DE10320633B4 - Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden, und lebenden Zellen, die nicht diesem Reiz ausgesetzt wurden - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden, und lebenden Zellen, die nicht diesem Reiz ausgesetzt wurden Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von
(a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind, bezeichnet als gereizte Zellen,
(b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind, bezeichnet als Referenzzellen,
wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird, das zumindest Fibroblasten umfasst, was
die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter erlaubt, der nach einem Reiz verändert ist.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Veränderung (Modifikation) von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von
    • (a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind und als gereizte Zellen bezeichnet werden,
    • (b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind und als Referenzzellen bezeichnet werden,
    • (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird,
    dies erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der nach einem Reiz verändert ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von mindestens einer möglichen wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der bei einem Reiz verändert ist, umzukehren, oder der Veränderung von mindestens einem biologischen Parameter, der bei einem Reiz verändert wird, vorzubeugen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer durch dieses Verfahren ausgewählten wirksamen Substanz zur Herstellung mindestens einer kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine Substanz, die im Bereich der Kosmetik oder der Pharmazie wirksam ist und die durch solch ein Verfahren ausgewählt wurde.
  • Sonnenstrahlung wird durch elektromagnetische Strahlung, einschliesslich 56 % wärmebildender Infrarotstrahlung (Wellenlänge: 5.000 bis 800 nm), 39 % sichtbarem Licht (800 bis 400 nm) und 5 % Ultraviolettlicht A, B, C (400 bis 190 nm), einschliesslich ca. 4,9 % UVA und 0,1 UVB + UVC, gebildet.
    • • UVC-Strahlen, die sehr schädlich sind, werden im allgemeinen durch die Ozonschicht gefiltert.
    • • UVB-Strahlen werden teilweise beim Durchdringen der Atmosphäre und durch Glas gestoppt. Sie treffen auf die Epidermis, werden aber vor der Dermis gestoppt. Sie sind verantwortlich für die Bildung von Sonnenbrand, der durch die Anwesenheit von sonnenverbrannten Zellen gekennzeichnet ist. Hierbei handelt es sich um Keratinozyten, die den Apoptoseprozess aufgrund der im Kern hervorgerufenen DNA-Läsionen begonnen haben. Ihre Zahl ist hoch, wenn die UVB-Dosis hoch ist. Normalerweise ermöglicht ein natürliches Verteidigungsverfahren die Reparatur oder das Entfernen von gefährlichen Zellen, ein Ausfall des Systems durch Sättigung oder durch genetische Fehler spielt aber eine fundamentale Rolle beim Auftreten von Hautkrebs.
    • • UVA-Strahlen können im Sommer wie im Winter einfach durch die Atmosphäre gehen, sie gehen durch die Dermis und die Epidermis und sind aufgrund der aufgenommenen Menge ebenfalls für Schädigungen verantwortlich, obwohl sie weniger schädlich als UVB-Strahlen sind: UVA-Strahlen führen kaum oder gar nicht zu Sonnenbrandzellen, sie können aufgrund der Bildung von freien Radikalen zelluläre DNA, aber auch zelluläre Lipide und zelluläre Proteine schädigen. UVA-Strahlen sind verantwortlich für eine beschleunigte Hautalterung mit erhöhtem Abbau von Kollagen und elastischen Fasern sowie anderen Bestandteilen der extrazellulären Matrix innerhalb der Dermis. Weiterhin wurde in vielen Arbeiten gezeigt, dass UVA-Strahlen eine immunsuppressive Wirkung über die epidermalen Langerhans-Zellen aufzeigen, die nach Bestrahlung mit T-Lymphozyten interagieren und eine systemische Wirkung durch Cytokine und Neuromediatoren, die kaskadenartig durch epidermale Zellen und Nervenfasern hergestellt werden (L. Meunier, Eur. J. Dermatol. 1999, 9: 269-275), haben. Über einen längeren Zeitraum gesehen ist das Risiko für Hautkrebs erhöht, die Vorläufer- Krebszellen werden nicht länger als fremde Zellen erkannt und sie werden daher nicht durch das Immunsystem entfernt.
  • Eine europäische Heliosstudie (R. Zanetti et al., Br. J. Canc. 1996, 73: 1440-1554) zeigt die Beziehungen zwischen dem Aussetzen gegenüber UV-Strahlen, dem Haut-Phenotyp und Karzinomen und definiert das Wissen eines direkt mit UV-Strahlen verbundenen Risikos.
  • Neben anderen Schädigungen, die im Zusammenhang mit Bestrahlung bekannt sind, können hier solche aufgeführt werden, die aufgrund der Erhöhung der Temperatur bei Infrarotstrahlung hervorgerufen werden, die bei Melanozyten die Herstellung von Hitzeschockproteinen induziert, genauso wie Defekte, die ähnlich den durch UVB-Strahlen induzierten sind (Nakazawa et al., J. Invest. Dermatol. 1998, 110: 972-977); solche, die aufgrund von Nah-Infrarotbestrahlung die Wirkung auf die Zell-Lebensdauer von Hautzellen beeinflussen (B.H. Yoo et al., J. Cosmet. Sci. 2002, 53(3): 175-184); solche, die aufgrund von Aussetzen gegenüber sichtbarem Licht (wiederholte Dosis), eine Mutagenizität induzieren (O. Larko, Lakartidningen 2002, 99(18): 2036-2040); solche, die aufgrund ionisierter Bestrahlung Ulzerierung und Krebs bilden (G. Lorette, L. Machet, Cancer Radiother. 2001, 5(1): 116s-120s) oder Modifikationen des Zellmetabolismus, wie der Synthese von Kollagen Typ I und III in der Haut (R. Riekki et al., Arch. Dermatol. Res. 2002, 294(4): 178-184) oder sogar Modifikationen der Proliferation und der epidermalen Differenzierung (V. Sivan et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 53(2): 385-393), aber auch solche aufgrund der cytogenetischen Wirkungen von Mikrowellen (L. Zotti-Martelli et al., Mutat. Res. 2000, 472(1-2): 51-58) oder den onkogenen Effekten durch Hemmung von Hitzeschockproteinen (HSP70 und HSP27), oder durch Bildung von freien Radikalen durch elektromagnetische Felder und insbesondere solche, durch Mobiltelefone gebildete (P.W. French et al., Differenciation 2001, 67(4-5): 93-97; Di Carlo et al., J. Cell Biochem. 2002, 84(3): 447-454; D. Leszynski et al., Differenciation 2002, 70(2-3): 120-129; Y.M. Moustafa t al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 26(4): 605-608.
  • Es existieren auch andere Faktoren, wie bestimmte chemische Mittel (Wasserstoffperoxid, Stickoxid, Schwermetalle,) oder biologische Mittel (Viren, Bakterien,) und selbst mechanische Faktoren (Dehnung, Kompression), die eine Zellreizung induzieren können.
  • Zur Zeit werden diese Zellfunktionen, einschliesslich Proliferation, Differenzierung und Zelltod, die durch eine Vielzahl von Genen und Zellsignalwegen reguliert werden, ex vivo (Biopsie) oder in vitro in Zellkulturen von Monolayern, im allgemeinen von Fibroblasten, Keratinozyten oder Melanozyten, die von gesunden oder kranken Spendern oder von Zellinien stammen, untersucht. Weiterhin ist es nicht immer möglich, Daten bezüglich der Expression und der Zellsynthese als Funktion von bestimmten Reizen zu finden, oder die in vitro erhaltenen Ergebnisse stellen sich manchmal als gegensätzlich zu denen, wie sie in vivo aufgrund des vereinfachten, beim Experiment verwendeten Modells beobachtet werden können, heraus.
  • Über einige Jahre wurden verschiedene dreidimensionale Zellmodelle, hauptsächlich für die Zelltherapie, für Cytotoxizitätstests und Wirksamkeitstests, als Alternativen zu Tierexperimenten entwickelt. Als Epidermismodelle können solche genannt werden (EP-A1-0 789 074 von L'Oreal; A. de Brugerolle de Fraissinette et al., 1999, Cell Biol. Tox. 15: 121-135), die zur Vorhersage von akuter oder chronischer Hautreizung verwendet werden, aber auch Modelle von rekonstruiertem Epithel (G. Schmalz et al., Eur. J. Oral Sci. 2000, 108: 442-448; Nielsen et al., Int. J. Pharm. 2000, 200: 261-270), sowie von rekonstruierter Haut oder von pigmentierter rekonstruierter Haut und/oder immunkompetent rekonstruierter Haut (M. Regnier et al., Pour la Science (1999) 266: 154-159).
  • Einige dieser Modelle werden heutzutage häufig in pharmako-toxikologischen Bewertungen und Studien zur Wirksamkeit von pharmazeutischen und kosmetischen Wirkstoffen verwendet. Die verwendeten Analyseverfahren sind im wesentlichen Histologieverfahren, kombiniert mit bildgebender Analyse, Analyse von Stoffwechselsynthesen und deren Regulation mittels elektrophoretischer Analyse, Western-Blot, Northern-Blot oder RT-PCR-Analyse. Die Protein-Array- (oder MAPPing) und DNA-Arraytechniken, Techniken der zweidimensionalen Elektrophorese oder der kombinierten Cytokinbestimmung (Cytokine-MAP) wurden bei diesen dreidimensionalen Modellen, die durch Standard-Kulturbedingungen kultiviert werden, im Vergleich mit Kulturbedingungen, wobei diese Modelle einem Reiz unterliegen, egal ob physischer, chemischer, biologischer oder mechanischer Natur, bisher nicht verwendet.
  • Vielmehr wurden diese Techniken bisher in Zellsystemen von Monolayern, wie z.B. der Studie der verändernden Wirkung von ultraviolettem Reiz auf normale oder maligne humane Melanozyten (Zellinie oder aus Tumorgewebe extrahierten Melanozyten), kultiviert als Monolayer (C. Valery, J.J. Grob und P. Verrando, J. Invest. Dermatol. (2001) 117: 1471-1482), entwickelt und angewendet.
    •
  • ZIELE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG:
  • Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Studienmodells für Zellstoffwechsel, die die in vivo-Situation von Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind, wiedergibt.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von
    • (a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind und als gereizte Zellen bezeichnet werden,
    • (b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind und als Referenzzellen bezeichnet werden,
    • (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird,
    dies erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der nach einem Reiz verändert ist.
  • Diese Proteom- oder Transkriptom- oder Genomanalyse erlaubt die Definition von Wirkungstargets, die die Modifikation von mindestens einem Parameter, der während einer Reizsituation verändert ist, umkehrt oder deren Modifikation verhindert.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines dreidimensionalen Gewebemodells, wie es oben beschrieben ist, zur Beurteilung der Wirkung eines Wirkstoffs, insbesondere eines kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffs, auf das Genom- oder Proteinprofil.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von dreidimensionalen Gewebemodellen, wie sie oben beschrieben sind, zur Bewertung der Wirkung auf das Genom- oder Transkriptom- oder Proteomprofil einer Formulierung, insbesondere einer kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierung, enthaltend einen solchen Wirkstoff.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung mindestens eines möglichen Wirkstoffs, der in der Lage ist, die Modifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der während einer Reizsituation verändert ist, umzukehren oder die Modifizierung zu verhindern.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Wirkstoffs, ausgewählt durch ein solches Verfahren, und dessen Verwendung zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt die Lösung der oben dargestellten Probleme.
