ES2270643A1 - Un procedimiento de identificacion de una modificacion final de al menos un parametro biologico usando celulas vivas sujetas a estres y celulas vivas no sujetas a este mismo estres. - Google Patents
Un procedimiento de identificacion de una modificacion final de al menos un parametro biologico usando celulas vivas sujetas a estres y celulas vivas no sujetas a este mismo estres. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2270643A1 ES2270643A1 ES200301096A ES200301096A ES2270643A1 ES 2270643 A1 ES2270643 A1 ES 2270643A1 ES 200301096 A ES200301096 A ES 200301096A ES 200301096 A ES200301096 A ES 200301096A ES 2270643 A1 ES2270643 A1 ES 2270643A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- stress
- membrane
- model
- analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 254
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 66
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 claims description 61
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 46
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 34
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 28
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 27
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 26
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 20
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 20
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 19
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 17
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 17
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 15
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 14
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 claims description 12
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 claims description 12
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 claims description 12
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 11
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 10
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 10
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 10
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 9
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 8
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 claims description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 6
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 6
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 6
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 6
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 5
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 claims description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 claims description 4
- 231100000818 accidental exposure Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 claims description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L terephthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 148
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 21
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 14
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 14
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 14
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 14
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 14
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 14
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 13
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 13
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 12
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 244000309466 calf Species 0.000 description 12
- IROWCYIEJAOFOW-UHFFFAOYSA-N DL-Isoprenaline hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 IROWCYIEJAOFOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 11
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 11
- 229940057594 isuprel Drugs 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 9
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 5
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 3
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 3
- 239000012571 GlutaMAX medium Substances 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- OTKWDNCXANVGKB-UHFFFAOYSA-N 1-n,1-n-diethyl-4-n-(7-fluoroquinolin-4-yl)pentane-1,4-diamine Chemical compound FC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 OTKWDNCXANVGKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100025074 C-C chemokine receptor-like 2 Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 2
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 2
- 102100033167 Elastin Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 2
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 2
- 108050002883 beta-defensin Proteins 0.000 description 2
- 102000012265 beta-defensin Human genes 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 2
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 description 1
- 102100028681 C-type lectin domain family 4 member K Human genes 0.000 description 1
- 101710183165 C-type lectin domain family 4 member K Proteins 0.000 description 1
- 108010017079 CCR6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004288 CCR6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241001340526 Chrysoclista linneella Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 231100000948 EpiDerm Skin Irritation Test Toxicity 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000722985 Fidia Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010045100 HSP27 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001126925 Lobata Species 0.000 description 1
- 108010009489 Lysosomal-Associated Membrane Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100038213 Lysosome-associated membrane glycoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101100345727 Medicago sativa MMK2 gene Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000219780 Pueraria Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 206010042496 Sunburn Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 230000037338 UVA radiation Effects 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 1
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229960003718 diatrizoate sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004955 epithelial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N hesperetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 229960001587 hesperetin Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- DLBKWJOHNPIHQO-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-n-[methyl-[6-(methylamino)hexyl]amino]nitrous amide Chemical compound CNCCCCCCN(C)N(O)N=O DLBKWJOHNPIHQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 230000001739 rebound effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031337 regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000037070 skin defense Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M sodium amidotrizoate Chemical compound [Na+].CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
- A61K8/4973—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom
- A61K8/498—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom having 6-membered rings or their condensed derivatives, e.g. coumarin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/60—Materials for use in artificial skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Birds (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Transplantation (AREA)
Abstract
Comprende análisis de proteómica comparada y/o transcriptómica comparada y/o genómicacomparada: a) de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés, b) de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia, c) siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite identificar finalmente al menos un parámetro que se modifica tras dicho estrés. La presente invención además trata de un procedimiento de identificación de al menos una sustancia potencialmente activa capaz de revertir al menos un parámetro biológico que se modifica durante el estrés, o prevenir la modificación de al menos un parámetro biológico que se modifica durante el estrés. La presente invención además trata del uso de una sustancia activa seleccionada por este procedimiento, para preparar al menos una composición cosmética o farmacéutica. La presente invención además trata de una sustancia que es activa en el campo de la cosmética o de la farmacia y que se selecciona por tal procedimiento.
Description
Un procedimiento de identificación de una
modificación final de al menos un parámetro biológico usando células
vivas sujetas a estrés y células vivas no sujetas a este mismo
estrés.
La presente invención trata esencialmente de un
procedimiento para identificar una modificación finalmente de al
menos un parámetro biológico, y se basa en los análisis de
proteómica comparada y/o transcriptómica comparada y/o genómica
comparada:
- a)
- de células vivas sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite identificar finalmente al menos un parámetro biológico que se modifica tras dicho estrés.
La invención comprende el uso de este
procedimiento para la selección de principios activos.
La radiación solar está compuesta por
radiaciones electromagnéticas incluyendo un 56% de radiación
infrarroja (longitud de onda de 5.000 a 800 nm) que genera calor, un
39% de luz visible (entre 800 y 400 nm) y un 5% de ultravioletas A,
B, C (entre 400 y 190 nm), incluyendo cerca de un 4,9% de UVA y 0,1%
de UVB + UVC.
- Los UVC, que son muy dañinos, en general, son
filtrados por la capa de ozono.
- Los UVB son parcialmente retenidos cuando
atraviesan la atmósfera y el vidrio. Llegan a la epidermis, pero
son retenidos antes de la dermis. Son los responsables de la
formación de una quemadura solar caracterizada por la presencia de
células quemadas por el sol, que son queratinocitos, que han
iniciado un proceso de apoptosis debido a las lesiones del ADN de
sus núcleos. Su número será tan alto como alta sea la dosis de UVB
recibida. De hecho, un proceso natural de defensa permite la
reparación o eliminación de las células dañadas, sin embargo, el
fallo de este sistema por saturación o defecto genético juega un
papel fundamental en la aparición de cánceres de piel.
- Los UVA atraviesan la atmósfera fácilmente,
tanto en verano como en invierno, penetran la dermis y la epidermis
y, aunque son menos dañinos que los UVB, sin embargo, son
responsables de daños debido a las cantidades recibidas. Los UVA no
producen, o producen muy pocas, células quemadas por el sol y pueden
dañar el ADN celular, así como lípidos y proteínas celulares a
través de la formación de radicales libres. Los UVA son
responsables de un envejecimiento acelerado de la piel con un
aumento de la degradación del colágeno y de las fibras elásticas,
así como de otros constituyentes de la secuencia extracelular de la
dermis. Además, muchos trabajos han demostrado los efectos
inmunosupresores de los UVA a través de las células epidérmicas de
Langerhans que, tras la irradiación, interaccionan con los
linfocitos T y tienen un efecto sistémico a través de las citoquinas
y de los neuromediadores producidos en cascada por las células
epiteliales y por las fibras nerviosas (Meunier L., Eur. J.
Dermatol. 1999, 9: 269-271). A largo plazo, el
riesgo de cáncer de piel aumenta, las células precancerosas dejan
de ser reconocidas como células extrañas y, por tanto, dejan de ser
eliminadas por el sistema inmune.
Un estudio europeo de Helios (Zanetti R. y col.,
Br. J. Canc. 1996, 73: 1440-1454) muestra la
relación entre la exposición a los rayos UV, el fenotipo de la piel
y los carcinomas, y define la noción de riesgo directo unido a los
rayos UV.
Entre otros daños conocidos y que están
relacionados con las radiaciones, pueden citarse aquellos debidos a
un incremento en la temperatura por los rayos infrarrojos, que
inducen en los melanocitos la producción de proteínas de choque
térmico, así como efectos similares a los efectos inducidos por UVB
(Nakazawa y col., J. Invest. Dermatol. 1998; 110:
972-977); aquellos debidos a las radiaciones del
infrarrojo cercano que afecta a la viabilidad de las células de la
piel (Yoo B.H. y col., J. Cosmet. Sci. 2002; 53(3):
175-184); aquellos debidos a la exposición a la luz
visible (repetidas dosis) que induce una mutagenicidad (Larko O.,
Lakartidningen 2002, 99(18): 2036-2040);
aquellos debidos a las radiaciones ionizantes que generan
ulceraciones y cánceres (Lorette G., Machet L., Cancer Radiother.
2001, 5(1): 116s-120s) o modificaciones del
metabolismo celular como la síntesis de colágeno de tipo I y III en
la piel (Riekki R., y col., Arch. Dermatol. Res. 2002,
294(4): 178-184) o incluso modificaciones de
la proliferación y de la diferenciación epidérmica (Siran V. y col.,
Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys 2002, 53(2):
385-393); también aquellos debidos a los efectos
citogenéticos de las microondas (Zotti-Martelli L.,
y col., Mutat. Res. 2000, 472(1-2):
51-58) o a los efectos oncogénicos de la inhibición
de la ruta de las proteínas de choque térmico (HSP70 y HSP27) o por
generación de radicales libres debido a campos electromagnéticos y,
sobre todo, a aquellos generados por los teléfonos móviles (French
P.W. y col., Differenciation 2001 67(4-5):
93-97; Di Carlo y col., J. Cell Biochem. 2002;
84(3): 447-454; Lesczynski D., y
col., Differenciation 2002; 70(2-3): 102-129; Moustafa Y.M., y col., J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 26(4): 605-608).
col., Differenciation 2002; 70(2-3): 102-129; Moustafa Y.M., y col., J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 26(4): 605-608).
Existen también otros factores tales como
ciertos agentes químicos (peróxido de hidrógeno, óxido nítrico,
metales pesados...) o agentes biológicos (virus, bacterias...)
incluso factores mecánicos (estiramiento, comprensión) que pueden
inducir un estrés celular.
Hasta ahora, todas las funciones celulares,
incluyendo proliferación, diferenciación y muerte celular, que
están controladas por numerosos genes y las rutas de señalización
celular, se analizan ex vivo (biopsia) o in vitro en
cultivos celulares en monocapa, generalmente de fibroblastos,
queratinocitos o melanocitos obtenidos a partir de donantes sanos o
patológicos, o a partir de líneas celulares. Además, no siempre es
posible encontrar datos sobre la expresión y la síntesis celular en
función de un estrés en particular, o los resultados obtenidos in
vitro algunas veces resultan contradictorios con aquello que se
pueden observar in vivo debido a la simplificación de los
modelos usados en la experimentación.
Durante varios años se han desarrollado algunos
modelos celulares tridimensionales para terapia celular, para
ensayos citotóxicos y pruebas de eficacia, alternativos a la
experimentación con animales. Podemos citar modelos de epidermis
(documento EP 0 789 074 A1 de Oreal; A. De Brugerolle de
Fraissinette y col., 1999, Cell Biol. Tox. 15:
121-135) usada para la predicción de la irritación
aguda o crónica de la piel, y también modelos de epitelios
reconstruidos (Schmalz G. y col, Eur. J. Oral. Sci. 2000, 108:
442-448; Nielsen y col., Int. J. Pharm. 2000, 200:
261-270) así como de pieles reconstruidas, pieles
reconstruidas pigmentadas y/o pieles reconstruidas
inmunocompetentes por ejemplo (Regnier M. y col., en Pour la science
(1999) 266: 154-159).
Si hoy en día alguno de estos modelos se usan
ampliamente en las evaluaciones
fármaco-toxicológicos y en los estudios de eficacia
de ingredientes farmacéuticos y cosméticos, los procedimientos de
análisis usados son esencialmente técnicas histológicas combinadas
con el análisis de imagen, el análisis de síntesis metabólica y de
su regulación por análisis electroforético, análisis por
Western-blot, Northern-blot y
RT-PCR. Las técnicas de secuencia de proteínas (o
MAPPing) y de secuencias de ADN, de electroforesis bidimensional o
de determinaciones combinadas de citoquinas
(MAP-citoquina), en particular, no se han aplicado a
estos modelos tridimensionales que se cultivan bajo condiciones de
cultivo estándar, en comparación con las condiciones de cultivo
bajo las cuales estos modelos experimentan un estrés, sea de
naturaleza física, química, biológica o mecánica.
En contraste, estas tecnologías han sido
desarrolladas y usadas en sistemas celulares en monocapa como, por
ejemplo, en el estudio del papel modulador de un estrés por
radiación ultravioleta en melanocitos humanos normales o malignos
(línea celular o melanocitos extraídos de tejido tumoral)(Valerj
C., Grob J.J. y Verrando P., en J. Invest. Dermatol. (2001) 117:
1471-1482).
Un objetivo principal de la invención es
resolver inesperadamente el problema técnico que consiste en
proporcionar un modelo de estudio del metabolismo celular que
refleje la situación observada in vivo cuando las células han
sufrido estrés.
Un objetivo de la presente invención es resolver
el nuevo problema técnico que consiste en proporcionar un
procedimiento para identificar una modificación final de al menos
un parámetro biológico, que comprende los análisis de proteómica
comparada y/o transcriptómica comparada y/o genómica comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite finalmente identificar al menos un parámetro que se modifica tras dicho estrés.
Este análisis proteómico o transcriptómico o
genómico permite definir dianas de acción para revertir o prevenir
la modificación de al menos un parámetro que se modifica durante el
estrés aplicado.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar una solución que permita el uso de los modelos
tisulares tridimensionales descritos anteriormente con el propósito
de evaluar el efecto de un principio activo sobre el perfil genómico
o proteico, en particular, un principio activo cosmético o
farmacéutico.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar una solución que permita el uso de los modelos
tisulares tridimensionales descritos anteriormente con el propósito
de evaluar el efecto de una formulación sobre el perfil genómico o
transcriptómico o proteómico, en particular, una formulación
cosmética o farmacéutica que contenga dicho principio activo.
