NL1022658C2

NL1022658C2 - Methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter onder gebruikmaking van levende cellen die aan een stress worden onderworpen en levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen.

Info

Publication number: NL1022658C2
Application number: NL1022658A
Authority: NL
Inventors: Eric Perrier; Valerie Andre; Stephane Grenier; Corinne Reymermier
Original assignee: Coletica
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2003-02-12
Publication date: 2004-06-03
Also published as: JP2009131251A; FR2847268A1; ES2331165A1; ES2331165B2; ES2270643B1; GB2395490B; FR2847268B1; JP5311749B2; GB2395490A; DE10320633A1; GB0303216D0; KR100646047B1; KR20040044078A; JP2007191482A; ES2270643A1; DE10320633B4; CH694328A5; JP2004166686A; US20040096815A1

Description

1 a

Titel: Methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter onder gebruikmaking van levende cellen die aan een stress worden onderworpen en levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen

De onderhavige uitvinding heeft in essentie betrekking op een methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, omvattende de vergeleken proteomische en/of vergeleken transcriptomische en/of vergeleken genomische analyse: 5 a) van levende cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen; b) van levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; c) waarbij ten minste één van deze twee klassen van cellen in een drie-10 dimensionaal weefselmodel wordt gebruikt, waardoor eventuele identificatie wordt mogelijk gemaakt van ten minste één biologische parameter die na genoemde stress gemodificeerd is.

De onderhavige uitvinding betreft verder een methode voor het identificeren van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen ten minste één 15 biologische parameter die bij het ondervinden van een stress wordt gemodificeerd om te keren, of een indicatie te geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die bij het ondervinden van een stress wordt gemodificeerd.

De onderhavige uitvinding betreft verder het gebruik van een met een dergelijke methode geselecteerde actieve stof voor het bereiden van ten minste één 2 0 cosmetische en/of farmaceutische samenstelling.

Verder betreft de onderhavige uitvinding een stof die op het gebied van de cosmetica of farmacie actief is en met een dergelijke methode is geselecteerd.

STAND VAN DE TECHNIEK

2 5 Zonnestraling wordt gevormd door elektromagnetische straling waaronder 56% infraroodstraling (golflengte van 5000 tot 800 nm) die warmte genereert, 39% zichtbaar licht (van 800 tot 400 nm) en 5% ultraviolet A, B, C (van 400 tot 190 nm), waaronder ongeveer 4,9% UVA en 0,1% UVB + UVC.

10226581 ι I - UVC's, die zeer schadelijk zijn, worden in het algemeen door de ozonlaag I gefilterd.

I - UVB's worden voor een deel bij het passeren door de atmosfeer en glas H tegengehouden. Ze bereiken de epidermis, maar worden nog voor de dermis I 5 tegengehouden. Ze zijn verantwoordelijk voor de vorming van een zonverbranding die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van zonverbrande cellen, die keratinocyten zijn welke een apoptose proces zijn begonnen als gevolg van laesies van het DNA in I hun kern. Hun aantal is even groot als de grootte van de ontvangen UVB dosis. Een natuurlijk verdedigingsproces maakt in feite herstel of verwijdering van beschadigde 10 cellen mogelijk, maar het falen van dit systeem ten gevolge van verzadiging of een H genetische fout speelt een fundamentele rol in het vóórkomen van huidkankers.

H UVA's passeren gemakkelijk door de atmosfeer, zowel in de zomer als in de winter, ze penetreren de dermis en de epidermis en hoewel ze minder schadelijk zijn dan UVB's zijn ze desalniettemin ten gevolge van de ontvangen hoeveelheden 15 verantwoordelijk voor beschadigingen. UVA's produceren geen of zeer weinig zon- I verbrande cellen en kunnen via de vorming van vrije radicalen cellulair DNA, maar ook cellipiden en celeiwitten beschadigen. UVA's zijn verantwoordelijk voor een versnelde veroudering van de huid met een verhoogde afbraak van het collageen en I elastische vezels, maar ook van de andere bestanddelen van de extracellulaire matrix I 2 0 in de dermis. Verder heeft veel werk de immunosuppressieve effecten van UVA's aangetoond via de epidermale cellen van Langerhans die na bestraling interactie vertonen met de T-lymofocyten en een systemisch effect hebben via de cytokines en de neuromediators die in een cascade door de epidermale cellen en de zenuwvezels worden geproduceerd (Meunier L., Eur. J. Dermatol. 1999, 9: 269-275). Op de lange H 25 duur neemt het risico van huidkanker toe, doordat de voorloperkankercellen niet langer als vreemde cellen worden herkend en bijgevolg niet meer door het immuunsysteem worden geëlimineerd.

Een Europese onderzoeks Helios (Zanetti R. et al, Br. J. Canc. 1996, 73: 1440- 1454) toont de verbanden aan tussen blootstelling aan UV's, huid-fenotype en 3 0 carcinoma's, en definieert het begrip van aan de UV's verbonden direct risico.

Van de andere beschadigingen die bekend zijn en verbonden zijn met straling kunnen die worden genoemd welke te wijten zijn aan een stijging van de temperatuur door de infrarode straling, die bij de melanocyten de productie van warmte-shock eiwitten induceert, evenals effecten die lijken op de door UVB geïnduceerde effecten I 1022658· t t 3 (Nakazawa et al, J. Invest. Dermatol. 1998, 110: 972-977); die welke aan straling in het nabije infrarood te wijten zijn, tasten de cellevensvatbaarheid van de huidcellen aan (Yoo B.H. et al, J. Cosmet. Sci. 2002, 53(3): 175-184); die welke aan blootstelling aan zichtbaar licht (herhaalde doses) te wijten zijn, induceren een mutagene werking 5 (Larko O., Lakartidningen 2002, 99(18): 2036-2040); die welke aan ioniserende straling te wijten zijn, genereren zweren en kankers (Lorette G., Machet L., Cancer Radiother. 2001, 5(1): 116s-120s) of modificaties van celmetabolisme zoals de synthese van collageen van type I en III in de huid (Riekki R. et al, Arch. Dermatol. Res. 2002, 294(4): 178-184) of zelfs modificaties van de proliferatie en van de 10 epidermale differentiatie (Sivan V. et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 53(2): 385-393), maar ook die welke aan de cytogenetische effecten van microgolven te wijten zijn (Zotti-Martelli L. et al, Mutat. Res. 2000, 472(1-2): 51-58) of aan de oncogenische effecten door inhibitie van de route van de warmte-shock eiwitten (HSP70 en HSP27), of door vorming van vrije radicalen door elektromagnetische 15 velden en met name die welke door mobiele telefoons worden gegenereerd (French P.W. et al, Differenciation 2001, 67(4-5): 93-97; Di Carlo et al, J. Cell. Biochem. 2002, 84(3): 447-454; Leszczynski D. et al, Differenciation 2002, 70(2-3): 120-129; Moustafa Y.M. et al, J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 26(4): 605-608).

Er bestaan ook andere factoren, zoals bepaalde chemische middelen (water-2 0 stofperoxide, stikstofoxide, zware metalen, ...), of biologische middelen (virussen, bacteriën, ...), zelfs mechanische factoren (uitrekking, compressie, ...) die een stress voor de cel kunnen induceren.

Tegenwoordig worden alle celfuncties, waaronder proliferatie, differentiatie en celdood, die door talloze genen en celsignaalroutes worden beheerst, ex vivo (biopsie) 2 5 of in, vitro aan celkweken in monolagen, in het algemeen van fibroblasten, keratino- cyten of melanocyten, afkomstig van gezonde of pathologische donoren of van cellijnen, geanalyseerd. Bovendien is het niet altijd mogelijk gegevens te vinden over de expressie en de celsyntheses als functie van een bepaalde stress, of soms komen de in vitro verkregen resultaten in strijd met wat in vivo kan worden waargenomen als 3 0 gevolg van het in de proefnemingen toegepaste vereenvoudigde model.

Sinds enige jaren zijn verschillende driedimensionale celmodellen ontwikkeld, hoofdzakelijk voor celtherapie, voor cytotoxiciteitstests en effectiviteitstests, als alternatief voor dierexperimenten. Genoemd kunnen worden modellen van epidermis (EP 0 789 074 Al van Oreal; A. de Brugerolle de Fraissinette et al, 1999, Cell Biol.

1022658· I Tox. 15: 121-135) die gebruikt worden voor de voorspelbaarheid van acute of I chronische huidirritatie, maar ook modellen van gereconstrueerd epitheel (Schmalz I G. et al, Eur. J. Oral Sci. 2000, 108: 442-448; Nielsen et al, Int. J. Pharm. 2000, 200: I 261-270), evenals van gereconstrueerde huid of van gepigmenteerde gereconstrueerde I 5 huid en/of immunocompetente gereconstrueerde huid, bijvoorbeeld (Regnier M. et al, I in Pour la science (1999) 266: 154-159).

Ook al worden sommige van deze modellen heden ten dage op ruime schaal toegepast voor farmaco-toxicologische evaluaties en onderzoeken naar effectiviteit I van farmaceutische en cosmetische ingrediënten, zijn de gehanteerde analyse- I 10 methoden in essentie technieken van histologie gecombineerd met beeldanalyse, I analyse van metabolische syntheses en van hun regulering door elektroforetische I analyse, Western blot, Northern blot of RT-PCR analyse. De technieken van eiwit- arrays (of MAPPing) en DNA arrays, van bi-dimensionale elektroforese of van gecombineerde cytokine bepalingen (cytokine-MAP) in het bijzonder zijn niet op deze I 15 driedimensionale modellen toegepast, die onder standaard kweekcondities worden gekweekt, in vergelijking met kweekcondities waaronder deze modellen een stress hebben ondergaan, van fysische, chemische, biologische of mechanische aard.

I In tegendeel, deze technologieën zijn ontwikkeld en gebruikt bij celsystemen in monolagen, zoals bijvoorbeeld in de studie van de modulerende rol van een ultraviolet 20 stress op normale of kwaadaardige melanocyten van de mens (cellijn of uit tumor- weefsel geëxtraheerde melanocyten) die in monolagen worden gekweekt (Valery C., I Grob J.J. en Verrando P., in J. Invest. Dermatol. 2001, 117: 1471-1482).

I DOELEINDEN VAN DE UITVINDING

2 5 Een hoofddoel van de uitvinding is het onverwacht oplossen van het technische probleem dat bestaat uit het verschaffen van een onderzoeksmodel voor H celmetabolisme dat de in vivo waargenomen situatie weerspiegelt, wanneer de cellen een stress hebben ondergaan.

Een doel van de onderhavige uitvinding is het nieuwe technische probleem op 3 0 te lossen dat bestaat uit het verschaffen van een methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, omvattende de vergeleken proteomische en/of vergeleken transcriptomische en/of vergeleken genomische analyse: I 1022658· 5 a) van levende cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen; b) van levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; 5 c) waarbij ten minste één van deze twee klassen van cellen in een driedimensionaal weefselmodel wordt gebruikt, waardoor eventuele identificatie wordt mogelijk gemaakt van ten minste één biologische parameter die na genoemde stress gemodificeerd is.

Deze proteomische of transcriptomische of genomische analyse maakt het 10 mogelijk actiedoelwitten te definiëren, voor het omkeren, of het verschaffen van een indicatie, van de modificatie van ten minste één parameter die tijdens uitoefening van de stress wordt gemodificeerd.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is een oplossing te verschaffen die mogelijk maakt driedimensionale weefselmodellen zoals hierboven beschreven te 15 gebruiken met het oog op een evaluatie van het effect op het genomische of eiwit-profiel van een actieve stof, in het bijzonder een cosmetische of farmaceutische actieve stof.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is een oplossing te verschaffen die mogelijk maakt driedimensionale weefselmodellen zoals hierboven beschreven te 2 0 gebruiken met het oog op een evaluatie van het effect op het genomische of transcriptomische of proteomische profiel van een formulering, in het bijzonder een cosmetische of farmaceutische formulering die een dergelijke actieve stof bevat.

Weer een ander doel van de onderhavige uitvinding is het nieuwe technische probleem op te lossen dat bestaat uit het verschaffen van een methode voor het 2 5 identificeren van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen van het omkeren of verschaffen van een indicatie van de modificatie van ten minste één biologische parameter die bij het ondervinden van een stress wordt gemodificeerd.

Weer een ander doel van de onderhavige uitvinding is het nieuwe technische probleem op te lossen dat bestaat uit het verschaffen van een door een dergelijke 3 0 methode geselecteerde actieve stof, alsmede het gebruiken ervan voor de bereiding van een cosmetische of farmaceutische samenstelling.

1022658·

I SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

I De onderhavige uitvinding maakt het mogelijk de hierboven vermelde I technische problemen op te lossen.

I Binnen de context van deze uitvinding bedoelen de uitvinders met "genomisch I 5 onderzoek": de handeling van het opmaken van een inventaris en het verrichten van I onderzoek aan ten minste één deel van het geheel van de genen van een organisme teneinde hun functie te onderzoeken.

I Met "transcriptomisch onderzoek" bedoelen de uitvinders: de handeling van I het opmaken van een inventaris en het verrichten van onderzoek aan ten minste één H 10 deel van het geheel van de door transcriptie van het genoom gevormde RNA's.

Met "proteomisch onderzoek" bedoelen de uitvinders: de handeling van het opmaken van een inventaris en het verrichten van onderzoek aan ten minste één deel van de tot geëxprimeerde eiwitten.

De uitvinding bestaat vooral uit het verschaffen van een methode voor het I 15 identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, H welke gekenmerkt wordt doordat zij de vergeleken proteomische en/of vergeleken transcriptomische en/of vergeleken genomische analyse omvat: a) van levende cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen; 2 0 b) van levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; c) waarbij ten minste één van deze twee klassen van cellen in een drie- dimensionaal weefselmodel wordt gebruikt, waardoor eventuele identificatie wordt mogelijk gemaakt van ten minste één 25 biologische parameter die na genoemde stress gemodificeerd is.