  • Erfindungsgemäss bedeutet "Genomstudie" das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils des Gesamtgenoms eines Organismus und deren Analyse, um deren Funktion zu untersuchen.
  • "Transkriptionstudie" bedeutet erfindungsgemäss das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils der Gesamt-RNAs, die vom Genom transkribiert wurden, und deren Untersuchung.
  • "Proteomstudie" bedeutet erfindungsgemäss das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils der exprimierten Proteine und deren Untersuchung.
  • Die Erfindung besteht im wesentlichen aus der Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von
    • (a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind und als gereizte Zellen bezeichnet werden,
    • (b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind und als Referenzzellen bezeichnet werden,
    • (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird,
    dies erlaubt die Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der nach einem Reiz verändert ist.
  • Zellen, die als "Referenzzellen" bezeichnet werden, sind Zellen, die nicht dem untersuchten Reiz unterworfen wurden. Es ist für den Fachmann klar, dass zur Optimierung der Erfindung Referenzzellen die Zellen sind, die am wenigstens irgendeinem Reiz unterworfen sind. Diese Zellen werden insbesondere aus. geschützten Biopsien erhalten, d.h. die einer sehr geringen Sonnenstrahlung ausgesetzt sind (Brust, Bauch, usw.) oder Zellen, die überhaupt keinem Reiz ausgesetzt sind (physischer, chemischer, biologischer oder mechanischer Reiz).
  • Zellen, die als "gereizte Zellen" bezeichnet werden, sind Zellen, die aus Biopsien von Bereichen stammen, die der Sonne ausgesetzt sind (Hand, Gesicht usw.) oder Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden (physischer, chemischer oder biologischer Reiz), einschliesslich den folgenden: UVA, UVB, Sonnenlicht, Infrarot, nahes Infrarot, Wärme, Magnetfeld, elektromagnetische Strahlung, einschliesslich Mikrowellen und Wellen von Mobiltelefonen, Ionisierungsstrahlung, einschliesslich β-, γ- und Röntgenstrahlung, wie solchen, denen sie unterworfen werden, wenn sie zufällig oder nicht-zufällig einer solchen Strahlung ausgesetzt sind, usw. Die Zellen können aus verschiedenen Biopsien vom gleichen oder von verschiedenen Spendern stammen.
  • Der biologische Parameter entspricht im allgemeinen irgendeiner Modifikation der Expression eines Gens, irgendeiner Modifikation der Sekretion eines Proteins oder irgendeiner Modifikation, die im Stoffwechsel der Referenzzelle beobachtet werden kann.
  • Das Gewebemodell wird als ein Gewebemodell – auch als dreidimensionales Modell bezeichnet – definiert, das mit lebenden Zellen ausgesät werden kann, insbesondere mit dem Ziel der Rekonstruktion eines Gewebes eines Lebewesens, insbesondere ist das Gewebemodell definiert als eines, das ein Bindegewebematrixmodell sein kann; dieses wird im Fall der Haut als Dermis und im Fall der Mukosa als Chorion bezeichnet (enthaltend hautsächlich Stromazellen), ein Epithelmodell (hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen), ein Epidermismodell (hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten), ein Hautmodell (hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis), ein Modell einer Mukosa (bestehend aus einem Epithel und einem Chorion), einem Biopsiemodell (oder Transplantaten), das am Leben erhalten wird, genauso wie Modelle mit Monolayer oder in Suspension, die die in den oben beschriebenen Modellen vorhandenen Zellen verwenden.
  • In den Zellen können normale, gesunde oder pathologische Zellen verwendet werden oder Zellen, die von Zellinien stammen; diese Zellen können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
  • Gemäss einer Variante dieser letzten Eigenschaft umfasst das dreidimensionale Bindegewebematrix-Kultivierungsmodell (Dermis oder Chorion) einen mit Stromazellen ausgesäten Träger, um rekonstruierte Dermis oder rekonstruiertes Chorion zu bilden.
  • Die dreidimensionalen Epidermis- oder Epithelzellmodelle umfassen einen Träger, der gegebenenfalls zuvor mit Stromazellen ausgesät wurde, insbesondere Fibroblasten, und anschliessend werden diese Modelle mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten ausgesät, um rekonstruiertes Epithel oder Epidermis zu erhalten.
  • Das dreidimensionale Kultivierungsmodell von rekonstruierter Haut oder Mukosa umfasst einen Matrixträger (dermal oder von Chorion), ausgesät mit Epithelzellen, um eine rekonstruierte Mukosa zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um eine rekonstruierte Haut zu erhalten.
  • Gemäss einer Variante umfasst das verwendete dreidimensionale Kultivierungsmodell ein Modell, in das mindestens eine weitere Zellart, z.B. Epithelzellen (EC) und/oder Lymphozyten und/oder Fettzellen und/oder Hautfortsätze, wie Körperhaar, Haar, Talgdrüsen, eingefügt wurde.
  • Gemäss einer anderen Variante kann der dreidimensionale Träger weiterhin die Kolonisierung durch irgendeine andere Zellart erlauben (Immunzellen, Endothelzellen, Neuronen, Muskelzellen, Hepatozyten usw.).
  • Pigmentzellen, immunkompetente Zellen (Langerhans-Zellen und/oder dendritische Zellen), Nervenzellen usw., können vorteilhaft zu dem epithelialen Bereich zugefügt werden.
  • Die verschiedenen gewonnenen Zellarten (Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten usw.) werden getrennt vervielfältigt und können von verschiedenen Spendern separat oder zusammen zur Rekonstruierung der dreidimensionalen Modelle, genauso wie für die Kulturen in Monolayern oder in Suspensionen verwendet werden.
  • Die oben definierten Gewebemodelle werden am Ende der Kultivierung verwendet, um Genom- und Proteomanalysen durchzuführen, die insbesondere die Auswahl, Identifizierung und Charakterisierung möglicher Targets zur Bekämpfung von Wirkungen aufgrund eines Reizes erlauben.
  • Die möglichen Targets entsprechen den biologischen Parametern, die wieder rückgängig gemacht oder deren Modifikation verhindert werden soll.
  • Je nach Definition der Targets können die gleichen Modelle und Nachweisverfahren zum Screenen von kosmetisch oder pharmazeutisch wirksamen Bestandteilen verwendet werden. Zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen, die diese Bestandteile enthalten oder nicht enthalten, können die gleichen Modelle und Nachweisverfahren verwendet werden.
  • Diese Modelle und Nachweisverfahren können ebenfalls zum Nachweis der Toxizität von Wirkstoffen, von Kosmetika oder Pharmazeutika oder von kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden; diese Toxizität wird durch einen Reiz, insbesondere durch Fototoxizität, induziert.
  • Unter den verwendeten Analysetechniken können insbesondere die folgenden genannt werden:
    • • zur Analyse des Proteomprofils: zweidimensionale Elektrophorese und/oder Proteinarrays und/oder Cytokin-Arrays und/oder kombinierte ELISA-Nachweise,
    • • zur Analyse des Genomprofils: DNA-Arrays und/oder Multiplex-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR) und/oder Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-PCR),
    • • zur Analyse des Transkriptomprofils: RNA-Arrays, cDNA-Arrays und/oder Multiplex-Reverse-Transkription Polymerasekettenreaktion (Multiplex-RT-PCR) und/oder Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und/oder Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
  • Gemäss einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von:
    • (a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind, sogenannte gereizte Zellen,
    • (b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind, sogenannte Referenzzellen,
    • (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird,
    dies erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der nach einem Reiz verändert ist.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend:
    • (a) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse von lebenden Zellen, die einem Reiz unterworfen wurden, sogenannte gereizte Zellen, die in einem Gewebemodell ausgesät wurden;
    • (b) Vergleichen der in (a) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse von lebenden Zellen, die diesem Reiz nicht unterworfen wurden, sogenannte Referenzzellen; und
    • (c) mögliche Identifizierung einer Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, der nach diesem Reiz verändert ist.
  • Bevorzugt werden die Referenzzellen und die gereizten Zellen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet.
  • Bevorzugt ist der unter einem Reiz veränderte biologische Parameter durch mindestens einen Unterschied im Stoffwechsel der als gereizte Zellen bezeichneten Zellen und dem Stoffwechsel der als Referenzzellen bezeichneten Zellen definiert.
  • Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der obige Schritt (a) die folgenden Schritte:
    • (a1) Aussäen einer oder mehrerer Zellart(en) der sogenannten Referenzzellen in einem Zellmodell, d.h. in einem Monolayer, oder in einer Suspension und/oder einem Gewebemodell, d.h. dreidimensional;
    • (a2) Aussetzen dieses Modells einem Reiz, so dass diese Zellen als gereizte Zellen bezeichnet werden können.
  • Gemäss einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst Schritt (a) die folgenden Schritte:
    • (a1) Aussetzen einer oder mehrerer Art(en) von lebenden Zellen einem Reiz, so dass diese Zellen gereizte Zellen sind;
    • (a2) Verwendung dieser gereizten Zellen in einem Zellmodell, d.h. in einem Monolayer oder in einer Suspension und/oder einem Gewebemodell, d.h. dreidimensional.
  • Vorteilhafterweise ist der Reiz ein physischer Reiz, der ausgewählt sein kann aus: UVA, UVB, Sonnenlicht, Infrarot, nahem Infrarot, Wärme, Magnetfeld, elektromagnetischer Strahlung, einschliesslich Mikrowellen und Wellen von Mobiltelefonen, ionisierender Strahlung, einschliesslich β-, γ- und Röntgenstrahlung, denen man zufällig oder nicht-zufällig ausgesetzt ist, und/oder ein physiko-chemischer Reiz und/oder biologischer Reiz und/oder mechanischer Reiz.
  • Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform sind die gereizten Zellen entweder:
    • • Zellen, die aus Biopsien stammen, die aus Bereichen genommen wurden, die der Sonne ausgesetzt waren; der Fachmann kennt diese Bereiche, wie z.B. das Gesicht.
    • • Zellen, die durch physischen Reiz gereizt wurden, ausgewählt aus: UVA, UVB, Sonnenlicht, Infrarot, nahem Infrarot, Wärme, Magnetfeld, elektromagnetischer Strahlung, einschliesslich Mikrowellen und Wellen von Mobiltelefonen, ionisierender Strahlung, einschliesslich β-, γ- und Röntgenstrahlung, denen man zufällig oder nicht-zufällig ausgesetzt ist, und/oder ein physiko-chemischer Reiz und/oder biologischer Reiz und/oder mechanischer Reiz.
  • Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform sind die Referenzzellen entweder Zellen, die aus Biopsien stammen, die durch Sonnenbestrahlung nicht stark gereizt wurden, wie Brust, Bauch, Vorhaut, oder Zellen, die nicht durch einen Reiz, wie physischem Reiz durch UVA und/oder UVB und/oder Sonnenstrahlung und/oder Bestrahlung durch ein Magnetfeld und/oder chemischen Reiz und/oder biologischen Reiz und/oder mechanischen Reiz, gereizt wurden.
  • Vorteilhafterweise sind diese gereizten Zellen Zellen von mindestens einem Menschen oder von mindestens einem Tier.