Otro objetivo más de la presente invención es
resolver el nuevo problema técnico que consiste en proporcionar un
procedimiento para identificar al menos una sustancia
potencialmente activa capaz de revertir o de prevenir la
modificación de al menos un parámetro biológico que se modifica
durante un estrés.
Otro objetivo más de la presente invención es
resolver el nuevo problema técnico que consiste en proporcionar una
sustancia activa seleccionada por tal procedimiento y su uso para
preparar una composición cosmética o farmacéutica.
La presente invención pretende resolver los
problemas técnicos expuestos anteriormente.
En el contexto de esta invención, por "estudio
genómico", los inventores quieren decir: el acto de diseñar una
invención y llevar a cabo el estudio de al menos una parte del
total de los genes de un organismo con la intención de estudiar su
función.
Por "estudio transcriptómico", los
inventores quieren decir: el acto de diseñar una invención y llevar
a cabo el estudio de al menos una parte del total de los ARN
transcritos del genoma.
Por "estudio proteómico", los inventores
quieren decir: el acto de diseñar una invención y llevar a cabo el
estudio de al menos una parte de las proteínas expresadas.
La invención consiste principalmente en
proporcionar un procedimiento de identificación de una modificación
final de al menos un parámetro biológico, caracterizado porque
comprende los análisis de proteómica comparada y/o transcriptómica
comparada y/o genómica comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite finalmente identificar al menos uno parámetro biológico que se modifica tras dicho estrés.
Las células denominadas "células de
referencia" son células que no han sufrido el estrés estudiado.
Será fácil de entender para la persona experta en la técnica que,
con la intención de optimizar la invención descrita, las células de
referencia son células expuestas lo menos posible a cualquier
estrés. Estas células serán, sobre todo, extraídas de biopsias
protegidas, es decir, aquellas que no han sido muy expuestas a
radiaciones solares (mama, abdomen, etc.), o células que no se han
expuesto a estrés de ningún tipo sea cual sea (estrés
físico-químicos, biológico o
mecánico).
mecánico).
Las células denominadas células "sometidas a
estrés" son células procedentes de biopsias tomadas en áreas
expuestas al sol (mano, cara, etc.), o células que estén expuestas
a estrés (estrés físico, químico o biológico), incluyendo los
estreses: UVA, UVB, luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano,
térmico, campos magnéticos, radiaciones de ondas hertzianas
incluyendo las microondas y las ondas de los teléfonos móviles,
radiaciones ionizantes incluyendo beta, gamma y rayos X, así como
aquellos sufridos durante una exposición accidental o no accidental
a tal radiación, etc. Las células pueden proceder de varias
biopsias, del mismo donante o de donantes diferentes.
El parámetro biológico corresponde en general
con cualquier modificación de la expresión de un gen, con cualquier
modificación de la secreción de una proteína, o con cualquier
modificación que pueda ser detectada en el metabolismo de la células
de referencia.
El modelo tisular se define como un modelo
tisular, también denominado modelo tridimensional, que puede
sembrarse con células vivas, sobre todo con el objetivo de
reconstituir un tejido de un ser vivo, en particular, el modelo
tisular se define como capaz de ser un modelo de secuencia
conectiva, denominada dermis en el caso de la piel y denominada
corión en el caso de una membrana mucosa, que contiene
principalmente células estromales, un modelo epitelial constituido
principalmente de células epiteliales, un modelo de epidermis
constituido principalmente por queratinocitos, un modelo de piel
constituido por una epidermis y por una dermis, un modelo de
membrana mucosa constituida por un epitelio y un corión, un modelo
de biopsias (o explantes) mantenidas viables, así como los modelos
en monocapa, o en suspensión, haciendo uso de las células presentes
en los modelos descritos
anteriormente.
anteriormente.
En estos modelos pueden usarse células normales,
sanas o patológicas, o células procedentes de líneas celulares;
estas células pueden ser de origen humano o de origen animal.
Según una variante de esta última
característica, los modelos de cultivo tridimensional de secuencias
conectivas (dermis o corión), comprende un soporte sembrado con
células estromales con el fin de formar dermis reconstruida o
coriones reconstruidos.
Las epidermis tridimensionales o modelos de
cultivo epitelial comprenden un soporte sembrado o no de antemano
con células estromales, en particular, fibroblastos, y luego con
células epiteliales y en particular, queratinocitos, para obtener
epitelios o epidermis reconstruidos.
La piel reconstruida tridimensional o el modelo
de cultivo de membrana mucosa comprende un soporte de secuencia
(dérmica o de corión) sembrado con células epiteliales con el fin
de obtener una membrana mucosa reconstruida o con queratinocitos
con el fin de obtener piel reconstruida.
Según una variante, el modelo de cultivo
tridimensional usado comprende un modelo en que se incorpora al
menos un tipo celular adicional, por ejemplo, células endoteliales
(CE) y/o linfocitos y/o células adiposas y/o apéndices de la piel,
tales como vello, pelo, glándulas sebáceas.
Según una variante, el soporte tridimensional
puede también permitir la colonización de cualquier otro tipo
celular (células inmunes, células endoteliales, células musculares,
hepatocitos, etc.).
De forma ventajosa, además de la parte epitelial
pueden introducirse células pigmentarias, células inmunocompetentes
(células de Langerhans y/o células dendríticas), células
nerviosas...
Los diferentes tipos celulares extraídos
(fibroblastos, queratinocitos, melanocitos...) se amplifican por
separado y pueden usarse por separado o conjuntamente a partir de
varios donantes para la reconstrucción de modelos tridimensionales
así como para los cultivos en monocapa o en suspensión.
Los modelos tisulares definidos anteriormente se
usan, al final del cultivo, para hacer análisis genómicos y
proteómicos, lo cual permite en particular, la selección, la
identificación y la caracterización de dianas potenciales para
luchar contra los efectos del estrés.
Las dianas potenciales se corresponden con los
parámetros biológicos que han de revertirse o cuya modificación ha
de prevenirse.
Tras la definición de las dianas, estos mismos
modelos y procedimientos de detección puede ser usados para la
selección de principios activos cosméticos o farmacéuticos. Estos
mismos modelos y procedimientos de detección puede usarse para
demostrar la eficacia de formulaciones cosméticos o farmacéuticas
que contengan, o no, los activos.
Estos modelos y procedimientos de detección
pueden también usarse para demostrar la toxicidad de activos,
cosmético o farmacéutico, o de formulaciones cosméticas o
farmacéuticas, esta toxicidad es inducida por un estrés, en
particular, por fototoxicidad.
Entre las técnicas analíticas usadas pueden
citarse, en particular, las siguientes:
- -
- para el análisis del perfil proteómico: electroforesis bidimensional y/o secuencias de proteínas y/o citoquinas, y/o determinaciones de ELISA combinadas,
- -
- para el análisis del perfil genómico: secuencias de ADN, y/o reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex), y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR tiempo real),
- -
- para el análisis del perfil transcriptómico: secuencias de ARN, secuencias de ADNc y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa multiplex (RT-PCR-multiplex) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real).
Según un primer aspecto, la invención trata de
un procedimiento de identificación de una modificación final de al
menos un parámetro biológico que comprende el análisis de
proteómica comparada y/o transcriptómica comparada y/o genómica
comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional que permite finalmente identificar al menos un parámetro que se modifica tras dicho estrés.
Sobre todo, la invención trata de un
procedimiento de identificación de una modificación final de al
menos un parámetro biológico, que comprende:
- a)
- el análisis proteómico y/o transcriptómico y/o genómico, parcial o completo, de células vivas que están sujetas a un estrés, denominadas células sometidas a estrés, sembradas en un modelo tisular;
- b)
- comparar el análisis llevado a cabo en a) con el análisis proteómico y/o transcriptómico y/o genómico, parcial o completo, de células vivas que no estén sujetas a dicho estrés, denominadas células de referencia; y
- c)
- finalmente identificar al menos un parámetro biológico que se modifica después de dicho estrés.
De forma ventajosa, se usan las células de
referencia y las células sometidas a estrés en un modelo tisular
tridimensional.
De forma ventajosa, dicho parámetro biológico,
que se modifica durante un estrés, se define por al menos una
diferencia entre el metabolismo de las células denominadas células
sometidas a estrés y el metabolismo de las células denominadas
células de referencia.
Según una forma de realización ventajosa, el
paso a) citado anteriormente comprende las siguientes etapas:
- a1)
- exponer uno o más tipos de células a un estrés, de este modo las células serán llamadas células sometidas a estrés:
- a2)
- usar estas células sometidas a estrés, en un modelo celular, es decir, en una monocapa, o en suspensión, y/o modelo tisular, es decir, tridimensional.
De forma ventajosa, el estrés es un estrés
físico, este estrés es seleccionado entre los estreses: UVA, UVB,
luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano, térmico, campo
magnético, radiaciones de ondas hertzianas incluyendo microondas y
ondas de las teléfonos móviles, radiaciones ionizantes que incluyen
radiaciones beta, gamma, rayos X, así como aquellos sufridos
durante una exposición accidental o no accidental a tal radiación,
y/o un estrés físico-químico, y/o estrés biológico
y/o estrés mecánico.
Según una forma de realización ventajosa, las
células sometidas a estrés son:
- \bullet
- células procedentes de biopsias tomadas de áreas que han estado expuestas al sol, la persona experta en la técnica sabrá el área o zona que ha de ser muestreada, que será por ejemplo la mano o la cara.
- \bullet
- células que se someten a un estrés físico, este estrés es seleccionado entre los estreses: UVA, UVB, luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano, térmico, campo magnético, radiaciones de ondas hertzianas incluyendo microondas y ondas de las teléfonos móviles, radiaciones ionizantes que incluyen radiaciones beta, gamma, rayos X, así como aquellos sufridos durante una exposición accidental o no accidental a tal radiación, y/o un estrés físico-químico, y/o estrés biológico, y/o estrés mecánico.
Según una forma de realización ventajosa, las
células de referencia son células obtenido de biopsias que no están
muy sometidas a estrés por la radiación solar como la mama, el
abdomen, el prepucio, o células que no están sometidas a estrés por
un estrés tal como estrés físico por UVA y/o UVB y/o radiación
solar tipo, y/o radiación por un campo magnético, y/o estrés
químico, y/o estrés biológico y/o estrés mecánico.
De forma ventajosa, dichas células sometidas a
estrés son células de al menos un ser humano o de al menos un
animal.
De forma ventajosa, dicho estudio comprende al
menos un análisis seleccionado entre los siguientes procedimientos
de análisis:
- -
- para el análisis del perfil proteómico: electroforesis bidimensional y/o secuencias de proteínas y/o secuencias de citoquinas, y/o determinaciones de ELISA combinadas,
- -
- para el análisis del perfil genómico: secuencias de ADN, y/o reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex), y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR tiempo real),
- -
- para el análisis del perfil transcriptómico: secuencias de ARN, secuencias de ADNc y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa multiplex (RT-PCR-multiplex) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real).
De forma ventajosa, dicho modelo tisular se
cultiva y/o conserva bajo condiciones que mantengan, al menos
parcialmente, el metabolismo celular.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular
comprende por lo menos fibroblastos o queratinocitos.
De forma ventajosa, dicho modelo comprende:
células normales, sanas o patológicas, o células procedentes de
líneas celulares, siendo estas células preferiblemente de origen
humano o animal.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular se
selecciona entre los siguientes modelos: un modelo de secuencia
conectiva, denominada dermis en el caso de la piel o denominada
corión en el caso de una membrana mucosa, que contenga
principalmente células estromales; un modelo de epitelio
constituido principalmente por células epiteliales, uno modelo de
epidermis constituido principalmente por queratinocitos, un modelo
de piel constituido por una epidermis y una dermis, un modelo de
membrana mucosa constituida por un epitelio y un corión.
\newpage
De forma ventajosa, dicho modelo es un modelo
tisular de secuencia conectiva (dermis o corión) que comprende un
soporte de secuencia preferiblemente seleccionado a partir de:
- -
- un soporte inerte seleccionado entre el grupo consistentes en una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana de nitrocelulosa semipermeable, una membrana de nilón semipermeable, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM, una membrana semipermeable de poliéster, una membrana o una película de ácido poliglicólico. En este grupo, se encuentran por ejemplo los modelos dérmico Skin^{2TM} modelo ZX1100 y Dermagraft® y Transcyte® (Advanced Tissue Sciences);
- -
- un plástico para cultivo celular tratado (formación de una hoja dérmica: Michel M. y col. en In Vitro Cell. Dev. Biol.-Aminal (1999) 35: 318-326);
- -
- un gel o membrana compuesta por ácido hialurónico (Hyalograft® 3D-Fidia Advanced Biopolymers) y/o en colágeno y/o en fibronectina y/o en fibrina; en este grupo se puede encontrar por ejemplo el modelo dérmico Vitrix^{R} (Organogenesis);
- -
- una membrana porosa, revestida o no revestida, hecha de colágeno capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o, finalmente, chitosan (EP 0 296 078 A1 de CNRS, WO 01/911821 y WO 01/92322 de Coletica); en este grupo, se encuentra el modelo dérmico Mimederm® (Coletica), por ejemplo, estas secuencias de soporte contienen células estromales, fibroblastos en concreto.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular es un
modelo tisular de epidermis o modelo tisular de epitelio que
comprende un soporte de secuencia seleccionado preferiblemente de
entre:
- -
- un soporte inerte seleccionado entre el grupo consistente en una membrana sintética semipermeables, en concreto una membrana semipermeable de nitrocelulosa, una membrana semipermeables de nilón, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeables de policarbonato o polietileno, polipropileno, de tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeables Biopore-CM, una membrana semipermeables de poliéster; en este grupo se encuentran los modelos de epidermis y epitelio reconstruidos (Skinethic®) así como los modelos EpiDerm®, EpiAirway®, EpiOccular® (Mattek Corporation);
- -
- una película o una membrana compuesta por ácido hialurónico y/o en colágeno y/o en fibronectina y/o en fibrina. En este grupo, podemos citar, en particular, los modelos Mimetop® (Coletica), Laserskin® (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin® (L'Oreal).
