KR100646047B1 - 스트레스 받은 생체 세포 및 스트레스 받지 않은 생체세포에서 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형동정방법 - Google Patents

스트레스 받은 생체 세포 및 스트레스 받지 않은 생체세포에서 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상 변형동정방법에 관한 것이다.
본 발명은 본질적으로 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포, <<기준 세포>>로 불리는 상기와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 또는 삼차원적 조직 모델내에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나의 세포에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 스트레스에 의하여 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다. 본 발명은 활성원을 선별하기 위해 상기 과정을 사용함을 포함한다.
생물학적 변형, 생물학적 지표, 조직 모델, 변형동정방법, 세포 모델, 스트레스

Description

스트레스 받은 생체 세포 및 스트레스 받지 않은 생체 세포에서 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형동정방법{A method of identifying an eventual modification of at least one biological parameter making use of living cells which are subjected to a stress and living cells which are not subjected to this same stress}
본 발명은 본질적으로
a) <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포,
b) <<기준 세포>>로 불리는 상기와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 및
c) 삼차원적 조직 모델내에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나에 대한 단백질분해(proteomic) 및/또는 전사(transcriptomic) 및/또는 유전자(genomic) 비교분석을 포함함을 특징으로 하는 상기 스트레스에 의하여 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다.
본 발명은 더 나아가 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법, 또는 스 트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다.
본 발명은 더 나아가 적어도 하나의 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제공하기 위한 상기 방법에 의해 선별된 활성물질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 더 나아가 화장료 또는 약학 분야에서 활성이 있는, 상기 방법에 의해 선별되는 물질에 관한 것이다.
일사는 열을 발생시키는 56%의 적외선(5000 내지 800 nm의 파장), 39%의 가시광선(800 내지 400 nm) 및 4.9%의 UVA 및 0.1%의 UVB + UVC를 포함하는 자외선 A, B, C (400 내지 190 nm)를 포함하는 전자기 방사선으로부터 형성되어진다.
- UVC는 매우 해로운 것으로 일반적으로 오존층에 의해 걸러진다.
- UVB는 부분적으로 대기 및 유리를 통과하지 못한다. 이들은 표피에는 도달하지만 진피에는 도달하지 못한다. 이들은 핵의 DNA의 손상에 의한 세포사 과정을 일으키는 각질형성세포인 선번 세포(sunburn cells)의 존재에 의해 특징지워지는 선번을 형성시킨다. 이들 세포의 수는 도달한 UVB의 양이 높을수록 많아진다. 사실상, 자연적인 방어 과정이 손상된 세포를 회복시키고 제거하는 것을 가능하게 하지만, 삼투 또는 유전적 결점에 의한 이러한 시스템의 기능 부전은 피부암을 일으키는 근본적인 역할을 한다.
- UVA는 여름이나 겨울이나 대기를 쉽게 통과한다. 이들은 진피 및 표피를 통과하고, 비록 UVB보다는 덜 해롭지만 그럼에도 불구하고 도달한 양에 의해 손상을 일으킨다. UVA는 선번 세포를 형성시키지 않거나 아주 조금 형성시키며, 자유라 디칼을 형성시킴으로써 세포 DNA를 손상시킬수 있을 뿐만 아니라 세포 지질 및 세포 단백질을 손상시킬 수 있다. UVA는 콜라겐 및 탄성섬유뿐만 아니라 진피 내의 세포외기질(extra-cellular matrix)의 다른 구성성분의 퇴화(degradation)를 증가시켜 피부의 노화를 가속화시킨다. 더 나아가, 많은 연구들이 표피의 랑게르한스 세포를 통한 UVA의 면역억제 효과를 보여준다. 상기 랑게르한스 세포는 조사(irradiation) 후, 트림포사이트(Tlymphocytes)와 상호작용하고 표피 세포 및 신경섬유에 의하여 캐스캐이드 내에서 생산된 사이토카인 및 뉴로메디에이터를 통하여 전신 효과를 갖는다(Meunier L., Eur. J. Dermatol. 1999, 9: 269-275). 오랜 기간동안, 피부암의 위험은 증가되었으며, 전-암 세포(pre-cancerous cells)는 더 이상 외래 세포로서 인식되어지지 않아서 면역 시스템에 의해서 더 이상 제거되어지지 않는다.
유럽의 측량 광도(European survey Helios)(Zanetti R. et al, Br. J. Canc. 1996, 73 : 1440-1454)는 UV에 대한 노출, 피부 표현형 및 칼시노마스 간의 관계를 보여주며, UV와 관련된 직접적인 위험의 개념을 정의한다.
알려져 있는, 방사선과 관련된 다른 손상들 중에는, 멜라닌세포상에 충격단백질(Heat Shock Proteins)의 생산을 유도할뿐만 아니라 유도된 UVB 효과와 유사한 효과를 유도하는 적외선에 의하여 온도가 증가에 기인하는 것(Nakazawa et al, J Invest Dermatol 1998, 110 : 972-977); 피부 세포의 생존력에 영향을 주는 근적외선에 기인하는 것(YOO B.H. et al, J Cosmet Sci 2002, 53(3) : 175-184); 돌연변이유발성를 유도하는 가시광선의 노출(반복된 조사)에 기인하는 것(Larko O., Lakartidningen 2002, 99(18) : 2036-2040); 궤양 및 암(Lorette G., Machet L., Cancer Radiother 2001, 5(1) : 116s-120s), 또는 피부 내에서 타입 I 및 III의 콜라겐을 합성하는 것과 같은 세포 대사의 변형(Riekki R et al, Arch Dermatol Res 2002, 294(4) : 178-184), 또는 심지어는 분열증식 및 표피 분화의 변형(Sivan V. et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002, 53(2) : 385-393)을 발생시키는 전리 방사선에 기인하는 것; 및 마이크로파의 세포 유전학적인 효과(Zotti-Martelli L et al, Mutat Res 2000. 472(1-2) : 51-58) 또는 충격단백질(HSP70 및 HSP27) 경로의 억제 또는 전자기장 및 그 중에서도 휴대폰에 의해 발생된 전자기장에 의한 자유 라디칼의 발생에 의한 종양적 효과에 기인하는 것(French P.W et al, Differenciation 2001, 67(4-5) : 93-97; Di Carlo et al, J Cell Biochem 2002; 84(3) : 447-454; Leszczynski D. et al, Differenciation 2002 70(2-3) : 120-129; Moustafa Y.M. et al, J Pharm Biomed Anal 2001, 26(4) : 605-608)이 있다.
특정 화학 약품(과산화수소, 산화 질소 및 중금속 등) 또는 생물학적 약품(바이러스 및 박테리아 등), 심지어는 기계적 요인(신장 및 압축 등)과 같은 세포 스트레스를 유도할 수 있는 다른 요인들도 있다.
현재, 수많은 유전자들과 세포 신호 경로에 의해 조절되어지는, 분열증식, 분화, 세포사를 포함하는 모든 세포 기능은 일반적으로 건강하거나 병에 걸린 기증자 또는 세포주로부터 유래된 섬유아세포, 각질형성세포 또는 멜라닌세포의 단층 세포 배양액을 이용하여 생체밖(ex vivo)(생검) 또는 시험관내에서 분석되어진다. 게다가, 특별한 스트레스의 기능으로써 표현(expression) 및 세포 합성에 대한 데 이터를 찾는 것이 항상 가능하지 않거나, 또는 때때로 시험관내에서 얻은 결과들이 실험에 사용한 단순 모델에 기인하여 생체내에서 얻어질 수 있는 것과 모순되게 나타나기도 한다.
몇 년동안, 다양한 3차원적 세포 모델이 세포 치료, 세포파괴 테스트 및 효과성 테스트를 위하여 또는 동물실험을 위하여 주로 개발되어졌다. 급성 또는 만성의 피부 염증의 예측가능성을 위하여 사용되어지는 것으로 표피 모델(EP 0 789 074 A1 of Oreal; A. de Brugerolle de Fraissinette et al. 1999, Cell Biol. Tox. 15: 121-135); 및 재건된 상피 모델(Schmalz G. et al., Eur. J. Oral Sci. 2000. 108 : 442-448; Nielsen et al., Int. J. Pharm. 2000. 200 : 261-270), 예를 들어 재건된 피부 또는 착색된 재건 피부 및/또는 면역감응 재건 피부(Regnier M. et al in Pour la science (1999) 266 : 154-159)가 있다.
만약 이러한 모델 중 몇몇이 약물 독성 평가; 및 약학적 및 화장료 성분의 효과 연구를 위하여 오늘날 매우 광범위하게 사용되어진다면, 사용되어지는 분석방법은 본질적으로 이미지 분석, 대사적 합성 및 전기영동분석을 통한 이들의 조절 분석, 웨스턴-블럿 노던 블럿 분석, 또는 RT-PCT 분석과 결합된 조직학적 기술들이다. 특별히 단백질 배열(protein array)(또는 맵핑) 및 DNA 배열, 이차원적 전기영동 또는 결합된 사이토카인 측정(사이토카인-맵) 기술들은, 물리적, 화학적, 생물학적 또는 기계적 성질과 같은 스트레스를 받은 모델들의 배양 조건들과 비교해볼 때 표준 배양 조건하에서 배양되어진 이러한 삼차원적 모델에는 적용되어지지 않는다.
대조적으로, 이러한 기술들은 예를 들어, 단층으로 배양되어진 정상의 또는 악성의 인간 멜라닌세포(종양 조직으로부터 추출된 세포주 또는 멜라닌세포) 상에 가해진 자외선 스트레스의 조절하는 역할에 대한 연구와 같은, 단층 세포 시스템에서 개발되지고 사용되어져 왔다(Valery C., Grob J.J. and Verrando P. in J. Invest. Dermatol. (2001) 117: 1471-1482).
본 발명의 목적은 세포가 스트레스를 받았을 때 생체내에서 관찰되어지는 상황을 반영하는 세포 대사의 연구 모델을 제공하는 것으로 구성되는 기술적 문제를 기대치 않게 해결하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
a) <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포,
b) <<기준 세포>>로 불리는 상기와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 및
c) 삼차원적 조직 모델내에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함함으로써 상기 스트레스에 의하여 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형을 동정하는 방법을 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
상기 단백질분해 또는 전사 또는 유전자 분석은 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 지표를 역전하거나 상기 지표의 변형을 억제하도록 활동 목표를 정의하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성원, 특별히 화장료 또는 약학적 활성원의 유전자 또는 단백질분해 프로필에 대한 효과를 측정하기 위하여 상기에서 묘사한 삼차원적 조직 모델을 사용하는 것을 가능하게 하는 해법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제형, 특별히 활성원을 함유하는 화장료 또는 약학적 제형의 유전자 또는 전사 또는 단백질분해 프로필에 대한 효과를 측정하기 위하여 상기에서 묘사한 삼차원적 조직 모델을 사용하는 것을 가능하게 하는 해법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전하거나 상기 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법을 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의하여 선별된 활성물질 및 화장료 또는 약학적 조성물을 제공하기 위한 이의 용도로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 상기에서 기술한 기술적 문제들을 해결할 수 있다.
본 발명의 내용 중에서, <<유전자 분석>>은 그들의 기능을 연구하기 위해 생물체의 유전자 전체 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
본 발명에서 <<전사 분석>>은 전사되는 전체 RNA 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
<<단백질분해 분석>>은 발현된 단백질 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
본 발명은 주로
a) <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포,
b) <<기준 세포>>로 불리는 상기와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 및
c) 삼차원적 조직 모델내에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 비교분석을 포함함으로써 상기 스트레스에 의하여 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법을 제공하는 것으로 구성된다.
<<기준 세포>>로 불리는 세포는 연구되는 스트레스를 받지 않는 세포이다. 묘사된 발명을 최적화하기 위하여, 기준 세포는 어떤 스트레스에도 가장 적게 노출될 가능성이 있는 세포임은 당업자에게 쉽게 이해되어질 것이다. 이러한 세포는 특별히 보호되어진, 즉 태양광선에 그다지 많이 노출되지 않은 생검(가슴, 복부 등) 상에서 제거되어진 세포이거나, 아니면 무엇이든지 어떤 스트레스(물리적, 화학적, 생물학적 또는 기계적 스트레스)에도 노출되지 않은 세포가 될 것이다.
<<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포는 태양에 노출되어진 영역에서 취한 생검으로부터 유래된 세포, 또는 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선(ionizing radiations)에 우연적으로 또는 비우연적으로(non-accidental) 노출되는 동안 받은 스트레스를 포함하는 스트레스(물리적, 화학적 또는 생물학적 스트레스)에 노출된 세포이다. 상기 세포들은 동일한 기증자 또는 다른 기증자로부터 얻은 몇몇의 생검에서 유래될 수 있다.
생물학적 지표는 일반적으로 유전자 발현의 어떠한 변형, 단백질의 분비의 어떠한 변형, 또는 기준세포의 대사내에서 감지될 수 있는 어떠한 변형에 해당한다.