  • Bevorzugt umfasst die Untersuchung mindestens eine Analyse, ausgewählt aus den folgenden Analyseverfahren:
    • • zur Analyse des Proteomprofils: zweidimensionale Elektrophorese und/oder Proteinarrays und/oder Cytokin-Arrays und/oder kombinierte ELISA-Nachweise,
    • • zur Analyse des Genomprofils: DNA-Arrays und/oder Multiplex-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR) und/oder Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-PCR),
    • • zur Analyse des Transkriptomprofils: RNA-Arrays, cDNA-Arrays und/oder Multiplex-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-RT-PCR) und/oder Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und/oder Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR).
  • Bevorzugt wird das Gewebemodell kultiviert und/oder unter solchen Bedingungen konserviert, die zumindest teilweise einen Zellstoffwechsel aufrecht erhalten.
  • Bevorzugt umfasst das Gewebemodell zumindest Fibroblasten oder Keratinozyten.
  • Bevorzugt umfasst dieses Modell normale, gesunde oder pathologische Zellen oder Zellen, die von Zellinien stammen, bevorzugt solche Zellen, die von Menschen oder Tieren stammen.
  • Bevorzugt ist das Gewebemodell aus den folgenden Modellen ausgewählt: ein Modell einer Bindegewebematrixmodell, im Fall der Haut als Dermis bezeichnet und im Fall der Mukosa als Chorion bezeichnet (enthaltend hautsächlich Stromazellen), ein Epithelmodell (hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen), ein Epidermismodell (hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten), ein Hautmodell (hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis), ein Modell einer Mukosa (bestehend aus einem Epithel und einem Chorion).
  • Bevorzugt ist das Gewebemodell ein Gewebemodell einer Bindegewebematrix (Dermis oder Chorion), umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:
    • • einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran, einer Membran oder einem Film aus Polyglykolsäure. In dieser Gruppe finden sich beispielsweise das Haut- Modell Skin2TM, das Modell ZK1100 sowie Dermagraft® und Transcyte® (Advanced Tissue Sciences);
    • • mit Zellkultur behandelter Kunststoff (Bildung einer Haut-Folie: M. Mitchell et al., In Vivo Cell Dev. Biol.-Animal (1999) 35: 318-326),
    • • einem Gel oder einer Membran auf Basis von Hyaluronsäure (Hyalograft® 3D – Fidia Advances Biopolymers) und/oder auf Kollagen- und/oder auf Fibronectin- und/oder auf Fibrinbasis; zu dieser Gruppe zählt z.B. das Haut-Modell Vitrix® (Organogenesis);
    • • einer porösen Membran, die oberflächenbehandelt sein kann, hergestellt aus Kollagen, die ein oder mehrere Glycosaminoglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann (EP-A1-0 296 078 von CNRS, WO 01/911821 und WO 01/92322 von Coletica); in diese Gruppe fällt z.B. das Haut-Modell Mimederm® (Coletica), diese Matrixträger umfassen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten.
  • Bevorzugt ist das Gewebemodell ein Epidermis-Gewebemodell oder ein Epithel-Gewebemodell, umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:
    • • einem inerten Träger, ausgewählt aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; hierunter fallen die rekonstruierten Epidermis- und Epithelmodelle (Skinethic®) genauso wie die Modelle EpiDerm®, EpiAirway® und EpiOccular® (Mattek Corporation);
    • • einem Film oder eine Membran auf Basis von Hyaluronsäure und/oder auf Kollagenbasis und/oder auf Fibronectinbasis und/oder auf Fibrinbasis; hier können insbesondere die Modelle Mimetop® (Coletica), Laserskin® (Fidia Advanced Polymers), Episkin® (L'Oreal) genannt werden.
  • Diese Modelle werden zuvor mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten ausgesät.
  • Bevorzugt werden in den epithelialen Teil Epithelzellen, Pigmentzellen, immunokompetente Zellen und Nervenzellen zusätzlich zu den Epithelzellen eingefügt, bevorzugt sind die immunkompetenten Zellen Langerhans-Zellen.
  • Vorteilhafterweise ist das Gewebemodell ein Gewebemodell einer rekonstruierten Haut oder Mukosa, umfassend einen Haut- oder Chorionmatrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:
    • • einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
    • • einem Gel auf Basis von Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
    • • einer porösen Membran aus Kollagen, die oberflächenbehandelt sein kann und die ein oder mehrere Glycosaminglycane und/oder gegebenenfalls. Chitosan enthalten kann; diese poröse Matrizes integrieren Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
    • • deepidermisierte Dermis oder tote Dermis, die menschlichen oder tierischen Ursprungs sein kann.
  • Hier können insbesondere die Modelle Mimeskin® (Coletica), Apligraf® (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems® Biotechnologie Vertrieb) sowie Skin2TM (ZK1200-1300-2000 – Advanced Tissue Science) genannt werden.
  • Weiterhin existieren Modelle, die zur Gewebetherapie vorgesehen sind, diese können auch Gegenstand dieser Studien sein. Hier können die Modelle EpidexTM (Modex Therapeutiques), Epibase® (Laboratoire Genevrier), EpicellTM (Genzyme) , AutodermTM und TransdermTM (Innogenetics) genannt werden.
  • Der Matrixträger wird dann mit Epithelzellen ausgesät, um eine rekonstruierte Mukosa zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um rekonstruierte Haut zu erhalten.
  • Vorteilhafterweise umfasst das verwendete Gewebemodell ein Modell, in dem mindestens eine weitere Zellart eingefügt wurde, bevorzugt Endothelzellen (EC) und/oder Immunzellen, wie Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Fettzellen und/oder Hautfortsätze, wie Körperhaar, Haar und Talgdrüsen.
  • Gemäss einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eines der oben definierten Verfahren zur Durchführung eines Screenens von mindestens einer potentiell wirksamen Substanz, die mindestens einen biologischen Parameter, der, wie oben definiert, während eines Reizes verändert ist, umkehren kann.
  • Gemäss einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Verfahrens zur Durchführung eines Screenens von mindestens einer potentiell wirksamen Substanz, die in der Lage ist, eine Veränderung mindestens eines biologischen Parameters, der, wie oben definiert, während eines Reizes verändert ist, verhindert.
  • Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Screenens mindestens einer potentiell wirksamen Substanz, die in der Lage ist, eine Vorbeugung von oder die Umkehr der Veränderung mindestens eines biologischen Parameters, der während des oben definierten Reizes verändert wird/wurde, bereitzustellen, umfassend:
    • (A) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den oben definierten Referenzzellen, ausgesät in einem oben definierten Gewebemodell, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; Anlegen eines oben definierten Reizes;
    • (B) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse zur Untersuchung der Wirkung dieser Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen;
    • (C) Vergleichen des Zellstoffwechsels dieser Zellen in Anwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz mit dem Stoffwechsel dieser Zellen in Abwesenheit dieser Substanz, sogenannte Kontrollzellen; und
    • (D) Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Aktivität der möglicherweise aktiven Substanz, genauer umfassend die Identifizierung einer positiven oder negativen Wirkung der Substanz, um einer Veränderung des biologischen Parameters vorzubeugen
  • Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während eines Reizes verändert ist, umzukehren, umfassend:
    • (a) Kultivieren von Zellen, die einem Reiz ausgesetzt werden, sogenannte gereizte Zellen, bevorzugt wie oben definiert, mit einem veränderten biologischen Parameter, in Anwesenheit mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz über einen Zeitraum, der ausreicht, diese möglicherweise wirksame Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen wirken zu lassen; diese gereizten Zellen wurden in einem oben definierten Gewebemodell ausgesät;
    • (b) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, der in Schritt (a) kultivierten gereizten Zellen;
    • (c) Vergleichen der unter (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, den sogenannten Kontrollzellen;
    • (d) nach Vergleich der in (c) durchgeführten Analysen, mögliches Identifizieren mindestens einer wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter, der während eines Reizes verändert ist, umzukehren.
  • Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Modifikation mindestens eines biologischen Parameters, der während eines Reizes verändert ist, vorzubeugen, umfassend:
    • (a) In-Kontakt-Bringen der möglicherweise wirksamen Substanz mit den oben definierten Referenzzellen, ausgesät in einem oben definierten Gewebemodell, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; Anlegen eines oben definierten Reizes;
    • (b) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, der in Schritt (a) kultivierten gereizten Zellen;
    • (c) Vergleichen der unter (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, den sogenannten Kontrollzellen;
    • (d) aufgrund der vergleichenden Analyse gemäss Schritt (c), mögliches Identifizieren mindestens einer wirksamen Verbindung, die der Modifikation mindestens eines biologischen Parameters, der während eines Reizes verändert ist, vorbeugt.
  • Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Substanz, ausgewählt mittels der oben definierten Verfahren, zur Herstellung mindestens einer kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz, die im Bereich der Kosmetik oder Pharmazie wirksam ist und die aus den oben definierten Verfahren ausgewählt wurde.
  • Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine wirksame Substanz, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter umzukehren, der sich aufgrund von physikalischem, chemischem oder biologischem Reiz als verändert herausstellte, und/oder das Vorbeugen der Veränderung dieses Parameters, der durch vergleichende Studien zwischen Zellmodellen unter Verwendung von sogenannten gereizten Zellen und Zellmodellen unter Verwendung von sogenannten Referenzzellen identifiziert wurde. Eines dieser Modelle ist ein Gewebemodell, umfassend mindestens Fibroblasten oder Keratinozyten.
  • Andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden erläuternden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Beispiele deutlich. Diese Beispiele werden zur besseren Darstellung aufgeführt, begrenzen aber nicht den Umfang der Erfindung. In den Beispielen sind alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, die Temperatur ist in °C angegeben und der Druck ist atmosphärischer Druck, sofern nicht anders angegeben.
  • Die Abk. "M", "mM" und "μM" stehen in folgenden für die Einheiten mol/l, mmol/l bzw. μmol/l.
    •
  • BEISPIEL 1
  • Gewinnung und Kultivierung sogenannter gereizter Zellen und sogenannter Referenzzellen:
  • Zellen, die als Referenzzellen bezeichnet werden, sind:
    • • Zellen, die aus Biopsien von Spendern verschiedenen Alters gewonnen wurden, wobei die Biopsien nicht durch Sonne gereizt waren und durch plastische Chirurgie erhalten wurden, bevorzugt aus dem Bauch- oder Brustbereich oder möglicherweise aus dem Vaginal- oder Zahnbereich.
  • Zellen, die als gereizte Zellen bezeichnet werden, sind:
    • • Zellen, die aus Biopsien von Spendern verschiedenen Alters gewonnen wurden, wobei die Biopsien, die durch Sonne gereizt waren (Gesicht, Hals, Hand) durch plastische Chirurgie erhalten wurden.
  • Die erhaltenen Zelltypen können Fibroblasten sein, gewonnen durch Explantattechniken oder durch enzymatischen Verdau, z.B. mit Kollagenase, Keratinozyten oder Melanozyten, gewonnen nach enzymatischer dermoepidermischer Trennung, insbesondere mit Dispase oder Thermolysin oder Trypsin-EDTA.
