche <SEP> 1,240 <SEP> 0,266
<tb> Cellules <SEP> stressées <SEP> par <SEP> TNF[alpha] <SEP> en <SEP> épiderme <SEP> 1,617 <SEP> 0,546
<tb> reconstruit
<tb> Cellules <SEP> stressées <SEP> par <SEP> IFN[gamma] <SEP> en <SEP> monocouche <SEP> 0,450 <SEP> -1[ <SEP> 0,370
<tb> Cellules <SEP> stressées <SEP> Par <SEP> IFN[gamma]en <SEP> épiderme <SEP> reconstruit <SEP> 0,581 <SEP> . <SEP> 11 <SEP> 0,492
<tb>
<Desc/Clms Page number 57>
La réponse d'une synthèse de défensines par les cellules de la peau, lors d'un stress mimant une attaque microbienne est une réponse de défense, que l'on peut donc chercher à mimer en recherchant des principes actifs capables de stimuler les défensines cutanées sans que l'agression chimique n'ait eu lieu.

Claims (26)

  1. Revendications: 1. Procédé d'identification d'une modification éventuelle d'au moins un paramètre biologique, caractérisé en ce qui! comprend l'analyse protéomique comparée et/ou transcriptomique comparée et/ou génomique comparée : a) de cellules vivantes soumises à un stress, dites cellules stressées, b) de cellules vivantes non soumises à ce même stress, dites cellules de référence, c) au moins une de ces deux classes de cellules étant utilisée dans un modèle tissulaire tridimensionnel, permettant l'identification éventuelle d'au moins un paramètre biologique modifié suite au dit stress.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de références et les cellules stressées sont utilisées dans un modèle tissulaire tridimensionnel.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit paramètre biologique, modifié au cours d'un stress, est défini par au moins une différence entre le métabolisme des cellules dites stressées et le métabolisme des cellules dites de référence.
  4. 4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape a) précitée comprend les étapes suivantes : al) ensemencement de un ou plusieurs type de cellules dites de référence dans un modèle cellulaire c'est-à-dire en monocouche ou en suspension, et/ou tissulaire c'est à dire tridimensionnel ;
    <Desc/Clms Page number 59>
    a2) exposition de ce modèle à un stress, lesdites cellules étant alors dénommées cellules stressées.
  5. 5. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes : al) exposition de un ou plusieurs type de cellules vivantes à un stress, les cellules étant alors appelées cellules stressées : a2) utilisation de ces cellules stressées, dans un modèle cellulaire c'est- à-dire en monocouche ou en suspension, et/ou tissulaire c'est à dire tridimensionnel ;
  6. 6. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le stress est un stress physique, ce stress étant choisi parmi les stress UVA, UVB, lumière solaire, infra-rouge, proche infra-rouge, thermique, champ magnétique, rayonnement hertzien dont micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, , tels que ceux subis au cours d'une exposition accidentelle ou non à de tels rayonnements, et/ou un stress physicochimique, et/ou biologique, et/ou mécanique.
  7. 7. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 ou 6, caractérisé en ce que les cellules stressées sont soit : # des cellules issues de biopsies prélevées dans des zones exposées au soleil, l'homme de l'art saura apprécier de la zone à prélever, qui sera par exemple la main, le visage.
    # des cellules stressées par un stress physique, ce stress étant choisi parmi les stress UVA, UVB, lumière solaire, infra-rouge, proche infra- rouge, thermique, champ magnétique, rayonnement hertziens dont micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements
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    ionisants dont beta, gamma, X, , tels que ceux subis au cours d'une exposition accidentelle ou non à de tels rayonnements, et/ou un stress physico-chimique, et/ou biologique, et/ou mécanique.
  8. 8. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules de référence sont soit des cellules prélevées sur des biopsies peu stressées au rayonnement solaire tel que le sein, l'abdomen, le prépuce, soit des cellules non stressées par un stress tel qu'un stress physique de type rayonnement UVA et/ou UVB ou solaire, et/ou rayonnement d'un champ magnétique, et/ou stress chimique, et/ou biologique et/ou mécanique.
  9. 9. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cellules stressées sont des cellules d'au moins un être humain ou d'au moins un animal.
  10. 10. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite étude comprend au moins une analyse choisie parmi les méthodes d'analyses suivantes : - pour les analyses du profil du protéome : électrophorèse bidimensionnelle, et/ou matrice différentielle de protéine (Protein arrays) et/ou matrice différentielle de cytokine (cytokine array), et/ou dosages Elisa combinés, - pour les analyses du profil génomique : matrice différentielle d'ADN (DNA Arrays), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (PCR-multiplex), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR), et/ou Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (PCR en temps réel),
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    -les analyses du profil transcriptomique : matrice différentielle d'ARN (RNA Arrays), matrice différentielle d'ADNc (cDNA Arrays) et/ou Réverse Transcription de Réaction de Polymérisation en Chaîne Multiplexée (RTPCR-Multiplex) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne (RT-PCR) et/ou Réverse Transcription Réaction de Polymérisation en Chaîne en temps réel (RT-PCR en temps réel).
  11. 11. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire est cultivé et/ou conservé dans des conditions maintenant, au moins partiellement, un métabolisme cellulaire.
  12. 12. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire comprend au moins des fibroblastes ou des kératinocytes.
  13. 13. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit modèle comprend : des cellules normales, saines ou pathologiques, ou des cellules issues de lignées, de préférence ces cellules sont d'origine humaine ou animale.
  14. 14. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire est choisi parmi les modèles suivant : un modèle de matrice conjonctive, appelé derme dans la cas de la peau et appelé chorion dans le cas d'une muqueuse, contenant principalement des cellules stromales, un modèle d'épithélium constitué principalement des cellules épithéliales, un modèle d'épiderme constitué principalement de
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    kératinocytes, un modèle de peau constitué d'un épiderme et d'un derme, d'un modèle de muqueuse constitué d'un épithélium et d'un chorion.