조직 모델은 3차원적 모델로 불리는 조직 모델로서, 특히 생체의 조직을 재구성하는 것을 목적으로 생체 세포가 접종될 수 있는 것으로 정의되며, 특별히 조직 모델은 피부의 경우 진피라 불리고 점액질 막의 경우 융모막이라 불리는, 주로 스트로마세포(stromal cells)를 함유하는 결합 기질 모델; 주로 상피 세포로 구성된 상피 모델; 주로 각질형성세포로 구성된 표피 모델; 표피 및 진피로 구성된 피부 모델; 상피 및 융모막으로 구성된 점액질 막 모델; 생존하고 있는 생검(또는 외식편) 모델; 및 상기에서 묘사한 모델내에 존재하는 세포를 사용하는, 단층 또는 현탁 상태의 모델로 정의된다.
이러한 모델들은 정상세포, 건강세포 또는 병원성세포 혹은 세포주 유래의 세포로부터 제조되어질 수 있다. 여기에서 이러한 세포는 인간 또는 동물 유래이다.
상기 후자의 특징의 변형에 따라서, 결합 기질(진피 또는 융모막)의 3차원적 배양 모델은 재건된 진피 또는 재건된 융모막을 형성하기 위하여 스트로마세포를 접종한 지지체를 포함한다.
3차원적 표피 또는 상피 배양 모델은 재건된 상피 또는 진피를 얻기 위하여 스트로마세포, 특별히 섬유아세포를 접종한 또는 미리 접종하지 않은 뒤, 상피 세포 및 특별히 각질형성세포를 접종한 지지체를 포함한다.
3차원적 재건된 피부 또는 점액질 막 배양 모델은, 재건된 점액질 막을 얻기 위하여는 상피 세포를, 재건된 피부를 얻기 위하여는 각질형성세포를 접종한 기질 지지체(matrix support)(진피 또는 융모막)를 포함한다.
변형에 따라, 사용된 3차원적 배양 모델은, 적어도 하나의 추가적인 세포 타입, 예를 들어 내피 세포(EC; endothelial cells) 및/또는 림프구 및/또는 지방세포(adipose cells) 및/또는 체모, 모발, 피지선을 포함하는 피부 부속물이 병합된 모델을 포함한다.
변형에 따라, 3차원적 지지체는 다른 세포 타입(면역 세포, 내피 세포, 신경 세포, 근육 세포, 간세포 등등)에 의해 군체를 형성할 수 있다.
바람직하게는, 색소 세포(pigmentary cells), 면역감응 세포(immunocompetent cells)(랑게르한스 세포 및/또는 수지상 세포), 신경 세포 등등이 상피 부분에 추가적으로 도입될 수 있다.
추출된 다른 세포 타입(섬유아세포, 각질형성세포, 멜라닌세포 등)은 개별적으로 증폭되지만, 단층 또는 현탁액 배양뿐만 아니라 3차원 모델의 재건을 위해 몇몇 기증자들로부터 각각 혹은 공동으로 사용될 수 있다.
상기에서 정의한 조직 모델은 유전자 및 단백질분해 분석을 하기 위하여 배양의 끝에 사용되어지는데, 이들 분석은 특별히 스트레스의 영향에 대해 저항하기 위한 예상 표적(potential targets)의 선별, 동정 및 특징화(characterization)를 가능하게 한다.
예상 표적은 생물학적 지표와 결합하여 역전되거나 또는 상기 지표의 변형이 억제되어 본 발명에 따라 동정된다.
표적을 한정한 이 후, 이러한 동일한 모델 및 감지 방법은 화장료 또는 약학적 활성원을 선별하기 위하여 사용되어질 수 있다. 이러한 동일한 모델 및 감지 방법은 활성원을 함유하거나 함유하지 않은 화장료 또는 약학적 제제의 효과를 주장하기 위하여 사용될 수 있다.
이러한 모델 및 감지 방법은 화장료 또는 약학적 활성원, 또는 이러한 활성원을 함유하거나 함유하지 않은 화장료 또는 약학적 제제의 독성을 주장하기 위하여 사용될 수 있으며, 이러한 독성은 스트레스, 특별히 광독성(phototoxicity)에 의해 유도되어진다.
사용되는 분석 기술로는 특별히 하기 방법들이 있다:
단백질분해 프로필을 분석하기 위해서는 이차원적 전기영동법 및/또는 단백질 배열 및/또는 사이토카인 배열 및/또는 복합 ELISA(combined ELISA determinations)를,
유전적 프로필을 분석하기 위해서는 DNA 배열 및/또는 복합 PCR(PCR-multiplex) 및/또는 PCR 및/또는 실시간-PCR(real time polymerase chain reaction)를,
전사 프로필을 분석하기 위해서는 RNA 배열, cDNA 배열 및/또는 역전사-복합 PCR(reverse polymerase chain reaction multiplex) 및/또는 역전사-PCR 및/또는 실시간 RT-PCR을 사용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 특징에 따르면, 본 발명은
a) 스트레스 받은 세포(stressed cells)로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포,
b) 기준 세포(reference cells)로 불리는 상기 스트레스와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 및
c) 삼차원적 조직 모델에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 스트레스에 따른 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표(biological parameter)의 예상변형 동정방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은
a) 조직 모델내에 접종되어진, 스트레스 받은 세로로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포의 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
b) a) 단계에서 수행된 분석과, 기준 세포로 불리는 스트레스를 겪지 않은 생체 세포의 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 유전자 분석 대사를 비교하는 단계; 및
c) 상기 스트레스에 의해 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정하는 단계를 포함하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형을 동정하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 기준 세포 및 스트레스 받은 세포는 3차원적 조직 모델내에서 사용된다.
바람직하게는, 스트레스를 받는 동안 변형된 상기 생물학적 지표는 스트레스 받은 세포로 불리는 세포의 대사와 기준 세포로 불리는 세포의 대사 간의 적어도 하나의 차이로 정의된다.
본 발명의 유익한 실시예에 따라, 상기에서 언급된 a) 단계는 하기 단계를 포함한다:
a1) 단층 또는 현탁액의 세포 모델 및/또는 삼차원적인 조직 모델 내에 기준 세포로 불리는 세포의 하나 또는 그 이상의 타입을 접종하는 단계; 및
a2) 상기 모델에 스트레스를 가하여 스트레스 받은 세포로 명명하는 단계.
본 발명의 다른 유익한 실시예에 따라, 상기에서 언급된 a) 단계는 하기 단계를 포함한다:
a1) 생체 세포의 하나 또는 그 이상의 타입에 스트레스를 가하여 스트레스 받은 세포로 명명하는 단계; 및
a2) 단층 또는 현탁액의 세포 모델 및/또는 삼차원적인 조직 모델 내에서 상기 스트레스 받은 세포를 사용하는 단계.
바람직하게는, 본 발명에서 스트레스는 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선에 우연적으로 또는 비우연적으로(non-accidental) 노출되는 동안 받은 스트레스로부터 선택되어지는 물리적 스트레스; 및/또는 물리화학적 스트레스; 및/또는 생물학적 스트레스; 및/또는 기계적 스트레스이다.
본 발명의 유익한 실시예에 따라, 스트레스 받은 세포는
손이나 얼굴을 포함하는 당업자에게 알려져있는 시료를 채취하는 영역인 태양에 노출된 영역에서 채취한 생검으로부터 유래된 세포; 또는 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선에 우연적으로 또는 비우연적으로 노출되는 동안 받은 스트레스로부터 선택되어지는 물리적 스트레스; 및/또는 물리화학적 스트레스; 및/또는 생물학적 스트레스; 및/또는 기계적 스트레스에 의해 스트레스를 받은 세포 중 하나이다.
본 발명의 유익한 실시예에 따라, 기준 세포는
가슴, 배, 포피와 같은 태양광선에 의해 그다지 스트레스 받지 않은 생검 상에서 제거된 세포; 또는 UVA 및/또는 UVB 및/또는 태양광선 타입 및/또는 자기장 유래의 방사선의 물리적 스트레스, 및/또는 화학적 스트레스, 및/또는 생물학적 스트레스, 및/또는 기계적 스트레스에 의해 스트레스 받지 않은 세포 중 하나이다.
바람직하게는, 상기 스트레스 받은 세포는 적어도 한 명의 인간 또는 적어도 하나의 동물로부터 유래된 세포이다.
바람직하게는, 상기 연구는 하기 분석 방법으로부터 선택된 적어도 하나의 분석을 포함한다:
단백질분해 프로필을 분석하기 위해서는 이차원적 전기영동법 및/또는 단백질 배열 및/또는 사이토카인 배열 및/또는 복합 ELISA를,
유전적 프로필을 분석하기 위해서는 DNA 배열 및/또는 복합 PCR 및/또는 PCR 및/또는 실시간 PCR을,
전사 프로필을 분석하기 위해서는 RNA 배열, cDNA 배열 및/또는 역전사-복합 PCR 및/또는 역전사-PCR 및/또는 실시간 역전사-PCR을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 적어도 부분적으로는 세포 대사를 유지하는 조건 하에서 배양 및/또는 보존되어진다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 적어도 섬유아세포 또는 각질형성세포를 포함한다.
바람직하게는, 상기 모델은 정상세포, 건강세포 또는 병원성세포; 또는 세포주 바람직하게는 인간 또는 동물로부터 유래된 세포를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 피부의 경우 진피라 불리고 점액질 막의 경우 융모막이라 불리는, 주로 스트로마세포를 함유하는 결합 기질 모델; 주로 상피 세포로 구성된 상피 모델; 주로 각질형성세포로 구성된 표피 모델; 표피 및 진피로 구성된 피부 모델; 및 상피 및 융모막으로 구성된 점액질 막 중에서 선택된다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 하기로부터 선택되는 기질 지지체를 포함하는 결합 기질(진피 또는 융모막)의 조직 모델이다:
특별히 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르(polycarbonate) 또는 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산(polyethylene terephthalate; PET)의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막(AnoporeTM inorgarnic membrane)을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소(cellulose acetate) 또는 셀룰로오스에스테르(cellulose ester)(HATF) 막, 반투과성 바이오포어-시엠(Biopore-CMTM) 막, 반투과성 폴리에스터 막, 폴리글리콜산(polyglycolic acid)의 막 또는 필름으로 구성된 그룹으로부터 선택된 비활성 지지체; 본 그룹으로는 예를 들어 스킨 2TM 모델 ZK1100, 더마그라프트®(Dermagraft®) 및 트란스사이트®(Transcyte®)(어드번스드 티슈 사이언스사)와 같은 진피 모델들이 있다;
세포 배양액을 처리한 성형(피부박의 형성: Michel M. et al in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal(1999) 35 : 318-326);
하이알루론산(하이알로그래프트® 3D-피디아 어드밴스드 바이오폴리머 사) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 근거한 필름 또는 막으로, 본 그룹으로는 피부 모델 예를 들어 비트릭스®(오가노제네시스)가 해당된다;
하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans) 및/또는 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로 제조되어진 것으로 겉으로 드러나거나 그렇지 않은 다공성 기질(CNRS: EP 0 296 078 A1; 꼴레띠까: WO 01/92322). 상기 군에는 진피 모델 미메덤®(Mimederm®)(꼴레띠까사)이 해당되고, 기질 지지체는 종양세포 특별히 섬유아세포를 함유한다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 하기로부터 선택된 기질 지지체를 포함하는 표피 조직 모델 또는 상피 조직 모델이다:
특별히 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소 또는 셀룰로오스에스테르(HATF) 막, 반투과성 바이오포어-시엠 막, 반투과성 폴리에스터 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된 비활성 지지체로, 상기 그룹으로 재건된 표피 및 상피 모델(스키네틱®)뿐만 아니라 에피덤®, 에피에어웨이® 및 에피옥쿨라®(마텍 코포레이션) 모델을 포함하는 비활성 지지체;
하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 근거한 필름 또는 막으로, 상기 그룹으로 특별히 미메톱®(꼴레띠까사), 레이저스킨®(피디아 어드번스드 바이오폴리머스사), 에피스킨®(로레알사)을 포함하는 필름 또는 막.
상기 모델들은 종양세포 특별히 섬유아세포와 함께 미리 접종되어진 다음 상피세포 및 특별히 각질형성세포와 함께 접종되어진다.
바람직하게는, 상피 영역내에, 상피 세포, 색소 세포, 면역감응 세포, 신경 세포가 상피 세포에 추가적으로 도입되며, 바람직하게 면역감응세포는 랑게르한스 세포이다.
바람직하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 하기로부터 선택된 진피 또는 융모막 기질을 포함하는 재건된 피부 또는 점액질 막 조직 모델이다:
특별히 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소 또는 셀룰로오스에스테르 막, 반투과성 바이오포어-시엠 막, 반투과성 폴리에스터 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 종양세포 특별히 섬유아세포를 함유하는 비활성 지지체;
콜라겐 및/또는 하이알루론산 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린에 근거한 종양세포 특별히 섬유아세포를 함유하는 겔;
하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans) 및/또는 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로 제조된 겉으로 드러나거나 혹은 그렇지 않은 , 종양세포 특별히 섬유아세포를 통합하는 다공성 기질;
인간 또는 동물의 탈표피화된(de-epidermisized) 진피 또는 죽은 진피.
상기 그룹으로는 특별히 미메스킨®(꼴레띠까사), 아플리그라프®(오가노제네시스사), ATS-2000(셀시스템스® 바이오테크놀로지 버트리브), 스킨 2TM(ZK1200-1300-2000 - 어드번스드 티슈 사이언스)이 언급되어질 수 있다.