Cellen die "referentiecellen" worden genoemd, zijn cellen die niet de stress hebben ondergaan die onderzocht wordt. De vakman zal gemakkelijk inzien dat, ten behoeve van optimalisatie van de beschreven uitvinding, de referentiecellen cellen zijn die zo min mogelijk aan wat voor stress dan ook zijn blootgesteld. Deze cellen 30 zullen met name hetzij verwijderd zijn bij beschermde biopsieën, d.i. die niet veel aan zonnestraling zijn blootgesteld (borst, buik, enz....), hetzij cellen zijn die aan geen enkele soort stress zijn blootgesteld (fysisch-chemische, biologische of mechanische H stress).

I f022658· I ' 7

Cellen die "gestresste cellen" worden genoemd, zijn cellen die afkomstig zijn van biopsieën die in gebieden zijn genomen die aan de zon zijn blootgesteld (hand, gezicht, enz. ...), of cellen die aan een stress zijn blootgesteld (fysische, chemische of biologische stress), waaronder de volgende soorten stress: UVA, UVB, zonlicht, infra-5 rood, nabij infrarood, thermisch, magnetisch veld, hertziaanse straling, waaronder microgolven en golven van mobiele telefoons, ioniserende straling waaronder beta, gamma en röntgenstraling, zoals ondervonden tijdens een toevallige of niet-toevallige blootstelling aan dergelijke straling, enz. ... De cellen kunnen van verscheidene biopsieën afkomstig zijn, van dezelfde donor of van verschillende donoren.

10 De biologische parameter correspondeert in het algemeen met willekeurig welke modificatie van de expressie van een gen, met willekeurig welke modificatie van de secretie van een eiwit, of met willekeurig welke modificatie die in het metabolisme van een referentiecel zou kunnen worden opgemerkt.

Het weefselmodel is gedefinieerd als zijnde een weefselmodel, ook aangeduid 15 met een driedimensionaal model, dat met levende cellen kan worden gezaaid, met name met het doel van reconstitutie van een weefsel van een levend wezen, is het weefselmodel in het bijzonder gedefinieerd als zijnde in staat een model te zijn voor bindmatrix, genaamd dermis in het geval van huid en genaamd chorion in het geval van een slijmvlies, die in hoofdzaak stromale cellen bevat, een epitheelmodel dat in 2 0 hoofdzaak uit epitheelcellen bestaat, een epidermis model dat in hoofdzaak uit keratinocyten bestaat, een huidmodel dat uit een epidermis en uit een dermis bestaat, een slijmvliesmodel dat uit een epitheel en uit een chorion bestaat, een model van biopsieën (of explantaten) die in leven worden gehouden, als ook de modellen in een monolaag, of in suspensie, waarbij gebruik wordt gemaakt van de in 25 de hierboven beschreven modellen aanwezige cellen.

In deze modellen kan gebruik worden gemaakt van normale, gezonde of pathologische cellen, of van cellen die van cellijnen afkomstig zijn; deze cellen kunnen van menselijke of dierlijke herkomst zijn.

Volgens een variant van deze laatstgenoemde eigenschap omvat het drie- 3 0 dimensionale kweekmodel van bindmatrices (dermis of chorion) een drager die met stromale cellen is bezaaid, om gereconstrueerde dermis of gereconstrueerde chorions te vormen.

Het driedimensionale epidermis of epitheel kweekmodel omvat een drager die wel of niet tevoren met stromale cellen is bezaaid, in het bijzonder fibroblasten, en 1022658· Η I vervolgens met epitheelcellen en in het bijzonder keratinocyten, om gereconstrueerd I epitheel of epidermis te verkrijgen.

I Het driedimensionale gereconstrueerde huid of slijmvlies kweekmodel omvat I een matrixdrager (dermaal of van chorion) die met epitheelcellen is bezaaid ter 5 verkrijging van een gereconstrueerd slijmvlies of met keratinocyten ter verkrijging I van een gereconstrueerde huid.

I Volgens een variant omvat het toegepaste driedimensionale kweekmodel een I model waarin ten minste één additioneel celtype is opgenomen, bijv. endotheelcellen I (EC) en/of lymfocyten en/of adiposecellen en/of huidaanhangsels, zoals lichaamshaar, I 10 haar, talgklieren.

I Volgens een variant kan de driedimensionale drager tevens de kolonisatie H mogelijk maken met willekeurig welk ander celtype (immuuncellen, endotheelcellen, H neuronen, spiercellen, hepatocyten, enz. ...).

I Bij voorkeur kunnen, in aanvulling op het epitheel gedeelte, pigmentcellen, 15 immunocompetente cellen (cellen van Langerhans en/of dendritische cellen), zenuw- I cellen ..., worden ingebracht.

De verschillende geëxtraheerde celtypes (fibroblasten, keratinocyten, melano- I cyten, ...) worden afzonderlijk geamplificeerd en kunnen apart worden toegepast dan wel van verscheidene donoren worden bijeengebracht, zowel voor de reconstructie van 2 0 de driedimensionale modellen als voor de kweken in monolagen of in suspensie.

De hierboven gedefinieerde weefselmodellen worden aan het eind van de kweek gebruikt voor het uitvoeren van genomische en proteomische analyses, welke meer in het bijzonder de selectie, de identificatie en de karakterisatie van potentiële doelwitten voor het bestrijden van de effecten van een stress mogelijk maken.

I 25 De potentiële doelwitten corresponderen met de biologische parameters die omgekeerd moeten worden of waarvan de modificatie moet worden aangewezen.

Na definitie van de doelwitten kunnen deze zelfde modellen en methoden van detectie worden gebruikt voor het screenen van cosmetische of farmaceutische actieve stoffen. Deze zelfde modellen en methoden van detectie kunnen worden gebruikt om 3 0 de effectiviteit van cosmetische of farmaceutische formuleringen die al dan niet de actieve stoffen bevatten, aan te tonen.

Deze modellen en methoden van detectie kunnen tevens worden gebruikt om de toxiciteit aan te tonen van actieve stoffen, cosmetische of farmaceutische, of van I 1022658· 9 cosmetische of farmaceutische formuleringen, waarbij deze toxiciteit door een stress, in het bijzonder door fototoxiciteit, wordt geïnduceerd.

Van de gehanteerde analytische technieken kunnen in het bijzonder de volgende worden genoemd: 5 - voor de analyse van het proteomische profiel: bidimensionale elektroforese, en/of eiwit arrays, en/of cytokine array, en/of gecombineerde ELISA bepalingen; voor de analyse van het genomische profiel: DNA arrays, en/of polymerase kettingreactie multiplex (PCR-multiplex), en/of polymerase kettingreactie (PCR), en/of reële tijd polymerase kettingreactie (reële tijd PCR); 10 - voor de analyse van het transcriptomische profiel: RNA arrays, cDNA arrays en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie multiplex (RT-PCR-multiplex) en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) en/of reële tijd reverse transcriptie polymerase kettingreactie (reële tijd RT-PCR).

15 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Volgens een eerste aspect heeft de uitvinding betrekking op een methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, omvattende de vergeleken proteomische en/of vergeleken transcriptomische en/of vergeleken genomische analyse: 2 0 a) van levende cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen; b) van levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; c) waarbij ten minste één van deze twee klassen van cellen in een drie- 2 5 dimensionaal weefselmodel wordt gebruikt, waardoor eventuele identificatie wordt mogelijk gemaakt van ten minste één biologische parameter die na genoemde stress gemodificeerd is.

De uitvinding heeft met name betrekking op een methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, 3 0 omvattende: a) de proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, ten dele of volledig, van levende cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen, uitgezaaid in een weefselmodel; 10226§8· I 10 I b) vergelijking van de uitgevoerde analyse in a) met de proteomische analyse I en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, ten dele of volledig, van I levende cellen die niet aan genoemde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; en I 5 c) eventuele identificatie van ten minste één biologische parameter die na I genoemde stress gemodificeerd is.

Bij voorkeur worden de referentiecellen en de gestresste cellen in een driedimensionaal weefselmodel toegepast.

Bij voorkeur wordt de biologische parameter, die tijdens een stress wordt I 10 gemodificeerd, gedefinieerd door ten minste één verschil tussen het metabolisme van I de cellen die met gestresste cellen worden aangeduid en het metabolisme van de cellen die referentiecellen worden genoemd.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de hierboven genoemde stap a) I de volgende stappen: I 15 al) uitzaaien van een of meer typen cellen die met referentiecellen worden aangeduid in een celmodel, d.i. in een monolaag, of in suspensie, en/of weefselmodel, d.i. driedimensionaal; I a2) blootstellen van dit model aan een stress, waarbij deze cellen met gestresste H cellen worden aangeduid.

H 20 Volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat stap a) de volgende stappen: al) blootstellen van een of meer typen levende cellen aan een stress, waarbij deze cellen met gestresste cellen worden aangeduid; H a2) toepassen van deze gestresste cellen in een celmodel, d.i. in een monolaag, of 2 5 in suspensie, en/of weefselmodel, d.i. driedimensionaal.

De stress is bij voorkeur een fysische stress, waarbij deze stress gekozen wordt uit de stress soorten: UVA, UVB, zonlicht, infrarood, nabij infrarood, thermisch, magnetisch veld, hertziaanse strafing waaronder microgolven en golven van mobiele telefoons, ioniserende straling waaronder beta, gamma en röntgen straling, zoals 30 welke worden ondervonden tijdens een toevallige of niet toevallige blootstelling aan zulke straling, en/of een fysisch-chemische stress, en /of biologische stress, en/of mechanische stress.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de gestresste cellen: I 1022658* 11 • cellen die afkomstig zijn van biopsieën welke zijn afgenomen uit aan de zon blootgestelde gebieden; de vakman zal weten uit welke gebieden monsters genomen moeten worden, zoals de hand, het gezicht.

• cellen die gestresst zijn door een fysische stress, waarbij deze stress gekozen 5 wordt uit de stress soorten: UVA, UVB, zonlicht, infrarood, nabij infrarood, thermisch, magnetisch veld, hertziaanse straling waaronder microgolven en golven van mobiele telefoons, ioniserende straling waaronder beta, gamma en röntgen straling, zoals welke worden ondervonden tijdens een toevallige of niet toevallige blootstelling aan zulke straling, en/of een fysisch-chemische stress, en /of biologische 10 stress, en/of mechanische stress.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de referentiecellen hetzij bij biopsieën verwijderde cellen die niet erg met zonnestraling gestresst zijn, zoals de borst, de buik, de voorhuid, hetzij cellen die niet gestresst zijn door een stress zoals een fysische stress van het UVA en/of UVB en/of zonnestraling type, en/of straling 15 van een magnetisch veld, en/of chemische stress, en/of biologische stress en/of mechanische stress.

De gestresste cellen zijn bij voorkeur cellen van ten minste één mens of van ten minste één dier.

Het onderzoek omvat bij voorkeur ten minste één analyse uit de volgende 2 0 analysemethoden: voor de analyse van het proteomische profiel: bidimensionale elektroforese, en/of eiwitarrays en/of cytokine array en/of gecombineerde ELISA bepalingen; voor de analyse van het genomische profiel: DNA arrays, en/of polymerase kettingreactie multiplex (PCR-multiplex) en/of polymerase kettingreactie (PCR) en/of 25 reële tijd polymerase kettingreactie (reële tijd PCR); voor de analyse van het transcriptomische profiel: RNA arrays, cDNA arrays, en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie multiplex (RT-PCR-multiplex) en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) en/of reële tijd reverse transcriptie polymerase kettingreactie (reële tijd RT-PCR).

3 0 Het weefselmodel wordt bij voorkeur gekweekt en/of bewaard onder condities die een celmetabolisme ten minste gedeeltelijk in stand houden.

Het weefselmodel omvat bij voorkeur ten minste fibroblasten of keratinocyten.

1022658« I 12 I Bij voorkeur omvat het model: normale, gezonde of pathologische cellen, of I cellen die afstammen van cellijnen, bij voorkeur zijn deze cellen van menselijke of I dierlijke afkomst.

I Het weefselmodel wordt bij voorkeur uit de volgende modellen gekozen: een I 5 model van bindmatrix, genaamd dermis in het geval van huid en genaamd chorion in het geval van een slijmvlies, die voornamelijk stromale cellen bevat, een epitheel- I model dat in hoofdzaak door epitheelcellen wordt gevormd, een epidermis model dat I in hoofdzaak door keratinocyten wordt gevormd, een huidmodel dat door een I epidermis en een dermis wordt gevormd, een slijmvliesmodel dat door een epitheel en 10 een chorion wordt gevormd.

I Het weefselmodel is bij voorkeur een weefselmodel van bindmatrix (dermis of I chorion), welke een matrixdrager omvat die bij voorkeur is gekozen uit: - een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een semipermeabel synthetisch membraan, in het bijzonder een semipermeabel nitrocellulose membraan, 15 een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel I Biopore-CM membraan, een semipermeabel polyester membraan, een membraan of I 2 0 een film van polyglycolzuur. In deze groep bevinden zich bijv. de dermale modellen

Skin 2™ model ZK1100 en Dermagraft® en Transcyte® (Advanced Tissue Sciences); - een met celkweek behandelde kunststof (vorming van een dermaal blad: I Michel M. et al, in In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 1999, 35: 318-326); - een gel of een membraan gebaseerd op hyaluronzuur (Hyalograft® 3D - Fidia H 2 5 Advanced Biopolymers) en/of op collageen en/of op fibronectine en/of op fibrine; in deze groep bevindt zich bijv. het dermale model Vitrix® (Organogenesis); - een poreuze matrix, al dan niet voorzien van een oppervlak, vervaardigd van collageen dat in staat is een of meer glycosaminoglycanen en/of eventueel chitosan te I bevatten (EP 0 296 078 Al van CNRS, WO 01/911821 en WO 01/92322 van Coletica); 3 0 in deze groep bevindt zich bijv. het dermale model Mimederm® (Coletica), waarbij deze matrixdragers stromale cellen omvatten, in het bijzonder fibroblasten.