  • Nach Aufreinigung werden die Fibroblasten in DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagles Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 (V/V), versetzt mit 10 % Kälberserum, Penicillin in einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, vermehrt. Die Fibroblasten werden durch Trypsinierung bis zu einer Konfluenz von 90 vermehrt.
  • Nach Aufreinigung werden die Keratinozyten in K-SFM-Medium (Keratinozyten-Serum-freies Medium – Invitrogen) mit Extrakt aus Rinderhirnanhangdrüse, versetzt mit Penicillin in einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, vermehrt. Die Keratinozyten werden durch Trypsinierung bis zu einer Konfluenz von 90 % vermehrt.
  • Nach Aufreinigung werden die Melanozyten, in MMK2-Medium (Melanocyte Medium Kit – Sigma), versetzt mit Penicillin in einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Amphotericin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Geneticin mit einer Konzentration von 100 μg/ml, für 3 Tage vermehrt, um verbliebene Keratinozyten zu eliminieren. Die Kultur wird dann, mit Ausnahme des Geneticins, im gleichen Medium fortgesetzt. Die Melanozyten werden durch Trypsinierung bei einer erhaltenen Konfluenz von 90 % vermehrt.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von rekonstruierter Dermis aus sogenannten gereizten Zellen oder aus sogenannten Referenzzellen:
  • 500.000 Fibroblasten, die aus einem Pool von 3 Referenzbiopsien (Brustbiopsie) und aus einem Pool von 3 gereizten Biopsien-(Liften) stammen, vermehrt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in einem dermalen Substrat aus Kollagen, vernetzt mit Diphenylphosphorylazid, in einem DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 % Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat in einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, für einen Zeitraum von 21 Tagen ausgesät.
  • BEISPIEL 3
  • Quantifizierung der Cytokine in rekonstruierter Dermis, die zuvor mit sogenannten gereizten Zellen oder mit sogenannten Referenzzellen ausgesät wurden; der Reiz ist Bestrahlung durch UVA:
  • 500.000 Fibroblasten, die aus einer Referenzbiopsie stammen (Brustbiopsie), vermehrt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in einem dermalen Substrat aus Kollagen, vernetzt mit Diphenylphosphorylazid, in einem DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 % Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat in einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, für einen Zeitraum von 15 Tagen ausgesät. Anschliessend wurden sie für eine weitere Woche in einem serumfreien Medium kultiviert (FBM, Fibroblast-Grundmedium – Promocell).
  • Am Ende des Experiments wurde die rekonstruierte Dermis mit Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4) gespült und anschliessend in kleine Petrischalen, enthaltend 1 ml PBS mit einem pH von 7,4, verbracht. Bestimmte Proben wurden bei Umgebungstemperatur aufbewahrt (rekonstruierte Dermis, als Referenzdermis bezeichnet) und andere wurden mit UVA (365 nm) mit zunehmender Dosis bestrahlt (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 J/cm2).
  • Die rekonstruierte Dermis, umfassend sogenannte gereizte Zellen oder Referenzzellen, wurde dann in ein serumfreies Medium (FBM, Promocell) für 24 Stunden inkubiert. Die Lebendrate der Zellen in den Matrizes wurde mit einem MTT (Methylthiazoltetrazolium)-Test untersucht und als Prozentsatz der nicht-bestrahlten Kontrolle ausgedrückt. Das Medium wurde gesammelt, zentrifugiert und der Cytokingehalt wurde mittels Fluorokine MAP-Kit (R&D Systems) bestimmt. Kurz dargestellt wurden 50 μl-Standards oder -Proben in identische Vertiefungen pipettiert. 50 μl der mit spezifischem Antikörper immobilisierten Mikropartikel für verschiedene Cytokine wurden gemäss einem zuvor definierten Schema zu den Vertiefungen gegeben. Nach 1-stündiger Inkubation unter rotierendem Schütteln und Entfernen der nicht-gebundenen Substanzen durch Waschen, wurden markierte Antikörper gegen verschiedene Cytokine in die Vertiefungen gegeben und für weitere 2 Stunden unter rotierendem Schütteln inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Mikropartikel in Waschpuffer suspendiert und 1 Minute unter Schütteln gerührt. Die Auswertung erfolgt unmittelbar danach mit einem Luminex 100-Analysator (R&D Systems). Der Gehalt der verschiedenen Cytokine im Medium wurde mittels kalibrierter Bereiche durch hoch aufgereinigte rekombinante humane Cytokine untersucht. Diese Technik erlaubt die Analyse der zellulären Sekretion von verschiedenen Cytokinen (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα, GM-CSF, G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF, IFNγ).
  • TABELLE 1
    Figure 00300001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass Reize (hier UVA-Bestrahlung) eine Abnahme der Zell-Lebensfähigkeit sowie eine Zunahme der Synthese von pro-inflammatorischen Interleukinen induzieren; es kann daher von Interesse sein, diese Zunahme der Synthese unter Verwendung von entsprechend ausgewählten Wirkstoffen wieder zu erniedrigen.
  • BEISPIEL 4
  • Quantifizierung der Cytokine in rekonstruierter Epidermis, enthaltend sogenannte gereizte Zellen oder sogenannte Referenzzellen, zur Identifizierung eventueller Cytokinmodulation; der Reiz ist z.B. Bestrahlung durch UVB:
  • 4 × 106 Referenz-Keratinocyten, die keiner UVC-Bestrahlung ausgesetzt waren (Brustbiopsie) und die dann wie in Beispiel 1 beschrieben bis zur Passage 1 (erste Vermehrung durch Trypsinierung) vermehrt wurden, wurden in Boyden-Kammereinsätze (Membrandurchlässigkeit: 0,4 μm, Durchmesser: 25 mm) ausgesät. Diese Kammern wurden zuvor mit Nährfibroblasten-Unterschichten ausgesät, versetzt mit DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Kultivierungszeitraum von 3 bis 8 Tagen eingetaucht.
  • Die Keratinocytenkulturen wurden für 12 bis 18 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Tauchkultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
  • 6 Proben wurden am Ende der Kultur keiner Behandlung unterworfen (Referenzzellen umfassendes Modell = Kontrolle).
  • Verschiedene Reize wurden an insgesamt 6 rekonstruierte Epidermen angelegt. Für jede Art von Reiz können verschiedene, z.B. aus der nachstehenden Liste ausgewählte Protokolle verwendet werden:
  • Chemischer Reiz:
  • Verschiedene Mittel – z.B. 2 % Natriumlaurylsulfat (SLS), 0,05 % Tretinoin, Wasserstoffperoxid (3 bis 300 μM), Stickstoffmonoxid (NO) (MAHMA-Nonoat 0,1 bis 1 μM), Hypoxie durch Sättigung mit CO2 oder Zigarettenrauch – werden für 10 Minuten bis 1 Stunde auf die rekonstruierte Epidermis aufgebracht und dann durch Spülen mit PBS (pH 7,4) entfernt.
  • Biologischer Reiz:
  • Verschiedene Mittel – z.B. TGFβ (5 bis 10 ng/ml), TNFα (50, 100 bzw. 200 IU/ml), IL-1 (5 bis 10 ng/ml), LPS (Lipopolysaccharid 5 bis 10 ng/ml) – werden für 1 Stunde auf die rekonstruierte Epidermis aufgebracht und anschliessend durch Spülen mit PBS (pH 7,4) entfernt.
  • Mechanischer Reiz:
  • Die rekonstruierte Epidermis wurde geschnitten oder für 1 Stunde zusammengedrückt.
  • Thermischer Reiz:
  • Die rekonstruierte Epidermis wurde für 1 Stunde auf 37°C, 40°C bzw. 43°C gebracht.
  • Magnetfeld:
  • Die rekonstruierte Epidermis wurde für 1 Stunde unter ein Magnetfeld gebracht, z.B. 835 MHz/0,6 W und 1.800 MHz/0,125 W (Radiofrequenz von Mobiltelefonen).
  • Mikrowellen:
  • Die rekonstruierte Epidermis wurde Mikrowellen mit einer Frequenz von 2,45 bzw. 7,7 GHz und einer Leistung von 30 mW/cm2 ausgesetzt.
  • Ionisierende Strahlung:
  • Die rekonstruierte Epidermis wurde Röntgenstrahlen in einer Dosis von 0,2 bis 10 mGy ausgesetzt.
  • UV-Reiz:
    • UVA (0 bis 60 J/cm2), UVB (0 bis 100 mJ/cm2), Sonnenlicht (0 bis 3.500 kJ/cm2).
  • In diesem Experiment wurde eine Bestrahlung vom UVB-Typ ausgewählt. Dafür wurde das Kulturmedium entfernt und durch PBS (pH 7,4) ersetzt und bestimmte rekonstruierte Epidermis, die in den Einlagen vorhanden waren, wurden mit zunehmenden UVB-Dosen (312 nm) von 0 bis 100 mJ/cm2 bestrahlt. Die anderen wurden unter den gleichen Bedingungen ohne Bestrahlung gehalten (sogenannte nicht-gereizte Referenz-Epidermis). Die so behandelte rekonstruierte Epidermis wurde dann für weitere 24 Stunden im Immersionsmedium inkubiert. Die Bestimmung der Cytokine wurde mittels Fluorokine MAP wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Bestimmung der Proteine (Bicinchroninsäure-Kit zur Proteinbestimmung – Sigma, St. Louis, USA) oder durch einen anderen Test zur Bestimmung der Zell-Lebensfähigkeit, der die Bestimmung der alkalischen Phosphataseenzymaktivität ermöglicht (Inkubation für 2 Stunden bei 37°C in einer Lösung, enthaltend 5 mM p-Nitrophenylphosphat, 0,1 m Natriumacetat und 0,1 Triton X100, pH 5, dann Neutralisieren mit 10 % 1 N NaOH und Messen der Absorption bei 405 nm), durchgeführt.
  • Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der nicht-bestrahlten Kontrolle ausgedrückt und sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
  • TABELLE 2
    Figure 00340001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass ein Reiz (hier UVB-Bestrahlung) eine signifikante Abnahme der Zell-Lebensfähigkeit sowie eine Zunahme der Synthese von pro-inflammatorischen Interleukinen induziert; es kann daher von Interesse sein, diese Zunahme der Synthese zu erniedrigen und die Zellsterblichkeit zu begrenzen durch Verwendung von entsprechend ausgewählten Wirkstoffen.
  • BEISPIEL 5
  • Herstellung von rekonstruiertem mukosalen Zahnfleischepithel, umfassend sogenannte gereizte Zellen oder Referenzzellen zur Quantifizierung der mRNAs von Cytokinen, Chemokinen und immunmodulierenden Faktoren:
  • 1 bis 2 × 106 Epithelzellen der Zahnfleischmukosa, als Referenz-Zahnfleischmukosa-Epithelzellen bezeichnet (Zahnfleischbiopsie, Passage 3 (3. Vermehrung nach Trypsinierung)), gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Boyden-Kammereinsätzen ausgesät (Membranporosität: 0,4 μm, Durchmesser: 10 mm, Nährfibroblasten-Unterschicht), mit DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium, versetzt mit 10 Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 3 bis 8 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
  • Die Epithelzellkulturen wurden für 12 bis 18 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass der Prozentsatz an Kälberserum um 10 bis 1 % erniedrigt war, in Immersion gehalten.