Estos modelos se siembran de antemano con
células estromales, en particular, con fibroblastos, y luego con
células epiteliales y en particular, con queratinocitos.
De forma ventajosa, en la parte epitelial además
de las células epiteliales se introducen células pigmentarias,
células inmunocompetentes, células nerviosas, siendo las células
inmunocompetentes, preferiblemente, células de Langerhans.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular es una
piel reconstruida o un modelo tisular de membrana mucosa que
comprende un soporte de secuencia dérmica o coriónica
preferiblemente seleccionadas de:
- -
- un soporte inerte seleccionada entre el grupo consistente en una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana de nitrocelulosa semipermeable, una membrana de nilón semipermeable, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM, una membrana semipermeable de poliéster, conteniendo dicho soporte inerte células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- un gel compuesto de colágeno y/o de ácido hialurónico y/o de fibronectina y/o de fibrina que comprenda células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una secuencia porosa, revestida o no revestida, hecha de colágeno capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o, finalmente, chitosan, integrando estas secuencias porosas células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una dermis desepidermizada o dermis muerta, humana o animal.
\newpage
En este grupo pueden citarse, en particular, los
modelos Mimeskin® (Coletica), Apligarf® (Organogenesis),
ATS-2000 (CellSystems® Biotechnologie Vertrieb), así
como Skin^{2TM} (ZX1200-1300-2000
-Advanced Tissue Science).
Además, existen otros modelos dedicados a la
terapia tisular que pueden ser objeto de estos estudios. Pueden
citarse los modelos Epidex^{TM} (Modex Therapeutiques), Epibase®
(Laboratoire Genevrier), Epicell^{TM} (Genzyme), Autoderm^{TM} y
Transderm^{TM} (Innogenetics).
Entonces, el soporte de secuencia se siembra con
células epiteliales con el fin de obtener una membrana mucosa
reconstruida o con queratinocitos con el fin de obtener una piel
reconstruida.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular usado
comprende un modelo en el que al menos se incorpora un tipo celular
adicional, preferiblemente células endoteliales (CE) y/o células
inmunes como linfocitos, macrófagos, células dendríticas y/o células
adiposas y/o apéndices de la piel tales como vello, pelo, glándulas
sebáceas.
Según un segundo aspecto, la invención trata del
uso de un procedimiento definido anteriormente para llevar a cabo
la selección de al menos una sustancia potencialmente activa capaz
de revertir al menos un parámetro biológico que se modifique
durante un estrés según se ha definido antes.
Según un tercer aspecto, la invención trata del
uso de un procedimiento para llevar a cabo la selección de al menos
una sustancia potencialmente activa capaz de proporcionar una
prevención de la modificación de al menos un parámetro biológico que
se modifique durante un estrés como se ha definido antes.
De forma ventajosa, la presente invención trata
de un procedimiento para llevar a cabo la selección de al menos una
sustancia potencialmente activa capaz de proporcionar una
prevención o de como revertir la modificación de al menos un
parámetro biológico que se modifique durante un estrés tal y como se
ha definido antes, que comprende:
- A/
- poner dicha sustancia potencialmente activa en contacto con las células de referencia como se ha definido antes, cultivadas en un modelo tisular como se ha definido antes, por un periodo de tiempo suficiente como para que permita que dicha sustancia potencialmente activa actúe, aplicando un estrés tal como se describe anteriormente;
- B/
- análisis proteómico y/o análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo para hacer el estudio de la acción de dicha sustancia sobre el metabolismo de dichas células;
- C/
- comparar el metabolismo celular de dichas células en presencia de la sustancia potencialmente activa con el metabolismo de dichas células en ausencia de dicha sustancia, denominadas células control, y;
- D/
- identificar la presencia o ausencia de actividad en dicha sustancia potencialmente activa, sobre todo comprende identificar un efecto positivo o negativo de dicha sustancia con el fin de prevenir la modificación del parámetro biológico.
Según otro aspecto, la invención trata de un
procedimiento de identificación de al menos una sustancia
potencialmente activa capaz de revertir al menos un parámetro
biológico que se modifica durante un estrés, que comprende:
- a)
- células en cultivo que están sometidas a un estrés, denominadas células sometidas a estrés, preferiblemente como se ha definido anteriormente, que tienen un parámetro biológico modificado, en presencia finalmente de al menos una sustancia activa, durante un periodo de tiempo suficiente que permita que dicha sustancia potencialmente activa finalmente actúe sobre el metabolismo de dichas células. Estas células sometidas a estrés serán sembradas en un modelo tisular tal como se define anteriormente;
- b)
- el análisis proteómico y/o análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define anteriormente, de la células sometidas a estrés cultivas en la etapa a);
- c)
- comparar el análisis llevado a cabo en b) con el análisis proteómico y/o análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define anteriormente, de células vivas cultivadas sin la presencia de dicha sustancia potencialmente activa, denominadas células control;
- d)
- seguir con la comparación de los análisis llevados a cabo en c), finalmente identificando al menos una sustancia activa capaz de revertir al menos uno parámetro biológico que se modifica por el estrés.
Según otro aspecto, la invención trata de un
procedimiento de identificación de al menos una sustancia
potencialmente activa capaz de prevenir la modificación de al menos
un parámetro biológico que se modifica durante un estrés
comprendiendo:
- a)
- poner dicha sustancia potencialmente activa en contacto con las células de referencia como se define anteriormente, sembradas en un modelo tisular como se define anteriormente, durante un periodo de tiempo suficiente para que dicha sustancia potencialmente activa actúe; aplicando un estrés como se define anteriormente;
- b)
- el análisis proteómico y/o análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define anteriormente, de las células sometidas a estrés que se cultivan en la etapa a);
- c)
- comparar el análisis llevado a cabo en b) con el análisis proteómico y/o análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define anteriormente, de células vivas que se cultivan en ausencia de dicha sustancia potencialmente activa, denominadas células control;
- d)
- seguir con la comparación de los análisis llevados a cabo en c), identificando finalmente al menos una sustancia activa capaz de prevenir la modificación de al menos un parámetro biológico que se modifica por el estrés.
Según otro aspecto, la invención trata del uso
de una sustancia activa seleccionada por un procedimiento como se
define anteriormente, para preparar al menos una composición
cosmética y/o farmacéutica.
Según otro aspecto, la invención trata de una
sustancia que es activa en el campo de la cosmética o de la
farmacia y que se seleccione por un procedimiento definido
anteriormente.
Según otro aspecto, la invención trata de una
sustancia activa capaz de revertir un parámetro biológico que se
identifica como modificado durante un estrés físico, químico o
biológico, y/o de prevenir la modificación consecuente, siendo
identificado este parámetro por medio de estudios comparativos
entre los modelos celulares que usan las células denominadas
"células sometidas a estrés" y los modelos celulares que usan
las células denominadas "células de referencia"; siendo al
menos uno de estos modelos un modelo tisular que comprende al menos
fibroblastos o queratinocitos.
Otros objetivos, características y ventajas de
la invención saldrán claramente a la luz en la descripción
explicativa que sigue y que se hace en referencia a los ejemplos
que se dan simplemente como ilustración y que de ninguna manera
limita el alcance de la invención. Los ejemplo constituyen una
parte integral de la presente invención, y cualquier característica
nueva que aparezca con respecto al cualquier estado actual del tema
se reclama como una parte integral de la invención en su función y
en su generalidad. En los ejemplos todos los porcentajes se dan por
peso, la temperatura se da en grados Celsius, la presión es presión
atmosférica, a menos que se indique lo contrario.
Las células que se denominan "células de
referencia" son:
- \bullet
- células extraídas de biopsias, de donantes de edad variable, cuyas biopsias no están sometidas a estrés por el sol y obtenidas preferiblemente por cirugía plástica abdominal y mamaria o, finalmente, gingival o vaginal.
Las células que se denominan "células
sometidas a estrés" son:
- \bullet
- células extraídas de biopsias, de donantes de edad variable, cuyas biopsias se obtienen por cirugía plástica de áreas sometidas a estrés solar (cara, cuello, mano).
Los tipos de células obtenidas pueden ser
fibroblastos extraídos por la técnica de explantes o por digestión
enzimática, por ejemplo, con colagenasa, queratinocitos o
melanocitos extraídos tras la disociación enzimática
dermoepidérmica, en particular, con dispasa, termolisina o
tripsina-EDTA.
Tras la extracción, los fibroblastos se
amplifican en medio DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco)/Ham
F-12 glutamax 50/50 volumen/volumen, complementado
con un 10% de suero de ternera, con penicilina a una concentración
final de 100 UI/mililitro, con gentamicina a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro, con amfotericina B a una concentración
final de 1 microgramo/mililitro. Los fibroblastos se amplifican por
tripsinización tan pronto como se obtiene una confluencia del
90%.
Tras la extracción, los queratinocitos se
amplifican en medio K-SFM (Medio sin suero para
queratinocitos-Invitrogen) que contiene extracto de
glándula pituitaria bovina complementado con penicilina a una
concentración final de 100 UI/mililitros, con gentamicina a una
concentración final de 1 microgramo/mililitro, con anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro. Los
queratinocitos se amplifican por tripsinización tan pronto como se
obtiene una confluencia del 90%.
Tras la extracción, los melanocitos se
amplifican en medio MMK2 (kit de Medio para
Melanocitos-Sigma) complementado con penicilina a
una concentración final de 100 UI/mililitro, con gentamicina a una
concentración final de 1 microgramo/mililitro, con anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro y con geneticina
a razón de 100 microgramos/mililitro durante 3 días hasta eliminar
los queratinocitos residuales. El cultivo se continua entonces en
el mismo medio a excepción de la geneticina. Los melanocitos se
amplifican por tripsinización tan pronto como se obtiene una
confluencia del 90%.
Se siembran 500.000 fibroblastos obtenidos a
partir de una mezcla de tres biopsias de referencia (biopsia
mamaria), que se amplificaron según se describe en el ejemplo 1, en
un sustrato dérmico compuesto de colágeno que se entrecruza con
difenilfosforil azida, en un medio DMEM-glutamax
complementado con un 10% de suero de ternera, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 nanogramos/mililitro,
con penicilina a una concentración final de 100 UI/mililitro, con
gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, con
anfotericina B a una concentración final de 1 microgramo/mililitro
durante un periodo de 21 días.
Se siembran 500.000 fibroblastos originados a
partir de una biopsia de referencia(biopsia mamaria), que se
amplifican como se describe en el ejemplo 1, en un sustrato dérmico
compuesto por colágeno entrecruzado con difenilfosforil azida, en
un medio DMEM-glutamax complementado con un 10% de
suero de ternera, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 nanogramos/mililitro, con
penicilina a una concentración final de 100 UI/mililitro, con
gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro,
con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, durante un periodo de 15 días. Entonces se
cultivan durante una semana más en medio sin suero (FBM, Medio
Basal para Fibroblastos-Promocell).
Al final del experimento, las dermis
reconstruidas se lavan con tampón fosfato (PBS) pH 7,4 y entonces
se ponen en placas de Petri pequeñas que contengan 1 ml de PBS a pH
7,4. Algunas muestras se conservan a temperatura ambiente (dermis
reconstruidas denominadas "dermis de referencia"), y otras se
irradian con dosis crecientes
(0-5-10-15-20-25-30-30
J/cm^{2}) de UVA (365 nm).
Entonces, las dermis reconstruidas que
comprenden las células denominadas "células sometidas a
estrés" o "células de referencia" se incuban en un medio sin
suero (FBM, Promocell) durante 24 horas. La viabilidad de las
células en las secuencias se evalúa mediante una prueba con MTT
(metiltiazoltetrazolio) y se expresa como porcentaje del control no
irradiado. Los medios son recogidos, centrifugados y el contenido
en citoquinas se determina por el kit MAP Fluoroquina (R&B
Systems). Brevemente, 50 \mul de los estándar o de las muestras se
pipetean dentro de pocillos identificados. Se añaden en los
pocillos 50 \mul de anticuerpos específicos de las distintas
citoquinas inmovilizados en micropartículas en función de un plan
de placa predefinido. Tras una hora de incubación con agitación
orbital, y la eliminación por lavado de las sustancias no fijadas,
se añaden en los pocillos anticuerpos marcados específicos de las
diferentes citoquinas y se incuban durante 2 horas con agitación
orbital. Tras lavar, las micropartículas se resuspenden en tampón
de lavado, se agitan durante 1 hora con agitación orbital.