Het weefselmodel is bij voorkeur een epidermis weefselmodel of epitheel weefselmodel dat een matrixdrager omvat die bij voorkeur gekozen is uit: I 1022658· 13 een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een semipermeabel synthetisch membraan, in het bijzonder een semipermeabel nitrocellulose membraan, een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, van 5 polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel Biopore-CM membraan, een semipermeabel polyester membraan. In deze groep bevinden zich de modellen van gereconstrueerde epidermis en epitheel (Skinethic®), evenals de modellen EpiDerm®, EpiAirway®, EpiOccular® (Mattek Corporation); 10 - een film of een membraan gebaseerd op hyaluronzuur en/of op collageen en/of op fibronectine en/of op fibrine. In deze groep kunnen in het bijzonder worden genoemd de modellen Mimetop® (Coletica), Laserskin® (Fidia advanced Biopolymers), Episkin® (L'Oreal).

Deze modellen worden vooraf met stromale cellen bezaaid, in het bijzonder 15 fibroblasten, en daarna met epitheelcellen en in het bijzonder keratinocyten.

In het epitheelgedeelte worden in aanvulling op de epitheelcellen bij voorkeur ook epitheelcellen, pigmentcellen, immunocompetente cellen, zenuwcellen ingebracht, waarbij de immunocompetente cellen bij voorkeur cellen van Langerhans zijn.

Het weefselmodel is bij voorkeur een weefselmodel van gereconstrueerde huid 20 of slijmvlies dat een dermale of chorion matrixdrager omvat welke bij voorkeur is gekozen uit: een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een semipermeabel synthetisch membraan, in het bijzonder een semipermeabel nitrocellulose membraan, een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een 2 5 semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, van polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel Biopore-CM membraan, een semipermeabel polyester membraan, welke inerte drager stromale cellen bevat, in het bijzonder fibroblasten; 3 0 - een gel gebaseerd op collageen en/of hyaluronzuur en/of fibronectine en/of op fibrine, omvattende stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten; een poreuze matrix, al dan niet voorzien van een oppervlak, vervaardigd van collageen dat in staat is een of meer glycosaminoglycanen en/of eventueel chitosan te 1022658* I 14 H bevatten, in welke poreuze matrices stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten zijn I geïntegreerd; I - een van epidermis ontdane dermis of dode dermis, van een mens of dier.

H In deze groep kunnen in het bijzonder de modellen Mimeskin® (Coletica), Apligraf® I 5 (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems® Biotechnologie Vertrieb), evenals Skin 2™ I (ZK1200-1300-2000 - Advanced Tissue Science) worden genoemd.

H Bovendien bestaan er modellen die gewijd zijn aan weefseltherapie, welke eveneens het onderwerp van dergelijke studies kan zijn. Genoemd kunnen worden de I modellen Epidex™ (Modex Therapeutiques), Epibase® (Laboratoire Genevrier), I 10 Epicell™ (Genzyme), Autoderm™, en Transderm™ (Innogenetics).

De matrixdrager wordt dan bezaaid met epitheelcellen om een gerecon- strueerd slijmvlies te verkrijgen of met keratinocyten om een gereconstrueerde huid te verkrijgen.

Bij voorkeur omvat het toegepaste weefselmodel een model waarin ten minste 15 één extra celtype is opgenomen, liefst endotheelcellen (EC) en/of immuuncellen, zoals lymfocyten, macrofagen, dendritische cellen en/of adiposecellen en/of huid- aanhangsels, zoals lichaamshaar, haar, talgklieren.

I Volgens een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van I een methode zoals hierboven gedefinieerd voor het uitvoeren van de screening van I 2 0 ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen tot omkering van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress zoals hierboven gedefinieerd is gemodificeerd.

Volgens een derde aspect heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van een methode voor het uitvoeren van de screening van ten minste één potentieel 25 actieve stof met het vermogen een indicatie te geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress zoals hierboven gedefinieerd I is gemodificeerd.

De onderhavige uitvinding heeft bij voorkeur betrekking op een methode voor het uitvoeren van de screening van ten minste één potentieel actieve stof met het 3 0 vermogen tot het geven van een indicatie van, of tot het omkeren van de modificatie van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress zoals hierboven gedefinieerd is gemodificeerd, omvattende: AI in contact brengen van genoemde potentieel actieve stof met referentiecellen zoals hierboven gedefinieerd, uitgezaaid in een weefselmodel zoals hierboven gedefi- I 1022658# 15 nieerd, gedurende een voldoend lange periode opdat genoemde potentieel actieve stof kan werken; waarbij een stress zoals hierboven gedefinieerd wordt toegepast; B/ proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, ter bestudering van de werking van genoemde stof op 5 het celmetabolisme van genoemde cellen; C/ vergelijking van het celmetabolisme van genoemde cellen in aanwezigheid van de potentieel actieve stof met het metabolisme van genoemde cellen zonder de aanwezigheid van die stof, aangeduid met controlecellen; en D/ identificatie van de aan- of afwezigheid van activiteit van genoemde potentieel 10 actieve stof, wat met name de identificatie omvat van een positief of negatief effect van genoemde stof teneinde een indicatie te verschaffen voor de modificatie van de biologische parameter.

Volgens een ander aspect betreft de uitvinding een methode voor identificatie van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen tot omkering van ten 15 minste één biologische parameter die tijdens een stress is gemodificeerd, omvattende: a) kweken van cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met gestresste cellen, liefst zoals hierboven gedefinieerd, die een gemodificeerde biologische parameter hebben, in aanwezigheid van ten minste één eventueel actieve stof, gedurende een voldoend lange periode opdat genoemde potentieel actieve stof 2 0 eventueel kan inwerken op het celmetabolisme van genoemde cellen, waarbij genoemde gestresste cellen in een weefselmodel zoals hierboven gedefinieerd zijn uitgezaaid; b) proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals hierboven gedefinieerd, van de in 2 5 stap a) gekweekte gestresste cellen; c) vergelijking van de in b) uitgevoerde analyse met de proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals hierboven gedefinieerd, van levende cellen die gekweekt worden zonder de aanwezigheid van genoemde potentieel actieve stof, aangeduid met 3 0 controlecellen; d) in aansluiting op de vergelijking van de analyses die in c) is uitgevoerd, eventuele identificatie van ten minste één actieve stof met het vermogen tot omkering van ten minste één biologische parameter die door de stress wordt gemodificeerd.

1022658« I 16

Volgens een ander aspect betreft de uitvinding een methode voor identificatie I van ten minste één potentieel actieve stof welke een indicatie kan geven van de I modificatie van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress is I gemodificeerd, omvattende: I 5 a) in contact brengen van genoemde potentieel actieve stof met referentiecellen I zoals hierboven gedefinieerd, uitgezaaid in een weefselmodel zoals hierboven I gedefinieerd, gedurende een voldoend lange periode opdat genoemde potentieel actieve stof kan werken; waarbij een stress zoals hierboven gedefinieerd wordt toegepast; 10 b) proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals hierboven gedefinieerd, van de in I stap a) gekweekte gestresste cellen; c) vergelijking van de in b) uitgevoerde analyse met de proteomische analyse en/of transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij I 15 voorkeur zoals hierboven gedefinieerd, van levende cellen die gekweekt worden zonder de aanwezigheid van genoemde potentieel actieve stof, aangeduid met controlecellen; d) in aansluiting op de vergelijking van de analyses die in c) is uitgevoerd, eventuele identificatie van ten minste één actieve stof met het vermogen een indicatie 2 0 te geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die door de stress wordt gemodificeerd.

Volgens een ander aspect betreft de uitvinding het gebruik van een actieve stof die met een methode zoals hierboven gedefinieerd is geselecteerd, voor het bereiden van ten minste één cosmetische en/of farmaceutische samenstelling.

2 5 Volgens een ander aspect betreft de uitvinding een stof die actief is op het gebied van de cosmetica of van de farmacie en die geselecteerd is met een methode zoals hierboven gedefinieerd.

Volgens een ander aspect betreft de uitvinding een actieve stof met het H vermogen tot omkering van een biologische parameter die geïdentificeerd is als een 30 parameter die tijdens een fysische, chemische of biologische stress wordt gemodificeerd, en/of het vermogen een indicatie te geven van de modificatie ervan, waarbij deze parameter is geïdentificeerd door vergelijkende studies te maken tussen celmodellen die gebruik maken van cellen aangeduid met "gestresste cellen" en celmodellen die gebruik maken van cellen aangeduid met "referentiecellen", waarbij 17 ten minste één van deze modellen een weefselmodel is dat ten minste fibroblasten of keratinocyten omvat.

Andere doeleinden, kenmerken en voordelen van de uitvinding zullen duidelijk worden in het licht van de toeüchtende beschrijving die volgt en die gegeven wordt 5 onder verwijzing naar de voorbeelden die eenvoudig ter illustratie worden gegeven en op geen enkele wijze de omvang van de uitvinding beperken. De voorbeelden maken integraal deel uit van de uitvinding en elk kenmerk dat nieuw blijkt ten opzichte van eventuele stand van de techniek wordt geclaimd als integraal deel van de uitvinding in zijn functie en in zijn algemeenheid. Alle percentages in de voorbeelden zijn 10 betrokken op het gewicht, de temperatuur is in graden Celsius, de druk is atmosferische druk, tenzij anders is aangegeven.

VOORBEELD 1

Extractie en kweek van cellen aangeduid met "gestresste cellen" of van cellen 15 aangeduid met "referentiecellen11

Cellen die referentiecellen worden genoemd, zijn hetzij: • cellen die uit biopsieën worden geëxtraheerd, van donoren van uiteenlopende leeftijd, welke biopsieën geen stress in de zon hebben ondervonden en die verkregen van plastische chirurgie, die bij voorkeur is van de buik of van de borst of eventueel 2 0 van het tandvlees of van de vagina.

Cellen de gestresste cellen worden genoemd, zijn hetzij: • cellen die uit biopsieën worden geëxtraheerd, van donoren van uiteenlopende leeftijd, welke biopsieën zijn verkregen van plastische chirurgie van gebieden die gestresst zijn in de zon (gezicht, nek, hand).

25 De verkregen celtypen kunnen fibroblasten zijn, geëxtraheerd door de techniek van explantatie of door enzymatische digestie, bijv. met collagenase, keratinocyten of melanocyten, geëxtraheerd na enzymatische dermo-epidermische dissociatie, in het bijzonder met dispase of thermolysine of trypsine-EDTA...

Na extractie worden de fibroblasten geamplificeerd in DMEM medium 30 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 glutamax 50/50 volume/volume, aangevuld met 10% kalverserum, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met gentamycine in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 microgram/ml. De fibroblasten worden geamplificeerd door trypsinatie zodra een confluentie van 90% is verkregen.

10226881 Η I Na extractie worden de keratinocyten geamplificeerd in D-SFM medium (Keratinocyte Serum Free Medium - Invitrogen) dat extract van runder hypofyse klier bevat, aangevuld met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met I gentamycine in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, met amfotericine B in een 5 eindconcentratie van 1 microgram/ml. De keratinocyten worden geamplificeerd door trypsinatie zodra een confluentie van 90% is verkregen.

Na extractie worden de melanocyten geamplificeerd in MMK2 medium (Melanocyte Medium Kit - Sigma) angevuld met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met gentamycine in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, met 10 amfotericine B in een eindconcentratie van 1 microgram/ml en met geneticine in een I omvang van 100 microgram/ml gedurende 3 dagen teneinde de resterende I keratinocyten te elimineren. De kweek wordt dan in hetzelfde medium met uitzondering van het geneticine gecontinueerd. De melanocyten worden geamplificeerd door trypsinatie zodra een confluentie van 90% is verkregen.

I VOORBEELD 2

Vervaardiging van gereconstrueerde dermis uit cellen die met "gestresste cellen" worden aangeduid of uit cellen die met "referentiecellen" worden aangeduid 500.000 Fibroblasten, afkomstig van een samenvoeging van drie referentie I 2 0 biopsieën (biopsie van de borst) en van een samenvoeging van drie gestresste biopsieën (lifting), die zoals beschreven in Voorbeeld 1 zijn geamplificeerd, worden uitgezaaid in dermale substraten die uit collageen zijn vervaardigd dat met difenylfosforylazide is gecrosslinkt, in een DMEM-glutamax medium, aangevuld met 10% kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 milli- H 25 molair, met EGF of epidermale groeifactor in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met gentamycine in een eind- concentratie van 1 microgram/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van Η 1 microgram/ml, gedurende een periode van 21 dagen.

19 VOORBEELD 3

Kwantificering van cvtokines in gereconstrueerde dermis die tevoren is bezaaid met cellen aangeduid met "gestresste cellen” of met cellen aangeduid met "referentie-cellen". waarbij de stress een bestraling met UVA is 5 500.000 Fibroblasten, afkomstig van een referentie biopsie (biopsie van de borst), die zoals beschreven in Voorbeeld 1 zijn geamplificeerd, worden uitgezaaid in dermale substraten die uit collageen zijn vervaardigd dat met difenylfosforylazide is gecrosslinkt, in een DMEM-glutamax medium, aangevuld met 10% kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF of 10 epidermale groeifactor in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met gentamycine in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, gedurende een periode van 15 dagen. Daarna worden ze nog een week gekweekt in medium zonder serum (FBM, Fibroblast Basaal Medium - Promocell).

15 Aan het eind van de experimenten worden de gereconstrueerde dermis gespoeld in fosfaatbuffer (PBS) pH 7,4 en vervolgens in kleine Petri schalen geplaatst met daarin 1 ml PBS bij pH 7,4. Bepaalde monsters worden bij kamertemperatuur bewaard (gereconstrueerde dermis die met "referentie dermis" wordt aangeduid), en andere worden met UVA (365 nm) in toenemende doses (0-5- 10- 15-20-25-30 2 0 J/cm2) bestraald.