  • Am Ende des Experiments wurde das Medium entfernt und durch PBS (pH 7,4) ersetzt. Die rekonstruierten Epithele in den Einsätzen wurden durch verschiedene mögliche reizende oder sensibilisierende Mittel in einer Menge von 20 μl pro Epithel für 1 Stunde gereizt: 5 Natriumlaurylsulfat (SLS), Lipopolysaccharid (LPS) 1.000 U/ml, Prednisolon 10 mM (entzündungshemmendes Mittel von Sigma) und aktive Inhipase® (Extrakt aus der Wurzel von Pueraria lobata, Coletica), ebenfalls mit 20 μl pro Epithel für 1 Stunde. Die dem rekonstruierten Epithel zugesetzten Mittel wurden entfernt und das rekonstruierte Epithel wurde für 24 Stunden in Immersionsmedium ohne Kälberserum inkubiert. Bestimmte rekonstruierte Epithele wurden dann bezüglich der Zell-Lebensdauer mittels MTT (Methylthiazoltetrazolium) getestet. Andere rekonstruierte Epithele wurden abgekratzt und mit Tri Reagent® (T9424, Sigma, St. Louis, USA) aufgenommen und mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugieren bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht.
  • Die Bestimmung der mRNAs der Epithele wurde mittels Expression Array (R&D System) gemäss Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Ergebnisse sind als veränderter Faktor in bezug auf die nicht-gereizte Kontrolle dargestellt: (Ergebnisse der gereizten Zellen/Ergebnisse der nicht-gereizten Zellen) × 100.
  • TABELLE 3
    Figure 00370001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren kann man erkennen, dass ein Reiz (hier die Anwendung eines Mittels vom reizenden oder sensibilisierenden Typ) eine Veränderung von verschiedenen Entzündungsmarkern induziert. Die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils Inhipase® wird im Vergleich zu dem Referenz-Entzündungshemmer dargestellt.
  • BEISPIEL 6
  • Herstellung eines Gewebemodells aus rekonstruierter Haut, Untersuchung von thermischem Reiz auf die Synthese von mRNA und Vergleich zwischen jungen und alten Spendern:
  • Die Zellen wurden von Licht-geschützten Brustbiopsien erhalten.
  • 400.000 sogenannte junge Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von weniger als 35 Jahren) und sogenannte alte Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von mehr als 55 Jahren) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und bis zur Passage 5 vermehrt (5. Vermehrung durch Trypsinierung) und dann auf zwei dermalen Substratflächen ausgesät.
  • Kurz dargestellt, wurden die dermalen Substrate wie folgt hergestellt:
    • • Trocknen eines 0,75 %-igen Kollagengels bei 25°C, um einen Film zu bilden,
    • • Auftragen des Kollagenfilms auf 0,75 %-iges Kollagengel,
    • • Lyophilisieren für 24 Stunden und Vernetzen mit DPPA (50 μl/g Diphenylphosphorylazid auf Kollagen in Dimethylformamid als Lösungsmittel und dann Boratpuffer, pH 8,9)
    • • nach Spülen mit entmineralisiertem Wasser wurden die oberflächenbehandelten dermalen Substrate wieder lyophilisiert.
  • Das zur Kultivierung der Fibroblasten verwendete Medium ist ein DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10% Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und mit Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml. Zum Erhalt rekonstruierter Dermis wird eine Kultivierungszeit von 14 Tagen benötigt.
  • Anschliessend wurden 400.000 sogenannte junge Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von weniger als 35 Jahren) und sogenannte alte Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von mehr als 55 Jahren), die wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und bis zur Passage 2 (2. Vermehrung durch Trypsinierung) vermehrt wurden, auf äquivalente dermale Oberflächen auf der Filmseite in einem DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium ausgesät, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 7 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
  • Die Kulturen wurden für weitere 14 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
  • Am Ende des Experiments wurde das Medium entfernt und durch PBS (pH 7,4) ersetzt und die rekonstruierte Haut, die in den Einsätzen vorhanden war, wurde für 1 Stunde bei 37°C (Modell, umfassend die Referenzzellen) bzw. für 1 Stunde bei 43°C (Modell, umfassend die gereizten Zellen) inkubiert. Die so behandelte rekonstruierte Epidermis wurde dann für weitere 24 Stunden im Immersionsmedium kultiviert. Die Proben der gereizten Zellen und der Referenzzellen, die einem Hitzeschock ausgesetzt waren, wurden dann durch cDNA-Array analysiert.
    • • Kurz gesagt wurden die RNAs der Proben extrahiert (nachdem sie in flüssigem Stickstoff mit Hilfe eines Biopulverisators gemahlen worden waren) und gemäss dem Protokoll des Herstellers von Tri Reagent® (Sigma) gereinigt, um die gesamte DNA zu entfernen.
    • • Die auf gereinigten RNAs wurden qualitativ und quantitativ analysiert.
    • • Als nächstes folgten die Aufreinigung der gepoolten Messenger-RNAs (mRNAs) durch Hybridisierung der Poly(A)-Enden der mRNAs mit biotinylierten Oligo(dT)-Primern und selektives Einfangen durch Streptavidin-Kügelchen gemäss dem Protokoll von Atlas Pure (Clontech). Die DNA-Proben, die mehrfach mit 33P markiert waren, wurden durch Reverse Transkription der an Poly(dT)-Kügelchen gebundenen mRNAs mit Hilfe eines Primerpools, spezifisch zu den Sequenzen der immobilisierten Arrays, in Anwesenheit von [α33P]-dATP, hergestellt. Die markierten Sonden wurden dann durch Ausschluss-Säulenchromatografie aufgereinigt und Qualität und Menge der markierten Proben wurden durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
    • • Die kommerziellen Atlas-Membranen wurden vorbehandelt und dann wurden die an jede Membran immobilisierten cDNAs mit den entsprechenden markierten Sonden (68°C, eine Nacht) hybridisiert; die Filter wurden vor Durchführung der Analyse gewaschen.
    • • Die Analyse erfolgte mittels Autoradiografie und die Quantifizierung der Radioaktivität der Spots wurde mit Hilfe des Phosphorimager Cyclone (Packard Instruments; 3-stündige und dann 72-stündige Aufnahme) und QuantArray-Software von Packard durchgeführt.
    • • Die Identifizierung der interessierenden Gene unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen geschah wie folgt: Junge Spender gegenüber älteren Spendern mit oder ohne thermischen Reiz. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Veränderung zwischen den älteren und jungen Modellen in nicht-gereiztem und gereiztem Zustand dargestellt.
  • TABELLE 4
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass ein Reiz (hier Hitzeschock) einerseits die Veränderung von verschiedenen Markern induziert und andererseits eine unterschiedliche Antwort gegenüber einem Reiz in Abhängigkeit vom Alter des Spenders erkennen lässt. Dieses Modell erlaubt somit, die Wirkungstargets zu definieren, um vorzubeugen oder die Wirkung eines Hitzeschocks umzukehren. Weiterhin erlaubt dieses Modell die Entwicklung unterschiedlicher Strategien für Wirkstoffe in Abhängigkeit von der Altersgruppe.
  • BEISPIEL 7
  • Herstellung eines Gewebemodells von mehrzelliger rekonstruierter Haut, enthaltend Langerhans-Zellen, interstitielle dendritische Zellen, Macrophagen und Endothelzellen, und eine Studie zum biologischen Reiz durch bakteriellen Angriff eines bakteriellen Lipopolysaccharids:
    • – Generierung von nicht-differenzierten und unreifen dendritischen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu entwickeln, bevorzugt zur Differenzierung in Langerhans-Zellen: Peripheres zirkulierendes Blut wurde als venöse Blutprobe von ein oder mehreren humanen Spendern in Vacutainern, ausgerüstet mit den üblichen Antigerinnungsmitteln, wie Lithiumheparin, gesammelt.
  • Die Trennung der Monozyten (CD14+) aus diesem zirkulierenden Blut kann gemäss dem Protokoll von Geissmann et al., J. Exp. Med., Bd. 187, Nr. 6, 16. März 1998, Seiten 961-966, veröffentlicht von The Rockefeller University Press, vorteilhaft auf folgende Art und Weise durchgeführt werden:
    • • Nach Zentrifugieren auf einem Ficoll®-Gradienten (Natriumdiatrizoat/Polysaccharose-Dichte: 1.077; Lymphoprep Abcys 1053980), wurden die mononuklearen Zellen des zirkulierenden Blutes gewonnen und indirekt mit einem Antikörpercocktail (im wesentlichen Anti-CD3, Anti-CD7 und Anti-CD19, Anti-CD45RA, Anti-CD56, Anti-IgE), gekoppelt mit magnetischen Kügelchen, markiert.
    • • Nach der Passage durch eine magnetische Säule wurden nur nicht-magnetisch-markierte Monozyten eluiert.
  • Die CD14+-Monozyten können aus dem Eluat gemäss irgendeinem physikalischen Trennungsverfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, z.B. durch Sedimentation oder Zentrifugieren, gewonnen werden, und können so für die anschliessenden Kulturen benützt werden.
  • Die CD14+-Monozyten werden dann in einem Verhältnis von etwa 1 Million pro Milliliter in einem RPI 1640-Kulturmedium (Rosewell Park Memorial Institute), versetzt mit 10 % Kälberserum, das frei von Zusätzen ist und anfänglich zwei Cytokine enthält, nämlich das Cytokin GM-CSF in einem Verhältnis von 400 IU/ml und das Cytokin TGFβ1 in einem Verhältnis von 10 ng/ml, kultiviert.
  • Die Kultivierung wird bei 37°C in feuchter Atmosphäre, enthaltend 5 % CO2, durchgeführt.
  • Das Kulturmedium ist anfänglich mit einem dritten Cytokin, nämlich Cytokin IL-13 in einem Verhältnis von 10 ng/ml, versetzt. Nach maximal 2-tägiger Kultivierung wurde das gleiche Kulturmedium ohne IL-13 bis zum 6. Tag der Kultur zugegeben. Am 6. Tag der Kultivierung wurden nicht-differenzierte unreife dendritische Zellen generiert, die in der Lage sind, sich selbst zu verändern, bevorzugt zur Differenzierung in Langerhans-Zellen:
    • • etwa 60 bis 80 % der in vitro generierten dendritischen Zellen exprimieren intrazellulär Langerin sowie CCR6, dem spezifischen Rezeptor für MIP-3α,
    • • die in vitro generierten dendritischen Zellen sind stark chemotaktisch gegenüber MIP-3α, was die Funktionalität des CCR6-Rezeptors zeigt,
    • • die in vitro generierten dendritischen Zellen sind unreif, da sie die Marker der Reifung, nämlich CD83, DC-LAMP und CCR7, nicht exprimieren.
    • – Das Gewebemodell wurde dann gemäss dem folgenden Protokoll hergestellt: 2 × 105 Fibroblasten, gewonnen aus einer Bauchbiopsie (sogenannte Referenzzellen) wurden wie in Beispiel 1 vermehrt und dann auf dem dermalen Substrat, basierend auf Kollagen-Glycosaminglycan-Chitosan, in einem DMEM-Glutamax-Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, mit Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml für 21 Tage ausgesät. Die Kultivierung wurde für 1 Woche in dem oben beschriebenen Medium ohne EGF fortgesetzt.