더 나아가, 조직 치료법에 사용되어지며 그러한 연구의 목적으로도 사용되어질 수 있는 모델들이 존재한다. 상기 모델로는 에피덱스TM(모덱스 테라퓨티크스사), 에피바세®(라보라토이레 제너브리어사), 에피셀TM(겐자임사), 오토덤TM 및 트란스덤TM(이노제네틱스사)이 있다.
기질 지지체는 그 후 재건된 점액질 막을 얻기 위하여 상피 세포와 함께 접종되어지거나, 재건된 피부를 얻기 위하여 각질형성세포와 함께 접종되어진다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되어지는 상기 조직 모델은 적어도 하나의 추가적인 세포 타입, 바람직하게는 상피 세포(EC; endothelial cells) 및/또는 림프구, 대식세포, 수지상세포를 포함하는 면역 세포 및/또는 지방세포(adipose cells) 및/또는 체모, 모발, 피지선을 포함하는 피부 부속물이 추가된 모델을 포함한다.
본 발명의 두 번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 정의한 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 상기에서 정의한 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 세 번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 정의한 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 상기에서 정의한 스트레스를 받는 동안 변형된 적 어도 하나의 생물학적 지표를 역전하거나 또는 상기 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법에 관한 것으로 하기 단계를 포함한다:
A/ 상기에서 정의되어진 조직 모델내에 접종되어진 기준 세포와 접촉하도록 잠재적 활성물질을 상기 잠재적 활성물질이 활성화될 수 있는 충분한 시간 동안 놓아 둔 후 상기에서 정의된 스트레스를 적용하는 단계;
B/ 상기 세포의 세포 대사에 대한 상기 물질의 작용을 연구하기 위한 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
C/ 잠재적 활성물질이 존재하는 상기 세포의 세포 대사와, 대조구 세포라 불리는 상기 물질이 존재하지 않는 상기 세포의 대사를 비교하는 단계; 및
D/ 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있도록 상기 물질의 양성의 또는 음성의 효과를 동정하는 것을 포함하는 상기 잠재적 활성물질의 활성이 존재하는지 또는 존재하지 않는지 동정하는 단계.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명은 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법에 관한 것으로 하기 단계를 포함한다:
a) 상기에서 정의되어진 조직 모델내에 접종된, 변형된 생물학적 지표를 가지는, 바람직하게는 상기에서 정의된 스트레스 받은 세포로 불리는 스트레스를 겪은 세포를, 적어도 하나의 활성물질의 존재하에, 상기 잠재적 활성물질이 상기 세포의 세포 대사에 대하여 결국 활성화되기에 충분한 시간동안 배양하는 단계;
b) a) 단계에서 배양된 스트레스 받은 세포의, 바람직하게는 상기에서 정의된, 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
c) b) 단계에서 수행되어진 분석을, 대조구 세포로 불리는 상기 잠재적 활성물질의 부존재하에 배양되어진 생체 세포의 바람직게는 상기에서 정의되어진 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교하는 단계; 및
d) c) 단계에서 수행되어진 분석을 비교하여 종국적으로 스트레스에 의해 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전할 수 있는 적어도 하나의 활성물질을 동정하는 단계.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명은 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법에 관한 것으로 하기 단계를 포함한다:
a) 상기에서 정의된 조직 모델내에 접종되어진 잠재적 활성물질을 상기에서 정의된 기준 세포와 접촉하도록 상기 잠재적 활성물질이 활성화될 수 있는 충분한 시간 동안 놓아 둔 뒤 상기에서 정의된 스트레스를 적용하는 단계;
b) a) 단계에서 배양된 스트레스 받은 세포의, 바람직하게는 상기에서 정의된, 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
c) b) 단계에서 수행되어진 분석을, 대조구 세포로 불리는 상기 잠재적 활성 물질의 부존재하에 배양되어진 생체 세포의 바람직게는 상기에서 정의되어진 부분적 또는 완전한 단백질분해 및/또는 유전자 분석을 비교하는 단계; 및
d) c) 단계에서 수행되어진 분석을 비교하여 종국적으로 스트레스에 의해 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 활성물질을 동정하는 단계.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 정의된, 적어도 하나의 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법에 의해 선별된 활성물질의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명은 화장료 또는 약학 분야에서 활성이 있고 상기에서 정의한 방법에 의해 선별된 물질에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 본 발명은 물리적, 화학적 또는 생물학적 스트레스를 받는 동안 변형되어짐에 따라 동정되는 생물학적 지표를 역전하는 것, 및/또는 이들의 변형을 억제하는 것이 가능하고; 상기 지표는 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포를 사용하는 세포 모델과, <<기준 세포>>로 불리는 세포를 사용하는 세포 모델 간을 비교함으로써 동정되어지고; 상기 모델 중 적어도 하나는 섬유아세포 또는 각질형성세포 중 적어도 하나를 포함하는 조직모델임을 특징으로 하는 활성물질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기에 주어진 상세한 설명 및 실시예를 토대로 명백하여 질 것이며 이는 단순히 실례로서 주어지는 것일뿐이므로 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 실시예는 본 발명의 절대적으로 필요한 부분을 구성 하며, 당업계의 수준에 비교해서 신규한 것으로 나타나는 특징들은 그 것의 기능 및 보편성을 근거로 본 발명의 절대적으로 필요한 부분으로써 청구되어질 것이다. 실시예에서, 다른 표시가 없는 한, 모든 퍼센트는 중량 퍼센트로서, 온도는 섭씨 온도로서, 압력은 대기압으로서 주어진다.
실시예 1: <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포의 추출 및 배양
<<기준 세포>>로 불리는 세포는 하기 세포 중 어느 하나이다:
다양한 연령의 기증자로부터 얻은, 태양으로부터 스트레스를 받지 않은 생체 검사로부터 추출한 세포 및 바람직하게는 복부, 유방, 잇몸 또는 질인, 성형외과적 처치물로부터 얻은 세포.
<<스트레스 받은 세로>>로 불리는 세포는 하기 세포 중 어느 하나이다:
다양한 연령의 기증자로부터 얻은, 태양으로부터 스트레스를 받은 영역(얼굴, 목, 손)의 성형외과적 처치물로부터 얻은 생검으로부터 추출된 세포.
수득한 세포 타입은, 외식 기술 또는 예를 들어 콜라게나제와 같은 효소에 의한 분해에 의해 추출되어진 섬유아세포, 특별히 디스파제(dispase) 또는 서몰리신 또는 트립신-EDTA 등을 이용한 효소적 피부-표피의 분리(dermo-epidermic dissociation) 후에 추출되어진 각질형성세포 또는 멜라닌세포이다.
추출 후에, 섬유아세포는, 10% 송아지 혈청, 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 1㎍/mL 젠타마이신(gentamycin) 및 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B)로 보충한, DMEM 미디움(Delabecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 글루타맥스(glutamax) 50/50 (v/v) 배양액에서 증폭하였다. 트립신을 처리하여 컨플루언스(confluence) 90%에 도달할 때까지 섬유아세포를 증폭하였다.
추출 후에, 각질형성세포는 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 1㎍/mL 젠타마이신(gentamycin) 및 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B)로 보충한, 소의 뇌하수체(bovine pituitary gland)를 포함하는 K-SFM 미디움(Keratinocyte Serum Free Medium - Invitrogen) 내에서 증폭된다. 트립신을 처리하여 컨플루언스(confluence) 90%에 도달할 때까지 각질형성세포를 증폭하였다.
추출 후에, 멜라닌세포는 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 1㎍/mL 젠타마이신(gentamycin), 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B)로 보충된 MMK2 미디움(Melanocyte Medium Kit - Sigma) 내에서 증폭하고 100㎍/mL 제네틴을 3일 동안 처리하여 잔여 각질형성세포를 제거하였다. 트립신을 처리하여 컨플루언스 90%에 도달할 때까지 멜라닌세포를 증폭하였다.
실시예 2: <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포로부터 재건된 진피의 제조
실시예 1에 따라 증폭된 세 개의 기준 생검(포유동물의 생검) 및 세 개의 스트레스 받은 생검(리프팅에 의한 스트레스)으로부터 얻은 500,000 개의 섬유아세포를 DMEM-글루타맥스 배지에서 디페닐포스포릴라자이드로 가교결합된 콜라겐으로 만 들어진 진피 기질(substrates)에 접종하였다. 이 때, 상기 DMEM-글루타맥스 배지는 10% 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 1㎍/mL 젠타마이신(gentamycin) 및 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B)을 포함한다.
실시예 3: UVA를 조사하여 스트레스 받은 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포로 미리 접종한 재건된 진피내에서 사이토카인의 정량
실시예 1에 따라 증폭된 기준 생검(포유동물의 생검)으로부터 얻은 500,000 개의 섬유아세포를 DMEM-글루타맥스 배지 내에서 15일의 기간동안 디페닐포스포릴라자이드로 가교결합된 콜라겐으로 만들어진 진피 기질에 접종하였다. 이 때, 상기 DMEM-글루타맥스 배지는 10% 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 1㎍/mL 젠타마이신(gentamycin) 및 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B)을 포함한다. 그 후 혈청이 없는 배지(FBM, Fibroblast Basal Medium - Promocell) 내에서 일주일 더 배양하였다.
실험의 마지막에, 재건된 진피는 pH 7.4의 인산 완충액(PBS)으로 헹군 다음 pH 7.4의 PBS 1mL를 담고 있는 작은 페트리 접시에 넣었다. 특정 시료들은 실온에서 보존되어졌고(<<기준 진피>>로 불리는 재건된 진피), 다른 것들은 조사량을 증가시키면서(0-5-10-15-20-25-30 J/㎠) UVA(365nm)를 조사하였다.
<<스트레스 받은 세포>> 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포를 포함하는 재건된 진피는 그 후 혈청이 없는 미디움(FBM, Promocell) 내에서 24시간 동안 배양하였다. 기질 내에서의 세포 생존력은 MTT(메틸티아졸레테트라졸리움)을 이용한 테스트에 의하여 계산되었으며 비조사된 대조구(non-irradiated control)의 퍼센트로 표현되었다. 배양액들은 모아서 원심분리하였으며, 사이토카인 함량은 플루오로카인 맵 키트(Fluorokine MAP kit)(R&D Systems)을 이용하여 측정하였다. 잠시 동안, 50㎕의 표준 시료 또는 시료를 동정된 웰(identified wells) 안으로 피펫으로 넣었다. 다른 사이토카인의 특정 항체를 고정하는 미세입자 50㎕를 미리-정의된(pre-defined) 플레이트 플랜의 기능을 위해서 웰 안으로 첨가하였다. 환상으로 교반하면서 한 시간 동안 배양한 후에, 비-고정된(non-fixed) 물질을 씻어서 제거하고, 다른 사이토카인에 특이적인 표지된 항체(labeled antibodies)를 웰 안으로 첨가하고 환상으로 교반하면서 2 시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 미세입자들은 세척 완충액으로 현탁시켜, 환상으로 교반하면서 1분 동안 휘저었다. 기록(reading)은 루미넥스 100 분석기(Luminex 100 Analyser)(R&D Systems)을 이용하여 즉각적으로 수행되었다. 분석된 배양액내에 존재하는 다른 사이토카인의 함량은 고도로 정제된 재조합 인간 사이토카인으로 만들어진 눈금 범위에 의하여 결정되었다. 이러한 기술은 다양한 사이토카인(IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα, GM-CSF, G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF, IFNγ)의 세포 분비를 분석하기 위한 실험을 가능하게 한다.
사이토카인(pg/mL) 스트레스를 받지 않은 세포 자외선에 의한 스트레스를 받은 세포: 20J/㎠)
MTT 100% 72%
IL1 베타 (pg/mL) 24 ±10 56 ±19
IL6 (pg/mL) 570 ±142 1210 ±342
IL8 (pg/mL) 122 ±17 173 ±23
TNF 알파 (pg/mL) 18 ±6 110 ±42
본 발명의 방법들은 스트레스(여기서는 UVA 조사)가 세포 생존력을 감소시킬뿐만 아니라 전염증성 인터류킨(pro-inflammatory interleukins)의 합성을 증가시키는 것을 이해할 수 있게 하며 올바르게 선별된 활성원을 사용함으로써 이러한 합성의 증가를 감소시키는 효과가 있다.
실시예 4: UVB 조사와 같은 스트레스를 받은 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포를 포함하는 재건된 표피내에서 사이토카인의 궁극적인 변화를 동정하기 위한 사이토카인의 정량
여기에서 UVB 방사선에 비노출되고(포유류 생검), 패새지 1까지 실시예 1에서 묘사된 바와 같이 증폭된(트립신 처리 후 일차 증폭) 4 ×106개의 기준 각질형성세포를, 층(layer) 아래에 섬유아세포 영양소를 미리 접종한 보이든 챔버-타입 인서트(Boyden chamber-type inserts)(0.4㎛의 공극 및 25mm의 직경을 가진 막)에 접종하고, 10% 하이클론(Hyclone) II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손(hydrocortisone), 0.12 IU/mL 우물린(umulin), 0.4 ㎍/mL 이수프렐(isuprel), 2 ×10-9M 트리요도티로닌(triiodothyronine), 24.3 ㎍/mL 아데닌(adenine), 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스/햄 F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서 3 내지 8일 동안 액침배양하였다.
각질형성세포의 배양액은 그 후, 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요도티로닌 및 우물린을 제외한 액침 배양을 위해 사용하였던 동일한 배양액에서 12 내지 18일 동안 공기-액체 계면(air-liquid interface) 상에 놓아 두었다.