De gereconstrueerde dermis die cellen omvat aangeduid met "gestresste cellen" of "referentiecellen" worden vervolgens gedurende 24 uur geïncubeerd in een medium zonder serum (FBM, Promocell). De cel-levensvatbaarheid in de matrices wordt geëvalueerd door een test met MTT (methylthiazooltetrazool) en wordt 25 uitgedrukt in percentage van de niet-bestraalde controle. De media worden verzameld, gecentrifugeerd, en het gehalte aan cytokines wordt bepaald door de Fluorokine MAP kit (R&D Systems). In het kort, wordt 50 microliter van een standaard of een monster in geïdentificeerde putjes gepipetteerd. Aan de putjes wordt 50 microliter toegevoegd van micropartikels waarop specifieke antilichamen van 3 0 verschillende cytokines zijn geïmmobiliseerd, als functie van een vooraf bepaald plaatontwerp. Na 1 uur incubatie onder draaiende beweging en eliminatie van de niet-vastgebonden stoffen door wassen worden aan de putjes gelabelde antilichamen toegevoegd die specifiek zijn verschillende cytokines en wordt gedurende 2 uur onder draaiende beweging geïncubeerd. Na wassen worden de micropartikels in wasbuffer T022658* Η I 20 I gesuspendeerd en wordt 1 minuut lang onder draaiende beweging geagiteerd. Er wordt onmiddellijk afgelezen op een Luminex 100 Analyser (R&D Systems). Het in de I geanalyseerde media aanwezige gehalte van de verschillende cytokines wordt bepaald H met behulp van calibratie-bereiken, gemaakt met sterk gezuiverde recombinante I 5 menselijke cytokines. Door deze techniek kan een experiment de cellulaire secretie H van verscheidene cytokines analyseren (IL-Ιβ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, I GM-CSF, G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF, IFNy).

I Tabel I

Cytokine (pg/ml) niet-gestresste cellen cellen gestresst I met UVA: 20 J/cm2 I MTT 100% 72% I 15 ILlp (pg/ml) 24 ±10 56 ±19 I IL6 (pg/ml) 570 ±142 1210 ±342 I IL8 (pg/ml) 122 ±17 173 ±23 TNFa (pg/ml) 18 ±6 110 ±42

Door de methoden volgens de uitvinding kan worden waargenomen dat de stress (hier een bestraling met UVA) een afname induceert van de cel- H levensvatbaarheid, alsmede een toename van de synthese van pro-inflammatoire H interleukines: het zou dus interessant kunnen zijn om deze synthesetoenames te 25 verlagen door correct geselecteerde actieve stoffen te gebruiken.

I VOORBEELD 4 H Kwantificering van cytokines in gereconstrueerde epidermis die cellen aangeduid met "gestresste cellen" of cellen aangeduid met "referentiecellen" omvat, voor de 30 identificatie van eventuele modulaties van de cvtokines. waarbij de stress bijv, een H blootstelling aan UVB straling is 4.10G referentie-keratinocyten, die hier niet blootgesteld zijn aan UVB straling (biopsie van de borst) en die geamphficeerd worden zoals beschreven in Voorbeeld 1 H tot passage 1 (eerste amplificatie door trypsinatie), worden uitgezaaid in Boyden I 1022658· 21 kamer-type inserties (membraan met porositeit van 0,4 micrometer en diameter van 25 mm) welke vooraf bezaaid zijn met een fibroblast voeding onder lagen, in een DMEM-Glutamax / Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium dat is aangevuld met 10% van Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcen-5 tratie van 1 millimolair, met EGF of epidermale groeifactor in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met hydrocortison in een eindconcentratie van 0,4 microgram/ml, met umuline in een eindconcentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 microgram/ml, met trijoodthyronine in een eindconcentratie van 2.10 9 molair, met adenine in een eindconcentratie van 24,3 microgram/ml, met penicilline in een 10 eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 microgram/ml, en gedurende een ondergedompelde kweekperiode van 3 tot 8 dagen.

De kweken van keratinocyten worden dan voor 12 tot 18 dagen aan het grensvlak tussen lucht en vloeistof geplaatst in hetzelfde kweekmedium als voor de 15 ondergedompelde kweek is gebruikt, met uitzondering van het kalverserum, het hydrocortison, het isuprel, het trijoodthyronine en het umuline.

6 Monsters ondergaan geen behandeling aan het eind van de kweek (model dat de referentiecellen omvat = controle).

Verschillende soorten stress kunnen op een totaal van 6 gereconstrueerde 2 0 epidermis worden toegepast. Voor elk type stress kunnen verschillende protocols, uit de volgende lijst, bij voorbeeld worden toegepast:

Chemische stress: gedurende 10 minuten tot een uur worden verschillende middelen op de gereconstrueerde epidermis aangebracht en vervolgens geëlimineerd door spoelen in PBS, pH 7,4, zoals bijvoorbeeld 2% natriumlaurylsulfaat (SLS), 0,05% 25 tretinoïne, waterstofperoxide (3 tot 300 μΜ), stikstofoxide (NO) (MAHMA nonoaat 0,1 tot 1 μΜ), hypoxia door verzadiging met CO2 of door sigarettenrook.

Biologische stress: gedurende 1 uur worden verscheidene middelen op de gereconstrueerde epidermis aangebracht en vervolgens geëlimineerd door spoelen in PBS, pH 7,4, zoals bijv. TGFp (5-10 ng/ml), TNFa (50-100-200 IU/ml), IL1 (5-10 ng/ml), 30 LPS (lipopolysaccharide 5-10 ng/ml).

Mechanische stress: de gereconstrueerde epidermis worden gesneden of gecomprimeerd gedurende 1 uur.

Thermische stress: de gereconstrueerde epidermis worden gedurende 1 uur op 37°C, 40°C en 43°C geplaatst.

10226580 22 H Magnetisch veld: de gereconstrueerde epidermis worden gedurende 1 uur

I onder een magnetisch veld geplaatst, bijv. van 835 MHz/0,6W en 1800 MHz/0,125W

(radiofrequentie van mobiele telefoons).

I Microgolven: de gereconstrueerde epidermis worden aan microgolven H 5 onderworpen: frequenties 2,45 en 7,7 GHz en vermogen 30 mW/cm2.

Ioniserende straling: de gereconstrueerde epidermis worden onderworpen aan I röntgenstraling in doses van 0,2 tot 10 mGy.

I UV stress: UVA (0-60 J/cm2), UVB (0-100 mJ/cm2), zonlicht (0-3500 kJ/m2).

10 In deze experimenten hebben wij ervoor gekozen een bestraling met UVB type

I uit te voeren. Hiertoe wordt het kweekmedium geëlimineerd en vervangen door PBS

pH 7,4 en bepaalde gereconstrueerde epidermis die in de inserties aanwezig zijn, worden bestraald met toenemende doses UVB (312 nm) van 0 tot 100 mJ/cm2. Andere I worden onder dezelfde condities gehouden zonder bestraling (epidermis aangeduid 15 met "niet-gestresste referentie epidermis). De aldus behandelde gereconstrueerde epidermis worden dan nog eens 24 uur in onderdompelingsmedium geïncubeerd. De bepaling van de cytokines wordt uitgevoerd door Florokine MAP zoals beschreven in

Voorbeeld 3. De cel-levensvatbaarheid wordt geëvalueerd door eiwitbepaling (bicinchoninezuur kit voor eiwitbepaling - Sigma St Louis USA) of döor een andere 20 test van cel-levensvatbaarheid die de bepaling van de enzymatische alkalisch fosfatase activiteit toelaat (incubatie gedurende 2 uur bij 37°C in een oplossing die 5 mM p-nitrofenylfosfaat, 0,1 M natriumacetaat, 0,1% Triton X100 pH 5 bevat en vervolgens neutralisatie met 10% IN NaOH en aflezing van de absorptie bij 405 nm).

De resultaten worden, uitgedrukt in percentage van de niet-bestraalde 25 controle, getoond in de volgende Tabel: I 1022658· 23

Tabei II

Cytokine (pg/ml) niet-gestresste cellen cellen gestresst met UVB: 21 mJ/cm2 5 .................................................................................................................

BCA 100% 58% ILlp (pg/ml) 25 ±8 137 ±39 IL6 (pg/ml) 120 ± 30 702 ± 29 IL8 (pg/ml) 352 ±57 473 ±72 10 TNFa (pg/ml) 17 ± 11 125 ± 42

Door de methoden volgens de uitvinding wordt het mogelijk te zien dat de stress (hier een UVB bestraling) een significante afname van de cel-15 levensvatbaarheid induceert, evenals een toename van de synthese van de pro-inflammatoire interleukines: het zou daarom interessant kunnen zijn om deze toenames in synthese te verminderen en de celmortaliteit te beperken door correct geselecteerde actieve stoffen te gebruiken.

20 VOORBEELD 5

Vervaardiging van gereconstrueerde tandvleessliimvliesepitheel omvattende cellen die met "gestresste cellen" worden aangeduid of cellen die met "referentiecellen" worden aangeduid, voor kwantificering van de mRNA's van cytokines, chemokines en immunomodulatiefactoren 2 5 1 tot 2.106 Epitheelcellen van tandvleesslijmvlies aangeduid met "referentie tandvlees-slijmvlies epitheelcellen" (biopsie van tandvlees, passage 3 (3e amplificatie door trypsinatie)), die op de in Voorbeeld 1 beschreven wijze zijn geëxtraheerd, worden uitgezaaid in Boyden kamer-type inserties (membraan met porositeit van 0,4 micrometer en diameter van 10 mm - fibroblast voeding onder laag), in een 3 0 DMEM-Glutamax / Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium, aangevuld met 10% Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met hydrocortison in een eindconcentratie van 0,4 microgram/ml, met umuline in een eindconcentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 microgram/ml, met trijood- 1022668· I 24 I thyronine in een eindconcentratie van 2.10 9 molair, met adenine in een eindconcen- I tratie van 24,3 microgram/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, I met amfotericiné B in een eindconcentratie van 1 microgram/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 microgram/ml, en gedurende een ondergedompelde H 5 kweekperiode van 3 tot 8 dagen.

I De kweken van epitheelcellen worden daarna gedurende 12 tot 18 dagen I ondergedompeld gehouden in hetzelfde kweekmedium als voor de onderdompelings- I kweek is gebruikt, met uitzondering van het percentage kalverserum dat met 10% verlaagd wordt naar 1%.

H 10 Aan het eind van het experiment wordt het medium geëlimineerd en vervangen door PBS pH 7,4, en worden de in de inserties aanwezige gereconstrueerde epithelia met verscheidene potentieel irriterende of sensibiliserende middelen I gestresst, in een hoeveelheid van 20 microliter per epitheel en gedurende 1 uur: 5% I natriumlaurylsulfaat (SLS), Lipopolysaccharide (LPS) 1000 U/ml, een anti- 15 ontstekingsmiddel Prednisolon 10 mM (Sigma) en een actief Inhipase® 3% (extract van de wortel van pueraria lobata, Coletica) eveneens in de hoeveelheid van 20 microliter per epitheel gedurende 1 uur. De op de gereconstrueerde epithelia aangebrachte middelen worden vervolgens geëlimineerd waarna de gereconstrueerde epithelia nog eens 24 uur worden geïncubeerd in onderdompelingsmedium zonder 2 0 kalverserum. Bepaalde gereconstrueerde epithelia worden geanalyseerd in termen van cel-levensvatbaarheid door een test met MTT (methylthiazooltetrazool). Andere gereconstrueerde epitheha worden afgeschraapt en opgenomen in Tri Reagens® (T9424 Sigma, St Louis, USA) en vervolgens met chloroform geëxtraheerd. Na 15 minuten centrifugeren bij 4°C met 12.000g worden de RNA's in de bovenste laag 25 teruggevonden.

De bepaling van de mRNA's van de epitheha wordt uitgevoerd door Expression

Array (R&D System), volgens het door de leverancier gedefinieerde protocol. De resultaten worden uitgedrukt als een factor van variatie met betrekking tot de niet- gestresste controle: [(gestresste cellen resultaten/niet-gestresste cellen resultaten) x I 30 100].

25

Tabel III

Labelers stress met SLS stress met LPS's effect van effect van prednisolon Inhipase® 5 ...................................................................................................................

PLA2 102 168 93 50 ILlot 241 131 62 52 ILip 114 182 75 69 IL-lra 82 75 112 98 10 IL-lRAcP 102 124 95 119 IL-1RI 154 254 83 107 IL-1RII 137 262 88 102 TNFa 213 134 67 72 IL6 163 342 81 135 15 IL7 127 201 102 109 IL8 183 287 105 92 IL10 75 72 152 148 IL11 112 125 101 108 IL12 132 178 67 66 2 0 IL15 147 189 99 108

De methoden volgens de uitvinding laten toe waar te nemen dat de stress (hier het aanbrengen van een middel van een irriterend of sensibiliserend type) een modifi- 2 5 catie van verscheidene labellers van de ontsteking induceerde. De doelmatigheid van een actieve stof Inhipase® wordt aangetoond in vergelijking met het als referentie fungerende anti-ontstekingsmiddel.

VOORBEELD 6 3 0 Vervaardiging van een weefselmodel van gereconstrueerde huid en studie van een thermische stress op de syntheses van mRNA en vergelijking tussen ionge donoren en donoren op leeftijd

De geëxtraheerde cellen zijn verkregen van een tegen licht beschermde borst-biopsie.

1022658· Η 400.000 Fibroblasten die met "jonge fibroblasten" worden aangeduid I (samenvoeging van drie donoren van minder dan 35 jaar oud) en "fibroblasten op I leeftijd" (samenvoeging van drie donoren van meer dan 55 jaar oud) worden H geëxtraheerd en geamplificeerd tot passage 5 (5e amplificatie door trypsinatie) zoals 5 beschreven in Voorbeeld 1 en worden vervolgens uitgezaaid op de twee vlakken van dermale substraten die van een oppervlak zijn voorzien.