  • Anschliessend wurden 2 × 105 Keratinozyten, gewonnen aus Bauchbiopsie (sogenannte Referenzzellen) und gemäss Beispiel 1 bis zur Passage 1 (1. Vermehrung) vermehrt und 1 bis 3 × 105 undifferenzierte in vitro generierte dendritische Zellen auf die dermalen Äquivalente in einem DMEM-Glutamax/Ham F-12-Kulturmedium (Verhältnis 3/1 V/V) ausgesät, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 7 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
  • Anschliessend wurde die Kultur an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht und dort für 20 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrokortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin, kultiviert.
  • Unter diesen Bedingungen befinden sich die Langerhans-Zellen in der Epidermis und die interstitiellen dendritischen Zellen, die Macrophagen und die Endothelzellen in der Dermis.
  • Bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) wurde zu dem Immersionsmedium in einem Verhältnis von 10 ng/ml während 6 bzw. 24 Stunden zugegeben.
  • Am Ende des Experiments wurde die immunkompetent rekonstruierte Haut mittels cDNA-Array wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert. Die gesammelten und eingefrorenen Kulturmedien wurden durch Flurokine MAP wie in Beispiel 3 beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind insbesondere für den frühen Regulierungsbereich durch Interleukin 1 und TNFα in pg/ml und in Prozent Synthese der Cytokine [(Ergebnisse der gereizten Zellen/Ergebnisse der nicht-gereizten Zellen) × 100] mit dem DNA-Array dargestellt.
  • TABELLE 5
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Die Ergebnisse zeigen eine mehr oder weniger schnelle Aktivierung der Gene, codierend für die Regulierung der inflammatorischen Antwort durch Interleukin-1 und TNFα. Die Abnahme im Fall der Marker CD1a, CD40 und CD86 ist kein Phänomen der Genregulierung, sondern des Verschwindens der dendritischen Zellen, die anfänglich in den dreidimensionalen Modellen vorhanden sind, aufgrund der Wirkung einer Reizung durch Lipopolysaccharid, gefolgt von Migrieren in das unter dem Einsatz vorhandene Kulturmedium.
  • BEISPIEL 8
  • Herstellung von pigmentierter rekonstruierter Haut, die einem Reiz durch wiederholte Sonnenbestrahlung ausgesetzt war, und Studium der Wirksamkeit von antioxidativ wirksamen Bestandteilen:
  • Die Zellen wurden aus einer Brustbiopsie gewonnen, die nicht dem untersuchten Reiz ausgesetzt waren. 400.000 Fibroblasten, die wie in Beispiel 1 beschrieben bis zur Passage 5 vermehrt wurden (5. Vermehrung nach Trypsinierung), wurden auf einem dermalen Substrat auf Basis von oberflächenbehandelten Kollagenschwämmen ausgesät, in einem DMEM-Glutamax-Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum mit Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml für einen Zeitraum von 14 Tagen.
  • Anschliessend wurden 400.000 Keratinozyten und 10.000 Melanozyten, die wie in Beispiel 2 beschrieben bis zur Passage 2 vermehrt wurden (2. Vermehrung durch Trypsinierung), auf dermalen Äquivalenten ausgesät, in DMEM-Glutamax/Ham F-12-Kulturmedium (Verhältnis 3/1 V/V), versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum mit Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml für einen Zeitraum von 7 Tagen in einer Immersionskultur.
  • Die Kulturen wurden für 14 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
  • Für einen Zeitraum von 2 Wochen wurde zweimal wöchentlich das Immersionsmedium entfernt und durch PBS (pH 7,4) ersetzt. Einige der pigmentierten rekonstruierten Hautproben, die in den Einsätzen vorhanden waren, wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt; dieses Modell enthielt die sogenannten Referenzzellen. Andere in den Einsätzen vorhandene pigmentierte rekonstruierte Haut wurde mit Hilfe eines Sonnenbestrahlers Suntest CPS+ (Atlas) mit 561 kJ/qm bestrahlt (entsprechend einer durchschnittlichen 1-stündigen Bestrahlung in Mitteleuropa); dieses Modell enthielt die sogenannten gereizten Zellen. Ausserhalb der Bestrahlungszeiträume wurde die rekonstruierte Haut bei 37°C mit 5 % CO2 in Immersionsmedium kultiviert.
  • 8 μl einer kosmetischen Formulierung, mit oder ohne 3 Antioxidationswirkstoff, z.B. Flavagrum® (Hesperitinlaurat, Coletica), Flavenger® (Quercitincaprylat, Coletica), wurde auf die pigmentierte rekonstruierte Haut während 10 Tagen aufgetragen.
  • Am Ende der Behandlung wurde die pigmentierte rekonstruierte Haut für weitere 24 Stunden in Immersionsmedium eingetaucht und anschliessend wurde die Wirkung der antioxidativen Behandlung bestimmt durch Analyse:
    • • der Zell-Lebensdauer (getestet mit MTT – Methylthiazoltetrazolium) in der pigmentierten rekonstruierten Haut, enthaltend die gereizten Zellen oder die Referenzzellen – die Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz der Veränderung in bezug auf die nicht-bestrahlte Kontrolle;
    • • der Sekretion von Interleukinen, quantifiziert mit Fluorokine MAP-Kit, im Kulturmedium gesammelt gemäss Beispiel 3 – die Ergebnisse sind in pg/ml dargestellt.
  • TABELLE 6
    Figure 00520001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass ein Reiz (hier Sonnenbestrahlung) eine Abnahme der Zell-Lebensdauer sowie eine Zunahme der Synthese von pro-inflammatorischem Interleukin induziert. Es ist daher interessant, die Synthese der pro-inflammatorischen Moleküle unter Verwendung korrekt ausgewählter Wirkstoffe zu begrenzen. Von den untersuchten Wirkstoffen zeigten zwei, nämlich Flavagrum® und Flavenger®, eine Wirkung, die es scheinbar ermöglicht, das Referenzniveau dieser beiden Parameter wieder zu erreichen.
  • BEISPIEL 9
  • Untersuchung von physikalischem Reiz durch Bestrahlung mit UVB bei rekonstruierter Haut und Untersuchung der Wirksamkeit eines Wirkstoffs mittels Echtzeit-RT-PCR-Analyse:
  • Rekonstruierte Haut wurde gemäss dem in Beispiel 6 beschriebenen Protokoll hergestellt.
  • Die UVB-Bestrahlung erfolgte mit einem Wert von 50 mJ/cm2 und wurde für die eine Hälfte der Proben, enthaltend die gereizten Zellen, durchgeführt. Die anderen Proben wurden unter den gleichen Bedingungen auf Umgebungstemperatur gehalten und stellten die Referenzzellen der Proben dar. Die Proben wurden dann für weitere 24 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit eines Wirkstoffs (1 und 3 % Flavenger®, d.h. acyliertes Quercitin, Coletica) inkubiert.
  • Am Ende des Experiments wurde der Gehalt von Tropoelastin mRNA, Kollagen Typ I und Kollagen Typ III mittels Echtzeit-RT-PCR-Technik untersucht. Dafür wurden Primerpaare, die die Amplifizierung der spezifischen Fragmente von Tropoelastin, Kollagen Typ I und Kollagen Typ III ermöglichen (Sense 18/Antisense 19 bzw. Sense 18/Antisense 20), und Actin-Sequenzprimer (541 Basenpaare) verwendet. Nach Extraktion mit TriReagent® (Sigma) und Aufreinigung der RNAs gemäss Herstellerprotokoll, wurden die RT-PCR-Reaktionen (Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion) durch quantitative Echtzeit-RT-PCR mit Hilfe des Opticon-Systems (MJ Research) durchgeführt.
    COLL1 Sense: CAGAGGGAAGCCGCAAGA
    COLL1 Antisense: CTGGCCGCCATACTCGAAC
    COLL3 Sense: AAGGAGAGCCCGGACCAC
    COLL3 Antisense: GGRCCTCCAGGGACGCCATC
    ELASTIN Sense: CCTTCCCCGCAGTTACCTTTC
    ELASTIN Antisense: GCACGCCACCTGGGTATACAC
    ACTIN Sense: GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
    ACTIN Antisense: CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
  • Die in die Vertiefung eingebrachte Reaktionsmischung (50 μl) für jede Probe war wie folgt:
    • • 10 μl RNA mit einer Konzentration von 5 ng/μl,
    • • es wurden Primer mit verschiedenen Markern verwendet,
    • • Reaktionsmischung: Qiagen – 25 μl 2 × QuantiTect SYBR Green RT-PCR-Mastermix, enthaltend 5 mM MgCl2 + 0,5 μl QuantiTect RT-Mix (der Marker SYBR Green I wechselwirkt mit Doppelstrang-DNA während des Verlängerungsschrittes)
  • Die RT-PCR-Bedingungen sind wie folgt:
    • • Reverse Transkription: 30 Minuten bei 50°C,
    • • PCR-Reaktion: 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C, 50 Zyklen
  • Die Abwesenheit einer Kontamination und die Reinheit der amplifizierten Produkte wurden durch die Schmelzkurven der amplifizierten PCR-Produkte verifiziert. Die Produkte mit einem Doppelpeak oder einem abnormalen Schmelzpunkt wurden eliminiert.
  • Analyse und Berechnungsverfahren:
  • Die Aufnahme der Fluoreszenz in amplifizierter DNA wurde kontinuierlich während der PCR-Zyklen untersucht. Dieses System erlaubt es, Fluoreszenz-Messkurven als Funktion der Anzahl an PCR-Zyklen zu erhalten und somit die relative Menge der amplifizierten DNA zu bestimmen.
  • Um die vorhandene Zellpopulation in der rekonstruierten Haut zu berücksichtigen, wurden alle Ergebnisse auf das Signal des Actins, das als "Hauskeeping"-Gen verwendet wurde, bezogen.
  • Gemäss den Experimenten wurde der Grenzwert der Messung des C(T) (= Zyklusgrenzwert) für T auf zwischen 0,05 und 0,01 bestimmt, und anschliessend wurden entsprechende Messeinheiten für jedes Gen gemäss der folgenden Formel berechnet: Sgene <<×>> = 107 × (1/2)C(T)gene<<×>>
    • C(T)gene<<×>>
    bezeichnet die C(T)-Messwertgrenze (Zylusgrenzwert) des Gens <<×>>
  • Die Werte der Gene wurden auf das Signal von Actin durch die folgende Berechnung des Verhältnisses rückbezogen: R = Sgene<<×>>/Sactin
  • Die Verhältnisse wurden zwischen den behandelten und den unbehandelten Proben verglichen.
  • TABELLE 7
    Figure 00550001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass ein Reiz (hier UVB-Bestrahlung) eine schnelle Zunahme der RNAs, codierend für die Synthese der Moleküle der extrazellulären Matrix, wie Kollagen Typ I, Kollagen Typ II und Elastin, induziert. Die Anwendung des Wirkstoffs Flavenger® erlaubt die Begrenzung des UVB-Reizes, indem es die Synthese dieser Moleküle in dosisabhängiger Art und Weise wieder induziert.