6개의 시료들은 배양 끝에 어떠한 처리도 하지 않았다(기준 세포를 포함하는 모델 = 대조구). 6개의 재건된 표피 전체에 각가 다른 스트레스를 가했다. 각각의 스트레스 타입을 위하여, 예를 들어 하기 목록으로부터 선택된 다른 프로토콜들이 사용되어질 수 있다:
화학적 스트레스: 10분 내지 1시간 동안, 예를 들어 하기와 같은 다른 약품들(agents)을 재건된 표피에 바른 다음 pH 7.4의 PBS로 헹군다: 2% 라우릴 황산염 나트륨(SLS), 0.05% 트레티노인(tretinoine), 과산화수소(3 내지 300 μM), 산화질소(NO){0.1 내지 1μM 마흐마 노노에이트(MAHMA nonoate)}, CO2 포화 또는 담배 연기에 의한 저산소증;
생물학적 스트레스: 한 시간 동안 다양한 약품을 재건된 표피에 바른 다음 pH 7.4의 PBS로 헹군다: TGFβ(5-10 ng.mL), TNFα(50-100-200 IU/mL), IL1 (5-10 ng/mL), LPS {5-10 ng/mL 당지질(lipopolysaccharide)};
기계적 스트레스: 재건된 표피를 자르거나 1시간 동안 압축한다;
온도적 스트레스: 재건된 표피를 37℃, 40℃ 및 43℃에서 1시간 동안 놓아 둔다;
자기장: 재건된 표피를 자기장 예를 들어 835 MHz/0.6W ALC 1,800 MHz/0.25W (휴대폰의 무선 주파수)의 자기장 하에서 한 시간 동안 놓아 둔다;
마이크로파: 재건된 표피에 주파수 2.45 및 7.7 GHz 및 파워 30mW/㎠인 마이크로파를 쪼인다;
전리 방사선: 재건된 표피에 X-선을 0.2 내지 10 mGy의 조사량으로 쪼인다;
UV 스트레스: UVA (0-60 J/㎠), UVB (0-100 mJ/㎠), 일광(0-3,500 kJ/㎡).
본 실험에서, UVB 타입의 조사를 수행하는 것을 선택하였다. 이를 위하여, 배양액은 제거되고 pH 7.4의 PBS로 대체되었으며, 인서트 내에 존재하는 특정 재건된 표피는 UVB(312 nm)를 0 내지 100 mJ/㎠으로 조사량을 증가시키면서 조사하였다. 다른 것들은 조사를 제외하고 동일한 조건하에서 보존되었다(<<스트레스 받지 않은 기준 표피>>로 불리는 표피). 다음으로, 이와 같이 처리된 재건된 표피를 에멀션 미디움(emersion medium)에서 24 시간 동안 더 배양하였다. 사이토카인의 측정은 실시예 3에서 묘사한 플로로카인 맵(Florokine MAP)을 이용하여 수행하였다. 세포 생존력은 단백질 측정{단백질 측정을 위한 비킨코니닉산 키트(bicinchoninic acid kit) - 시그마 에스티 루이스사(Sigma St Louis), 미국} 또는 알칼린 포스파타아제의 효소적 활성 측정이 가능한 세포 생존력을 위한 다른 테스트{5 mM p-니트로페닐 인산염(p-nitrophenyl phosphate), 0.1 M 아세트산 나트륨, pH 5의 0.1% 트 리톤 엑스100(Triton X100)을 함유하는 용액내에서 37℃하에 2 시간 동안 배양한 후 10% 1N NaOH로 중화시킨 다음 405nm에서 흡광도를 측정)에 의해 계산되어졌다.
결과는 조사하지 않은 대조구에 대한 퍼센트로 하기 표 2에 나타내었다.
사이토카인(pg/mL) 스트레스를 받지 않은 세포 UVB에 의한 스트레스를 받은 세포: 21mJ/㎠)
BCA 100% 58%
IL1 베타 (pg/mL) 25 ±8 137 ±39
IL6 (pg/mL) 120 ±30 702 ±29
IL8 (pg/mL) 352 ±57 473 ±72
TNF 알파 (pg/mL) 17 ±11 125 ±42
본 발명의 방법들은 스트레스(여기서는 UVB 조사)가 세포 생존력을 현저하게 감소시킬뿐만 아니라 전염증성 인터류킨(pro-inflammatory interleukins)의 합성을 증가시키는 것을 이해할 수 있게 하며, 올바르게 선별된 활성원을 사용함으로써 합성의 이러한 증가를 감소시키고 세포 사망률(cell mortality)을 제한하는 효과가 있다.
실시예 5: 사이토카인, 케모카인 및 면역제어 인자들의 mRNAs의 정량을 위한, <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포 또는 <<기준 세포>>로 불리는 세포를 포함하는 재건된 잇몸의 점액질막 상피의 제조
실시예 1에서 묘사한 바와 같이 추출된, <<잇몸의 점액질막 기준 상피 세포>>로 불리는 1 내지 2 ×106개의 잇몸의 점액질막 상피 세포{잇몸의 생검, 패새지 3(트립신 처리 후 3 번째 증폭)}를, 보이든 챔버-타입 인서트(Boyden chamber-type inserts)(0.4㎛의 공극 및 25mm의 직경을 가진 막 - 층 아래에 섬유아세포 영 양소를 미리 접종함)에 접종하고, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 IU/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 ×10-9M 트리요도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스/햄 F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서 3 내지 8일 동안 액침배양하였다.
상피 세포의 배양액은 그 후, 송아지 혈청의 퍼센트를 10 내지 1%까지 낮추는 것을 제외하고 액침 배양을 위해 사용하였던 동일한 배양액에 12 내지 18일 동안 담가 두었다.
실험의 마지막에, 배양액은 제거되고 pH 7.4의 PBS로 대체되었으며, 인서트 내에 존재하는 재건된 상피는 상피 1개당 20㎕의 비율로 다양한 잠재적 자극제 또는 증감제에 의하여 1시간 동안 스트레스를 받았다: 5% 라우릴 황산염 나트륨(SLS), 1000U/mL 당지질(LPS), 10mM 항-염증제 프레드니솔론(Prednisolone)(시그마사) 및 3% 활성 인히파제®(Inhipase®){푸에라리아 로바타(pueraria lobata)의 뿌리 추출물, 꼴레띠까사)에 의해서도 상피 세포 1개당 20㎕의 비율로 1 시간 동안 스트레스를 받았다. 그 다음 재건된 상피에 바른 약품들을 제거한 뒤 재건된 상피를 송아지 혈청이 제거된 액침 배양액(immersion medium)에서 24 시간 동안 추가적으로 더 배양하였다. 특정의 재건된 상피는 MTT(메틸티아졸레테트라졸리움)을 이용한 테스트에 의하여 세포 생존력에 관하여 분석하였다. 다른 재건된 상피는 잘라내어 트리 리에이젼트®(Tri Reagent®)(T9424 시그마사, 미국 세인트 루이스)에 녹인 뒤 클로로포름으로 추출하였다. 4℃에서 12,000g으로 원심분리한 후, 상층에서 RNA를 얻었다.
상피의 mRNA의 측정은 제품 제조업자에 의해 정의된 프로토콜에 따라 익스프레션 어레이(Expression Array)(R&D System)를 이용하여 수행하였다. 결과는 스트레스 받지 않은 대조구에 대한 변화율(factor of variation)로써 표현되었다: [(스트레스 받은 세포 결과)/스트레스 받지 않은 세포 결과)×100].
라벨 SLS에 의한 스트레스 LPSs에 의한 스트레스 프레드니솔론의 영향(Effect of Prednisolone) 인히파제®에 의한 영향(Inhipase®)
PLA2 102 168 93 50
IL1α 241 131 62 52
IL1β 114 182 75 69
IL-1ra 82 75 112 98
IL-1R AcP 102 124 95 119
IL-1RI 154 254 83 107
IL-1RII 137 262 88 102
TNFα 213 134 67 72
IL6 163 342 81 135
IL7 127 201 102 109
IL8 183 287 105 92
IL10 75 72 152 148
IL11 112 125 101 108
IL12 132 178 67 66
IL15 147 189 99 108
본 발명의 방법들은 스트레스(여기서는 자극제 또는 증감제를 바르는 것)가 염증의 다양한 라벨들의 변형을 유도한다는 것을 이해할 수 있게 한다. 활성원 인히파제®의 효과적임이 기준 항염증제에 비교하여 입증되었다.
실시예 6: 재건된 피부의 조직 모델 제조, mRNA의 합성에 대한 열적 스트레스의 연구 및 청년과 중장년층 피실험자간의 비교
추출된 세포들은 광보호된(photoprotected) 포유동물 생검으로부터 얻은 것 들이다.
<<어린 섬유아세포(young fibroblasts)>> (35살 이하의 피실험자 3명) 및 <<나이든 섬유아세포(aged fibroblasts)>> (55살 이상의 피실험자 3명)로 불리는 400,000개의 섬유아세포가 추출되어져서 패새지 5(트립신 처리 후 5 번째 증폭)까지 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 증폭되어진 뒤 표면 진피 기질(surfaced dermal substrates)의 두 면상에 접종되었다.
간단히 설명하면, 진피 기질은 하기 프로토콜에 따라 제조되어졌다:
- 필름을 만들기 위하여 0.75% 콜라겐 겔을 25℃에서 건조;
- 0.75% 콜라겐 겔 상에 콜라겐 필름을 침착시킴;
- 24 시간 동안 동결건조 및 DPPA를 이용하여 가교결합{디메틸포름아마이드(dimethylformamide) 용매에서 콜라겐상에 50㎕/g의 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide)를 첨가한 뒤 pH 8.9의 붕산염 완충액을 첨가);
- 탈염수(demineralized water)로 헹구어 낸 뒤, 표면 진피 기질을 다시 한번 동결건조함.
섬유아세포의 배양을 위하여 사용되어진 배양액은 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한 DMEM-글루타맥스 미디움이다. 재건된 진피를 얻기 위하여는 14일의 배양 기간이 필요하다.
그 후, 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 추출되어져서 패새지 2(트립신 처리 후 2 번째 증폭)까지 증폭되어진, <<어린 각질형성세포(young keratinocytes)>> (35살 이하의 피실험자 3명) 및 <<나이든 각질형성세포(aged keratinocytes)>> (55살 이상의 피실험자 3명)로 불리는 400,000개의 각질형성세포를, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 IU/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 ×10-9M 트리요도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스/햄 F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서, 표면 진피 등가물의 필름 옆면 상에 접종하여 7일 동안 액침 배양하였다.
그 다음, 배양액은 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요도티로닌 및 우물린을 제외한 액침 배양을 위해 사용하였던 동일한 배양액에서 14일 동안 공기-액체 계면(air-liquid interface) 상에 놓아 두었다.
실험의 마지막에, 배양액은 제거되고 pH 7.4의 PBS로 대체되었으며, 인서트 내에 존재하는 재건된 피부는 37℃(기준 세포를 포함하는 모델)와 43℃(스트레스 받은 세포를 포함하는 모델)에서 한 시간 동안 배양하였다. 이와 같이 처리된 재건된 표피는 그 다음 액침 배양액에서 24 시간 동안 더 배양하였다. 열적 쇼크를 받은 <<스트레스 받은 세포>> 및 <<기준 세포>>를 포함하는 시료들은 cDNA 배열에 의해 분석되었다.
간단히 설명하면, 시료의 RNA는 추출되어져(바이오풀베리저를 이용하여 액체 질소 내에서 간 뒤), DNA를 전체 제거하기 위하여 트리 리에이젼트®(시그마사) 공급업자의 프로토콜에 따라서 정제되었다.
- 정제된 RNA는 정성적 및 정량적으로 분석되었다.
- 하기 단계는 아트라스 퓨어(클론테크사)의 프로토콜에 따른, 비오티닐레이티드 올리고(biotinylated oligo)(dT) 프라이머를 이용한 mRNA의 폴리(A) 말단의 하이브리드 형성 및 스트렙타비딘 비즈 상의 선택적인 포획에 의한 메센저 RNA를 정제하는 것이다. 33P로 복합적으로 표지된 DNA 프로브(probes)는 [α33P]-dATP의 존재하에 <<배열>> 상에 고정된 서열(sequence)에 특이적인 프라이머를 이용하여 폴리(dT)의 비즈 상으로 링크된 mRNA의 역전사에 의해 만들어진다. 표지된 프로브들은 배제 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였으며, 표지된 프로브의 특성 및 등가성(equivalence)은 액체 신틸레이션 카운팅(liquid scintillation counting)을 이용하여 평가하였다.
- 커스텀 아틀라스 막(Custon ATLAS membranes)은 전처리되었고, 그 다음 각 막 상에 고정된 cDNA는 대응하는 표지된 프로브를 이용하여 하이브리드되었다(68℃에서 하룻밤); 그 후 필터는 분석하기 전에 씻었다.
- 포스포리마거 사이클론(Phosphorimager Cyclone)(팩커드 인스트러먼트사; 3 시간 및 그 후 72 시간에 습득) 및 퀀트어레이 소프트웨어(QuantArray software)(팩커드사)를 이용하여 스팟(spots)의 자동방사선사진법 및 방사성 정량에 의한 분석
- 다른 실험 조건 간에 변화하는 중요한 유전자의 동정: 열적 스트레스를 거 치거나 거치지 않은 청년층 피실험자 대 중장년층 피실험자. 결과는 스트레스 받지 않은 조건 및 스트레스 받은 조건 하에서, 중장년층 모델 및 청년층 모델 간의 변이를 퍼센트로 표현하였다.