Inmediatamente se lleva a cabo la lectura en un Analizador Luminex
100 (R&D Systems). El contenido de las diferentes citoquinas
presentes en los medios analizados se determina en virtud de curvas
de calibrado hechas con citoquinas humanas recombinantes altamente
purificadas. Esta técnica permite hacer un experimento para analizar
la secreción celular de varias citoquinas
(IL-1\beta, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10, TNF\alpha, GM-CSF,
G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF,
IFN\gamma).
Citoquina (pg/ml) | Células no sometidas a estrés | Células sometidas estrés por UVA: 20 J/cm^{2} |
MTT | 100% | 72% |
IL1 beta (pg/ml) | 24\pm10 | 56\pm19 |
IL6 (pg/ml) | 570\pm142 | 1210\pm342 |
IL8 (pg/ml) | 122\pm17 | 173\pm23 |
TNF alfa (pg/ml) | 18\pm6 | 110\pm42 |
Los procedimientos de la invención permiten ver
como el estrés (aquí una radiación UVA), inducen un descenso de la
viabilidad celular, así como un aumento de la síntesis de
interleuquinas proinflamatorias: puede ser interesante, por tanto,
reducir estos aumentos de la síntesis usando principios activos
correctamente seleccionados.
Se siembran 4,10^{6} queratinocitos de
referencia, que aquí no han sido expuestos a la radiación UVB
(biopsia mamaria), y que se amplifican según se ha descrito en el
ejemplo 1 hasta el pase 1 (primera amplificación por
tripsinización), en insertos tipo cámara de Boyden (membrana de
porosidad 0,4 \muM y 25 mm de diámetro), las cuales han sido
sembradas de antemano con una subcapa nutritiva de fibroblastos, en
un medio de cultivo DMEM-Glutamax/Ham
F-12 (relación 3/1 v/v) complementada con un 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido ascórbico-2-
fosfato a una concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor
epidérmico de crecimiento a una concentración final de 10 ng/mL,
con hidrocortisona a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitros, con umulina a una concentración final de
0,12 UI/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración final
de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de 24,3
microgramos/mililitros, con penicilina a una concentración final de
100 UI/mililitro, con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/ml, y con gentamicina a una concentración final de 20
microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo por inmersión
de 3 a 8 días.
Entonces los cultivos de queratinocitos se
colocan en la interfase aire-líquido durante 12 a
18 días en el mismo medio de cultivo usado para el cultivo en
inmersión, excepto por el suero de ternera, la hidrocortisona, el
isuprel, la triiodotironina y la umulina.
Al final del cultivo, 6 muestras no sufrieron
tratamiento (modelo que comprende las células de referencia =
control).
Se pueden inducir diferentes estreses en un
total de 6 epidermis reconstruidas. Por ejemplo se pueden usar
diferentes protocolos, para cada tipo de estrés seleccionados de
entre la siguiente lista:
Estrés químico: se aplican distintos
agentes a las epidermis reconstruidas de 10 minutos a una hora y se
eliminar por lavado con PBS, pH 7,4, así por ejemplo: lauril sulfato
sódico (SLS) al 2%, tretionina al 0,05%, peróxido de hidrógeno (3 a
300 \muM), óxido nítrico (NO) (MAHMA nonoato 0,1 a 1 \muM),
hipóxia por saturación con CO^{2} y por humo de cigarrillo.
Estrés biológico: Se aplican varios
agentes a las epidermis reconstruidas durante una hora y después se
eliminan por lavado con PBS, pH 7,4, así por ejemplo: TGF\beta
(5-10 ng/ml), TNF\alpha
(50-100-200 UI/ml), IL1
(5-10 ng/ml), LPS (lipopolisacárido
5-10 ng/ml).
Estrés mecánico: las epidermis
reconstruidas se cortan o se comprimen durante 1 hora.
Estrés térmico: las epidermis
reconstruidas se colocan durante 1 hora a 37ºC, 40ºC y 43ºC.
Campos magnéticos: las epidermis
reconstruidas se colocan durante una hora bajo un campo magnético,
por ejemplo, de 835 MHz/0,6 W y 1.800 MHz/0,125 W (radiofrecuencia
de los teléfonos móviles).
Microondas: las epidermis reconstruidas
se someten a microondas: frecuencias 2,45 y 7,7 GHz y 30
mW/cm^{2} de poder.
Radiaciones ionizantes: las epidermis
reconstruidas se someten a dosis de 0,2 a 10 mGy de Rayos X.
Estrés UV: UVA (0-60
J/cm^{2}), UVB (0-100 mJ/cm^{2}), luz solar
(0-3.500 kJ/m^{2}).
En este experimento, hemos elegido llevar a cabo
una irradiación de tipo UVB. Para esto, se elimina el medio de
cultivo y se reemplaza por PBS pH 7,4 y algunas epidermis
reconstruidas presentes en los insertos se irradian con dosis
crecientes de UVB (312 mm) de 0 a 100 mJ/cm^{2}. Otras se
reservan bajo las mismas condiciones sin irradiación (epidermis
denominadas "epidermis de referencias no sometidas a estrés").
Las epidermis reconstruidas tratadas así se incuban entonces durante
24 horas más en medio de emersión. La determinación de las
citoquinas se lleva a cabo por MAP Floroquina como se ha descrito
en el ejemplo 3. La viabilidad celular se evalúa por determinación
de proteínas (kit del ácido bicinconinico para determinación de
proteínas-Sigma St Louis, USA) o por cualquier otra
prueba de viabilidad celular que permita la determinación de la
actividad enzimática de la fosfatasa alcalina (incubación durante 2
horas a 37ºC en una solución que contenga 5 mM de
p-nitrofenil fosfato, 0,1 M de acetato sódico, 0,1%
de Triton X100 pH 5 y, entonces, la neutralización con 10% de NaOH
1 N y se lee la absorbancia a 405 nm).
En la siguiente tabla se expresan los resultados
como porcentajes del control no irradiado:
\vskip1.000000\baselineskip
Citoquina (pg/ml) | Células no sometidas a estrés | Células sometidas a estrés por UVB: 21 J/cm^{2} |
BCA | 100% | 58% |
IL1 beta (pg/ml) | 25\pm8 | 137\pm39 |
IL6 (pg/ml) | 120\pm30 | 702\pm29 |
IL8 (pg/ml) | 352\pm57 | 473\pm72 |
TNF alfa (pg/ml) | 17\pm11 | 125\pm42 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (aquí una irradiación UVB), induce una disminución
significativa de la viabilidad celular, así corno un aumento de la
síntesis de interleuquinas proinflamatorias: puede ser interesante,
por tanto, reducir estos aumentos de la síntesis y limitar la
mortalidad celular usando correctamente los principios activos
seleccionados.
Se siembran de 1 a 2,10^{6} células de la
membrana mucosa gingival denominadas "células epiteliales de
referencia de la membrana mucosa gingival" (biopsia gingival,
pase 3 (3ª amplificación por tripsinización)), extraídas como se ha
descrito en el ejemplo 1, en insertos tipo cámara de Boyden
(membrana de porosidad 0.4 \muM y 10 mm de diámetro -subcapa
nutritiva de fibroblastos), en medio de cultivo
DMEM-Glutamax/Ham F-12 (relación 3/1
v/v) complementada con un 10% de suero de ternera Hyclone II, con
ácido ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/mL, con hidrocortisona a una concentración final de
0,4 microgramos/mililitros, con umulina a una concentración final
de 0,12 UI/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración final
de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de
24,3 microgramos/mililitros, con penicilina a una concentración
final de 100 UI/mililitro, con anfotericina B a una concentración
final de 1 microgramo/ml, y con gentamicina a una concentración
final de 20 microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo
de 3 a 8 días por inmersión.
Entonces, los cultivos de células epiteliales se
mantienen en inmersión durante 12 a 18 días en el mismo medio de
cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto porque el
porcentaje de suero de ternera se reduce de 10%
a 1%.
a 1%.
Al final del experimento, se elimina el medio y
se reemplaza por PBS, pH 7,4 y los epitelios reconstruidos
presentes en los insertos se someten a estrés por varios agentes
potencialmente irritantes o sensibilizadores, a la proporción de 20
\mul por epitelio y durante una hora: 5% de lauril sulfato sódico
(SLS), lipopolisacáridos (LPS) a 1000 U/ml, un agente
antiinflamatorio: la Prednisolona a 10 mM (Sigma) y un activo:
Inhipasa® al 3% (extracto de raíces de Pueraria lobata,
Coletica) también a una proporción de 20 \mul por epitelio,
durante una hora. Entonces los agentes aplicados sobre los
epitelios reconstruidos se eliminan y los epitelios reconstruidos se
incuban durante 24 horas más en medio de inmersión sin suero de
ternera. Algunos epitelios reconstruidos se analizan en términos de
viabilidad celular por la prueba con MTT (metiltiazoltetrazolio).
Otros epitelios reconstruidos se raspan y se ponen en Tri Reagent®
(T9424 Sigma, St. Louis USA) y, entonces, se extraen con cloroformo.
Tras la centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC, los ARN
aparecen en la capa superior.
La determinación de los ARNm de los epitelios se
hace por Expression Array (RD System), según el protocolo definido
por los proveedores. Los resultados se expresan como un factor de
variación con respecto a los controles no sometidos a estrés:
[(resultados de las células sometidas a estrés/resultados de las
células no sometidas a
estrés)xl00].
estrés)xl00].
\vskip1.000000\baselineskip
Marcadores | Estrés con SLS | Estrés con LPSs | Efecto de Prednisolona | Efecto de Inhipasa® |
PLA2 | 102 | 168 | 93 | 50 |
IL1\alpha | 241 | 131 | 62 | 52 |
IL1\beta | 114 | 182 | 75 | 69 |
IL-1ra | 82 | 75 | 112 | 98 |
IL-1R AcP | 102 | 124 | 95 | 119 |
IL-1RI | 154 | 254 | 83 | 107 |
IL-1 RII | 137 | 262 | 88 | 102 |
TNF\alpha | 213 | 134 | 67 | 72 |
IL6 | 163 | 342 | 81 | 135 |
IL7 | 127 | 201 | 102 | 109 |
IL8 | 183 | 287 | 105 | 92 |
IL10 | 75 | 72 | 152 | 148 |
IL11 | 112 | 125 | 101 | 108 |
IL12 | 132 | 178 | 67 | 66 |
IL15 | 147 | 189 | 99 | 108 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la invención permiten ver
como el estrés (aquí la aplicación de un agente de tipo irritante o
sensibilizador) induce la modificación de varios marcadores de
inflamación. Se demuestra la eficacia del principio activo
Inhipase® en comparación con la referencia antiinflamatoria.
Las células extraídas son aquellas obtenidas de
una biopsia mamaria fotoprotegida.
Se siembran 400.000 fibroblastos denominados
"fibroblastos jóvenes" (mezcla de tres donantes de menos de 35
años de edad) y "fibroblastos viejos" (mezcla de tres donantes
de más de 55 años de edad) que se extraen y amplifican hasta el pase
5 (5ª amplificación por tripsinización) como se ha descrito en el
ejemplo 1, en las dos caras de sustratos dérmicos revestidos.
Brevemente, los sustratos dérmicos se preparan
según el siguiente protocolo:
- -
- Secar a 25ºC un gel de colágeno al 0,75% con el fin de que forme una película.
- -
- Depositar la película de colágeno sobre un gel de colágeno al 0,75%.
- -
- Liofilizar durante 24 h y entrecruzar con DPPA (difenilfosforil azida a 50 \mul/g de colágeno en solvente dimetilformamida y tampón borato pH 8,9).
- -
- Tras lavar con agua desmineralizada, los sustratos dérmicos revestidos se liofilizan una vez más.
El medio usado para el cultivo de los
fibroblastos es un medio DMEM- Glutamax complementado con un 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 ng/ml, con penicilina a
una concentración final de 100 UI/mililitro, con anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y con
gentamicina a una concentración final de 20 microgramos/mililitro.
La obtención de dermis reconstruidas necesita un periodo de cultivo
de 14 días.
Entonces, 400.000 queratinocitos denominados
"queratinocitos jóvenes"(mezcla de tres donantes de menos de
35 años de edad) y "queratinocitos viejos" (mezcla de tres
donantes de mas de 55 años de edad), que se extraen y se amplifican
hasta el pase 2 (2ª amplificación por tripsinización) como se
describe en el ejemplo 1, se siembran en los equivalentes dérmicos
revestidos, sobre el lado de la película de colágeno, en medio de
cultivo DMEM-Glutamax/Ham F-12
(relación 3/1 v/v) complementada con un 10% de suero de ternera
Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/mL, con hidrocortisona a una concentración final de
0,4 microgramos/mililitros, con umulina a una concentración final
de 0,12 UI/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración
final de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de
24,3 microgramos/mililitros, con penicilina a una concentración
final de 100 UI/mililitro, con anfotericina B a una concentración
final de 1 microgramo/ml, y con gentamicina a una concentración
final de 20 microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo
por inmersión de 7 días.
Entonces, los cultivos se sitúan en la interfase
aire/líquido durante 14 días en el mismo medio de cultivo usado
para el cultivo por inmersión, excepto por el suero de ternera, la
hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la umulina.