In het kort, worden de dermale substraten volgens het volgende protocol vervaardigd: - drogen bij 25°C van een 0,75% collageengel ter vorming van een film; 10 afzetten van de collageenfilm op een 0,75% collageengel; - lyofiliseren gedurende 24 uur en crosslinken met DPPA (difenylfosforylazide I 50 μΐ/g op collageen in dimethylformamide oplosmiddel en vervolgens pH 8,9 boraat- I buffer); I - na spoelen met gedemineraliseerd water worden de van een oppervlak 15 voorziene dermale substraten nogmaals gelyofiliseerd.

Het voor de kweek van de fibroblasten toegepaste medium is een DMEM-

Glutamax medium, aangevuld met 10% Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur- 2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF of epidermale groei- factor in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met penicilline in een eindconcentratie 20 van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 pg/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 pg/ml. Voor het verkrijgen van gereconstrueerde dermis is een kweektijd nodig van 14 dagen.

Vervolgens worden 400.000 keratinocyten die "jonge keratinocyten" worden genoemd (samenvoeging van drie donoren van minder dan 35 jaar oud) en 25 "keratinocyten op leeftijd" (samenvoeging van drie donoren van meer dan 55 jaar oud), die geëxtraheerd en geamplificeerd tot passage 2 (2e amplificatie door trypsinatie) zijn, zoals beschreven in Voorbeeld 1, worden op de van een oppervlak voorziene dermale equivalenten uitgezaaid, op de filmkant, in een DMEM-Glutamax /

Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium, aangevuld met 10% Hyclone II kalver- 3 0 serum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met hydrocortison in een eindconcentratie van 0,4 pg/ml, met umuline in een eindconcentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 pg/ml, met trijoodthyronine in een eindconcentratie van 2.10'9 molair, met adenine in een eindconcentratie van 24,3 pg/ml, met penicilline in I inS>9RR8· 27 een eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 μg/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 μg/ml, en gedurende een tijd van ondergedómpelde kweek van 7 dagen.

De kweken worden daarna 14 dagen aan het grensvlak tussen lucht en 5 vloeistof geplaatst in hetzelfde kweekmedium als gebruikt voor de onderdompelings-kweek, met uitzondering van het kalverserum, het hydrocortison, het isuprel, het trijoodthyronine en het umuline.

Aan het eind van het experiment wordt het medium geëlimineerd en vervangen door PBS bij pH 7,4, en de gereconstrueerde huiden die in de inserties 10 aanwezig zijn, worden gedurende 1 uur bij 37°C (model dat de referentiecellen omvat) en 1 uur bij 43°C (model dat de gestresste cellen omvat) geïncubeerd. De aldus behandelde gereconstrueerde epidermis worden dan nog eens 24 uur in onderdompelings-medium geïncubeerd. De monsters die de "gestresste cellen" en de "referentiecellen" voor warmteshock omvatten, worden door cDNA array geanalyseerd.

15 In het kort, worden de RNA's van de monsters geëxtraheerd (eventueel na malen in vloeibare stikstof met behulp van een biopulverisator) en gezuiverd volgens het protocol van de leverancier van Tri Reagent® (Sigma), voor totale eliminatie van het DNA.

De gezuiverde RNA’s worden kwalitatief en kwantitatief geanalyseerd.

2 0 De volgende stap was de zuivering van de samenvoegingen van boodschapper RNA's (mRNA's) door hybridisatie van de poly(A) uiteinden van de mRNA's met gebiotinyleerde oligo(dT) primers en selectieve binding aan streptavidine parels, overeenkomstig het protocol van Atlas Pure (Clontech). De meervoudig met 33P gelabelde DNA probes werden vervaardigd door reverse transcriptie van de aan 2 5 parels van poly(dT) gebonden mRNA's, met behulp van een samenvoeging van primers die specifiek zijn voor de sequenties die op de "arrays" geïmmobiliseerd zijn, in aanwezigheid van [a33P]-dATP. De gelabelde probes werden door exclusie kolomchromatografie gezuiverd, de kwaliteit en de equivalentie van de gelabelde probes werden door vloeistof scintillatietelling geëvalueerd.

3 0 De Custom ATLAS membranen werden voorbehandeld en daarna werden de op elk membraan geïmmobiliseerde cDNA's met de corresponderende gelabelde probes gehybridiseerd (68°C, één nacht); de filters werden vervolgens gewassen voorafgaande aan analyse.

1022658* I 28 I - Analyse door autoradiografie en kwantificering van de radioactiviteit van de I spots met behulp van een Phosphorimager Cycloon (Packard Instrument; 3 uur en vervolgens 72 uur acquisitie) en de QuantArray software, Packard.

I - Identificatie van de genen die van belang zijn, variërend tussen de I 5 verschillende experimentele condities: jonge donoren versus donoren op leeftijd die H wel of niet een thermische stress hebben ondergaan. De resultaten worden I uitgedrukt in percentage variatie tussen het "op leeftijd" model en het jonge model, in I niet-gestresste en gestresste conditie.

I 10 Tabel IV

Labelers op leeftijd/jong op leeftijd/jong niet-gestresst gestresst I 15 Fosfolipase A2, proteïne kinase C inhibitor proteïne 1, factor activatie exoenzym S (FAS) 101 136

Bullous pemphiqoid antigeen 1 232 187

Kraakbeen specifiek proteoglycan kern proteïne 53 82 I COL1A1 nb 142 20 COL1A2 nb 124 I COL3A1 46 85 I COL6A1 64 62 I COL6A3 62 51

Fibronectine precursor 57 43 25 Hyaluronan synthase 189 154 I Involucrine 260 159 MMP1 68 125 I MMP11 63 92 I MMP16 135 195 I 30 TIMP1 74 86 TIMP3 173 152 I SPARC 50 51

Bindweefsel groeifactor precursor 56 45

Endotheline receptor type B 51 47 I 1022658· 29

Glia-afgeleide neurietpromotie factor 53 69

Granulocyt chemotactisch proteïne 2 562 489

Groei inhibitie factor, metallothioneïne III 161 142 IL-1 alfa precursor 162 398 5 IL-1R1 54 64 IL-1R2 512 242 IL-1RA 156 168 IL-3 75 52 IL-6 84 121 10 IL-8 737 917 IL-12B 81 91 KGF 50 42

Calgranuline B, migratie inhibitiefactor-gerelateerd proteïne 14, S100 calcium proteïne A9 1981 1402 15 Migratie inhibitiefactor-gerelateerd proteïne 8, calgranuline A, S100 calcium proteïne A8, cystische fibrose antigeen 4593 2567

Monocyt chemotactisch proteïne 1, monocyt chemotactische en activatie factor, 2 0 klein induceerbaar cytokine A2 289 425

Placenta groeifactor 1 en 2 388 142

Plaatjes-afgeleide groeifactor A 397 152

Plaatjes-afgeleide groeifactorreceptor alfa subeenheid 50 89

Pleiotrofine precursor, heparine bindingsfactoren 49 58 2 5 TGF beta induceerbaar vroeg proteïne 48 102

Prostaglandine G/H synthase 1 113 158

Prostaglandine G/H synthase 2 68 125 47 kDa warmte-shock proteïne, collageen bindend proteïne 1 84 289 3 0 70 kDa warmte-shock proteïne 131 587 90 kDa warmte-shock proteïne 107 412

Bax 104 158 bcl2 nb nb FAS antigeen ligand (FASL) nb 289 1022658* 30 I FAS antigeen ligand receptor nb 452 TNF-gerelateerd apoptose inducerend ligand I (TRAIL), apo2 ligand nb 197

Tenacine precursor, hexabrachion, cytotactine 64 75 5 ..................................................................-...............-.............-.....................

I Door de methoden volgens de uitvinding wordt mogelijk gemaakt waar te nemen dat de stress (hier een warmte-shock) enerzijds de modificatie van talloze I labelers induceert en anderzijds een verschillende reactie op de stress geeft als H 10 functie van de leeftijd van de donoren. Dit model laat derhalve toe actiedoelwitten te I definiëren teneinde een indicatie te verschaffen van het effect van een warmte-shock, of deze om te keren. Voorts laat dit model toe een andere strategie te definiëren voor het ontwikkelen van actieve stoffen als functie van de leeftijdsgroep in kwestie.

I 15 VOORBEELD 7

Vervaardiging van een weefselmodel van pluricellulaire gereconstrueerde huid met daarin cellen van Laneerhans. interstitiële dendritische cellen, macrofagen en endotheelcellen. een studie van een biologische stress, welke een bacteriële aanval is met bacterieel lipopolvsaccharide I 2 0 ♦ Generatie van de niet-gedifferentieerde en onrijpe dendritische cellen die in I staat zijn zich preferentieel te oriënteren in de differentiatieroute van de cellen van

Langerhans:

Het periferaal circulerende bloed werd verzameld door een aderlijk bloed- monster te nemen van een of meer menselijke donoren, in vacutainers aangevuld met I 25 gebruikelijke anti-stollingsproducten zoals lithium-heparine.

I De afscheiding van de monocyten (CD14+) uit dit circulerend bloed kan op voordelige wijze worden uitgevoerd volgens het protocol, beschreven door Geissmann I et al, in J. Exp. Med. Vol 187, nr 6, 16 maart 1998, blz. 961-966, gepubliceerd door

The Rockefeller University Press, op de volgende wijze: I 3 0 - na centrifugeren op een Ficoll® gradiënt (natrium diatrizoaat/polysucrose I dichtheid 1,077; Lymphoprep Abcys 1053980) worden de éénkernige cellen van het circulerend bloed gewonnen en indirect gelabeld met een cocktail van antilichamen I (voornamelijk anti-CD3, anti-CD7, anti-CD19, anti-CD45RA, anti-CD56, anti-IgE), gekoppeld aan magnetische kralen.

I 1022658« 31 na passage over een magnetische kolom worden alleen de niet-magnetisch gelabelde monocyten geëlueerd.

De CD14+ monocyten worden in het eluaat gewonnen volgens een willekeurige aan de vakman bekende fysische scheidingsmethode en in het bijzonder door 5 sedimentatie of centrifugatie, en worden als zodanig geëlueerd voor de daaropvolgende kweken.

De CD14+ monocyten worden daarna in kweek gezet in een hoeveelheid van ongeveer 1 miljoen per milliliter, in een RPMI 1640 kweekmedium (Rosewell Park Memorial Institute), aangevuld met 10% foetaal kalverserum dat 10 gedesupplementeerd wordt en in het begin twee cytokines bevat, namelijk het cytokine GM-CSF in een hoeveelheid van 400 IU/ml en het cytokine TGFpl in een hoeveelheid van 10 ng/ml.

De kweek wordt uitgevoerd bij 37°C in een vochtige atmosfeer die 5% CO2 bevat.

15 Het kweekmedium wordt in het begin aangevuld met een derde cytokine, namelijk het cytokine IL-13 in een hoeveelheid van 10 ng/ml. Vóór ten hoogste 2 dagen kweek wordt hetzelfde kweekmedium toegevoegd, maar zonder het IL-13, tot de 6e kweekdag. Op de 6e dag worden niet-gedifferentieerde en onrijpe dendritische cellen gegenereerd die in staat zijn zich preferentieel te oriënteren in de 2 0 differentiatieroute tot cellen van Langerhans: ongeveer 60 tot 80% van de dendritische cellen die in vitro gegenereerd zijn, exprimeren Langerine op intracellulair niveau, en CCR6 dat de specifieke receptor van MIP-3a is, de dendritische cellen die in vitro gegenereerd zijn, ondervinden sterke 2 5 chemische aantrekking door MIP-3a en dit toont de functionaliteit van de receptor CCR6 aan, de dendritische cellen die in vitro gegenereerd zijn, zijn onrijp aangezien ze niet de labels voor rijpheid CD83, DC-LAMP en CCR7 exprimeren.

3 0 ♦ Het weefselmodel wordt dan vervaardigd volgens het protocol: 2.105 Fibroblasten die uit een abdominale biopsie zijn geëxtraheerd, referentiecellen genoemd, worden geamplificeerd zoals beschreven in Voorbeeld 1 en worden vervolgens uitgezaaid op dermale substraten op basis van collageen-glycosaminoglycan-chitosan, in een DMEM-Glutamax kweekmedium, aangevuld met 10226581 I 32 I 10% hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van I 1 millimolair, met EGF of epidermale groeifactor in een eindconcentratie van

10 ng/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B

H in een eindconcentratie van 1 μg/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van H 5 20 pg/ml, en gedurende een kweektijd van 21 dagen. De kweek wordt nog een week langer voortgezet in het hierboven beschreven medium met uitzondering van het I EGF.

I Vervolgens worden 2.105 keratinocyten, geëxtraheerd uit een abdominale H biopsie, met daarin cellen die "referentiecellen" worden genoemd en geamplificeerd 10 tot passage 1 (eerste amplificatie) zoals beschreven in Voorbeeld 1, en van 1 tot 3.105 in vitro gegenereerde niet-gedifferentieerde dendritische cellen, uitgezaaid op de dermale equivalenten in een DMEM-Glutamax / Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium, aangevuld met 10% Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2> I fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF in een eindconcentratie H 15 van 10 ng/ml, met hydrocortison in een eindconcentratie van 0,4 pg/ml, met umuline in een eindconcentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 pg/ml, met trijoodthyronine in een eindconcentratie van 2.10 9 molair, met I adenine in een eindconcentratie van 24,3 pg/ml, met penicilline in een eind- concentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 pg/ml, I 2 0 en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 pg/ml, en gedurende een tijd van ondergedompelde kweek van 7 dagen.

De kweken worden daarna 20 dagen aan het grensvlak tussen lucht en vloeistof geplaatst in hetzelfde kweekmedium als gebruikt voor de onderdompelings- kweek, met uitzondering van het kalverserum, het hydrocortison, het isuprel, het I 25 trijoodthyronine en het umuline.