표지 스트레스 받지 않은 중장년층/청년층 피실험자 스트레스 받은 중장년층/청년층 피실험자
포스포리파제 A2, 프로테인 키나제 C 억제제 프로테인 1, 세포외효소 S (FAS)를 활성화시키는 인자 101 136
수포성의 펨피고이드 항원 1 (Bullous pemphigoid antigen 1) 232 187
연골 특이 프로테오글리칸 코어 프로테인 53 82
COL1A1 Nd 142
COL1A2 Nd 124
COL3A1 46 85
COL6A1 64 62
COL6A3 62 51
피브로넥틴(Fibronectin) 전구체 57 43
하이알루로난 신타아제(Hyaluronan synthase) 189 154
인보룩린(Involucrin) 260 159
MMP1 68 125
MMP11 63 92
MMP16 135 195
TIMP1 74 86
TIMP3 173 152
SPARC 50 51
연결조직 성장인자 전구체 56 45
엔도테린(Endothelin) 수용체 타입 B 51 47
글리아 유도 신경돌기-증진 인자(Glia derived neurite-promoting factor) 53 69
과립구 주화성 단백질 2(Granulocyte chemotactic protein 2) 562 489
성장 억제 인자, 메탈로티오네인 III(metallothionein III) 161 142
IL-1 알파 전구체 162 398
IL-1R1 54 64
IL-1R2 512 242
IL-1RA 156 168
IL-3 75 52
IL-6 84 121
IL-8 737 917
IL-12B 81 91
KGF 50 42
칼그라눌린 B(Calgranulin B), 이동 억제 인자-관련 단백질 14(migration inhibitory factor-related protein 14), S100 칼슘 단백질 A9 1981 1402
이동 억제 인자-관련 단백질 8, 칼그라눌린 A, S100 칼슘 단백질 A8, 담당의 섬유증 항원(cystic fibrosis antigen) 4593 2567
단핵세포 주화성 단백질 1(Monocyte chemotactic protein 1), 단핵세포 주화성 및 활성화(activating) 인자, 스몰 인덕터블 사이토카인 A2(small inductible cytokine A2) 289 425
태반(Placenta) 성장 인자 1, 2 388 142
혈소판(Platelet) 유도 성장 인자 A 397 152
혈소판 유도 성장 인자 수용체 알파 서브유닛(Platelet derived growth factor receptor alpha subunit) 50 89
플레이오트로핀(Pleiotrophin) 전구체, 헤파린 바인딩 인자(heparin binding factors) 49 58
TGF 베타 유도 조기 단백질(TGF beta inducible early protein) 48 102
프로스타그란딘(Prostaglandin) G/H 신타아제 1 113 158
프로스타그란딘(Prostaglandin) G/H 신타아제 2 68 125
47 kDa 열적 쇼크 단백질, 콜라겐 바인딩 단백질 1 84 289
70 kDa 열적 쇼크 단백질 131 587
90 kDa 열적 쇼크 단백질 107 412
Bax 104 158
bcl2 nd Nd
FAS 항원 리간드 (FASL) nd 289
FAS 항원 리간드 수용체 nd 452
TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand)(TRAIL), 아포2(apo2) 리간드 nd 197
테나신(Tenacin) 전구체, 헥사브라키온(hexabrachion), 사이토탁틴(cytotactin) 64 75
본 발명의 방법들은 스트레스(여기서는 열적 쇼크)가 한편으로는 수많은 표지의 변형을 유도할뿐만 아니라 다른 한편으로는 피실험자 나이의 함수로서 스트레스에 대하여 다른 반응을 유도한다는 것을 이해할 수 있게 한다. 그래서 본 모델은 열적 쇼크의 표시를 제공하거나 열적 쇼크의 효과를 전환하기 위한 작용 타깃(action targets)을 정의하는 것이 가능하다. 더 나아가, 본 모델은 문제의 연령 그룹의 함수로서 활성원을 개발하기 위한 다른 전략을 정의하는 것이 가능하다.
실시예 7 : 랑게르한스 세포, 세포간 모수석 세포, 대식세포 및 내피세포를 함유하는 다세포의(pluricellular) 재건된 피부에 대한 조직 모델 제조, 박테리아의 지질다당류와의 박테리아성 응집(aggression)과 같은 생물학적 스트레스 연구
◆ 랑게르한스 세포의 분화 경로에서 우선적으로 스스로 순응할 수 있는 분화되지 않고 미숙한 모수석 세포의 발생:
말초 순환 혈액을 한 명 또는 그 이상의 인간 피실험자로부터 정맥 혈액 샘플을 취하여 리튬-헤파린(lithium heparin)과 같은 보통의 항-응고제 제품을 보충한 진공주사기에 모았다.
이러한 순환하는 혈액으로부터 단핵세포(CD14+)를 분리하는 것은 바람직하게는 록케펠레 유니버시티 프레스(The Rockefeller University Press)에 의해 개시된 게이스만 외(Geissmann et al.) (J. EXP. MED. Vol 187, No .6; 961-966 페이지; 1998년 3월 16일)에 의하여 묘사된 프로토콜에 따라 하기 방식대로 수행되어질 수 있다:
- 피콜 그라디언트(Ficoll gradient)(소듐 디아트리조에이트/다당류 밀도 1.077; 림포프렙 압시스 1053980)를 첨가하여 원심분리한 후, 순환하는 혈액의 단 핵 세포를 회수하여 마그네틱 비즈에 연결된 항체 칵테일(주로 항-CD3, 항-CD7, 항-CD19, 항-CD45RA, 항-CD56, 항-IgE)로 간접적으로 표지하였다;
- 마그네틱 컬럼을 통과시키면 단지 자기적으로 표지되지 않은 단핵 세포만이 용출되었다.
CD14+ 단핵 세포는 당업자에게 잘 알려진 물리적 분리 방법, 바람직하게는 침전 또는 원심분리에 의하여 용출액에서 회수되었으며, 그 다음의 배양을 위하여 그 자체로서 용출되었다.
그 다음 CD14+ 단핵 세포는 두 개의 사이토카인, 즉 400 IU/mL 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL 사이토카인 TGFβ1이 보충되지 않고 처음부터 함유되있는, 10% 우태반 혈청을 보충한 RPMI 1640 배양액{로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Rosewell Park Memorial Institute)}에서 밀리리터당 대략 1 백만의 비율로 배양되었다.
배양은 5%의 CO2를 함유하는 습기 있는 대기 중에서 37℃ 하에서 수행되었다.
배양액은 초기에 세 번째 사이토카인, 즉 10 ng/mL 사이토카인 IL-13으로 보충되었다. 배양이 최고조에 달하는 2일 전에, 배양 6일 째까지 IL-13을 포함하지 않은 상기와 동일한 배양액을 첨가하였다. 6일 째에, 분화되지 않은 미숙한 모수석 세포가 랑게르한스 세포로 분화되는 경로중에 우선적으로 스스로 순응할 수 있게 되었다:
- 시험관 내에서 발생된 대략 60 내지 80%의 모수석 세포는 세포 내에서 랑 게린(Langerin)과 MIP-3α에 대한 특이적인 수용체인 CCR6을 발현시킨다;
- 시험관 내에서 발생된 모수석 세포는 MIP-3α에 의하여 화학적으로 강하게 끌리며, 이 점은 수용체 CCR6의 기능성을 증명하는 것이다;
- 시험관 내에서 발생된 모수석 세포는 성숙기 표지 CD83, CD-LAMP 및 CCR7을 나타내지 않으므로 미숙한 상태다.
◆ 조직 모델은 그 다음 하기 프로토콜에 따라서 제조된다:
기준 세포로 불리는 복부의 생검으로부터 추출된 2 ×105개의 섬유아세포가 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 증폭된 다음, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스 배양액에서, 콜라겐-글리코사미노글리칸-키토산에 근거한 진피 기질 상에 접종한 후 21일 동안 배양하였다. 배양은 EGF를 제외한 상기에서 묘사한 배양액에서 일 주일 더 수행되었다.
그 다음, 복부의 생검으로부터 추출되어지고, 기준 세포로 불리는 세포를 포함하며 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 패새지 1(첫번째 증폭)까지 증폭된 2×105개의 각질형성세포와 시험관 내에서 발생된 1 내지 3×105개의 분화되지 않은 모수석 세포를, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 IU/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 ×10-9M 트리요도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스/햄 F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서, 진피 등가물 상에 접종하여 7일 동안 액침 배양하였다.
그 다음, 배양액은 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요도티로닌 및 우물린을 제외한 액침 배양을 위해 사용하였던 동일한 배양액에서 20일 동안 공기-액체 계면(air-liquid interface) 상에 놓아 두었다.
이러한 조건에서, 랑게르한스 세포는 표피 내에 위치하게 되고, 세포간 모수석 세포, 대식세포 및 내피세포는 진피 내에 위치하게 된다.
박테리아성 지질다당류(LPS)를 6 내지 24 시간 동안 10 ng/mL의 비율로 액침 배양액에 첨가하거나 또는 첨가하지 않는다.
실험의 마지막에, 면역감응의 재건된 피부는 실시예 6에서 묘사한 바와 같이 cDNA 어레이에 의해 분석되었다. 그 다음, 회수되어 냉동된 배양액은 실시예 3에서 묘사한 바와 같이 플로로킨 맵(Florokine MAP)에 의해 분석되었다. pg/mL 단위의 인터루킨(interleukin) 1 및 TNFα에 의하여 특별히 조숙한 정상 부분에 대한 대한 결과를 나타내었으며 DNA 어레이에 대한 결과는 사이토카인의 합성을 위한 퍼센트(스트레스 받은 세포 결과/스트레스 받지 않은 세포 결과)×100로 나타내었다.
플로로킨 맵 스트레스 없음 스트레스 받은 세포 결과/스트레스 받지 않은 세포 결과(6시간) 스트레스 받은 세포 결과/스트레스 받지 않은 세포 결과(24시간)
IL1 베타(pg/mL) 76±17 125±28 207±59
TNF 알파(pg/mL) 53±21 87±19 95±22
cDNA 어레이
인터루킨-1 알파 (IL-1 알파; IL1A); 헤마토포이에틴-1 (hematopoietin-1) 100 138
인터루킨-1 베타 (IL-1; IL1B); 카타볼린(catabolin) 117 198
효소를 전환시키는(converting) 인터루킨-1 베타 (IL1BCE) 100 125
인터루킨-1 수용체 길항재 단백질 (interleukin-1 receptor antagonist protein) (IL-1RA; IRAP) 72 335
인터루킨-1 수용체 타입 I (IL-1R1); IL-1R-알파; p80; CDW121A 항원 119 164
인터루킨-1 수용체 타입 II (IL-1R2); IL-1R-베타 100 103
인터루킨-1 수용체-관련 키나제 (IRAK) 73 152
종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파; TNFA); 카켁틴(cachectin) 152 287
종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 1, 내피세포; B12 단백질 123 100
종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) + 종양 괴사 인자 수용체 2 (TNFR2); 종양 괴사 인자 바인딩 단백질 2 (TBP2) 83 119
종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1); 종양 괴사 인자 바인딩 단백질 1 (TBP1); CD120A 항원 108 176
종양 괴사 인자-유도성 단백질 TSG-6 (tumor necrosis factor-inducible protein TSG-6); 하이알루로네이트-바인딩 단백질 (hyaluronate-binding protein) 100 129
효소를 전환시키는 TNF-알파 (TACE); 어 디스인테그린 & 메탈로프로테이나제 도메인 17 (a disintegrin & metalloproteinase domain 17) (ADAM17) 74 124
TNF-알파-자극된 (TNF-alpha-stimulated) ABC 단백질 (TSAP) 100 100
리간드를 유도하는 TNF-관련 아폽토시스 (TNF-related apoptosis inducing ligand) (TRAIL); APO-2 리간드 (APO2L) 96 98
CD1a 전구체 82 52
CD86 항원 전구체 56 39
CD40 항원 전구체 89 45
이러한 결과는 인터루킨 1 및 TNF 알파에 의한 염증성 반응의 저절을 인코딩하는 유전자가 다소 빨리 활성화됨을 증명한다. 표지 CD1a, CD40 및 CD86의 경우에 관찰되는 감소는 유전자 조절 현상에 기인하는 것이 아니라 지질다당류에 의한 스트레스의 영향으로 삼차원적 모델에서 초기에 존재하던 모수석 세포가 소멸하여 배양액에서 이주함에 따라 인서트 하에 존재하게 되기 때문이다.
본 발명의 방법은 또한 발생된 스트레스에 따라 관찰되어진 표시(indication)를 제공하거나 또는 상기와 같이 관찰되어진 다양한 변형을 조절하는 것을 가능하게 하는 활성원을 선별할 수 있게 한다.
실시예 8: 반복된 태양광선의 조사에 의한 스트레스에 노출된 착색된(pigmented) 재건된 피부의 제조, 및 항산화제 활성원의 유효성 연구
추출된 세포를 연구한 스트레스에 노출되지 않은 포유 동물의 생검으로부터 얻었다. 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 패새지 5(트립신 처리 후 5 번째 증폭)까지 증폭된 400,000개의 섬유아세포를, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF 또는 표피 성장 인자, 100 IU/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신으로 보충한 DMEM-글루타맥스 배양액에서, 콜라겐의 표면 스폰지에 근거한 진피 기질 상에 접종하여 14일 동안 배양하였다.