  • BEISPIEL 10
  • Untersuchung zum physikalischen Reiz durch Sonnenbestrahlung auf rekonstruierter Dermis und Screening von wirksamen Bestandteilen mittels Multiplex-Echtzeit-RT-PCR-Analyse:
  • Die rekonstruierte Dermis wurde wie in Beispiel 3 beschrieben über 3 Wochen hergestellt.
  • Bestimmte rekonstruierte Dermis, enthaltend sogenannte Referenzzellen, wurde bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Andere rekonstruierte Dermis wurde mit Hilfe eines Sonnenbestrahlers Suntest CPS+ (Atlas) mit 561 kJ/qm bestrahlt (entsprechend einer durchschnittlichen 1-stündigen Bestrahlung in Mitteleuropa); dieses Modell enthielt die sogenannten gereizten Zellen.
  • Die rekonstruierte Dermis wurde in Gegenwart eines Wirkstoffs (3 %) oder in dessen Abwesenheit bestrahlt und dann für weitere 24 Stunden inkubiert.
  • Die RNAs wurden schliesslich wie in Beispiel 5 beschrieben extrahiert.
  • Die Expression der Gene von latentem TGF und von Kollagen Typ I (COL1) wurde gleichzeitig mittels Multiplex-Echtzeit-RT-PCR nach strenger Selektion der Primer (Ausbeute, Spezifität und Multiplexkompatibilität) und Optimierung der Echtzeit-RT-PCR-Bedingungen (Konzentration der Komponenten, Parameter der Zyklen, Bedingungen der Fluoreszenzdetektion) analysiert.
  • Die Hydrolysesonden für Actin (20 bis 30 mer) wurden am 5'-Ende mittels JOE Fluoreszenzreporter (Absorption 520, Emission 548) und am 3'-Ende mittels TAMRA-Quencher (Applied Biosystems – Foster City, CA) markiert. Die Hydrolysesonden der zu analysierenden Gene (20 bis 30 mer) wurden am 5'-Ende mittels FAM Fluoreszenzreporter (Absorption 495, Emission 520) und am 3'-Ende mittels TAMRA-Quencher (Absorption 555, Emission 576, Applied Biosystems) markiert.
    latentes TGF Sense: AGCGGGAGGAGGGACGAG
    latentes TGF Antisense: TGAGGGACGCCGTGTAGG
    COL1 Sense: CAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTA
    COL1 Antisense: CTTGTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA
  • Die Bedingungen der RT-PCR waren die folgenden:
    Superscript Kit one step RT-PCR mit Platin Taq (Invitrogen)
    ABI PRISM® 7000 Sequenz Detection System (Applied Biosystems)
  • Reaktionsmischung:
    • 10 μl RNA mit einer Konzentration von 5 ng/μl
    • 25 μl 2 × Reaktionsmix
    • 2,5 μl Primer, Sense und Antisense, 10 μM
    • 1,8 μl MgSO4, 50 mM
    • 2 μl dNTP, 5 mM
    • 1 μl der Hydrolysesonde für jedes Genpaar (Actin/TGFI und Actin/Kollagen I), 10 μM
    • 1 μl RT/Taq-Mix
    • Wasser auf 50 μl
  • RT-PCR-Protokoll:
    • RT 48°C, 30 Minuten
    • Denaturierung der RT und Aktivierung der Polymerase bei 95°C während 5 Minuten
    • 50 Zyklen: 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 30 Sekunden bei 72°C
  • Die Analyse der Ergebnisse (Berechnung des Verhältnisses R = Sgene<<×>>/Sactin) wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. Die Wirksamkeit der Wirkstoffe wurde analysiert und ausgedrückt als Potenz der Aktivierung von latentem TGF, induziert durch Sonnenbestrahlung der Wirkstoffe, sowie durch direkte Wirkung und/oder indirekte Wirkung (über Freisetzung von aktivem TGF-β1) auf Kollagen Typ I. Die Ergebnisse für einige interessante Wirkstoffe (Weizenextrakt, Soft Roe®, Coletica) wurden ausgedrückt als Prozentsatz der Veränderung in bezug auf die Kontrolle von nicht-bestrahlten und nicht mit Wirkstoff behandelten Zellen.
  • TABELLE 8
    Figure 00590001
  • Durch die erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich zu erkennen, dass ein Reiz (hier UV-Bestrahlung) eine Zunahme der Synthese von TGFβ und Kollagen Typ I induziert. Es kann daher von Interesse sein, diese Zunahme der Synthese durch Verwendung von richtig ausgewählten Wirkstoffen nachzuahmen. Im folgenden werden die Ergebnisse für zwei Extrakte dargestellt.
  • TABELLE 9
    Figure 00590002
  • BEISPIEL 11
  • Verwendung von rekonstruierter Epidermis und Monolayer-Kulturen, umfassend gereizte Zellen und Referenzzellen zur Untersuchung der Veränderung von kutaner antibakterieller Kapazität:
  • Antibiotische Peptide sind kleine Moleküle (10 bis 50 Aminosäuren), die in der Lage sind, Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze oder Viren, zu zerstören, indem sie ihre Zellmembran durchlässig machen. Die Mehrheit der antibiotischen Peptide wird in Epithelgewebe von Tieren gefunden, wo sie eine wesentliche Rolle in der ersten Immunbarriere spielen. Insbesondere wurde gezeigt, dass sie in den Gastrointestinal- und Atemwegsystemen sowie in der Haut und der Mukosa des Menschen vorkommen. Defensine stellen eine Klasse von antimikrobiellen Peptiden dar und sie wurden am meisten untersucht. Es werden zwei Klassen von Defensinen unterschieden: die α-Defensine (6 Repräsentanten) und die β-Defensine, die in drei Formen, hBD1, hBD2 und hBD3 (humanes β-Defensin 1, 2 und 3) vorkommen.
  • Unter einer Reizung, die einen mikrobiellen Angriff nachahmt (Lipopolysaccharid oder LPS, TNFα, Interferon-γ usw.), können die Zellen diese Moleküle als Verteidigungsmittel synthetisieren.
  • Um dies zu veranschaulichen, wurden Keratinozytenkulturen in Monolayern und in Form von rekonstruierter Epidermis aus Zellen, gewonnen aus der gleichen Vorhautbiopsie, hergestellt. Normale Human-Keratinozyten werden in Monolayern in 96 Well-Kulturplatten in einem definierten Medium ohne Serum und angereichert mit Calcium (Endkonzentration 1,7 mM) kultiviert.
  • Bei 80 % Konfluenz wurden die Zellen einem chemischen Reiz d.h. Molekülen, die einen mikrobiellen Angriff imitieren, wie TNFα (100 ng/ml) oder IFNγ (100 ng/ml), für 16 Stunden ausgesetzt. Nicht-gereizte Keratinozyten, d.h. solche, die nicht mit chemischen Substanzen, die einen mikrobiellen Angriff imitieren, kontaktiert wurden, wurden als Modell für rekonstruierte Epidermis verwendet.
  • Nach 16 Stunden wurden die Überstände gesammelt und die Zellen wurden bei –80°C nach Waschen mit PBS eingefroren.
  • Die Gesamt-RNAs wurden mittels 96 Well Extraction-Kit mit Silicasäulen extrahiert und mit einem 96 Well-Spektrofotometer bei 260 bzw. 280 nm gemessen. Die RNAs wurden auf 5 ng/μl verdünnt.
  • Eine qualitative Ein-Schritt-RT-PCR wurde mit (anfänglich) 50 ng RNA in 96 Vertiefungen für Actin, hBD2 und hBD3 durchgeführt. Die verwendeten Primer stammten aus der Literatur und wurden mit 0,5 μM verwendet.
    hBD2 Sense: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3'
    hBD2 Antisense: 5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3' (J. Harder et al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387:861)
    hBD3 Sense: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3'
    hBD3 Antisense: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3'
    Actin Sense: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
    Actin Antisense: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (J. Harder et al., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem. 2001; 276:5707-5713)
  • Die Proben wurden in einen Thermocycler verbracht und mit einem gemeinsamen Amplifizierungsprogramm amplifiziert: 50°C, 30 Minuten; 94°C, 2 Minuten; (94°C, 30 Sekunden; 60°C, 30 Sekunden; 68°C, 30 Sekunden), 32 Zyklen für Defensine und 30 Zyklen for Actin; 72°C, 10 Minuten; 14°C, unendlich.
  • Nach Vermehrung wurden die Produkte mit einer Rate von 3 μl pro Amplifizierungsprodukt von Actin + 6 μl Amplifizierungsprodukt von hBD2 + 6 μl Amplifizierungsprodukt von hBD3 vermischt. 5 μl einer Mischung von Auffüllpuffer und Wasser (2/3) wurden hinzugefügt und das Endvolumen von 20 μl wurde auf ein vorgegossenes 2 %-iges Agarosegel gegeben. Die Proben migrierten für 30 Minuten und die Banden wurden unter UV in einer Dunkelkammer dargestellt und digital fotografiert.
  • 2. Schritt des Screening-Verfahrens:
  • 1 bis 2 × 106 Vorhautkeratinozyten, gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Boyden-Kammereinsätze (Membranporosität: 0,4 μm, Durchmesser: 10 mm) ausgesät. Diese Kammern wurden zuvor mit Nährfibroblasten-Unterschichten ausgesät, versetzt mit DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, für einen Zeitraum von 3 Tagen in Immersionskultur.
  • Die Keratinocytenkulturen wurden für weitere 11 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
  • Am Ende des Experiments wurden die rekonstruierten Epidermis wie folgt behandelt:
    • • 1 Probe wurde keiner Behandlung unterzogen (Modell, enthaltend Referenzzellen = Negativkontrolle).
    • • 1 Probe wurde keiner Behandlung mit den Wirkstoffen unterzogen, wurde aber verschiedenen Reizsituationen am Ende der Kultur ausgesetzt (Modell, enthaltend gereizte Zellen = Positivkontrolle), z.B. Inkubation in Anwesenheit von TFNα bei 100 ng/ml, IFNγ 100 ng/ml.
    • • 1 Probe wurde einer Behandlung mit den Wirkstoffen unterworfen (1 % in Kulturmedium während 24 Stunden) und dann gereizt (äquivalent zur Positivkontrolle).
  • Die rekonstruierten Epidermis wurden dann für weitere 24 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit des Wirkstoffs kultiviert und dann mit PBS gewaschen und schliesslich wurden die Gesamt-RNAs extrahiert und mit einem 96 Well-Spektrofotometer bei 260 bzw. 280 nm bestimmt. Die RNAs wurden auf 5 ng/μl verdünnt und dann wie oben beschrieben behandelt.
  • Analyse:
  • Die Fotografien der Gele wurden mittels einer Bildsoftware analysiert, die die Intensität der Banden quantifizieren kann. Die Verhältnisse der Intensität von hBD2/Actin- und hBD3/Actin-Banden und den Monolayer-Modellen und den 3D-Modellen (rekonstruierte Epidermis) wurden einerseits in nicht-gereiztem Zustand verglichen und andererseits nach Reizeinwirkung (Zellbehandlung mit TNFβ oder IFNγ).