Onder deze condities worden de cellen van Langerhans gelocaliseerd in de epidermis, the interstitiële dendritische cellen, de macrofagen en de endotheelcellen in de dermis.

Het bacteriële hpopolysaccharide (LPS) wordt al dan niet aan het H 3 0 onderdompehngsmedium toegevoegd in een hoeveelheid van 10 ng/ml voor 6 en 24 uur.

Aan het eind van het experiment worden de immunocompetente gereconstrueerde huiden met een cDNA array geanalyseerd, zoals beschreven in

Voorbeeld 6. De verzamelde en ingevroren kweekmedia worden dan met Florokine I f022658· 33 MAP geanalyseerd, zoals beschreven in Voorbeeld 3. De resultaten worden getoond in het bijzonder voor het premature regulatiedeel door interleukine 1 en TNFa in pg/ml en in percentage voor de synthese van cytokines ([(gestresste cellen resultaten/niet-gestresste cellen resultaten) x 100]) voor de DNA array.

5

Tabel V

Fluorokine MAP afwezigheid gestresst/refe- gestresst/refe- van stress rentie, 6 uur rentie, 24 uur 10 ...................................................................-..................................................

IL1 beta (pg/ml) 76+ 17 125 ± 28 207 ± 59 TNF alfa (pg/ml) 53 ±21 87 ± 19 95 ± 22 cDNA array 15 interleukine-1 alfa (IL-1 alfa; ILIA); hematopoietine-1 100 138 interleukine-1 beta (IL-1; IL1B); cataboline 117 198 interleukine-1 beta converterend enzym 2 0 (IL1BCE) 100 125 interleukine-1 receptor antagonist proteïne (IL- IRA; IRAP) 72 335 interleukine-1 receptor type I (IL-1R1); IL-lR-alfa; p80; CDW121A antigen 119 164 25 interleukine-1 receptor type II (IL-1R2); IL- lR-beta 100 103 interleukine-1 receptor-geassocieerd kinase (IRAK) 73 152 tumor necrose factor alfa (TNF-alfa; 3 0 TNFA); cachectine 152 287 tumor necrose factor alfa-geïnduceerd proteïne 1, endothelial; B12 proteïne 123 100 tumor necrose factor receptor (TNFR) + tumor necrose factor receptor 2 (TNFR2); tumor 1022658· I necrose factor bindend proteïne 2 (TBP2) 83 119 H tumor necrose factor receptor 1 (TNFRl); tumor necrose factor bindend proteïne 1 I (TBPl); CD120A antigeen 108 176 5 tumor necrose factor-induceerbaar proteïne I TSG-6; hyaluronaat-bindend proteïne 100 129 H TNF alfa converterend enzym (TACE); een I disiritegrine & metalloproteinase domein 17 (ADAM17) 74 124 10 TNF alfa-gestimuleerd ABC proteïne I (TSAP) 100 100 TNF-gerelateerd apoptose inducerend ligand (TRAIL); APO-2 ligand (AP02L) 96 98 I CD la precursor 82 52 I 15 CD86 antigeen precursor 56 39 CD40 antigeen precursor 89 45

Deze resultaten tonen een meer of minder snelle activering aan van de genen 2 0 die coderen voor de regulering van de inflammatoire reactie door het interleukine 1 I en het TNF alfa. De daling die wordt waargenomen in het geval van de labelers CD la, CD40 en CD86 is niet te wijten aan een verschijnsel van genregulering, maar aan een verdwijning van de dendritische cellen die in het begin in de 3-dimensionale modellen aanwezig zijn onder invloed van de stress door het lipopolysaccharide, na 25 hun migratie in het onder de insertie aanwezige kweekmedium.

De methoden volgens de uitvinding laten ook een selectie toe van actieve stoffen die in staat zijn een indicatie te geven van de verscheidene modificaties die na genereren van de stress worden waargenomen, of deze modificaties te moduleren.

35 VOORBEELD 8

Vervaardiging van gepigmenteerde gereconstrueerde huiden die ziin blootgesteld aan een stress welke bepaald wordt door herhaalde bestraling met zonlicht, en studie van de doelmatigheid van actieve stoffen met anti-oxidant werking 5 De geëxtraheerde cellen worden verkregen van een borstbiopsie die niet aan de onderzochte stress is blootgesteld. 400.000 Fibroblasten, geamplificeerd tot passage 5 (5e amplificatie door trypsinatie) zoals beschreven in Voorbeeld 1, worden uitgezaaid op dermale substraten, gebaseerd op van een oppervlak voorziene sponzen van collageen, in een DMEM-Glutamax kweekmedium, aangevuld met 10% hyclone 10 II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF of epidermale groeifactor in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 pg/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 pg/ml, en gedurende een kweektijd van 14 dagen.

15 Vervolgens worden 400.000 keratinocyten en 10.000 melanocyten, geamplificeerd tot passage 2 (2e amplificatie door trypsinatie) zoals beschreven in Voorbeeld 1, op de dermale equivalenten uitgezaaid in een DMEM-Glutamax / Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium, aangevuld met 10% Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een eindconcentratie van 1 millimolair, met 2 0 EGF in een eindconcentratie van 10 ng/ml, met hydrocortison in een eindconcentratie .

van 0,4 pg/ml, met umuhne in een eindconcentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 pg/ml, met trijoodthyronine in een eindconcentratie van 2.10 9 molair, met adenine in een eindconcentratie van 24,3 pg/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 25 1 pg/ml, en met gentamycine in een eindconcentratie van 20 pg/ml, en gedurende een tijd van ondergedompelde kweek van 7 dagen.

De kweken worden daarna 14 dagen aan het grensvlak tussen lucht en vloeistof geplaatst in hetzelfde kweekmedium als gebruikt voor de onderdompelings-kweek, met uitzondering van het kalverserum, het hydrocortison, het isuprel, het 3 0 trijoodthyronine en het umuline.

Twee keer per week en twee weken lang wordt het onderdompelingsmedium geëlimineerd en vervangen door PBS bij pH 7,4. Bepaalde in de inserties aanwezige gepigmenteerde gereconstrueerde huiden worden bij kamertemperatuur bewaard; dit model omvat cellen die met "referentiecellen" worden aangeduid. Andere in de T022658« I 36 I inserties aanwezige gepigmenteerde gereconstrueerde huiden worden met 561 kJ/m2 I bestraald (wat overeenkomt met een gemiddelde blootstelling van 1 uur in centraal I Europa) met behulp van een zonnestraler Suntest CPS+ (ATLAS); dit model omvat H cellen die met "gestresste cellen" worden aangeduid. Buiten de perioden van H 5 bestraling worden de gereconstrueerde huiden bij 37°C onder 5% CO2 in onderdompelingsmedium gekweekt.

I Op de gepigmenteerde gereconstrueerde huiden wordt voor 10 dagen 8 μΐ I aangebracht van een cosmetische formulering die al dan niet 3% van een actieve stof I met antioxidant werking bevat, bijv. Flavagrum® (Hesperitine Lauraat, Coletica), 10 Flavenger® (Quercitine Caprylaat, Coletica).

H Aan het eind van de behandeling worden de gepigmenteerde gereconstrueerde I huiden nog eens 24 uur in onderdompelingsmedium ondergedompeld en vervolgens wordt de effectiviteit van de antioxidantbehandeling geëvalueerd door analyse van: I - De cellulaire levensvatbaarheid (test met MTT - methylthiazooltetrazool) in de 15 gepigmenteerde gereconstrueerde huiden die de "gestresste" cellen of de "referentie" I cellen omvatten. De resultaten worden uitgedrukt in percentage variatie ten opzichte van de niet-bestraalde controle.

- De secretie van interleukine, gekwantificeerd door Fluorokine MAP kit in het kweekmedium dat op de in Voorbeeld 3 beschreven wijze is verzameld. De resultaten 20 worden uitgedrukt in picogram/ml.

I Tabel VI

niet-gestresste gestresste cellen bestraling + bestraling + 25 cellen (bestraling) Flavagrum® Flavenger® I MTT 100 76% 88% 92% I IL1 beta (pg/ml) 76 179 125 97 I IL6 (pg/ml) 379 649 452 426 30 IL8 (pg/ml) 275 395 312 294 I TNF alfa (pg/ml) 53 152 105 89 37

De methoden volgens de uitvinding maken het mogelijk waar te nemen dat de stress (hier zonnestraling) leidt tot een afname van de cellevensvatbaarheid, alsmede tot een toename van de synthese van pro-inflammatoire interleukines: het is daarom interessant om de synthese van pro-inflammatoire moleculen te beperken door op de 5 juiste wijze geselecteerde actieve stoffen te gebruiken. Van de gescreende actieve stoffen hebben er twee, Flavagrum® en Flavenger®, een effectiviteit vertoond welke kan neigen tot herstel van het referentieniveau voor deze twee parameters.

VOORBEELD 9

10 Studie van een fysische stress die door een bestraling met UVB wordt bepaald, op een gereconstrueerde huid, en studie van de effectiviteit van een actieve stof, waarbij de analyse wordt uitgevoerd door reële tiid RT-PCR

Gereconstrueerde huiden worden gemaakt overeenkomstig het protocol beschreven in Voorbeeld 6.

15 De UVB bestraling met 50 mJ/cm2 wordt uitgevoerd voor de helft van de monsters die "gestresste" cellen bevatten. De andere monsters worden bij kamertemperatuur bewaard onder dezelfde condities, en vormen monsters die "referentie" cellen omvatten. De monsters worden dan nog eens 24 uur geïncubeerd al dan niet in aanwezigheid van een actieve stof (1 en 3% Flavenger®, d.i. geacyleerd quercitine, 2 0 Coletica, Frankrijk).

Aan het eind van het experiment worden het gehalte aan tropo-elastine mRNA, collageen van type I en collageen van type III geëvalueerd door middel van een reële tijd RT-PCR techniek. Hiertoe werden primer paren gebruikt die de amplificatie toelaten van specifieke fragmenten van tropo-elastine, van collageen van 25 type I en van collageen van type III (sense 18/antisense 19 resp. sense 18/antisense 20) en actinesequentie primers (541 baseparen). Na extractie in TriReagent® (Sigma) en zuivering van de RNA's volgens het protocol van de leverancier worden de reacties van RT-PCR (reverse transcriptie polymerase kettingreactie) uitgevoerd door kwantitatieve reële tijd RT-PCR met behulp van het "Opticon" systeem (MJ Research).

30

COLLI sense CAGAGGGAAGCCGCAAGA

COLLI antisense CTGGCCGCCATACTCGAAC

COLL3 sense AAGGAGAGCCCGGACCAC

COLL3 antisense GGACCTCCAGGGACGCCATC

1022658# I 38

I ELASTINE sense CCTTCCCCGCAGTTACCTTTC

I ELASTINE antisense GCACGCCACCTGGGTATACAC

I ACTINE sense GTGGGGCGCCCCAGGCACCA

I ACTINE antisense CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC

I Het in het putje gebrachte reactiemengsel (50 μΐ) is het volgende, voor elk I monster: I 10 μΐ RNA in de concentratie van 5 ng/μΐ; H - de primers van de verschillende toegepaste labelers; 10 - reactiemengsel (Qiagen - 25 μΐ 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR mastermix I met daarin 5 mM MgCb + 0,5 μΐ QunatiTect RT mix), waarbij de labeler SYBR Green I I zichzelf in het dubbelstrengs DNA inserteert tijdens de verlengingsstap).

I De condities van de RT-PCR ziin de volgende: I 15 - Reverse transcriptie: 30 min bij 50°C; I - PCR reacties: [15 sec bij 94°C, 30 sec bij 60°C en 30 sec bij 72°C], 50 cycli.

De afwezigheid van contaminatie en de zuiverheid van de geamplificeerde

H producten worden geverifieerd door de smeltkrommen van de geamplificeerde PCR

producten. De producten met een dubbele piek of een abnormale smelttemperatuur 2 0 worden geëlimineerd.

I Analyse en berekeningsmethode:

De opname van fluorescentie in het geamplificeerde DNA werd continu tijdens I de PCR cycli geëvalueerd. Dit systeem maakt het mogelijk fluorescentiemetings- krommen te verkrijgen als functie van het aantal PCR cycli en aldus een relatieve 25 hoeveelheid geamplificeerd DNA te evalueren.

Om rekening te houden met de in de gereconstrueerde huiden aanwezige celpopulatie werden alle resultaten toegekend aan het «actine» signaal, dat als huishoudgen werd gebruikt.

Volgens het experiment wordt de meetdrempel van de C(T) (= cyclus drempel) 30 vastgelegd voor T tussen 0,05 en 0,01 en dan wordt een willekeurige meeteenheid berekend voor elk gen, volgens de formule:

Sgen «x» — 107 X (l/2)Cf06en«x» waarin C(T)gen«x» de meetdrempel van de C(T) (cyclus drempel) van het gen «x» betekent.

I moofiRA* 39

De waarden voor de genen die van belang zijn, worden aan het «actine» signaal toegekend door berekening van de verhouding: R = Sgen «x» / Sactine

Deze verhoudingen worden vergeleken tussen de behandelde en niet-5 behandelde monsters.

Tabel Vil niet-gestresste gestresste cellen bestraald + bestraald + 10 cellen (bestraald) Flavenger® 1% Flavenger® 3%

Collageen I 0,86 1,08 0,94 0,92

Collageen III 1,20 1,47 1,37 1,26

Elastine 4,20 5,2 4,87 4,61 15 ..................................................................................................-.............-.....

De methoden volgens de uitvinding maken mogelijk waar te nemen dat de stress (hier een UVB bestraling) leidt tot een snelle toename van de RNA's, welke coderen voor de synthese van moleculen van de extracellulaire matrix, zoals collageen van type I, van type III en elastine. Het aanbrengen van een actieve stof Flavenger® 2 0 laat toe de effecten van de geïnduceerde UVB stress te beperken door op een dosis-afhankelijke wijze de synthese van deze moleculen te herstellen.