그 다음, 실시예 1에서 묘사한 바와 같이 패새지 2(트립신 처리 후 2 번째 증폭)까지 증폭된 400,000개의 각질형성세포와 10,000개의 멜라닌세포를, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드 로코르티손, 0.12 IU/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2×10-9 M 트리요도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 IU/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신으로 보충한 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서 진피 등가물 상에 접종한 후 7일 동안 액침 배양하였다.
그 다음 배양액은 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요도티로닌 및 우물린을 제외한 액침 배양에서 사용한 동일한 배양액에서 14일 동안 공기-액체 계면에 놓아 두었다.
일 주일에 두 번, 이 주일 동안, 액침 배양액은 제거되고 pH 7.4의 PBS로 대체되었다. 인서트 내에 존재하는 특정의 착색된 재건 피부는 실온에서 보관하였다; 상기 모델은 "기준 세포"로 불리는 세포를 포함한다. 인서트 내에 존재하는 다른 착색된 재건 피부는 태양광선 방사선 조사 장치 선테스트 시피에스+(solar irradiator Suntest CPS+)(ATLAS사)에 의하여 561 KJ/㎡(중앙 유럽에 한 시간 평균 노출량에 해당됨)의 비율로 조사되었다; 상기 모델은 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포를 포함한다. 방사선 조사 기간 이 후에, 재건된 피부는 액침 배양액에서 5%의 CO2 하에서 37℃에서 배양되었다.
3%의 항산화제 활성원, 예를 들어 플라바그룸®(Flavagrum®)(헤스페리틴 라우레이트, 꼴레띠까사), 플라벤저®(Flavenger®)(쿠에르시틴 카프릴레이트, 꼴레띠까사)를 함유하거나 또는 함유하지 않는 8㎕ 화장료 조성물을 10일 동안 착색된 재건 피부에 발랐다.
실험의 마지막에, 착색된 재건 피부는 액침 배양액에서 24 시간 동안 추가적으로 더 담가 둔 뒤, 항산화제 처리의 유효성을 하기 분석법에 따라 평가하였다:
- <<스트레스 받은 세포>> 또는 <<기준 세포>>를 포함하는 착색된 재건 피부 내에서의 세포 생존력(MTT-메틸티아졸레테트라졸리움을 이용한 테스트). 결과는 비조사된 대조구에 대한 변형의 퍼센트로 표현하였다.
- 실시예 3에서 묘사한 바와 같이 수집된 배양액에서 플로로킨 맵 키트에 의해 정량된 인터루킨의 분비량. 결과는 pg/mL의 단위로 표현하였다.
스트레스 받지 않은 세포 스트레스 받은 세포 (조사) 조사 + 플라바그룸® 조사 + 플라벤저®
MTT 100 76% 88% 92%
IL1 베타 (pg/mL) 76 179 125 97
IL6 (pg/mL) 379 649 452 426
IL8 (pg/mL) 275 395 312 294
TNF 알파 (pg/mL) 53 152 105 89
본 발명의 방법은 스트레스(여기서는 태양광선의 조사)가 전-염증성(pro-inflammatory) 인터루킨의 합성을 증가시킬 뿐만 아니라 세포의 생존력을 감소시킨다는 것을 이해할 수 있게 한다. 그러므로 올바르게 선별된 활성원을 사용함으로써 전-염증성 분자의 합성을 제한하는 효과가 있다. 선별된 활성원 중에서, 두 가지, 플라바그룸® 및 플라벤저®가 이러한 두 지표에 대한 기준치를 복구시키는 데에 효과적임을 알 수 있다.
실시예 9: 재건된 피부 상에 UVB를 조사하는 물리적 스트레스에 대한 연 구, 활성원의 효능 조사 및 실시간 RT-PCR을 이용하여 수행한 분석
재건된 피부는 실시예 6에서 묘사한 프로토콜에 따라 제조되었다.
<<스트레스 받은 세포>>를 포함하는 시료의 반에 50 mJ/㎠의 비율로 UVB를 조사하였다. <<기준 세포>>를 포함하는 다른 시료들은 같은 조건 하에서 실온에 보관하였다. 그 다음 상기 시료들은 활성원을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 24시간 동안 추가적으로 더 배양하였다(1 및 3%의 플라벤저®, 즉 아실레이트 쿠에르시틴, 프랑스 꼴레띠까사).
실험의 마지막에, 트로포엘라스틴 mRNA, 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐의 함량을 실시간 RT-PCR 기술로 측정하였다. 이를 위하여, 트로포엘라스틴, 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐(각각, 센스 18/안티센스 19 및 센스 18/안티센스 20)의 특이 단편을 증폭할 수 있는 한 쌍의 프라이머와 액틴 시퀀스 프라이머(541 쌍의 염기)가 사용되었다. 공급업체의 프로토콜에 따라 트리리에이전트®(시그마사)에서 추출하고 RNA를 정제한 후, RT-PCR의 반응은 <<옵티콘(Opticon)>> 시스템(MJ 리서치사)의 도움으로 정량적인 실시간 RT-PCR에 의해 수행되었다.
COLL1 센스 CAGAGGGAAGCCGCAAGA
COLL1 안티센스 CTGGCCGCCATACTCGAAC
COLL3 센스 AAGGAGAGCCCGGACCAC
COLL3 안티센스 GGACCTCCAGGGACGCCATC
엘라스틴 센스 CCTTCCCCGCAGTTACCTTTC
엘라스틴 안티센스 GCACGCCACCTGGGTATACAC
액틴 센스 GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
액틴 안티센스 CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
각 시료를 위한, 웰 안으로 주입된 반응 혼합물(50㎕)은 다음과 같다:
- 5ng/㎕ 농도의 RNA 10㎕
- 사용된 다양한 표지(labelers)의 프라이머
- 반응 혼합물 {퀴아겐(Qiagen) - 5mM MgCl2를 포함하는 25㎕의 2×쿠안티텍트 에스와이비알 그린 RT-PCR 마스터 믹스(2×QuantiTect SYBR Green RT-PCR master mix) + 0.5㎕의 쿠안티텍트 RT 믹스(QuantiTect RT mix)}, 연신 단계(elongation step) 동안에 DNA 이중 스트랜드 내에 그 자체로 삽입된 SYBR 그린 I 표지.
RT-PCR의 조건은 하기와 같다:
- 역전사: 30분, 50℃
- PCR 반응: [94℃에서 15초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초], 50 주기(cycles)
오염이 없음과 증폭된 산물의 순도는 증폭된 PCR 산물의 융해곡선으로 증명되었다. 이중 피크 또는 비정상적인 융해온도를 가지는 산물은 제거되었다.
분석 및 계산 방법:
증폭된 DNA내에서 형광성의 함입(incorporation)은 PCR 주기 동안 계속적으로 계산되었다. 이러한 시스템은 PCR 주기에 대한 넘버의 기능으로서 형광성 측성 곡선을 얻는 것을 가능하게 하며 따라서, 증폭된 DNA의 상대적인 양을 계산할 수 있게 된다.
재건된 피부내에 존재하는 세포 개체수(cell population)를 세기 위하여, 모든 결과는 하우스키핑(housekeeping) 유전자로서 사용되는 시그날 <<액틴>>을 고려하였다.
실험에 따라서, C(T){= 주기 역치(cycle threshold)}의 측정된 역치값은 0.05 내지 0.01의 범위의 T를 위해 고정되었으며 그 다음 측정의 임의 단위(unit)가 하기 식에 따라 각 유전자에 대하여 계산되었다:
S유전자 <<X>> = 107 ×(1/2)C(T)유전자 <<X>>
C(T)유전자 <<X>>는 유전자 <<X>>의 C(T) (주기 역치)의 측정된 역치값을 의미한다.
중요한 유전자의 값은 하기의 비율의 계산하여 시그날 <<액틴>>로 고려하였 다:
R = S유전자 <<X>> / 색틴(Sactin).
이러한 비율을 처리된 시료 및 처리되지 않은 시료 간에 비교하였다.
스트레스 받지 않은 세포 스트레스 받은 세포(조사) 조사 + 플라벤저® 1% 조사 + 플라벤저® 3%
콜라겐 I 0.86 1.08 0.94 0.92
콜라겐 III 1.20 1.47 1.37 1.26
엘라스틴 4.20 5.2 4.87 4.61
본 발명의 방법은 스트레스(여기서는 UVB의 조사)가 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III 및 엘라스틴과 같은 세포외 기질의 분자들의 합성을 인코딩(encoding)하는 RNAs를 급속하게 증가하도록 유도한다는 것을 이해할 수 있게 하였다. 활성원 플라벤저®의 적용은 이러한 분자의 합성을 사용량-의존적인 방식으로 회복시킴으로써 유도된 UVB 스트레스의 효과를 제한할 수 있다.
실시예 10: 재건된 진피 상에 태양광선을 조사하는 물리적인 스트레스의 연구, 활성원의 선별 및 실시간 복합 RT-PCR 분석
재건된 진피는 실시예 3에서 묘사한 방식으로 3 주간에 걸쳐 제조되었다.
특정의 재건된 진피는 실온에서 보관되었다; 이러한 모델은 <<기준 세포>>로 불리는 세포를 포함한다. 다른 재건된 진피는 태양광선 조사기 선테스트 시피에스+(Suntest CPS+)(ATLAS)를 이용하여 561 KJ/㎡(중앙 유럽에서의 한 시간 평균 노출량에 해당됨)로 조사되었다; 이러한 모델은 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포를 포함한다. 재건된 진피는 활성원(3%)의 존재 하에 또는 부존재 하에 조사된 뒤 24 시간 동안 배양하였다. RNA는 마지막으로 실시예 5에서 묘사한 바와 같이 추출되었다.
잠재적인 TGF 및 콜라겐 타입 I(COL1)의 유전자의 발현은 프라이머{수율, 특이성(specificity) 및 멀티플렉스 적합성(Multiplex compatibility)}의 엄격한 선별(selection) 및 실시간 RT-PCR의 실험조건 최적화(구성성분의 농도, 주기의 지표, 형광성 감지 조건) 후에 실시간 RT-PCR 멀티플렉스에 의해 동시에 분석되었다.
액틴의 가수분해 프로브(probes)(20 내지 30 mer)는 JOE 형광성 리포터(fluorescent reporter)(들뜸 520-방출 548)로 5' 말단에 표지되었으며 탐라 퀀처(TAMRA quencher)(어플라이드 바이오시스템스 - 포스터 시티, 캐나다)에 의해 3' 말단에 표지되었다.
분석되기 위한 유전자의 가수분해 프스브(20 내지 30 mer)는 형광성 리포터 FAM(들뜸 495 - 방출 520)로 5' 말단에 표지되었으며 탐라 퀀처(들뜸 555 - 방출 576 - 어플라이드 바이오시스템스)에 의해 3' 말단에 표지되었다.
TGF 잠재적 센스 AGCGGGAGGAGGGACGAG
TGF 잠재적 안티센스 TGAGGGACGCCGTGTAGG
COL1 센스 CAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTA
COL1 안티센스 CTTGTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA
RT-PCR의 조건은 하기와 같다:
플래티넘 태그(platinum Taq)가 있는 원 스텝 RT-PCR을 위한 수퍼스크립트 키트(Superscript kit){인비트로젠사(Invitrogen)}
ABI PRISM® 7000 시퀀스 디텍션 시스템 (어플라이드 바이오시스템스사)
반응 혼합물:
5 ng/㎕ 농도의 10㎕ RNA
25㎕ 2×리엑션 믹스
10μM 농도의 2.5㎕ 프라이머, 센스 및 안티센스
50mM 농도의 1.8㎕ MgSO4
5mM 농도의 2㎕ dNTP
10μM 농도의 각 유전자 한쌍(액틴/TGFI 및 액틴/콜라겐 I)의 가수분해물 1㎕
1㎕ RT/태그 믹스
50㎕ 워터 큐에스피(qsp)
RT-PCR 프로토콜
RT; 48℃, 30분
RT의 변성 및 95℃에서 5분 동안 중합효소의 활성화
50 주기 : 94℃ 15초 - 60℃ 30초 - 72℃ 30초
결과의 분석(비율 R의 계산 = S유전자 <<X>>/색틴)은 실시예 10에서 묘사한 바와 같이 수행되었다. 활성원의 효과는 콜라겐 타입 I상에서의 직접적 효과 및/또는 리바운드(rebound) 효과(방출된 활성 TGF-β1에 의한)뿐만 아니라 활성원의 태양광선 조사에 의해 유도된 잠재적 TGF의 활성화에 관하여 분석되었다. 몇몇의 중요한 활성원(밀 추출물, 소프트 로에®, 꼴레띠까사)의 결과는 조사되지 않고 활성원으로 처리되지 않은 대조구에 대한 변형을 퍼센트로 표현하였다.