Al final del experimento, se elimina en medio y
se sustituye con PBS a pH 7,4, y las pieles reconstruidas presentes
en los insertos se incuban durante una hora a 37ºC (modelo que
comprende las células de referencia) y durante una hora a 43ºC
(modelo que comprende las células sometidas a estrés). Las epidermis
reconstruidas tratadas de este modo se incuban entonces durante 24
horas más en medio de inmersión. Las muestras que comprenden a las
"células sometidas a estrés" y las "células de
referencia" con choque térmico se analizan por secuencia de
ADNc.
- -
- Brevemente, los ARN de las muestras se extraen (finalmente tras homogeneización en nitrógeno líquido con la ayuda de un biopulverizador) y se purifican según el protocolo del proveedor de Tri Reagent® (Sigma) para la total eliminación del ADN.
- -
- Los ARN purificados se analizan cualitativa y cuantitativamente.
- -
- La siguiente fase fue la purificación de las mezclas de ARN mensajeros (ARNm) por hibridación de los extremos poly(A) de los ARNm con cebadores oligo(dT) biotinilados y con la captura selectiva por bolas de estreptavidina, según el protocolo de Atlas Pure (Clontech). Las sondas de ADN se marcan repetidamente con ^{32}P mediante transcripción inversa de los ARNm unidos a las bolas de poly(dT), con la ayuda de un grupo de cebadores específicos de las secuencias inmovilizadas en las secuencias, en presencia de [\alpha^{33}P]-dATP. Las sondas marcadas se purifican en una columna cromatográfica de exclusión; la calidad y la equivalente de las sondas marcadas se evaluó por recuento con líquido de centelleo.
- -
- Las membranas Custom ATLAS se pretratan y entonces, los ADNc inmovilizados en cada membrana se hibridan (68ºC, una noche) con las correspondientes sondas marcadas; los filtros se lavan antes del análisis.
- -
- Análisis por autorradiografía y cuantificación de la radioactividad de las manchas con ayuda de un Cyclone Phosphorimager (Packard Instrument; 3 horas y, entonces, 72 horas de adquisición) y del software QuarltArray, Packard.
- -
- Identificación de los genes de interés que varían entre las diferentes condiciones experimentales; donantes jóvenes frente a donantes que ha sufrido o no estrés térmico. Los resultados se expresan como porcentaje de variación entre el modelo de vejez y el modelo de juventud, en condiciones de no exposición a estrés y de exposición a estrés.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (aquí un choque térmico), induce, por un lado, la
modificación de numerosos marcadores y por otro lado, una respuesta
diferente al estrés en función de la edad de los donantes. Este
modelo permite, por tanto, definir dianas de acción que proporcionan
un indicio del mismo o de cómo revertir el efecto de un choque
térmico. Además, este modelo permite definir una estrategia
diferente para desarrollar principios activos en función del grupo
de edad en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
Generación de células dendríticas
indiferenciadas e inmaduras capaces de orientarse por si mismas de
forma preferente hacia la ruta de diferenciación de las células de
Langerhans:
La sangre periférica circulante se recogió
tomando una muestra de sangre venosa a partir de uno o más donantes
humanos, en tubos de vacío complementados con productos
anticoagulantes normales como la heparina de
litio.
litio.
La separación de los monocitos (CD14^{+}) a
partir de esta sangre circulante puede hacerse de forma ventajosa
según el protocolo descrito por Geissmann y col., en J. Exp. Med.
Vol 187, Nº 6, 16 de marzo de 1998, páginas 961-966
publicado por The Rockefeller University Press, de la siguiente
forma:
- -
- tras la centrifugación en un gradiente de Ficoll® (diatrizoato sódico/polisacarosa con densidad 1,077; Lymphoprep Abcys 1053980), se recuperan las células mononucleadas de la sangre circulante y se marcan de forma indirecta con una mezcla de anticuerpos (principalmente anti-CD3, anti-CD7, anti-CD19, anti-CD45RA, anti-CD56 anti-IgE) unidos a bolas magnéticas.
- -
- tras el paso por una columna magnética, sólo eluyen los monocitos no marcados magnéticamente.
Los monocitos CD14^{+} se recuperan del
eludido usando cualquier procedimiento físico de separación bien
conocido por la persona experta en la técnica y, sobre todo, por
sedimentación o centrifugación, y se eluyen así para cultivos
sucesivos.
Entonces los monocitos CD14^{+} se ponen en
cultivo, a la proporción de aproximadamente 1 millón por mililitro,
en medio de cultivo RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute)
complementado con 10% de suero fetal de ternera descomplementado, y
que contiene inicialmente dos citoquinas, denominadas citoquina
GM-CSF a una concentración de 400 UI/ml y citoquina
TGF\beta1 a una concentración de 10 ng/ml.
El cultivo se realiza a 37ºC en una atmósfera
saturada de vapor de agua que contenga 5% de CO^{2}.
El medio de cultivo se complementa inicialmente
con una tercera citoquina, denominada citoquina
IL-13 a una concentración de 10 ng/ml. Antes de
máximo 2 días de cultivo, se añade el mismo medio de cultivo pero
sin que contenga la IL-13, hasta el 6º día de
cultivo. Al 6º día, se generan células dendríticas indiferenciadas e
inmaduras capaces de orientarse por sí mismas preferentemente hacia
la ruta de diferenciación de las células de Langerhans:
- -
- aproximadamente del 60% al 80% de las células dendríticas generadas in vitro expresan intracelularmente la langerina, y el CCR6 que es el receptor específico de MIP-3\alpha;
- -
- las células dendríticas generadas in vitro son fuertemente atraídas quimiotácticamente por MIP-3\alpha, y esto demuestra la funcionalidad del receptor CCR6, las células dendríticas generadas in vitro son fuertemente atraídas de forma química por MIP-3a, y esto demuestra la funcionalidad del receptor CCR6,
- -
- las células dendríticas generada in vitro son inmaduras ya que no expresan los marcadores de madurez CD83, DC-LAMP y CCR7.
\newpage
El modelo tisular se lleva a cabo entonces según
el protocolo:
Doscientos mil fibroblasto extraídos de una
biopsia abdominal, denominadas células de referencia, se
amplifican, según se describe en el ejemplo 1, y entonces se
siembran en un sustrato dérmico compuesto por
colágeno-glicosaminoglicano- chitosan, en un medio
de cultivo DMEM-Glutamax complementado con 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 ng/ml, con penicilina a
una concentración de 100 UI/mililitro, anfotericina B a una
concentración final de 1 microgramo/mililitro, y gentamicina a una
concentración final de 20 microgramos/mililitro, y por un periodo
de cultivo de 21 días. El cultivo se continúa durante una semana
más en el medio descrito excepto por el EGF.
Entonces, 2,10^{5} queratinocitos extraídos de
una biopsia abdominal, que comprende las células denominadas
"células de referencia" y amplificados hasta el pase 1 (1ª
amplificación) según se ha descrito en el ejemplo 1, y de 1 a
3,10^{5} células dendríticas indiferenciadas generadas in
vitro se siembran en los equivalentes dérmicos en un medio de
cultivo DMEM-Glutamax/Ham F-12
(relación 3/1 v/v) complementada con un 10% de suero de ternera
Hyclone II, con ácido ascórbico-2- fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/ml, con hidrocortisona a una concentración final de
0,4 microgramos/mililitros, con umulin a una concentración final de
0,12 UI/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración
final de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de
24,3 microgramos/mililitros, penicilina a una concentración final
de 100 UI/mililitro, con anfotericina B a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro, y con gentamicina a una concentración
final de 20 microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo
en inmersión de 7 días.
Los cultivos entonces se sitúan en la interfase
aire/líquido durante 20 días en el mismo medio de cultivo usado
para el cultivo en inmersión, excepto por el suero de ternera, la
hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la umu-
lina.
lina.
En estas condiciones, las células de Langerhans
se localizan en la epidermis, mientras que las células dendríticas
intersticiales, los macrófagos y las células endoteliales lo hacen
en la dermis.
Se añade o no el liposacárido bacteriano (LPS) a
los medios sumergidos a una concentración de 10 ng/ml durante 6 y
24 horas.
Al final del experimento, las pieles
reconstruidas inmunocompetentes se analizan por secuencia de ADNc
según se describe en el ejemplo 6. Los medios de cultivos recogidos
y congelados se analizan por Fluoroquina MAP según se ha descrito
en el ejemplo 3. Los resultados se presentan en pg/ml, en
particular, para la parte de regulación prematura por interleuquina
1 y TNF\alpha y en porcentajes de la síntesis de citoquinas
([(resultados de células sometidas a estrés/resultados de células
no sometidas a estrés)x100]) para la secuencia de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran una activación más o
menos rápida de los genes que codifican para la regulación de la
respuesta inflamatoria debida a interleuquina 1 y a TNF alfa. El
descenso observado en el caso de los marcadores CD1a, CD40 y CD86
no es debido a un fenómeno de regulación génica sino más bien a la
desaparición de las células dendríticas, inicialmente presentes en
el modelo tridimensional, bajo el efecto del estrés debido al
lipopolisacárido, seguido de su migración al medio de cultivo
presente bajo en inserto.
Los procedimientos de la invención también
permiten hacer una selección de principios activos capaces de
proporcionar un indicio o de modular las diferentes modificaciones
observadas tras el estrés generado.
Las células extraídas se obtienen a partir de
una biopsia mamaria no expuesta al estrés estudiado. Se siembran
400.000 fibroblastos, amplificados hasta el pase 5 (5ª amplificación
por tripsinización) como se describe en el ejemplo 1, en sustratos
dérmicos compuestos por esponjas recubiertas de colágeno, en un
medio de cultivo DMEM-Glutamax complementado con un
10% de suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 ng/ml, con penicilina a
una concentración final de 100 UI/mililitro, con anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y con
gentamicina a una concentración final de 20 miligramos/mililitros,
y por un periodo de cultivo de 14 días.
Entonces, se siembran 400.000 queratinocitos y
10.000 melanocitos, amplificados hasta el pase 2(2ª
amplificación por tripsinización) como se ha descrito en el ejemplo
1, se sembraron en los equivalentes dérmicos en medio de cultivo
DMEM-Glutamax/Ham F-12 (relación 3/1
v/v) complementado con un 10% de suero de ternera de Hyclone II,
con ácido ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/ml, con hidrocortisona a una concentración final de
0,12 UI/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración final
de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de 24,3
miligramos/mililitro, con penicilina a una concentración fina de
100 UI/ml, con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, y con gentamicina a una concentración fina de
20 microgramos/mililitro, y por un periodo de cultivo en inmersión
de 7 días.
Los cultivos entonces se ponen en la interfase
aire-líquido durante 14 días en el mismo medio de
cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto por el suero de
ternera, la hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la
umulina.
Dos veces por semana y durante dos semanas, el
medio de inmersión se elimina y se cambia por PBS a pH 7,4. Algunas
pieles reconstruidas pigmentadas presentes en los insertos se
conservan a temperatura ambiente; este modelo comprende células
denominadas "células de referencia". Otras pieles pigmentadas
reconstruidas presente en los insertos se irradian a 561 KJ/m^{2}
(que corresponde con un promedio de una hora de exposición en
Europa Central) con la ayuda de un irradiador solar Suntest CPS+
(ATLAS); este modelo comprende células denominadas "células
sometidas a estrés". Fuera de los periodos de irradiación, las
pieles reconstruidas se cultivan a 37ºC bajo un 5% de CO^{2} en
medio de inmersión.
Se aplican 8 \mul de una formulación cosmética
que contiene o no un activo antioxidante al 3%; por ejemplo,
Flavagrum® (Laurato de hesperitina, Coletica), Flavenger®
(Caprilato de quercitina, Coletica) en las pieles reconstruidas
pigmentadas durante 10 días.
Al final del tratamiento, las pieles
reconstruidas pigmentadas se sumergen durante 24 horas más en medio
de inmersión, y entonces se evalúa la eficacia del tratamiento
antioxidante mediante análisis de:
- -
- La viabilidad celular (prueba con MTT-metiltiazoltetrazolio) en las pieles reconstruidas pigmentadas que comprenden las células "sometidas a estrés" o las células "de referencia". Los resultados se expresan como porcentaje de variación con respecto al control no irradiado.
- -
- La secreción de interleuquina cuantificada por el kit de Fluoroquina MAP en el medio de cultivo recogido según se describe en el ejemplo 3. Los resultados se expresan en picogramos/ml.
Células no sometidas | Células sometidas a | Irradiación + | Irradiación + | |
a estrés | estrés (Irradiación) | Flavagrum® | Flavenger® | |
MTT | 100 | 76% | 88% | 92% |
IL1 beta (pg/ml) | 76 | 179 | 125 | 97 |
IL6 (pg/ml) | 379 | 649 | 452 | 426 |
IL8 (pg/ml) | 275 | 395 | 312 | 294 |
TNF alfa (pg/ml) | 53 | 152 | 105 | 89 |
Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (radiación solar aquí), induce un descenso de la
viabilidad celular, así como un incremento en la síntesis de
interleuquinas proinflamatorias: es interesante, por tanto, limitar
la síntesis de moléculas proinflamatorias usando principios activos
seleccionados correctamente. Entre los principios activos
seleccionados, dos de ellos, Flavagrum® y Flavenger®, muestran una
eficacia capaz de hacer que los niveles de referencia de esos dos
parámetros tiendan a restablecerse.