VOORBEELD 10

Studie van een fysische stress die door zonnestraling wordt bepaald op 2 5 gereconstrueerde dermis en screening van actieve stoffen, waarbij de analyse wordt uitgevoerd door reële tijd RT-PCR Multiplex

De gereconstrueerde dermis worden vervaardigd zoals beschreven in Voorbeeld 3, in een tijd van 3 weken.

Bepaalde gereconstrueerde dermis worden bij kamertemperatuur bewaard; dit 3 0 model omvat cellen die "referentiecellen" worden genoemd. Andere gereconstrueerde dermis worden bestraald met 561 kJ/m2 (wat overeenkomt met een gemiddelde blootstelling van een uur in centraal Europa) met behulp van een zonnestraler Suntest CPS+ (ATLAS); dit model omvat cellen die "gestresste cellen" worden genoemd.

1022658# 40 H De gereconstrueerde dermis worden bestraald al dan niet in aanwezigheid van H actieve stof (3%) en worden vervolgens 24 uur lang geïncubeerd.

H De RNA's worden tenslotte geëxtraheerd zoals beschreven in Voorbeeld 5.

I De expressie van de genen van de latente TGF en van het collageen van type I

I 5 (COLl) wordt gelijktijdig geanalyseerd door reële tijd RT-PCR multiplex na een I rigoreuze selectie van de primers (opbrengst, specificiteit en multiplex compatibi- liteit) en optimalisatie van het experiment van reële tijd RT-PCR (concentraties van de componenten, parameters van de cycli, condities van fluorescentie detectie).

I De probes van actine hydrolyse (20 tot 30 meren) worden aan het 5'-uiteinde 10 gelabeld met de JOE fluorescentie rapporteur (Excitatie 520 - Emissie 548) en aan I het 3'-uiteinde met de TAMRA quencher (Applied Biosystems - Foster City, CA).

De probes van hydrolyse van de te analyseren genen (20 tot 30 meren) worden I aan het 5'-uiteinde gelabeld met de fluorescentie rapporteur FAM (Excitatie 495 - I Emissie 520) en aan het 3'-uiteinde met de TAMRA quencher (Excitatie 555 - Emissie 15 576 - Applied Biosystems).

TGF latent sense AGCGGGAGGAGGGACGAG

TGF latent antisense TGAGGGACGCCGTGTAGG

I COLl sense CAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTA

20 COLl antisense CTTGTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA

De RT-PCR condities ziin de volgende:

Superscript kit één stap RT-PCR met platina Taq (Invitrogen) ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

Reactiemengsel: 10 μΐ RNA in de concentratie van 5 ng/μΐ 25 μΐ 2x reactie mix 2,5 μΐ primers, sense en antisense, 10 μΜ

I 3 0 1,8 μΐ MgS04 50 mM

2 μΐ dNTP 5 mM

1 μΐ van de hydrolyse van elk genenpaar (actine/TGFI en actine/collageen I) 10 μΜ I 1 μΐ RT/Taq mix water qsp 50 μΐ I 1022658« 41 RT-PCR protocol: RT 48°C 30 min

Denaturering van de RT en activering van het polymerase 95°C 5 min 50 cycli van: 94°C 15sec - 60°C 30 sec - 72°C 30 sec 5

De analyse van de resultaten (berekening van de verhouding R Sgen«x» /

Sactine) wordt uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld 10. Het effect van de actieve stoffen wordt geanalyseerd in termen van potentiëring van de activatie van de latente TGF welke door zonnestraling wordt geïnduceerd van de actieve stoffen, en tevens in 10 termen van direct effect en/of rebound effect (via vrijgekomen actief TGF-βΙ) op het collageen van type I. De resultaten van verscheidene interessante actieve stoffen (tarwe-extract, Soft Roe®, Coletica) worden gegeven in percentage variatie ten opzichte van de controle die niet bestraald en niet behandeld met actieve stof wordt.

15 Tabel VIII

latent TGF COL1 niet gestresste cellen 100 100 2 0 gestresste cellen (bestraald) 124 107

De methoden volgens de uitvinding maken het mogelijk waar te nemen dat de stress (hier een UV bestraling) een toename induceert in de synthese van TGF beta 25 en van collageen 1: het zou daarom interessant kunnen zijn om deze toenames in synthese na te bootsen door correct geselecteerde actieve stoffen te gebruiken. Aldus worden hier de resultaten getoond, verkregen voor de twee uitgekozen extracten: 1022658«

42 I Tabel IX

I TGF latent Collageen I

niet-gestresste gestresste niet-gestresste gestresste H 5 cellen cellen cellen cellen I tarwe-extract 129 187 153 213 I Soft Roe Extract 111 154 99 147 I VOORBEELD 11 H Gebruik van gereconstrueerde epidermis en van kweken in monolagen. omvattende "gestresste" cellen en "referentie" cellen voor onderzoek van de modulatie van de cutane antibacteriële vermogens 15 Antibiotische peptiden zijn moleculen van kleine grootte (10 tot 50 amino- zuren) die in staat zijn tot vernietigen van microörganismen, zoals bacteriën, fungi of H virussen, door hun celmembraan permeabel te maken. De meeste antibiotische peptiden worden aangetroffen in de epitheelweefsels van dieren, waar ze een toonaangevende rol spelen van eerste immuunbarrière. Meer in het bijzonder in de 2 0 mens zijn ze aangetoond in het maagdarm systeem en het ademhalingssysteem, als ook in de huid en de slijmvliezen. Defensines vormen een klasse van antimicrobiële peptiden die het meest bestudeerd is. Er wordt tussen twee klassen van defensines onderscheiden, de a-defensines (6 vertegenwoordigers) en de β-defensines die in drie vormen aanwezig zijn, hBDl, hBD2 en hBD3 (menselijk β-defensine 1, 2 en 3).

H 25 Onder een stress die een microbiële aanval nabootst (lipopolysaccharide of LPS, TNF alfa, Interferon gamma, enz. ...) kunnen de cellen deze moleculen als verdedigingsmiddel synthetiseren.

Om dit aan te tonen worden keratinocytenkweken in monolagen en in de vorm van gereconstrueerde epidermis vervaardigd uit cellen die uit dezelfde voorhuid- 3 0 biopsie zijn geëxtraheerd. De normale menselijke keratinocyten worden in monolagen gekweekt op kweekplaten met 96 putjes, in een bepaald medium zonder serum en verrijkt met calcium (eindconcentratie 1,7 mM).

H Bij 80% confluentie worden de cellen gedurende 16 uur in aanraking gebracht met een chemische stress, d.i. moleculen die een microbiële aanval nabootsen, zoals I 1022658· 43 TNFa (100 ng/ml) of IFNy (100 ng/ml). Keratinocyten die niet gestresst worden, d.i.

t die niet in aanraking gebracht zijn met de chemische stoffen die een microbiële aanval nabootsen, worden gebruikt in een model van gereconstrueerde epidermis.

Na 16 uur worden de supernatanten verzameld en de cellen in de diepvries 5 geplaatst bij -80°C na een spoeling met PBS.

Het totale RNA wordt geëxtraheerd met behulp van een 96-putjes fluo extractie kit op siliciumoxide kolommen en wordt bepaald op een 96-putjes spectro-fotometer bij 260 en 280 nm. De RNA's worden verdund op 5 ng/μΐ.

De éénstaps kwalitatieve RT-PCR wordt uitgevoerd op 50 ng RNA (initieel) in 10 96 putjes, aan actine, hBD2 en hBD3. De primers worden toegepast bij 0,5 μΜ en zijn uit de literatuur: hBD2 sense 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3';

hBD2 antisense 5'-GGAGCCCTTTCTGAATC CGCA-3' (Harder J. et al., A

peptide antibiotic from human skin. Nature 1997; 387: 861); 15 hBD3 sense 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3'; hBD3 antisense 5'-CTTCGGCAGCATT TTCGGCCA-3'; actine sense 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'; actine antisense 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. et al.,

Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic. J. 2 0 Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).

De monsters worden in een thermocycler gezet en na een gemeenschappelijk amplificatie programma: 50°C, 30 min; 94°C, 2 min; (94°C, 30 sec; 60°C, 30 sec; 68°C, 30 sec) 32 cycli voor de defensines en 30 cycli voor het actine; 72°C, 10 min; 14°C, oneindig.

2 5 Na amplificatie worden de producten gemengd in een hoeveelheid van 3 μΐ amplificatieproducten van actine + 6 μΐ amplificatieproducten van hBD2 + 6 μΐ amplificatieproducten van hBD3. Er wordt 5 μΐ toegevoegd van een mengsel van vulbuffer en water (2/3) en de laatste 20 μΐ wordt gedeponeerd op een voorgegoten 2% agarosegel. De monsters migreren in 30 minuten en de banden worden onder UV in 3 0 een zwarte kamer zichtbaar gemaakt en digitaal gefotografeerd.

2e stap van de screening methode: 1 tot 2.106 voorhuidkeratinocyten, geëxtraheerd zoals beschreven in Voorbeeld 1, worden uitgezaaid in Boyden kamer-type inserties (membraan met porositeit 1022658· I 44 Η I 0,4 μπι en diameter 10 mm), die vooraf bezaaid zijn met een fibroblastvoeding onder- I laag, in een DMEM-Glutamax / Ham F-12 (verhouding 3/1 v/v) kweekmedium, I aangevuld met 10% Hyclone II kalverserum, met ascorbinezuur-2-fosfaat in een H eindconcentratie van 1 millimolair, met EGF in een eindconcentratie van 10 ng/ml, I 5 met hydrocortison in een eindconcentratie van 0,4 μg/ml, met umuline in een eind- concentratie van 0,12 IU/ml, met isuprel in een eindconcentratie van 0,4 μg/ml, met I trijoodthyronine in een eindconcentratie van 2.10 9 molair, met adenine in een eind- concentratie van 24,3 μg/ml, met penicilline in een eindconcentratie van 100 IU/ml, met amfotericine B in een eindconcentratie van 1 pg/ml, en met gentamycine in een I 10 eindconcentratie van 20 pg/ml, en gedurende een tijd van ondergedompelde kweek van 3 dagen.

I De keratinocytenkweken worden daarna 11 dagen aan het grensvlak tussen I lucht en vloeistof geplaatst in hetzelfde kweekmedium als gebruikt voor de onderdompelingskweek, met uitzondering van het kalverserum, het hydrocortison, 15 het isuprel, het trijoodthyronine en het umuline.

Aan het eind van het experiment worden de gereconstrueerde epidermis op de I volgende wijze behandeld: 1 monster ondergaat geen behandeling (model dat referentiecellen omvat = negatieve controle).

2 0' 1 monster ondergaat geen behandeling met de actieve stoffen maar ondergaat verscheidene typen stress aan het eind van het kweken (model dat gestresste cellen omvat = positieve controle), bijv. incubatie in aanwezigheid van TNFa bij 100 ng/ml, I IFNy bij 100 ng/ml.

- 1 monster ondergaat de behandeling met de actieve stof (1% in het kweek- 25 medium gedurende 24 uur) en vervolgens een stress (equivalent aan de positieve controle).

De gereconstrueerde epidermis worden dan nog eens 24 uur geïncubeerd, al dan niet in de aanwezigheid van actieve stoffen, worden gespoeld in PBS en daarna wordt het totale RNA geëxtraheerd en bepaald op een 96-putjes spectrofotometer bij 3 0 260 en 280 nm. De RNA's worden op 5 ng/μΐ verdund en behandeld op de hierboven H beschreven wijze.

I 1022658« 45

Analyse:

De foto's van de gels worden geanalyseerd met een beeldbehandelings-software die de intensiteit van de banden kwantificeert. De intensiteitsverhoudingen van de hBD2/actine en hBD3/actine banden worden vergeleken, enerzijds tussen het 5 monolagen model en het 3D model (gereconstrueerde epidermis) in een niet- gestresste conditie, en anderzijds na het effect van een stress (cellen behandeld met TNFpoflFNy).

Expressie van hBD2 en hBD3 in monolaag, vergeleken met een 3D 10 gereconstrueerd epidermis model, modellen waarin niet-gestresste referentiecellen worden gebruikt:

Tabel X

15 hBD2 hBD3 niet-gestresste cellen in monolaag 0,318 0 niet-gestresste cellen in 3D gereconstrueerde epidermis 0,525 0,015 20

Effecten van de stress op de expressie van hBD2 en hBD3 in monolaag, vergeleken met een 3D gereconstrueerd epidermis model:

Tabel XI

25 hBD2 hBD3 door TNFa gestresste cellen in monolaag 1,240 0,266 door TNFa gestresste cellen in gereconstrueerde epidermis 1,617 0,546 3 0 door IFNy gestresste cellen in monolaag 0,450 0,370 door IFNy gestresste cellen in gereconstrueerde epidermis 0,581 0,492 10226881 I 46 I De reactie van een synthese van defensines door de cellen van de huid, tijdens een stress die een microbiële aanval nabootst, is een verdedigingsreactie, welke I derhalve kan worden nagebootst om naar actieve stoffen te zoeken die in staat zijn de I defensines van de huid te stimuleren zonder dat daarbij agressieve chemie wordt H 5 gebruikt.

I 1022658*

Claims

1. Methode voor het identificeren van een eventuele modificatie van ten minste één biologische parameter, met het kenmerk, dat zij omvat de vergeleken transcriptomische en/of vergeleken genomische analyse: a) van levende cellen die aan.een stress worden onderworpen, aangeduid met 5 gestresste cellen; b) van levende cellen die niet aan deze zelfde stress worden onderworpen, aangeduid met referentiecellen; waarbij ten minste één van deze twee klassen van cellen in een driedimensionaal weefselmodel wordt gebruikt hetgeen tenminste fibroblasten omvat, 10 waardoor eventuele identificatie wordt mogelijk gemaakt van ten minste één biologische parameter die na genoemde stress gemodificeerd is.