잠재적인 TGF COL1
스트레스 받지 않은 세포 100 100
스트레스 받은 세포(조사) 124 107
본 발명의 방법은 스트레스(여기서는 UV의 조사)가 TGF 베타 및 콜라겐 1의 합성의 증가를 유도한다는 것을 이해할 수 있게 한다. 그러므로, 정확하게 선별된 활성원을 사용함으로써 합성에 대한 이러한 증가를 모방하는 것이 가능하다. 따라서, 여기서는 선별된 두 추출물에 대한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
TGF-잠재적 콜라겐 I
스트레스 받지 않은 세포 스트레스 받은 세포 스트레스 받지 않은 세포 스트레스 받은 세포
밀 추출물 129 187 153 213
소프트 로에 추출물 111 154 99 147
실시예 11: 피부의 항박테리아성 능력의 변형 조사를 위한 <<스트레스 받은 세포>> 및 <<기준 세포>>를 포함하는 재건된 진피 및 이의 단분자층에서의 배양
항생의 펩타이드는 박테리아, 진균류 또는 바이러스와 같은 미생물의 세포막을 삼투성이 있게 함으로써 이들 미생물을 파괴할 수 있는 작은 크기(10 내지 50 아미노산)의 분자이다. 대부분의 항생 펩타이드는 첫번째 면역 장벽의 압도적인 역할을 하는 동물의 상피 조직에서 발견된다. 인간에 대하여 더욱 상세하게는, 이들 펩타이드는 피부 및 점액질 막에서 뿐만 아니라 위장 및 호흡기 내에서 증명할 수 있다. 디펜신(defensins)은 가장 많이 연구하는 항균성의 펩타이드 클래스(class)를 구성한다. 디펜신의 두 클래스는 α-디펜신(α-defensins)(6개의 대표적 예), 및 세 가지 형태, hBD1, hBD2 및 hBD3(1, 2 및 3의 인간 β-디펜신)로 존재하는 β-디펜신으로 구분된다.
미생물학적 공격(지질다당류 또는 LPS, TNF 알파, 인터페론 감마, 등...)을 모방하는 스트레스 하에서, 세포는 방어의 수단으로써 이러한 분자들을 합성할 수 있다.
이 점을 주장하기 위하여, 각질형성세포를 단분자층에서, 동일한 포피 생검으로부터 추출한 세포로부터 제조된 재건된 표피의 형태로 배양하였다. 표준의 인간 각질형성세포는 혈청을 제외하고 칼슘을 풍부히 첨가한(최종 농도 1.7 mM) 용액을 배양액으로 하여 96-웰 배양 플레이트 상에서 단분자층으로 배양되었다.
80%의 합류점에서, 세포는 화학적 스트레스, 즉 TNFα(100ng/mL) 또는 IFNγ(100 ng/mL)와 같은 미생물학적 공격을 모방하는 분자들에 접촉하여 16 시간 동안 놓아 두었다. 스트레스 받지 않은, 즉 미생물학적 공격을 모방하는 화학적 물질과 접촉하여 놓아 두지 않은 각질형성세포를 재건된 표피의 모델에서 사용하였다.
16 시간 후에, 상청액을 수집하고 세포는 PBS로 헹군 후 -80℃에서 동결건조되었다.
전체 RNAs를 실리카 컬럼 상에서 96-웰 플루오 추출 키트를 이용하여 추출하고 260 및 280 nm에서 96-웰 분광 광도계로 측정하였다. RNAs는 5 ng/㎕로 희석하였다.
상기 96 웰 안에서 액틴, hBD2 및 hBD3의 RNA(초기) 50ng을 취하여 원-스텝의 정성적인 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머들은 0.5μM의 농도로 사용되었으며 문헌을 참고하였다: hBD2센스: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3'; hBD2안티센스: 5'-GGAGCCCTTTCTGAATC CGCA-3' (Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387: 861}; hBD3센스: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', hBD3 안티센스: 5'-CTTCGGCAGCATT TTCGGCCA-3'; 액틴센스: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', 액틴 안티센스: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. et al., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic. J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
시료들을 서모사이클러(thermocycler) 안에 넣어 일반적인 증폭 프로그램을 실시하였다: 50℃, 30분; 94℃, 2분; (94℃, 30초; 60℃, 30초; 68℃, 30초) 디펜신에 대하여는 32 주기 및 액틴에 대하여는 30 주기; 72℃, 10분; 14℃, 무한대.
증폭 후에, 산물(product)은 3㎕의 액틴 증폭 산물 + 6㎕의 hBD2 증폭 산물 + 6㎕의 hBD3 증폭 산물의 비율로 혼합되었다. 충전제 완충액 및 물의 혼합물(2/3) 5㎕를 첨가하고 마지막 20㎕를 미리 부운(pre-poured) 2% 아가로스 겔 상에 침전시켰다. 시료들을 30분 동안 마이그레이트(migrate) 시켰으며 밴드는 흑색 챔버의 UV 하에서 가시화하였고 디지털 방식으로 사진을 찍었다.
선별 방법의 2 번째 단계
실시예 1에서 묘사한 바와 같이 추출한, 1 내지 2×106개의 포피 각질형성세포를, 층 아래에 섬유아세포 영양소를 미리 접종한 보이든 챔버-타입 인서트(0.4㎛의 공극 및 10mm의 직경을 가진 막)에 접종하고, 10% 하이클론 II 송아지 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-인산염, 10ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 IU/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 ×10-9M 트리요도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 IU/mL 페니실린, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 20㎍/mL 젠타마이신으로 보충한, DMEM-글루타맥스/햄 F-12(비율 3/1 v/v) 배양액에서 3일 동안 액침배양하였다.
각질형성세포의 배양액 은 그 후, 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요도티로닌 및 우물린을 제외한, 액침 배양을 위해 사용하였던 동일한 배양액에 11일 동안 공기-액체 계면 상에 놓아 두었다.
실험의 마지막에, 재건된 표피는 하기 방식으로 처리되었다:
- 1 시료는 아무런 처리도 하지 않았다(기준 세포를 포함하는 모델 = 음성적 대조구);
- 1 시료는 활성원은 처리하지 않고 배양의 끝에 다양한 타입의 스트레스를 처리하였다(스트레스 받은 세포를 포함하는 모델 = 양성적 대조구), 예를 들면 100 ng/mL의 TNFα, 100 ng/mL의 IFNγ의 존재 하에서 배양;
- 1 시료는 활성원을 처리한(24시간 동안 1%의 활성원을 첨가하여 배양) 다음 스트레스를 가하였다(양성적 대조구와 동일한 스트레스).
재건된 표피는 그 다음 활성원의 존재 또는 부존재 하에서 24시간 동안 추가적으로 배양하고 PBS로 헹군 후 전체 RNA를 추출하여 260 및 280nm에서 96-웰 분광광도계로 측정하였다. RNA는 5ng/㎕로 희석한 다음 상기에서 묘사한 바와 같이 처리하였다.
분석
겔의 사진은 밴드의 세기(intensity)를 정량할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어에 의해 분석되었다. hBD2/액틴 및 hBD3/액틴 밴드의 세기 비율은 한편으로는 스트레스 받지 않은 조건에서 단분자층 모델 및 3차원적 모델(재건된 표피) 간에 비교하였으며, 다른 한편으로는 스트레스(TNFα 또는 IFNγ로 처리한 세포)의 영향을 비교하였다.
스트레스 받지 않은 기준 세포를 사용한 모델들인, 단분자층 모델 및 3차원적 재건 표피 모델에서의 hBD2 및 hBD3의 발현:
hBD2 hBD3
단분자층의 스트레스 받지 않은 세포 0.318 0
3차원적 재건 표피의 스트레스 받지 않은 세포 0.525 0.015
단분자층 및 3차원적 재건 표피 모델에서의 hBD2 및 hBD3의 발현에 대한 스트레스의 영향:
hBD2 hBD3
단분자층의 TNFα에 의해 스트레스 받은 세포 1.240 0.266
재건된 표피의 TNFα에 의해 스트레스 받은 세포 1.617 0.546
단분자층의 IFNγ에 의해 스트레스 받은 세포 0.450 0.370
재건된 표피의 IFNγ에 의해 스트레스 받은 세포 0.581 0.492
미생물학적 공격을 모방한 스트레스를 받는 동안, 피부의 세포에 의한 디펜신의 합성 반응은 방어 반응(defense response)이다. 그러므로 화학적 공격의 발생없이 피부 디펜신을 자극할 수 있는 활성원을 조사할 수 있게 된다.
본 발명 생물학적 지표의 변형을 동정하는 방법은
a) <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 스트레스를 겪은 생체 세포,
b) <<기준 세포>>로 불리는 상기와 동일한 스트레스를 겪지 않은 생체 세포, 및
c) 삼차원적 조직 모델내에서 사용되어지는 상기 세포의 두 부류 중 적어도 하나의 세포에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 비교분석을 포함함으로써 상기 스트레스에 의하여 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형을 동정할 수 있게 된다.
본 발명은 더 나아가 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시키거나 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법과, 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제공하기 위한 상기 방법에 의해 선별된 활성물질의 용도를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Claims (35)

  1. 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 스트레스로 인해 변형되는 하나 이상의 생물학적 지표를 동정하기 위한 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법:
    a) 스트레스 받은 세포(stressed cells)로 불리는 스트레스를 겪은 생체피부세포와 기준 세포(reference cells)로 불리는 상기 스트레스를 겪지 않은 생체피부세포에 각각에 대한 전사 프로필 분석 또는 유전자 프로필 분석을 실시하고 비교하는 단계,
    단, 상기 세포들은 섬유아세포를 포함하는 삼차원적 모델에서 이용됨;
    b) 상기 비교분석을 통해 스트레스 받은 세포에서 하나 이상의 생물학적 지표의 변형을 동정하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기준 세포와 스트레스 받은 세포는 삼차원적 조직 모델에서 사용됨을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  3. 제 1항에 있어서, 스트레스를 받는 동안 변형되어진 상기 생물학적 지표는 스트레스 받은 세포로 불리는 세포의 대사(metabolism) 및 기준 세포로 불리는 세포의 대사 간에 생긴 하나 이상의 차이에 의해 정의되어짐을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계는
    a1) 삼차원적인 조직 모델 내에 기준 세포로 불리는 피부세포의 하나 또는 그 이상의 타입을 접종하는 단계; 및
    a2) 상기 모델에 스트레스를 가하여 스트레스를 받은 피부세포를 스트레스 받은 세포로 명명하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계는
    a1) 생체피부세포의 하나 또는 그 이상의 타입에 스트레스를 가하여 스트레스를 받은 피부세포를 스트레스 받은 세포로 명명하는 단계; 및
    a2) 삼차원적인 조직 모델 내에서 상기 스트레스 받은 세포를 사용하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  6. 제 1항에 있어서, 스트레스는 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선 중에서 선택되는 물리적 스트레스임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  7. 제 1항에 있어서, 스트레스는 물리화학적 스트레스 또는 생물학적 스트레스임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  8. 제 1항에 있어서, 스트레스는 기계적 스트레스임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  9. 제 1항에 있어서, 스트레스 받은 세포는
    태양에 노출된 영역에서 채취한 생검으로부터 유래된 피부세포; 또는
    UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 스트레스에 의해 스트레스를 받은 피부세포임을 특징으로 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  10. 제 1항에 있어서, 스트레스 받은 세포는
    태양에 노출된 영역에서 채취한 생검으로 부터 유래된 피부세포; 또는
    물리적 스트레스 또는 생물학적 스트레스에 의해 스트레스 받은 피부세포임을 특징으로 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  11. 제 1항에 있어서, 스트레스 받은 세포는
    태양에 노출된 영역에서 채취한 생검으로 부터 유래된 피부세포; 또는
    기계적 스트레스에 의해 스트레스 받은 피부세포임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  12. 제 1항에 있어서, 기준 세포는 태양광선에 의해 직접적으로 스트레스 받지 않은 생검 상에서 제거된 피부세포; 또는
    UVA, UVB, 태양광선 타입 또는 자기장 유래의 방사선의 물리적 스트레스에 의해 스트레스 받지 않은 피부세포; 또는
    화학적 스트레스를 받지 않은 피부세포; 또는
    생물학적 스트레스를 받지 않은 피부세포; 또는
    기계적 스트레스에 의해 스트레스 받지 않은 피부세포임을 특징으로 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 스트레스 받은 세포는 한 명 이상의 인간 또는 하나 이상의 동물로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 분석은
    DNA 어레이, 복합 PCR(PCR-multiplex), PCR 또는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)을 포함하는 유전자 프로필 분석; 및
    RNA 어레이, cDNA 어레이, 역전사 복합 PCR(reverse polymerase chain reaction multiplex), 역전사 PCR 또는 실시간 역전사 PCR(real time RT-PCR)을 포함하는 전사 프로필의 분석으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 분석 방법을 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  15. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은 부분적 또는 전체적으로 세포 대사를 유지하고 있는 조건하에서 배양 또는 보존됨을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  16. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은 각질형성세포(keratonocytes)를 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 모델은 정상, 건강 또는 병원성 인간 또는 동물세포; 또는 세포주로 부터 유래된 인간 또는 동물세포를 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  18. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은
    피부의 경우 진피라 불리고 점액질 막의 경우 융모막이라 불리는 스트로마세포(stromal cells)를 함유하는 결합 기질 모델;
    상피 세포로 구성된 상피 모델;
    각질형성세포(keratonocytes)로 구성된 표피 모델;
    표피 및 진피로 구성된 피부 모델; 및
    상피 및 융모막으로 구성된 점액질막 모델로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  19. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은
    - 세포 배양을 포함한 성형; 및 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르(polycarbonate) 또는 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산(polyethylene terephthalate; PET)의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막(AnoporeTM inorgarnic membrane)을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소(cellulose acetate) 또는 셀룰로오스에스테르(cellulose ester)(HATF) 막, 반투과성 바이오포어-시엠(Biopore-CMTM) 막, 반투과성 폴리에스터 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양세포 또는 섬유아세포를 함유하는 비활성 지지체;
    - 하이알루론산(Hyaluronic Acid), 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브린(fibrin)에 근거한 종양세포 또는 섬유아세포를 함유하는 겔 또는 막; 및
    - 하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans) 또는 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로 제조되어지고 종양세포 또는 섬유아세포를 함유하는 다공성 기질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 기질 지지체(matrix support)를 포함하는 결합 기질(진피 또는 융모막)의 조직 모델임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  20. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은
    - 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르(polycarbonate) 또는 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산(polyethylene terephthalate; PET)의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막(AnoporeTM inorgarnic membrane)을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소(cellulose acetate) 또는 셀룰로오스에스테르(cellulose ester)(HATF) 막, 반투과성 바이오포어-시엠(Biopore-CMTM) 막, 반투과성 폴리에스터 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 미리 종양세포 또는 섬유아세포와 함께 그 후 상피세포 또는 각질형성세포와 함께 접종되거나 접종되지 않은 비활성 지지체; 및
    - 하이알루론산(Hyaluronic Acid), 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브린(fibrin)에 근거한, 미리 종양세포 또는 섬유아세포와 함께 그 후 상피세포 또는 각질형성세포와 함께 접종된 필름 또는 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된 기질 지지체를 포함하는 표피 조직 모델 또는 상피 조직 모델임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상피세포, 색소세포(pigmentary cells), 면역감응세포(immunocompetent cells) 및 신경세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 세포를 상피 부분에 추가적으로 도입함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  22. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은 다음의 그룹에서 선택되는 진피 또는 융모막 기질 지지체를 포함하는 재건된 피부 또는 점액질 막 조직 모델임을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법:
    - 반투과성 니트로셀룰로오스 막, 반투과성 나일론 막, 테플론 막 또는 테플론 스폰지, 폴리탄산에스테르(polycarbonate) 또는 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 또는 폴리에틸렌 테레프탈염산(polyethylene terephthalate; PET)의 반투과성 막, 반투과성 아노포어 무기성 막(AnoporeTM inorgarnic membrane)을 포함하는 반투과성 합성 막, 초산 섬유소(cellulose acetate) 또는 셀룰로오스에스테르(cellulose ester)(HATF) 막, 반투과성 바이오포어-시엠(Biopore-CMTM) 막, 반투과성 폴리에스터 막으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 종양세포 또는 섬유아세포를 함유하는 비활성 지지체;
    - 콜라겐, 하이알루론산(Hyaluronic Acid), 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브린(fibrin)에 근거한 종양세포 또는 섬유아세포를 함유하는 겔;
    - 하나 또는 그 이상의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans) 또는 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로 제조되고, 기질세포 또는 섬유아세포를 포함하는 다공성 기질;
    - 인간 또는 동물의 탈표피화된(de-epidermisized) 진피 또는 죽은 진피; 및
    - 재건된 점액질 막을 얻기 위해 상피세포를 파종하거나 재건피부를 얻기 위해 각질형성세포를 파종한 기질 지지체.