Las pieles reconstruidas se hacen según el
protocolo descrito en el ejemplo 6.
La mitad de las muestras que comprenden células
"sometidas a estrés" se irradian con UVB a razón de 50
mJ/cm^{2}. Las otras muestras se conservan a temperatura ambiente
bajo las mismas condiciones, y constituyen las muestras que
comprende células "de referencia". Las muestras se incuban
entonces durante 24 horas más en presencia o no de un activo (1% y
3% de Flavenger®, es decir quercitina acilada, Coletica,
Francia).
Al final del experimento, se evalúa por la
técnica de RT-PCR en tiempo real el contenido del
ARNm de la tropoelastina, colágeno de tipo 1 y colágeno de tipo III.
Para ello, se usan parejas de cebadores que permiten la
amplificación de fragmentos específicos de tropoelastina, de
colágeno de tipo 1 y de colágeno de tipo III (sentido
18/antisentido 19 y sentido 18/antisentido 20, respectivamente) y
cebadores para la secuencia de la actina (541 pares de bases).
Después de la extracción con Tri Reagent® (Sigma) y la purificación
de los ARN según el protocolo de los proveedores, se llevan a cabo
las reacciones de RT-PCR (Transcripción inversa de
la reacción en cadena de la polimerasa) cuantificando la
RT-PCR en tiempo real con la ayuda del sistema
"Opticon" (MJ Research).
La mezcla de reacción (50 \mul) introducida en
el pocillo es la siguiente, para cada muestra:
- -
- 10 \mul de ARN a una concentración de 5 ng/\mul.
- -
- Los cebadores de los distintos marcadores usados
- -
- Mezcla de reacción (Qiagen-25 \mul 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR mezcla original que contiene MgCl_{2} 5 mM + 0,5 \mul de mezcla QuantiTect RT), el marcador SYBR Green I se inserta por sí mismo en la doble hélice de ADN durante la etapa de elongación).
Las condiciones de RT-PCR son
las siguientes:
- -
- Transcripción inversa: 30 min a 50ºC
- -
- Reacciones de PCR: [15 seg a 94ºC, 30 seg a 60ºC y 30 seg a 72ºC], 50 ciclos.
La ausencia de contaminación y la pureza de los
productos amplificados se verifica por las curvas de fusión de los
productos de PCR amplificados. Se eliminan los productos que
presentan un pico doble o una temperatura de fusión anormal.
Análisis y procedimiento de cálculo:
La incorporación de fluorescencia al ADN
amplificado se evalúa continuamente durante los ciclos de PCR. Este
sistema permite obtener curvas de medida de fluorescencia en
función del número de ciclos de PCR y de ese modo, evaluar una
cantidad relativa de ADN amplificado.
Con el fin de tener en cuenta la población
celular presente en las pieles reconstruidas, todos los resultados
se atribuyen a la señal de la "actina", usado como gen
constitutivo.
Según el experimento, el umbral de medida de
C(U) (= ciclo umbral) se fija para U entre 0,05 y 0,01 y se
calcula una unidad de medida arbitraria para cada gen según la
fórmula:
Sgen "x"=
10^{7}x(1/2)^{C(U)gene\text{"x"}}
C(U)gen "x" significa el
umbral de medida del C(U) (Ciclo Umbral) del gen
"x".
Los valores de los genes que interesan se
atribuyen a la señal de la actina calculando la proporción:
R = Sgen"x"/Sactina
Se comparan estas proporciones entra las
muestras tratadas y no tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Células no sometidas | Células sometidas a | Irradiación + | Irradiación + | |
a estrés | estrés (Irradiadas) | Flavenger® 1% | Flavenger® 3% | |
Colágeno I | 0,86 | 1,08 | 0,94 | 0,92 |
Colágeno III | 1,20 | 1,47 | 1,37 | 1,26 |
Elastina | 4,20 | 5,2 | 4,87 | 4,61 |
Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (aquí una irradiación con UVB), induce un incremento
rápido de los ARN que codifican para la síntesis de moléculas de la
secuencia extracelular tales como el colágeno de tipo 1, de tipo
III y la elastina. La aplicación de un principio activo Flavenger®
permite limitar los efectos del estrés inducido por UVB
reestableciendo, de una manera dosis- dependiente, la síntesis de
estas moléculas.
Las dermis reconstruidas se hacen según se
describe en el ejemplo 3, durante 3 semanas.
Algunas dermis reconstruidas se mantienen a
temperatura ambiente; este modelo comprende a las células denominas
"células de referencia". Otras dermis reconstruidas se
irradian a 561 KJ/m^{2} (que corresponde con un promedio de una
hora de exposición en Europa Central) con la ayuda de un irradiador
solar Suntest CPS+ (ATLAS); este modelo comprende células
denominadas "células sometidas a estrés".
Las dermis reconstruidas se irradian en
presencia o no de activo (3%) y entonces, se incuban durante 24
horas. Finalmente, los ARN se extraen según se describe en el
ejemplo 5.
La expresión de los genes de TGF latente y de
colágeno de tipo I (COL1) se analiza simultáneamente por
RT-PCR multiplex en tiempo real tras una rigurosa
selección de los cebadores (concentraciones de los componentes,
parámetros de los ciclos, condiciones de detección de la
fluorescencia).
Las sondas de hidrólisis de actina (20 a 30 mer)
se marcan en el extremo 5' con el fluorescente JOE (excitación
520-emisión 548) y en el extremo 3' con el
amortiguador TAMRA (Applied Biosystems-Foster City,
CA).
Las sondas de hidrólisis de los genes analizados
(20 a 30 mer) se marcan en el extremo 5' con el fluorescente FAM
(Excitación 495-Emisión 520) y en el extremo 3' con
el amortiguador TAMRA (excitación 555-emisión
576-Applied Biosystem).
Las condiciones de la RT-PCR son
las siguientes:
- Kit Superscript de RT-PCR en una etapa con Taq platinum (Invitrogen)
- Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems).
- 10 \mul de ARN a una concentración de 5 ng/\mul
- 25 \mul de mezcla de reacción 2x
- 2,5 \mul de cebadores, cadenas sentido y antisentido, 10 \muM
- 1,8 \mul de SO_{4}Mg 50 mM
- 2 \mul de dNTP 5 mM
- 1 \mul de la hidrólisis de cada pareja de genes (actina/TGFI y actina/colágeno I) 10 \muM
- 1 \mul de RT/Taq mix
- agua qsq 50 \mul
- RT 48ºC, 30 min
- Desnaturalización de RT y activación de la polimerasa a 95ºC, 5 minutos
- 50 ciclos de: 94ºC 15 seg-60ºC 30 seg-72ºC 30 seg.
El análisis de los resultados (cálculo de la
proporción R=Sgen"x"/Sactina) se lleva a cabo como se ha
descrito en el ejemplo 10. El efecto de los activos se analiza en
términos de potenciación de la activación de TGF latente inducido
debida a la irradiación solar de los activos, así como en términos
de efecto directo y/o efecto rebote (a través de la liberación de
TGF-\beta1 activo) en el colágeno de tipo I. Los
resultados de varios activos interesantes (extracto de trigo, Soft
Roe®, Coletica) se presentan como porcentajes de la variación con
respecto al control no irradiado y no tratado con el activo.
TGF latente | COL 1 | |
Células no sometidas a estrés | 100 | 100 |
Células sometidas a estrés (irradiadas) | 124 | 197 |
Los procedimientos de la invención permiten
observar como el estrés (aquí una radiación UV), induce un aumento
de la síntesis de TGF beta y de colágeno I: por tanto, puede ser
interesante mimetizar estos aumentos de la síntesis usando
principios activos correctamente seleccionados. De este modo, aquí
están los resultados obtenidos para los dos extractos
seleccionados:
TGF-latente | Colágeno I | |||
Células no sometidas | Células sometidas | Células no sometidas | Células sometidas | |
a estrés | estrés | estrés | estrés | |
Extracto de trigo | 129 | 187 | 153 | 213 |
Extracto de ISoft Roe | 111 | 154 | 99 | 147 |
Los péptidos antibióticos son moléculas de
pequeños tamaño (de 10 a 50 aminoácidos) capaces de destruir a
microorganismos tales como bacterias, hongos o virus, volviendo la
membrana celular permeable. La mayoría de los péptidos antibióticos
se encuentran en los tejidos epiteliales de animales, donde juegan
un papel preponderante como barrera inmune primaria (primera). Más
en particular, se ha demostrado que en el hombre se encuentran en
los sistemas gastrointestinal y respiratorio, así como en la piel y
en las membranas mucosas. Las defensinas constituyen la clase de
péptidos antimicrobianos más estudiada. Se distinguen dos clases de
defensinas, las \alpha-defensinas (6
representativas) y las \beta-defensinas presentes
en tres formas: hBD1, hBD2 y hBD3 (\beta-defensina
humana 1, 2 y 3).
Bajo un estrés que imita un ataque microbiano
(lipopolisacádiro o LPS, TNA alfa, Interferon gamma, etc), las
células pueden sintetizar estas moléculas a manera de defensa.
Para demostrar esto, se preparan cultivos de
queratinocitos en monocapa y en forma de epidermis reconstruida con
células extraídas a partir de la misma biopsia de prepucio. Los
queratinocitos humanas normales se cultivan en monocapa en placas
de cultivo de 96 pocillos, en un medio definido sin suero y
enriquecido en calcio (concentración final 1,7 mM).
Cuando se alcanza un 80% de confluencia, las
células se ponen en contacto con un estrés químico, es decir,
moléculas que mimetizan un ataque microbiano, como TNF\alpha (100
ng/ml) o IFN\gamma (100 ng/ml), durante 16 años. Los
queratinocitos no sometidos a estrés, es decir no se ponen en
contacto con las sustancias químicas que imitan un ataque
microbiano, se usan en el modelo de epidermis reconstruida.
Tras 16 horas, los sobrenadantes se recogen y
las células se congelan en seco a -80ºC tras un lavado con PBS.
El ARN total se extrae con la ayuda de kit de
extracción fluo de 96 pocillos en columnas de sílica y se determina
a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro de 96 pocillo. Los ARN se
diluyen a 5 ng/ml.
La RT-PCR cualitativa en una
etapa se realiza para actina, hBD2 y hBD3 con 50 ng de ARN
(inicial) en 96 pocillo. Los cebadores se usan a 0,5 \muM y
provienen de la literatura: cadena sentido para hDB2:
5'-CCAGCCAT
CAGCCATGAGGGT-3'; cadena antisentido para hBD2: 5'-GGAGCCCTTTC TGAATCCGCA-3'(Harder J. y col., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387: 861); cadena sentido para hBD3: 5'-AGCCTAGCAGCTAT
GAGGATC-3'; cadena antisentido para hBD3: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', cadena sentido para actina: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', cadena antisentido para actina: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. y col., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
CAGCCATGAGGGT-3'; cadena antisentido para hBD2: 5'-GGAGCCCTTTC TGAATCCGCA-3'(Harder J. y col., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387: 861); cadena sentido para hBD3: 5'-AGCCTAGCAGCTAT
GAGGATC-3'; cadena antisentido para hBD3: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', cadena sentido para actina: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', cadena antisentido para actina: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. y col., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
Las muestras se sitúan en un termociclador y
siguen un programa de amplificación: 50ºC, 30 min; 94ºC, 2 min;
(94ºC, 30 seg; 60ºC, 30 seg; 68ºC, 30 seg) 32 ciclos para las
defensinas y 30 ciclos par la activa; 72ºC, 10 min; 14ºC,
infinito.
Tras la amplificación, los productos se mezclan
en una proporción de 3 \mul de productos de ampliación de actina
+ 6 \mul de productos de ampliación de hBD2 + 6 \mul de
productos de amplificación de hBD3. Se añaden 5 \mul de una mezcla
de tampón de relleno y agua (2/3) y los 20 \mul se depositan en
un gel de agarosa al 2% vertido previamente. Las muestras se hacen
migrar durante 30 minutos y las bandas se visualizan bajo una luz
UV en una cámara oscura y se fotografían digitalmente.
Segunda etapa del método de selección:
En insertos tipo cámara de Boyden (membrana de
porosidad 0,4 \mum y 10 mm de diámetro) se siembran de 1 a
2,10^{6} queratinocitos del prepucio, extraídos según se ha
descrito en el ejemplo 1, con una subcapa de fibroblastos
nutritivos, en medio de cultivo DMEM-Glutamax/HAM
F-13 (relación 3/1 v/v) complementado con un 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 nanogramos/mililitro, con hidrocortisona a una
concentración finar de 0,4 microgramos/mililitro, con umulina a una
concentración final de 0,12 UI/mililitro, con isuprel a una
concentración final de 0,4 microgramos/milkilitro, con
triiodotironina a una concentración final de 2,10^{-9} molar, con
adenina a una concentración final de 24,3 microgramos/mililitro, con
penicilina a una concentración 100 UI/mililitro, con anfotericina B
a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y con
gentamicina a una concentración final de 20 microgramos/mililitro,
y durante un periodo de cultivo en inmersión de 3 días.
Los cultivos de queratinocitos entonces se
colocan en la interfase aire/líquido durante 11 días en el mismo
medio de cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto por el
suero de ternera, la hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina
y la imulina.