2. Methode volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de referentiecellen en de gestresste cellen in een driedimensionaal weefselmodel worden toegepast. 15

3. Methode volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat genoemde biologische parameter, die tijdens een stress wordt gemodificeerd, wordt gedefinieerd door ten minste één verschil tussen het metabolisme van de met gestresste cellen aangeduide cellen en het metabolisme van de referentiecellen genoemde cellen. 20

4. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat genoemde stap a) de volgende stappen omvat: al) uitzaaien van een of meer typen cellen, referentiecellen genaamd, in een celmodel, d.i. in een monolaag, of in suspensie, en/of weefselmodel, d.i. 25 driedimensionaal; a2) blootstellen van dit model aan een stress, waarbij deze cellen gestresste cellen worden genoemd. 1022658 I 48

5 Al in contact brengen van genoemde potentieel actieve stof met referentiecellen zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd, uitgezaaid in een weefselmodel zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd, gedurende een voldoend lange periode opdat genoemde potentieel actieve stof kan werken; waarbij een stress zoals in een van conclusies 6-11 gedefinieerd wordt toegepast;

5. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-3, met het kenmerk, H dat genoemde stap a) de volgende stappen omvat: I al) blootstellen van een of meer typen levende cellen aan een stress, waarbij deze cellen gestresste cellen worden genoemd; 5 a2) gebruiken van deze gestresste cellen in een celmodel, d.i. in een monolaag, of in I suspensie, en/of weefselmodel, d.i. driedimensionaal.

6. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de stress een fysische stress is, waarbij deze stress gekozen wordt uit de stress I 10 soorten: UVA, UVB, zonlicht, infrarood, nabij infrarood, thermisch, magnetisch veld, hertziaanse straling waaronder microgolven en golven van mobiele telefoons, ioniserende straling waaronder beta, gamma en röntgen straling, zoals welke worden I ondervonden tijdens een toevallige of niet toevallige blootstelling aan zulke straling, en/of een fysisch-chemische stress, en lof biologische stress, en/of mechanische stress.

7. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerkt I dat de stress een fysisch-chemische stress, en/of een biologische stress is.

8. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerkt 20 dat de stress een mechanische stress is,

9. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-3 en 5 of 6-8, met het kenmerk, dat de gestresste cellen zijn: · cellen die afkomstig zijn van biopsieën welke zijn afgenomen uit aan de zon 25 blootgestelde gebieden; de vakman zal weten uit welke gebieden monsters genomen moeten worden, zoals de hand, het gezicht. · cellen die gestresst zijn door een fysische stress, waarbij deze stress gekozen wordt uit de stress soorten: UVA, UVB, zonlicht, infrarood, nabij infrarood, thermisch, magnetisch veld, hertziaanse straling waaronder microgolven ên golven van mobiele 30 telefoons, ioniserende straling waaronder beta, gamma en röntgen straling, zoals welke worden ondervonden tijdens een toevallige of niet toevallige blootstelling aan zulke straling.

10 B/ transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, ter bestudering van de werking van genoemde stof op het celmetabolisme van genoemde cellen; Cl vergelijking van het celmetabolisme van genoemde cellen in aanwezigheid van de potentieel actieve stof met het metabolisme van genoemde celllen zonder de 15 aanwezigheid van die stof, aangeduid met controlecellen; en D/ identificatie van de aan- of afwezigheid van activiteit van genoemde potentieel actieve stof, wat met name de identificatie omvat van een positief of negatief effect van genoemde stof teneinde een indicatie te verschaffen voor de modificatie van de biologische parameter. 20

10. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-3 en 5 of 6-8, met het kenmerk, dat de gestresste cellen zijn: • cellen die afkomstig zijn van biopsieën welke zijn afgenomen uit aan de zon blootgestelde gebieden; de vakman zal weten uit welke gebieden monsters genomen 5 moeten worden, zoals de hand, het gezicht. • cellen die gestresst zijn door een fysische stress, en/of een biologische stress.

11. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-3 en 5 of 6-8, met het kenmerk, dat de gestresste cellen zijn: 10. cellen die afkomstig zijn van biopsieën welke zijn afgenomen uit aan de zon blootgestelde gebieden; de vakman zal weten uit welke gebieden monsters genomen moeten worden, zoals de hand, het gezicht. • cellen die gestresst zijn door een mechanische stress.

12. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de referentiecellen hetzij bij biopsieën verwijderde cellen zijn die niet erg met zonnestraling gestresst zijn, zoals de borst, de buik, de voorhuid, hetzij cellen die niet gestresst zijn door een stress zoals een fysische stress van het UVA en/of UVB en/of zonnestraling type, en/of straling van een magnetisch veld, en/of chemische 20 stress, en/of biologische stress en/of mechanische stress.

13. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de gestresste cellen cellen van ten minste één mens of van ten minste één dier zijn. 25

14. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het onderzoek ten minste één analyse omvat uit de volgende analysemethoden: voor de analyse van het genomische profiel: DNA arrays, en/of polymerase 30 kettingreactie multiplex (PCR-multiplex) en/of polymerase kettingreactie (PCR) en/of reële tijd polymerase kettingreactie (reële tijd PCR); voor de analyse van het transcriptomische profiel: RNA arrays, cDNA arrays, en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie multiplex (RT-PCR-multiplex) 1022658 I 30 I en/of reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) en/of reële tijd reverse I transcriptie polymerase kettingreactie (reële tijd RT-PCR). Η

15. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het H 5 kenmerk, dat het weefselmodel wordt gekweekt en/of bewaard onder condities die een H celmetabolisme ten minste gedeeltelijk in stand houden.

16. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het weefselmodel ten minste fibroblasten of keratinocyten omvat. I 10

17. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het model omvat: normale, gezonde of pathologische cellen, of cellen die afstammen van cellijnen, bij voorkeur zijn deze cellen van menselijke of dierlijke afkomst. I 15

18. Methode volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het weefselmodel uit de volgende modellen wordt gekozen: een model van bindmatrix, genaamd dermis in het geval van huid en genaamd chorion in het geval van een slijmvlies, die voornamelijk stromale cellen bevat, een epitheelmodel dat H 20 in hoofdzaak door epitheelcellen wordt gevormd, een epidermis model dat in hoofdzaak door keratinocyten wordt gevormd, een huidmodel dat door een epidermis en een dermis wordt gevormd, een slijmvliesmodel dat door een epitheel en een chorion wordt gevormd. I 25

19. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-18, met het kenmerk, dat het weefselmodel een weefselmodel van bindmatrix (dermis of chorion) is, welke een matrixdrager omvat die bij voorkeur is gekozen uit: - een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een met celkweek behandelde kunststof, een semipermeabel synthetisch membraan, in het bijzonder een 30 semipermeabel nitrocellulose membraan, een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, of polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore™ membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel Biopore-CM™ membraan, een j semipermeabel polyester membraan, waarbij de inerte drager stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten bevat; een gel of een membraan gebaseerd op hyaluronzuur en/of op collageen en/of op 5 fibronectine en/of op fibrine; dat stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten omvat; een poreuze matrix, vervaardigd van collageen dat een of meer glycosaminoglycanen en/of eventueel chitosan kan bevatten, waarbij deze poreuze matrices stromale cellen omvatten, in het bijzonder fibroblasten.

20. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-18, met het kenmerk, dat het weefselmodel een epidermis weefselmodel of een epitheel weefselmodel is, welke een matrixdrager omvat die bij voorkeur is gekozen uit: een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een semipermeabel synthetisch membraan, in het bijzonder een semipermeabel nitrocellulose membraan, 15 een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, of polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore™ membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel Biopore-CM™ membraan, een semipermeabel polyester membraan, waarbij de inerte 20 drager al dan niet tevoren bezaaid is met stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten en daarna met epitheelcellen en in het bijzonder keratinocyten; een film of een membraan gebaseerd op hyaluronzuur en/of op collageen en/of op fibronectine en/of op fibrine, tevoren bezaaid met stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten en daarna met epitheelcellen en in het bijzonder keratinocyten. 25

21. Methode volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat in het epitheelgedeelte, de epitheelcellen, pigmentcellen, immunocompetente cellen, zenuwcellen extra zijn ingebracht, waarbij de immunocompetente cellen bij voorkeur cellen van Langerhans zijn. 30

22. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-18, met het kenmerk, dat het weefselmodel een weefselmodel van gereconstrueerde huid of slijmvlies is dat een dermale of chorion matrixdrager omvat welke bij voorkeur is gekozen uit: 1022658 I 52 I - een inerte drager, gekozen uit de groep bestaande uit een semipermeabel I synthetisch membraan, in het bijzonder een semipermeabel nitrocellulose membraan, een semipermeabel nylon membraan, een teflon membraan of een teflon spons, een I semipermeabel membraan van polycarbonaat of polyetheen, polypropeen, of I 5 polyethyleentereftalaat (PET), een semipermeabel anorganisch Anopore membraan, van een celluloseacetaat of cellulose-ester (HATF) membraan, een semipermeabel H Biopore-CM membraan, een semipermeabel polyester membraan, welke inerte drager stromale cellen bevat, in het bijzonder fibroblasten; I - een gel gebaseerd op collageen en/of hyaluronzuur en/of fibronectine en/of op I 10 fibrine, omvattende stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten; een poreuze matrix, vervaardigd van collageen dat een of meer glycosaminoglycanen en/of eventueel chitosan kan bevatten, in welke poreuze matrices I stromale cellen, in het bijzonder fibroblasten zijn geïntegreerd; I - een van epidermis ontdane dermis of dode dermis, van een mens of dier; I 15 waarbij de matrixdrager dan bezaaid wordt met epitheelcellen om een gereconstrueerd slijmvlies te verkrijgen of met keratinocyten om een gereconstrueerde huid te verkrijgen.

23. Methode volgens een of meer van de conclusies 1-22, met het kenmerk, I 20 dat het toegepaste weefselmodel een model omvat waarin ten minste één extra celtype is opgenomen, liefst endotheelcellen (EC) en/of immuuncellen, zoals lymfocyten, macrofagen, dendritische cellen en/of adiposecellen en/of huidaanhangsels, zoals lichaamshaar, haar, talgklieren.

24. Gebruik van een methode volgens een of meer van de conclusies 1-23 voor het uitvoeren van de screening van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen tot omkering van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd is gemodificeerd. 30

- 25. Gebruik van een methode volgens een of meer van de conclusies 1-23 voor het uitvoeren van de screening van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen een indicatie te geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd is gemodificeerd.

26. Methode volgens conclusie 24 of 25, met het kenmerk, dat deze omvat:

27. Methode voor het identificeren van ten minste één potentieel actieve stof met het vermogen tot omkering van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress is gemodificeerd, omvattende: a) kweken van cellen die aan een stress worden onderworpen, aangeduid met 25 gestresste cellen, liefst zoals in conclusies 4-11 en 13 gedefinieerd, die een gemodificeerde biologische parameter hebben, in aanwezigheid van ten minste één eventueel actieve stof, gedurende een voldoend lange periode opdat genoemde potentieel actieve stof eventueel kan inwerken op het celmetabolisme van genoemde cellen, waarbij genoemde gestresste cellen in een weefselmodel zoals in een of meer 30 van conclusies 1-23 gedefinieerd zijn uitgezaaid; b) transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals in conclusie 14 gedefinieerd, van de in stap a) gekweekte gestresste cellen; 1022658 H c) vergelijking van de in b) uitgevoerde analyse met de transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals in conclusie 14 H gedefinieerd, van levende cellen die gekweekt worden zonder de aanwezigheid van genoemde potentieel actieve stof, aangeduid met controlecellen; 5 d) in aansluiting op de vergelijking van de analyses die in c) is uitgevoerd, eventuele identificatie van ten minste één actieve stof met het vermogen tot omkering van ten minste één biologische parameter die door de stress wordt gemodificeerd.

28. Methode voor het identificeren van ten minste één potentieel actieve stof 10 welke een indicatie kan geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die tijdens een stress is gemodificeerd, omvattende: a) in contact brengen van genoemde potentieel actieve stof met referentiecellen H zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd, uitgezaaid in een weefselmodel zoals in een of meer van conclusies 1-23 gedefinieerd, gedurende een voldoend lange 15 periode opdat genoemde potentieel actieve stof kan werken; waarbij een stress zoals in een van conclusies 6-11 gedefinieerd wordt toegepast; b) transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals in conclusie 14 gedefinieerd, van de in stap a) gekweekte gestresste cellen; 20 c) vergelijking van de in b) uitgevoerde analyse met de transcriptomische analyse en/of genomische analyse, gedeeltelijk of volledig, bij voorkeur zoals in conclusie 14 gedefinieerd, van levende cellen die gekweekt worden zonder de aanwezigheid van genoemde potentieel actieve stof, aangeduid met controlecellen; d) in aansluiting op de vergelijking van de analyses die in c) is uitgevoerd, 25 eventuele identificatie van ten minste één actieve stof met het vermogen een indicatie te geven van de modificatie van ten minste één biologische parameter die door de stress wordt gemodificeerd.

29. Gebruik van een actieve stof geselecteerd uit hesperitine lauraat, H 30 quercitine caprylaat en een tarwe extract, voor het bereiden van ten minste één cosmetische en/of farmaceutische samenstelling. . · ..

30. Gebruik van een actieve stof geselecteerd uit hesperitine lauraat, quercitine caprylaat en een tarwe extract, voor het bereiden van ten minste één cosmetische eh/of farmaceutische samenstelling voor het verhogen van de levensvatbaarheid van de cel. 5

31. Gebruik van een actieve stof geselecteerd uit hesperitine lauraat, quercitine caprylaat en een tarwe extract, voor het bereiden van ten minste één cosmetische en/of farmaceutische samenstelling voor het verlagen van de synthese van pro-inflammatoire interleukines. 10 1022658