  23. 제 2항에 있어서, 상기 조직 모델은 상피 세포(EC; endothelial cells) 또는 면역 세포를 포함하는 피부 부속물이 추가된 모델을 포함함을 특징으로 하는 생체피부세포의 시험관내에서의 선별방법.
  24. 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선 중에서 선택되는 물리적 스트레스; 물리화학적 스트레스; 생물학적 스트레스 또는 기계적 스트레스를 받는 동안 변형된 하나 이상의 생물학적 지표를 역전시키거나 억제할 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성 물질을 선별하는 방법:
    a) 상기 잠정적 활성물질을 상기에서 정의된 스트레스를 가하면서 상기 잠정적 활성물질이 활동할 수 있을 만큼 충분한 시간 동안 제1항에 정의된 조직모델에 파종된 제1항에 정의된 기준세포와 접촉시키는 단계,
    b) 상기 세포의 세포 대사 동안 상기 물질의 작용을 연구하기 위해 전사체 분석 또는 유전체 분석을 부분적 또는 전체적으로 실시하는 단계,
    c) 잠정적 활성물질을 첨가한 상기 세포의 세포 대사와 상기 물질을 처리하지 않은 대조군 세포의 대사와 비교하는 단계, 및
    d) 상기 잠정적 활성물질의 활성 여부를 동정하는 단계.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. a) 제 2항에서 정의되어진 조직 모델내에 접종된, 변형된 생물학적 지표를 가지는, UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선 중에서 선택되는 물리적 스트레스; 물리화학적 스트레스; 생물학적 스트레스 또는 기계적 스트레스에 의해 스트레스를 받은 인간 또는 동물 유래의 피부세포를, 하나 이상의 활성물질의 존재하에, 상기 잠재적 활성물질이 상기 피부세포의 세포 대사에 대하여 종국에는 활성화되기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계;
    b) a) 단계에서 배양된 스트레스 받은 세포의 부분적 또는 완전한 전사 또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
    c) b) 단계에서 수행되어진 분석을, 대조구 세포로 불리는 상기 잠재적 활성물질의 부존재하에 배양되어진 생체 피부세포의 부분적 또는 완전한 전사 또는 유전자 분석을 비교하는 단계; 및
    d) c) 단계에서 수행되어진 분석을 비교하여 종국적으로 스트레스에 의해 변형된 하나 이상의 생물학적 지표를 역전할 수 있는 하나 이상의 활성물질을 동정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 스트레스를 받는 동안 변형된 하나 이상의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법.
  28. a) 제 1항에서 정의된 조직 모델내에 접종되어진 잠재적 활성물질을 제 1항에서 정의된 기준 세포와 접촉하도록 상기 잠재적 활성물질이 활성화될 수 있는 충분한 시간 동안 놓아 두는 단계 및 UVA, UVB, 일광, 적외선, 근적외선, 열, 자기장, 마이크로파 및 휴대폰 전파를 포함하는 헤르쯔 전파, 및 베타, 감마 및 X 선을 포함하는 전리 방사선 중에서 선택되는 물리적 스트레스; 물리화학적 스트레스; 생물학적 스트레스 또는 기계적 스트레스를 적용하는 단계;
    b) a) 단계에서 배양된 스트레스 받은 세포의 부분적 또는 완전한 전사 또는 유전자 분석을 실시하는 단계;
    c) b) 단계에서 수행되어진 분석을, 대조구 세포로 불리는 상기 잠재적 활성물질의 부존재하에 배양되어진 생체 피부 세포의 부분적 또는 완전한 전사 또는 유전자 분석을 비교하는 단계; 및
    d) c) 단계에서 수행되어진 분석을 비교하여 종국적으로 스트레스에 의해 변형된 하나 이상의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 하나 이상의 활성물질을 동정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 스트레스를 받는 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법.
  29. 물리적, 화학적 또는 생물학적 스트레스를 받는 동안 변형되어짐에 따라 동정되는 생물학적 지표를 역전하는 것, 또는 이들의 변형을 억제하는 것이 가능하고, 상기 지표는 <<스트레스 받은 세포>>로 불리는 세포를 사용하는 세포 모델과, <<기준 세포>>로 불리는 세포를 사용하는 피부세포 모델을 서로 비교함으로써 동정되고, 상기 모델은 섬유아세포 또는 각질형성세포를 포함하는 조직 모델이며, 제24항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 의해 선별됨을 특징으로 하는 활성물질.
  30. 제29항에 있어서, 상기 활성물질은 헤스페리틴 라우레이트, 쿠에르시틴 카프릴레이트 또는 밀 추출물 중 어느 하나임을 특징으로 하는 활성물질.
  31. 쿠에르시틴 카프릴레이트 또는 헤스페리틴 라우레이트를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
  32. 쿠에르시틴 카프릴레이트 또는 헤스페리틴 라우레이트를 유효성분으로 포함하는 피부 세포에 대한 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물.
  33. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제조하는 방법:
    제24항, 제27항 내지 제28항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 의해 화장료 조성물에서 이용될 수 있는 활성 물질을 선별하는 단계, 및
    상기 단계에서 선별된 활성 물질과 화장학적으로 허용 가능한 담체를 혼합하는 단계.
  34. 헤스페리틴 라우레이트 또는 쿠에르시틴 카프릴레이트를 유효성분으로 포함하는 태양광선 조사에 의한 변형 억제용 화장료 조성물.
  35. 쿠에르시틴 카프릴레이트를 유효성분으로 포함하는 UVB 조사에 의한 변형 억제용 화장료 조성물.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006006249A (ja) * 2004-06-28 2006-01-12 Hiroshima Univ 羊膜由来細胞の培養方法及びその利用
DE102004061289B4 (de) * 2004-12-20 2009-04-02 Euroderm Gmbh Testkit mit Testzellen und Immunzellen sowie Herstellverfahren hierfür
EP1865072A4 (en) * 2005-03-03 2009-07-22 Sapporo Breweries METHOD FOR CONTROLLING THE AROMA OF AN ALCOHOLIC BEVERAGE
US20070072175A1 (en) * 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
EP1736780A1 (en) 2005-06-24 2006-12-27 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and means for detecting and/or quantifying hierarchical molecular change of a cell in response to an external stimulus
JP4850001B2 (ja) * 2005-09-05 2012-01-11 プリマハム株式会社 新規ストレスバイオマーカー及びその用途
JP4734619B2 (ja) * 2006-01-27 2011-07-27 プリマハム株式会社 新規ストレスバイオマーカー及びその用途
JP5229789B2 (ja) * 2007-02-27 2013-07-03 プリマハム株式会社 新規ストレスバイオマーカー及びその用途
CN102893160B (zh) 2010-05-17 2015-10-14 宝洁公司 经由评估蛋白质片段检测并展示毛发损伤的系统和方法
GB2485816A (en) * 2010-11-25 2012-05-30 Alcyomics Ltd In vitro model for the prediction of immunogenicity, hypersensitivity or allergenicity
BR112015003717A2 (pt) * 2012-08-21 2016-02-23 Ajinomoto Kk método para a identificação de um metabólito altamente requerido por um animal industrial, e, método para a produção de uma composição de alimentação
EP2944958A1 (en) * 2014-04-04 2015-11-18 Techno-Path (Distribution) A method of predicting phenotypic instability in a cell
CN112074596A (zh) * 2018-02-09 2020-12-11 亥姆霍兹慕尼黑-德国健康与环境研究中心(有限公司) 监测疤痕形成的装置和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002015700A1 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy
US20020102726A1 (en) * 1998-07-13 2002-08-01 Allen-Hoffmann B. Lynn Immortalized human keratinocyte cell line

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5834477B2 (ja) * 1979-05-25 1983-07-27 三省製薬株式会社 クエルセチンの脂肪酸エステル
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5266480A (en) * 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5700450A (en) * 1988-03-30 1997-12-23 The Trustees Of Boston University Methods for enhancing melanin synthesis in melanocytes using diacyglycerols and uses thereof
DE19508608B4 (de) * 1994-03-23 2006-06-29 Merck Patent Gmbh Lichtbeständiges kosmetisches Mittel enthaltend Tetraalkylquercetin sowie Tetraalkylquercetine als solche
US5650279A (en) * 1995-01-27 1997-07-22 Allergan, Inc. Gene sequence induced in skin by retinoids
US6197575B1 (en) * 1998-03-18 2001-03-06 Massachusetts Institute Of Technology Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays
US6323219B1 (en) * 1998-04-02 2001-11-27 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods for treating immunomediated inflammatory disorders
FR2778663B1 (fr) * 1998-05-15 2001-05-18 Coletica Nouveaux esters de flavonoides,leur utilisation en cosmetique, dermopharmacie, en pharmacie et en agro-alimentaire
WO1999064615A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Valentis, Inc. Formulations for electroporation
FR2792650B1 (fr) * 1999-04-20 2003-02-28 Oreal Equivalent de peau agee, son procede de preparation et son utilisation
US6426362B1 (en) * 1999-10-08 2002-07-30 Galileo Laboratories, Inc. Formulations of tocopherols and methods of making and using them
DE10100122A1 (de) * 2001-01-03 2002-07-11 Henkel Kgaa Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro
EP1404809B1 (en) * 2001-03-02 2013-12-11 Stratatech Corporation Improved skin substitutes and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102726A1 (en) * 1998-07-13 2002-08-01 Allen-Hoffmann B. Lynn Immortalized human keratinocyte cell line
WO2002015700A1 (en) * 2000-08-24 2002-02-28 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bernard FX et al, Exp Dermatol. 2002 Feb;11(1):59-74 *
Corsini E et al, Toxicol In Vitro. 2002 Aug;16(4):427-31 *
Falanga V et al, J Invest Dermatol. 2002 Sep;119(3):653-60 *
Fletcher ST et al, Toxicol In Vitro. 2001 Aug-Oct;15(4-5):393-8 *
Vladutiu GD et al, Life Sci. 1986 Aug 25;39(8):717-26.] *

Also Published As

Publication number Publication date
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