Al final del experimento, la epidermis
reconstruida se trataron de la siguiente manera:
- -
- una muestra que no experimenta ningún tratamiento (modelo que comprende las células de referencia = control negativo).
- -
- una muestra que no experimenta tratamiento con los activos pero sufre los distintos tratamientos al final del cultivo (modelo que comprende las células sometidas a estrés = control positivo), por ejemplo, incubación en presencia de TNF\alpha a 100 ng/ml o IFN\gamma 100 ng/ml.
- -
- una muestra que experimenta el tratamiento con el activo (1% en el medio de cultivo durante 24 horas) y luego un estrés (equivalente al control positivo.
Entonces la epidermis reconstruida se incuba
durante 24 horas mas en presencia o no de los activos, se lava con
PBS y se extrae el ARN total y se determina a 260 y 280 nm en un
espectrofotómetro para 96 pocillos. Los ARN se diluyen a 5 ng/\mul
y se tratan como ha sido descrito anteriormente.
Análisis:
Las fotografías de los geles se analizan con un
software de tratamiento de imagen que cuantifica la intensidad de
las bandas. Se compara la relación de la intensidad de las bandas
de hBD2/actina y hBD3/actina, por un lado, entre los modelo en
monocapa y el modelo 3D (epidermis reconstruida) en condiciones de
no-estrés, y, por otro lado, después del efecto del
estrés (células tratadas con TNF\beta o IFN\gamma).
Expresión de hBD2 y hBD3 en monocapa, comparado
con un modelo 3D de epidermis reconstruida, modelos con células de
referencia no sometidas a estrés:
hBD2 | hBD3 | |
Células no sometidas a estrés en monocapa | 0,318 | 0 |
Células no sometidas a estrés en epidermis reconstruidas 3D | 0,525 | 0,015 |
Efectos del estrés en la expresión de hBD2 y
hBD3 en monocapa, comparada con modelos tridimensionales de
epidermis reconstruida:
hBD2 | hBD3 | |
Células sometidas a estrés por TNF\alpha, en monocapa | 1,240 | 0,266 |
Células sometidas a estrés por TNF\alpha, en epidermis reconstruida | 1,617 | 0,546 |
Células sometidas a estrés por IFN\gamma, en monocapa | 0,450 | 0,370 |
Células sometidas a estrés por IFN\gamma, en epidermis reconstruida | 0,581 | 0,492 |
La respuesta de una síntesis de defensinas por
las células de la piel, durante un estrés que imita un ataque
microbiano es una respuesta de defensa que puede, por tanto, usarse
para imitar en la búsqueda de principios activos que son capaces de
estimularlas defensinas de la piel sin que tenga lugar una agresión
química.
Claims (29)
1. Un procedimiento para identificar una
modificación final de al menos un parámetro, caracterizado
porque comprende los análisis de transcriptómica comparada y/o
genómica comparada.
- a)
- de células vivas sujetas a un estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas no sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite identificar finalmente al menos un parámetro biológico que se modifica tras dicho estrés.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las células de referencia y las células
sometidas a estrés se usan en un modelo tisular tridimensional.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque dicho parámetro biológico, que se
modifica durante el estrés, se define por al menos una diferencia
entre el metabolismo de las células denominadas células sometidas a
estrés y el metabolismo de las células denominadas células de
referencia.
4. El procedimiento según una cualquier de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa a)
citada anteriormente comprende las siguientes etapas:
- a1)
- sembrar uno o más tipos de células denominadas células de referencia en un modelo celular, es decir en una monocapa, o en suspensión, y/o en modelo celular es decir, tridimensional;
- a2)
- exponer este modelo a un estrés, por ello, dichas células se denominan células sometidas a estrés.
5. El procedimiento según una cualquier de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la etapa a)
comprende las siguientes etapas:
- a1)
- exponer a un estrés a uno o más tipos de células vivas, por ello, las células se denominan células sometidas a estrés:
- a2)
- usar estas células sometidas a estrés en un modelo celular; es decir en una monocapa o en suspensión, y/o en un modelo tisular, es decir tridimensional.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el estrés es un
estrés físico, este estrés se selecciona entre los estreses: UVA,
UVB, luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano, térmico, campo
magnético, radiación hertziana incluyendo microondas y ondas de los
teléfonos móviles, radiaciones ionizantes incluyendo beta, gamma, y
rayos X, así como aquellos sufridos durante una exposición
accidental o no accidental a dichas radiaciones.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el estrés es
físico-químico o biológico.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el estrés es
mecánico.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 8, caracterizado porque las
células sometidas a estrés son:
- \bullet
- células originadas a partir de biopsias tomadas de áreas expuestas al sol,
- \bullet
- células sometidas a un estrés físico, este estrés se selecciona entre los estreses: UVA, UVB, luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano, térmico, campo magnético, radiación hertziana incluyendo microondas y ondas de los teléfonos móviles, radiaciones ionizantes incluyendo beta, gamma, y rayos X.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 8, caracterizado porque las
células sometidas a estrés son:
- \bullet
- células originadas a partir de biopsias tomadas de áreas expuestas al sol,
- \bullet
- células sometidas a un estrés físico o biológico.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 8, caracterizado porque las
células sometidas a estrés son:
- \bullet
- células originadas a partir de biopsias tomadas de áreas expuestas al sol,
- \bullet
- células sometidas a un estrés mecánico.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
células de referencia son células obtenidas a partir de biopsias no
sometidas directamente a radiación solar, como la mama, el abdomen,
el prepucio, o células que no han sido sometidas a ningún estrés
físico por UVA y/o UVB y/o un tipo de radiación solar, y/o
radiación por un campo electromagnético, o células que no han sido
sometidas a estrés químico, y/o estrés biológico, y/o estrés
mecánico.
13. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dichas
células sometidas a estrés son células de al menos un ser humano o
de al menos un animal.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho
estudio comprende al menos un análisis seleccionado de entre los
siguientes métodos de análisis:
- -
- por el análisis del perfil genómico: secuencias de ADN, y/o reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex), y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real),
- -
- por el análisis del perfil transcriptómico: secuencias de ARN, secuencias de ADNc y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa multiplex (RT-PCR-multiplex) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real).
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho
modelo tisular se cultiva y/o conserva bajo condiciones que
mantienen, al menos parcialmente, el metabolismo celular.
16. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho
modelo tisular comprende al menos queratinocitos.
17. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho
modelo comprende: células normales, sanas o patológicas, o células
originadas a partir de líneas celulares, siendo estas células,
preferiblemente, de origen humano o animal.
18. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones presentes, caracterizado porque dicho
modelo tisular se selecciona de entre los siguientes modelos: un
modelo de secuencia conectiva, denominada dermis en el caso de la
piel y denominada corión en el caso de una membrana mucosa, que
contiene principalmente células estromales, un modelo epitelial
constituido principalmente por células epiteliales, un modelo de
epidermis constituido principalmente por queratinocitos, un modelo
de piel constituido por una epidermis y una dermis, un modelo de
membrana mucosa constituida por un epitelio y un corión.
19. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque dicho modelo
tisular es un modelo tisular de secuencia conectiva (dermis o
corión) que comprende un soporte de secuencia preferiblemente
seleccionado de entre:
- -
- un soporte inerte seleccionado de entre el grupo constituido por un plástico tratado para el cultivo celular, una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana semipermeable de nitrocelulosa, una membrana semipermeable de nilón, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno o tereftalato de polietileno (PET), una membrana inorgánica semipermeable Anopore^{TM}, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM^{TM}, una membrana semipermeable de poliéster, dicho soporte inerte conteniendo células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- un gel o membrana compuesto de ácido hialurónico y/o de colágeno y/o de fibronectina y/o de fibrina que comprenden células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una secuencia porosa, hecha de colágeno que sea capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o finalmente, chitosan, comprendiendo estas secuencias porosa células estromales, en particular, fibroblastos.
20. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque dicho modelo
tisular es un modelo de tejido epidérmico o un modelo de tejido
epitelial que comprende un soporte de secuencia preferiblemente de
entre:
- -
- un soporte inerte seleccionado de entre el grupo constituido por una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana semipermeable de nitrocelulosa, una membrana semipermeable de nilón, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno o tereftalato de polietileno (PET), una membrana inorgánica semipermeable Anopore^{TM} una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM^{TM}, una membrana semipermeable de poliéster, siendo o no dicho soporte inerte sembrado de antemano con células estromales, en particular, fibroblastos, y después con células epiteliales y, en particular, queratinocitos,
- -
- una película o una membrana compuesta de ácido hialurónico y/o colágeno y/o fibronectina, sembrada de antemano con células estromales, en particular, fibroblastos, y después con células epiteliales y, en particular, queratinocitos.
21. El procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque en la parte epitelial se introducen
además células epiteliales, células pigmentarias, células
inmunocompetentes, células nerviosas, siendo las células
inmunocompetentes, células de Langerhans.
22. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque dicho modelo tisular
es un modelo de piel reconstruida o un modelo de membrana mucosa
que comprende un soporte de secuencia dérmica o corión
preferiblemente seleccionada de entre:
- -
- un soporte inerte seleccionado de entre el grupo constituido por una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana semipermeable de nitrocelulosa, una membrana semipermeable de nilón, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno o tereftalato de polietileno (PET), una membrana inorgánica semipermeable Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM, una membrana semipermeable de poliéster, conteniendo dicho soporte células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- un gel compuesto de colágeno y/o ácido hialurónico y/o fibronectina y/o fibrina, que comprende células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una secuencia porosa, hecha de colágeno capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o finalmente, chitosan, células estromales, integrando estas secuencias porosa en particular, fibroblastos,
- -
- una dermis desepidermizada o dermis muerta, humana o animal,
- -
- entonces, el soporte de secuencia se siembra con células epiteliales con el fin de obtener una membrana mucosa reconstruida, o con queratinocitos con el fin de obtener una piel reconstruida.
23. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque dicho modelo
tisular comprende un modelo en el que se incorpora al menos un tipo
adicional de células, preferiblemente células endoteliales (EC) y/o
células inmunes como linfocitos, macrófagos, células dendríticas y/o
células adiposas y/o apéndices de la piel, como vello, pelo,
células sebáceas.
24. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23 para llevar a cabo la selección de al menos
una sustancia potencialmente activa capaz de revertir al menos un
parámetro biológico modificado durante un estrés tal y como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23 para llevar a cabo la selección de al menos
una sustancia potencialmente activa capaz de proporcionar una
prevención de la modificación de al menos un parámetro biológico
que se modifica durante un estrés según se define en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 23.
26. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado porque
comprende:
- A/
- poner dicha sustancia potencialmente activa en contacto con las células de referencia según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, sembradas en un modelo tisular según se define en una cualquiera de lasa reivindicaciones 1 a 23, durante un periodo de tiempo suficiente que permita que dicha sustancia potencialmente activa actúe; aplicación de un estrés según de se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 y 11;
- B/
- el análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, para realizar el estudio de la acción de dicha sustancia en el metabolismo celular de dichas células;
- C/
- comparar el metabolismo celular de dichas células en presencia de la sustancia activa con el metabolismo de dichas células en ausencia de dicha sustancia, denominadas células control, y;
- D/
- identificar la presencia o ausencia de actividad de dicha sustancia potencialmente activa comprende, sobre todo identificar un efecto positivo o negativo de dicha sustancia con el fin de proporcionar una prevención de la modificación del parámetro biológico.
27. Un procedimiento de identificación de al
menos una sustancia potencialmente activa capaz de revertir al
menos un parámetro biológico modificado durante un estrés que
comprende:
- a)
- cultivar las células sujetas a un estrés, denominadas células sometidas a estrés, preferiblemente como se define en las reivindicaciones 4 a 11 y 13, que tengan un parámetro biológico modificado en presencia de al menos una sustancia finalmente activa durante un periodo de tiempo suficiente que permita que, finalmente, dicha sustancia activa actué sobre el metabolismo celular de las células; dichas células sometidas a estrés se cultivan en modelos tisular según se define en las reivindicaciones 1 a 23;
- b)
- el análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define en la reivindicación 14, de las células sometidas a estrés que se han cultivado en la etapa a);
- c)
- comparar el análisis llevado a cabo en b) con el análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define en la reivindicación 14, de las células vivas cultivadas en ausencia de dicha sustancia potencialmente activa, denominadas células control;
- d)
- seguido a la comparación de los análisis llevada a cabo en c), finalmente se identifica al menos una sustancia activa capaz de revertir al menos un parámetro biológico modificado por el estrés.
28. Un procedimiento para identificar al menos
una sustancia potencialmente activa capaz de proporcionar una
prevención de la modificación de al menos un parámetro biológico
que se modifica durante un estrés comprende:
- a)
- poner dicha sustancia potencialmente activa en contacto con las células de referencia según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, sembrada en un modelo tisular como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, durante un periodo de tiempo suficiente que permita que dicha sustancia potencialmente activa actúe; aplicación de un estrés como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11;
- b)
- el análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define en la reivindicación 14, de células sometidas a estrés cultivadas en la etapa a);
- c)
- comparar el análisis llevado a cabo en b) con el análisis transcriptómico y/o análisis genómico, parcial o completo, preferiblemente como se define en la reivindicación 14, de células vivas cultivadas en ausencia de dicha sustancia potencialmente activa, denominadas células control;
- d)
- seguido de la comparación de los análisis realizados en c), identificar finalmente al menos una sustancia activa capaz de proporcionar una prevención de la modificación de al menos un parámetro biológico modificado por el estrés.