  15. 15. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire de matrice conjonctive (derme ou de chorion) comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant en un plastique traité culture cellulaire, en une membrane synthétique semi- perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi- perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou polyéthylène téréphtalate (PET) semi- perméable, une membrane inorganique AnoporeTM semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CMTM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un gel ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine comprenant des cellules stromales en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses comprenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes.
  16. 16. Procédé, selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire d'épiderme ou d'épithélium comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi :
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    AnoporeTM semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CMTM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte étant ou non ensemencé au préalable par des cellules stromales, en particulier des fibroblastes puis par des cellules épithéliales et en particulier des ké rati n ocytes, - un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine, ensemencé au préalable par des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, puis par des cellules épithéliales et en particulier des kératinocytes.
    - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique
  17. 17. Procédé, selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'au niveau de la partie épithéliale, on introduit en plus des cellules épithéliales, des cellules pigmentaires, des cellules immunocompétentes, des cellules nerveuses, de préférence les cellules immunocompétentes sont des cellules de Langerhans.
  18. 18. Procédé, selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire est un modèle tissulaire de peau ou de muqueuse reconstruite comprenant un support matriciel dermique ou de chorion de préférence choisi parmi : - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de
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    Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un gel à base de collagène et/ou acide hyaluronique et/ou fibronectine, et/ou de fibrine comprenant des cellules stromales en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses intégrant des cellules stromales, en particulier des fibroblastes, - un derme desépidermisé ou derme mort, humain ou animal, - le support matriciel est ensuite ensemencé par des cellules épithéliales pour obtenir une muqueuse reconstruite ou des kératinocytes pour obtenir une peau reconstruite.
    nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique
  19. 19. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que ledit modèle tissulaire utilisé comprend un modèle dans lequel a été incorporé au moins un type cellulaire complémentaire, de préférence des cellules endothéliales (CE) et/ou des cellules immunitaires telles que lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées.
  20. 20. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement
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    active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress tel que défini à l'un quelconque des revendications 1 à 19.
  21. 21. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 pour effectuer le criblage d'au moins une substance potentiellement active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress tel que défini à l'un quelconque des revendications 1 à 19.
  22. 22. Utilisation, selon la revendication 20 ou 21, caractérisée en ce que le procédé comprend : A/ la mise en contact de ladite substance potentiellement active avec des cellules de référence telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 19, ensemencées dans un modèle tissulaire tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 19, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir ; application d'un stress tel que défini à l'une quelconque des revendications 6 et 7 ; B/ analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète pour la réalisation de l'étude de l'action de ladite substance sur le métabolisme cellulaire desdites cellules ; C/ la comparaison du métabolisme cellulaire desdites cellules en présence de la substance potentiellement active avec le métabolisme desdites cellules sans la présence de ladite substance, dites cellules témoins, et ; D/ l'identification de la présence ou l'absence d'activité de ladite substance potentiellement active, notamment comprend l'identification d'un effet positif ou négatif de ladite substance pour prévenir la modification du paramètre biologique.
    <Desc/Clms Page number 66>
  23. 23. Procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress comprenant : a) la culture de cellules soumises à un stress, dites cellules stressées de préférence telles que définies aux revendications 4 à 7 et 9, ayant un paramètre biologique modifié, en présence d'au moins une substance éventuellement active, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir éventuellement sur le métabolisme cellulaire desdites cellules, lesdites cellules stressées étant ensemencées dans un modèle tissulaire tel que défini aux revendications 1 à 19 ; b) l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie à la revendication 10, des cellules stressées cultivées à l'étape a) ; c) La comparaison de l'analyse effectuée au b) avec l'analyse protéomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie à la revendication 10, de cellules vivantes cultivées sans la présence de ladite substance potentiellement active, dites cellules témoins ; d) Suite à la comparaison des analyses effectuées au c), l'identification éventuelle d'au moins une substance active capable de reverser au moins un paramètre biologique modifié par le stress.
  24. 24. Procédé d'identification d'au moins une substance potentiellement active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié au cours d'un stress comprenant : a) la mise en contact de ladite substance potentiellement active avec des cellules de référence telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 19, ensemencées dans un modèle tissulaire tel que
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    défini à l'une quelconque des revendications 1 à 19, pendant une période de temps suffisante pour permettre à ladite substance potentiellement active d'agir ; application d'un stress tel que défini à l'une quelconque des revendications 6 et 7 ; b) l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie à la revendication 10, des cellules stressées cultivées à l'étape a) ; c) La comparaison de l'analyse effectuée au b) avec l'analyse protéomique et/ou transcriptomique et/ou génomique, partielle ou complète, de préférence telle que définie à la revendication 10, de cellules vivantes cultivées sans la présence de ladite substance potentiellement active, dites cellules témoins ; d) Suite à la comparaison des analyses effectuées au c), l'identification éventuelle d'au moins une substance active capable de prévenir la modification d'au moins un paramètre biologique modifié par le stress.
  25. 25. Procédé d'identification, selon la revendication 23 ou 24, caractérisé en ce que ladite substance potentiellement active est choisie parmi l'hespéritine laurate, la quercitine caprylate, et un extrait de blé.
  26. 26. Utilisation d'une substance pour la fabrication d'une composition permettant d'augmenter la viabilité cellulaire et de diminuer la synthèse d'interleukine pro-inflammatoire, ladite substance active étant choisie parmi l'hespéritine laurate, la quercitine caprylate, et un extrait de blé.
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