  • TABELLE 10 Expression von hBD2 und hBD3 in Monolayer im Vergleich zu 3D-rekonstruiertem Epidermismodell, Modelle mit nicht-gereizten Referenzzellen:
    Figure 00640001
  • TABELLE 11 Wirkung von Reiz auf die Expression von hBD2 und hBD3 in Monolayer, verglichen mit 3D-rekonstruiertem Epidermismodell
    Figure 00640002
  • Die Antwort der Synthese von Defensinen durch Hautzellen bei einem Reiz, der einen mikrobiellen Angriff imitiert, ist eine Verteidigungsantwort, die als eine beim Suchen nach Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Stimulierung der Hautdefensine ohne chemischen Angriff zu ermöglichen, angesehen werden kann.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001

Claims (31)

  1. Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von (a) lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt sind, bezeichnet als gereizte Zellen, (b) lebenden Zellen, die nicht diesem gleichen Reiz ausgesetzt sind, bezeichnet als Referenzzellen, wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird, das zumindest Fibroblasten umfasst, was die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter erlaubt, der nach einem Reiz verändert ist.
  2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Referenzellen als auch die gereizten Zellen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet werden.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der biologische Parameter, der während eines Reizes verändert ist, definiert ist durch mindestens einen Unterschied im Stoffwechsel der sogenannten gereizten Zellen und im Stoffwechsel der sogenannten Referenzzellen.
  4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) die folgenden Schritte umfasst: (a1) Aussäen einer oder mehrerer Zellart(en) der sogenannten Referenzzellen in einem Zellmodell, d.h. in einem Monolayer, oder in einer Suspension und/oder einem dreidimensionalen Gewebemodell; (a2) Aussetzen dieses Modells einem Reiz, so dass diese Zellen als gereizte Zellen bezeichnet werden können.
  5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (a) die folgenden Schritte umfasst: (a1) Aussetzen einer oder mehrerer Art en) von lebenden Zellen einem Reiz, so dass diese Zellen gereizte Zellen sind; (a2) Verwendung dieser gereizten Zellen in einem Zellmodell, d.h. in einem Monolayer oder in einer Suspension und/oder einem dreidimensionalen Gewebemodell.
  6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Reiz ein physischer Reiz ist, ausgewählt aus: UVA, UVB, Sonnenlicht, Infrarot, nahes Infrarot, Wärme, Magnetfeld, elektromagnetischer Strahlung, Ionisierungsstrahlung, wie solchen, denen sie unterworfen werden, wenn sie zufällig oder nicht-zufällig einer solchen Strahlung ausgesetzt sind.
  7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Reiz ein physiko-chemischer Reiz und/oder biologischer Reiz ist.
  8. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Reiz ein mechanischer Reiz ist.
  9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 oder 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die gereizten Zellen sind: • Zellen, die aus Biopsien stammen, die aus Bereichen genommen wurden, die der Sonne ausgesetzt waren; • Zellen, die durch einen physischen Reiz gereizt wurden, ausgewählt aus: UVA, UVB, Sonnenlicht, Infrarot, nahem Infrarot, Wärme, Magnetfeld, elektromagnetischer Strahlung, ionisierender Strahlung, denen man zufällig oder nicht-zufällig ausgesetzt ist.
  10. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, 5 oder 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die gereizten Zellen entweder • Zellen sind, die aus Biopsien stammen, die aus Bereichen entnommen wurden, die der Sonne ausgesetzt sind, oder • Zellen sind, welche durch einen physiko-chemischen und/oder biologischen Reiz gereizt sind.
  11. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 3, 5 oder 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen entweder • Zellen sind, die aus Biopsien stammen, die aus Bereichen entnommen wurden, oder • Zellen, welche durch einen mechanischen Reiz gereizt sind.
  12. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzzellen Zellen von Biopsien sind, die nicht durch Sonnenstrahlung gereizt sind, oder Zellen, die nicht durch einen Reiz, wie physischem Reiz von UVA und/oder UVB und/oder Sonnenbestrahlung und/oder Strahlung durch ein Magnetfeld und/oder chemischem Reiz und/oder biologischem Reiz und/oder mechanischem Reiz, gereizt sind.
  13. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die gereizten Zellen Zellen von mindestens einem Menschen oder von mindestens einem Tier sind.
  14. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Experiment mindestens eine Analyse, ausgewählt aus den folgenden Analyseverfahren, umfasst: • zur Analyse des Genomprofils: DNA-Arrays und/oder Multiplex-PCR und/oder PCR und/oder Echtzeit-PCR, • zur Analyse des Transkriptomprofils: RNA-Arrays, cDNA-Arrays und/oder Multiplex-RT-PCR, und/oder RT-PCR, und/oder Echtzeit-RT-PCR.
  15. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell unter Bedingungen, die zumindest teilweise einen Zellstoffwechsel aufrecht erhalten, kultiviert und/oder aufbewahrt wird.
  16. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell zumindest Keratinozyten umfasst.
  17. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Modell umfasst: normale, gesunde oder pathologische Zellen oder Zellen, die aus Zellinien stammen, wobei die Zellen bevorzugt humanen oder tierischen Ursprungs sind.
  18. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ausgewählt ist aus den folgenden Modellen: ein Modell einer Bindegewebematrix, im Fall der Haut als Dermis bezeichnet und im Fall der mukosalen Membran als Chorion bezeichnet, enthaltend hautsächlich Stromazellen, ein Epithelmodell, hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen, ein Epidermismodell, hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten, ein Hautmodell, hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis, ein Modell einer mukosalen Membran, bestehend aus einem Epithel und einem Chorion.
  19. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein Gewebemodell eines Bindegewebes ist, Dermis oder Chorion, umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus: • einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus mit Zellkultur behandeltem Plastik, einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat, PET, einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester, HATF-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; • einem Gel oder einer Membran auf Basis von Hyaluronsäure und/oder Kollagen und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; • einer porösen Kollagenmatrix, die ein oder mehrere Glycosaminoglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann, wobei diese porösen Membranen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, aufweisen können.
  20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein Epidermisgewebe-Modell oder ein Epithelgewebe-Modell ist, umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus: • einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat, PET, einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester, HATF-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran, wobei dieser inerte Träger gegebenenfalls zuvor mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten besät wird; • ein Film oder eine Membran, basierend auf Hyaluronsäure und/oder Kollagen und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, zuvor ausgesät mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten.
  21. Verfahren gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass im epithelialen Teil Epithelzellen, Pigmentzellen, immunkompetente Zellen und Nervenzellen eingeführt sind, bevorzugt sind die immunkompetenten Zellen Langerhans-Zellen.
  22. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein rekonstruiertes Haut- oder mucosales Membrangewebemodell ist, umfassend einen dermalen oder Chorion-Matrixträger, ausgewählt aus: • einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat, PET, einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester, HATF-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; • einem Gel auf Basis von Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; • einer porösen Membran aus Kollagen, die ein oder mehrere Glycosaminglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann; diese porösen Matrizes enthalten Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; • deepidermisierte Dermis oder tote Dermis, die menschlichen oder tierischen Ursprungs sein kann; dieser Matrixträger wird dann mit Epithelzellen ausgesät, um eine rekonstruierte mucosale Membran zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um rekonstruierte Haut zu erhalten.
  23. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Gewebemodell ein Modell umfasst, in das mindestens ein weiterer Zelltyp eingeführt ist, bevorzugt Endothelzellen, EC und/oder Immunzellen und/oder Adiposezellen und/oder Hautfortsätze, wie Körperhaare, Haare, Talgdrüsen.
  24. Verwendung eines Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Durchführung eines Screenens mindestens eines möglichen Wirkstoffs, der in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während eines Reizes modifiziert wurde, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, umzukehren.
  25. Verwendung eines Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Durchführung eines Screenens mindestens eines möglichen Wirkstoffs, der in der Lage ist, einer Veränderung von mindestens einem biologischen Parameter, der während eines Reizes modifiziert wurde, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, vorzubeugen.
  26. Verfahren wie beschrieben in Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (A) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den Referenzzellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, ausgesät in einem Gewebemodell, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; Anlegen eines Reizes wie in einem der Ansprüche 6 bis 11 definiert; (B) teilweise oder komplette Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse zur Durchführung einer Wirkungsanalyse dieser Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen; (C) Vergleichen des Zellstoffwechsels dieser Zellen in Anwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz mit dem Stoffwechsel dieser Zellen, sogenannter Kontrollzellen, in Abwesenheit dieser Substanz; und (D) Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Aktivität der möglicherweise wirksamen Substanz, insbesondere umfassend die Identifizierung einer positiven oder negativen Wirkung der Substanz, um einer Veränderung des biologischen Parameters vorzubeugen
  27. Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während eines Reizes verändert ist, umzukehren, umfassend: (a) Kultivieren von Zellen, die einem Reiz ausgesetzt werden, sogenannte gereizte Zellen, wie in den Ansprüchen 4 bis 11 und 13 definiert, mit einem veränderten biologischen Parameter in Anwesenheit mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz über einen Zeitraum, der ausreicht, diese möglicherweise wirksame Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen wirken zu lassen; diese gereizten Zellen wurden in einem Gewebemodell wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, ausgesät; (b) teilweise oder komplette Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, wie in Anspruch 14 definiert, der gereizten Zellen, die in Schritt (a) kultiviert werden; (c) Vergleichen der unter (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, wie in Anspruch 14 definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, den sogenannten Kontrollzellen; (d) gefolgt von dem Vergleich der in (c) durchgeführten Analysen, dabei möglicherweise mindestens eine wirksame Substanz identifizierend, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter, der während eines Reizes verändert ist, umzukehren.
  28. Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Veränderung von mindestens einem biologischen Parameter, der während eines Reizes verändert ist, vorzubeugen, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den Referenzzellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, ausgesät in einem Gewebemodell, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 definiert, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; Anlegen eines Reizes wie in einem der Ansprüche 6 bis 11 definiert; (b) teilweise oder komplette Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, wie in Anspruch 14 definiert, der in Schritt (a) kultivierten Zellen; (c) Vergleich der in (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, wie in Anspruch 14 definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, sogenannte Kontrollzellen; (d) gefolgt vom Vergleich die in (c) durchgeführten Analysen und möglicherweise Identifizieren mindestens einer wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Veränderung mindestens eines biologischen Parameters, verändert aufgrund eines Reizes, vorzubeugen.
  29. Verwendung einer aktiven Substanz, nämlich Quercitin-Caprylat zur Herstellung von mindestens einer topischen kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verminderung der Synthese auf dem Hautniveau von Collagen I oder III oder von Elastin, um die Synthese von Collagen I oder III oder ein Elastinniveau, erhöht aufgrund einer UVB Bestrahlung wieder herzustellen.
  30. Verwendung einer aktiven Substanz, gewählt aus Hesperitin-Laurat und Quercitin-Caprylat zur Herstellung von mindestens einer topischen kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Zelllebensfähigkeit von Hautzellen, um die Zelllebensfähigkeit wiederherzustellen, die aufgrund einer Sonnenbestrahlung abgenommen hatte.
  31. Verwendung einer aktiven Substanz, gewählt aus Hesperitin Laurat und Quercitin-Caprylat zur Herstellung von mindestens einer topischen kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verminderung der Synthese von proinflammatorischen Interleukinen in Hautzellen, um die Synthese von proinflammatorischen Interleukinen wiederherzustellen, die aufgrund einer Sonnenbestrahlung angestiegen war.
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