29. Método para fabricar una composición
cosmética y/o farmacéutica caracterizada por comprender;
- -
- identificar una sustancia activa utilizando el método de las reivindicaciones 24 a 28, y
- -
- mezclar dicha sustancia activa con un excipiente aceptable cosméticamente o farmacéuticamente.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR214,491 | 2002-11-19 | ||
FR0214491A FR2847268B1 (fr) | 2002-11-19 | 2002-11-19 | Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress |
FR02214491 | 2002-11-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2270643A1 true ES2270643A1 (es) | 2007-04-01 |
ES2270643B1 ES2270643B1 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=8871571
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200301096A Expired - Fee Related ES2270643B1 (es) | 2002-11-19 | 2003-05-12 | Un procedimiento de identificacion de una modificacion final de al menos un parametro biologico usando celulas vivas sujetas a estres y celulas vivas no sujetas a este mismo estres. |
ES200601448A Expired - Fee Related ES2331165B2 (es) | 2002-11-19 | 2003-05-12 | Uso de un compuesto derivado de hesperitina o quercetina para limitaro prevenir modificaciones en parametros biologicos debidas a la radiacion solar. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200601448A Expired - Fee Related ES2331165B2 (es) | 2002-11-19 | 2003-05-12 | Uso de un compuesto derivado de hesperitina o quercetina para limitaro prevenir modificaciones en parametros biologicos debidas a la radiacion solar. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040096815A1 (es) |
JP (3) | JP2004166686A (es) |
KR (1) | KR100646047B1 (es) |
CH (1) | CH694328A5 (es) |
DE (1) | DE10320633B4 (es) |
ES (2) | ES2270643B1 (es) |
FR (1) | FR2847268B1 (es) |
GB (1) | GB2395490B (es) |
NL (1) | NL1022658C2 (es) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006006249A (ja) * | 2004-06-28 | 2006-01-12 | Hiroshima Univ | 羊膜由来細胞の培養方法及びその利用 |
DE102004061289B4 (de) * | 2004-12-20 | 2009-04-02 | Euroderm Gmbh | Testkit mit Testzellen und Immunzellen sowie Herstellverfahren hierfür |
WO2006093104A1 (ja) * | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Sapporo Breweries Limited | アルコール飲料の香味を制御する方法 |
US20070072175A1 (en) * | 2005-05-13 | 2007-03-29 | Biogen Idec Ma Inc. | Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof |
EP1736780A1 (en) | 2005-06-24 | 2006-12-27 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Method and means for detecting and/or quantifying hierarchical molecular change of a cell in response to an external stimulus |
JP4850001B2 (ja) * | 2005-09-05 | 2012-01-11 | プリマハム株式会社 | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 |
JP4734619B2 (ja) * | 2006-01-27 | 2011-07-27 | プリマハム株式会社 | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 |
JP5229789B2 (ja) * | 2007-02-27 | 2013-07-03 | プリマハム株式会社 | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 |
EP2572201B1 (en) | 2010-05-17 | 2015-08-26 | The Procter and Gamble Company | Methods of detecting and demonstrating hair damage via evaluation of protein fragments |
GB2485816A (en) | 2010-11-25 | 2012-05-30 | Alcyomics Ltd | In vitro model for the prediction of immunogenicity, hypersensitivity or allergenicity |
BR112015003717A2 (pt) * | 2012-08-21 | 2016-02-23 | Ajinomoto Kk | método para a identificação de um metabólito altamente requerido por um animal industrial, e, método para a produção de uma composição de alimentação |
EP2944958A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-11-18 | Techno-Path (Distribution) | A method of predicting phenotypic instability in a cell |
CN112074596A (zh) * | 2018-02-09 | 2020-12-11 | 亥姆霍兹慕尼黑-德国健康与环境研究中心(有限公司) | 监测疤痕形成的装置和方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020102729A1 (en) * | 1998-06-08 | 2002-08-01 | Maclaughlin Fiona | Formulations for electroporation |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5834477B2 (ja) * | 1979-05-25 | 1983-07-27 | 三省製薬株式会社 | クエルセチンの脂肪酸エステル |
US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
US5700450A (en) * | 1988-03-30 | 1997-12-23 | The Trustees Of Boston University | Methods for enhancing melanin synthesis in melanocytes using diacyglycerols and uses thereof |
DE19508608B4 (de) * | 1994-03-23 | 2006-06-29 | Merck Patent Gmbh | Lichtbeständiges kosmetisches Mittel enthaltend Tetraalkylquercetin sowie Tetraalkylquercetine als solche |
US5650279A (en) * | 1995-01-27 | 1997-07-22 | Allergan, Inc. | Gene sequence induced in skin by retinoids |
WO1999047922A2 (en) * | 1998-03-18 | 1999-09-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays |
US6323219B1 (en) * | 1998-04-02 | 2001-11-27 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Methods for treating immunomediated inflammatory disorders |
FR2778663B1 (fr) * | 1998-05-15 | 2001-05-18 | Coletica | Nouveaux esters de flavonoides,leur utilisation en cosmetique, dermopharmacie, en pharmacie et en agro-alimentaire |
US5989837A (en) * | 1998-07-13 | 1999-11-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Immortalized human keratinocyte cell line |
FR2792650B1 (fr) * | 1999-04-20 | 2003-02-28 | Oreal | Equivalent de peau agee, son procede de preparation et son utilisation |
US6426362B1 (en) * | 1999-10-08 | 2002-07-30 | Galileo Laboratories, Inc. | Formulations of tocopherols and methods of making and using them |
AU2001286727A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-04 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy |
DE10100122A1 (de) * | 2001-01-03 | 2002-07-11 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
ES2457092T3 (es) * | 2001-03-02 | 2014-04-24 | Stratatech Corporation | Sustitutos de piel mejorados y usos de los mismos |
-
2002
- 2002-11-19 FR FR0214491A patent/FR2847268B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-02-12 US US10/365,853 patent/US20040096815A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-12 NL NL1022658A patent/NL1022658C2/nl not_active IP Right Cessation
- 2003-02-12 GB GB0303216A patent/GB2395490B/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-20 CH CH00266/03A patent/CH694328A5/fr not_active IP Right Cessation
- 2003-03-31 KR KR1020030020227A patent/KR100646047B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-04-09 JP JP2003105104A patent/JP2004166686A/ja active Pending
- 2003-05-08 DE DE10320633A patent/DE10320633B4/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-12 ES ES200301096A patent/ES2270643B1/es not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-12 ES ES200601448A patent/ES2331165B2/es not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-27 JP JP2007047595A patent/JP5311749B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-11-04 JP JP2008282923A patent/JP2009131251A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020102729A1 (en) * | 1998-06-08 | 2002-08-01 | Maclaughlin Fiona | Formulations for electroporation |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
BERNARD FRANÃOIS-XAVIER et al.: "Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono-layer cultures, reconstituted epidermis and normal human skin; transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis." EXPERIMENTAL DERMATOLOGY. DENMARK FEB 2002, Vol. 11, n 1, febrero 2002 (2002-02), pßginas 59-74, XP002251235 ISSN: 0906-6705. * |
BERNARD FRANÇOIS-XAVIER et al.: "Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono-layer cultures, reconstituted epidermis and normal human skin; transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis." EXPERIMENTAL DERMATOLOGY. DENMARK FEB 2002, Vol. 11, nº 1, febrero 2002 (2002-02), páginas 59-74, XP002251235 ISSN: 0906-6705. * |
E CORSINI et al.: "Use of differential-display polymerase chain reaction to identify genes selectively modulated by chemical allergens in reconstituted human epidermis." Toxicology in vitro, agosto 2002, Vol. 16, páginas 427-431. \\ Y 6-29 * |
E CORSINI et al.: "Use of differential-display polymerase chain reaction to identify genes selectively modulated by chemical allergens in reconstituted human epidermis." Toxicology in vitro, agosto 2002, Vol. 16, pßginas 427-431. * |
FALANGA VINCENT et al.: "Wounding of bioengineered skin: Cellular and molecular aspects after injury." JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, Vol. 119, n 3, septiembre 2002 (2002-09), pßginas 653-660, XP002251236, ISSN: 0022-202X. * |
FALANGA VINCENT et al.: "Wounding of bioengineered skin: Cellular and molecular aspects after injury." JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, Vol. 119, nº 3, septiembre 2002 (2002-09), páginas 653-660, XP002251236, ISSN: 0022-202X. * |
FLETCHER et al.: "Gene expression analisys of EPIDERM following exposure to SLS using cDNA microarrays." Toxicology in vitro 2001, Vol. 15, páginas 393-398. \\ Y 6-29 * |
FLETCHER et al.: "Gene expression analisys of EPIDERM following exposure to SLS using cDNA microarrays." Toxicology in vitro 2001, Vol. 15, pßginas 393-398. * |
HAYDEN P J et al.: "Changes in cancer-related gene expression in an in vitro human skin model following UVB-irradiation." JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY. NEW YORK, NY, US, Vol. 114, n 4, abril 2000 (2000-04), pßgina 824, XP002217294 ISSN: 0022-202X. * |
HAYDEN P J et al.: "Changes in cancer-related gene expression in an in vitro human skin model following UVB-irradiation." JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY. NEW YORK, NY, US, Vol. 114, nº 4, abril 2000 (2000-04), página 824, XP002217294 ISSN: 0022-202X. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE10320633B4 (de) | 2006-04-13 |
GB2395490B (en) | 2005-06-22 |
FR2847268B1 (fr) | 2006-09-29 |
ES2331165B2 (es) | 2012-02-07 |
JP2004166686A (ja) | 2004-06-17 |
NL1022658C2 (nl) | 2004-06-03 |
JP5311749B2 (ja) | 2013-10-09 |
JP2009131251A (ja) | 2009-06-18 |
US20040096815A1 (en) | 2004-05-20 |
KR20040044078A (ko) | 2004-05-27 |
ES2331165A1 (es) | 2009-12-22 |
FR2847268A1 (fr) | 2004-05-21 |
GB0303216D0 (en) | 2003-03-19 |
KR100646047B1 (ko) | 2006-11-13 |
CH694328A5 (fr) | 2004-11-30 |
GB2395490A (en) | 2004-05-26 |
ES2270643B1 (es) | 2008-04-01 |
JP2007191482A (ja) | 2007-08-02 |
DE10320633A1 (de) | 2004-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5311749B2 (ja) | 太陽の放射にさらされた後の細胞の生存率を増大するための、又は炎症性分子の合成を制限するための、ラウリル酸ヘスペリチンおよびカプリル酸ケルシチンから選択される活性物質 | |
Paquet et al. | Oxygen tension regulates human mesenchymal stem cell paracrine functions | |
Wareham et al. | Age related reactivation of an X-linked gene | |
BR112020018602A2 (pt) | Reprogramação celular transiente para reversão de envelhecimento celular | |
ES2755096T3 (es) | Sistema que permite el mantenimiento de la supervivencia y el transporte de biopsias de piel y sus aplicaciones | |
CN110606869B (zh) | 一种促皮肤愈合肽oa-gp11及其制备方法与应用 | |
CN111759748A (zh) | 一种抗衰老肽类组合物及其应用 | |
ES2933121T3 (es) | Modelo ex vivo de piel humana inflamada y sus usos para el cribado de compuestos antiinflamatorios | |
DE10320602B4 (de) | Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen | |
WO2004011631A3 (en) | Methods and compositions for treating tissue defects using pulsed electromagnetic field stimulus | |
CN107022004B (zh) | 一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用 | |
Li et al. | Biphasic calcium phosphate recruits Tregs to promote bone regeneration | |
Xue et al. | The involvement of alpha-melanocyte-stimulating hormone in the hyperpigmentation of human skin autografts | |
FR2899106A1 (fr) | Utilisation d'une substance pour limiter et/ou prevenir la modification d'au moins un parametre biologique modifie au cours d'une irradiation | |
CN118561959A (zh) | 一种多肽、用于抗衰老的透皮水凝胶及应用 | |
CN117551590B (zh) | 长双歧杆菌婴儿亚种、微生物菌剂及其应用 | |
Jiang et al. | Contribution of Tregs to the promotion of constructive remodeling after decellularized extracellular matrix material implantation | |
Qiu et al. | Enhanced osteogenic differentiation in 3D hydrogel scaffold via macrophage mitochondrial transfer | |
Cappellozza | The main barrier of human body: the skin. An experimental in vitro model to evaluate morphological and functional biodistribution features in healthy and pathological conditions | |
El Sheikh et al. | Effect of He: Ne laser on the growth of Amnion cells grown over a synthetic nanoscaffolds | |
CN117137959A (zh) | 用于在待检体中使血管稳定化的、包含红花提取物的组合物 | |
Ivanova et al. | Secretion mechanisms of Wnt proteins | |
Isoir | Appraisal of alternative skin model for the study of epidermal restoration following exposure to various environmental stress agents: ionising radiation and UV B | |
WO2022265527A1 (en) | A process for the decellularization of adipose tissue and use of the resulting formulation, in particular in the form of an extracellular matrix (adipoecm) | |
JP2020146007A (ja) | 皮膚基底膜への障害を予防又は改善する物質のスクリーニング方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20070401 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2270643B1 Country of ref document: ES |
|
FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20211119 |