ES2331165A1 - Un procedimiento de identificacion de una modificacion final de al menos un parametro biologico usando celulas vivas sujetas a estres y celulas vivas no sujetas a este mismo estres. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de laurato de hesperitina o caprilato de quercetina para fabricar una composición cosmética o farmacéutica de aplicación tópica capaz de prevenir o limitar la modificación de parámetros biológicos modificados por la exposición a la irradiación solar.
Description
Uso de un compuesto derivado de hesperitina o
quercetina para limitar o prevenir modificaciones en parámetros
biológicos debidas a la radiación solar.
La presente invención trata esencialmente del
uso de principios activos como son el laurato de hesperitina o de
caprilato de quercetina para fabricar una composición cosmética o
farmacológica para limitar y/o prevenir la modificación de al menos
un parámetro biológico modificado en células vivas sujetas o no a
estrés.
La radiación solar está compuesta por
radiaciones electromagnéticas incluyendo un 56% de radiación
infrarroja (longitud de onda de 5.000 a 800 nm) que genera calor,
un 39% de luz visible (entre 800 y 400 nm) y un 5% de ultravioletas
A, B, C (entre 400 y 190 nm), incluyendo cerca de un 4,9% de UVA y
0,1% de UVB + UVC.
- Los UVC, que son muy dañinos, en general, son
filtrados por la capa de ozono.
- Los UVB son parcialmente retenidos cuando
atraviesan la atmósfera y el vidrio. Llegan a la epidermis, pero
son retenidos antes de la dermis. Son los responsables de la
formación de una quemadura solar caracterizada por la presencia de
células quemadas por el sol, que son queratinocitos, que han
iniciado un proceso de apoptosis debido a las lesiones del ADN de
sus núcleos. Su número será tan alto como alta sea la dosis de UVB
recibida. De hecho, un proceso natural de defensa permite la
reparación o eliminación de las células dañadas, sin embargo, el
fallo de este sistema por saturación o defecto genético juega un
papel fundamental en la aparición de cánceres de piel.
- Los UVA atraviesan la atmósfera fácilmente,
tanto en verano como en invierno, penetran la dermis y la epidermis
y, aunque son menos dañinos que los UVB, sin embargo, son
responsables de daños debido a las cantidades recibidas. Los UVA no
producen, o producen muy pocas, células quemadas por el sol y pueden
dañar el ADN celular, así como lípidos y proteínas celulares a
través de la formación de radicales libres. Los UVA son
responsables de un envejecimiento acelerado de la piel con un
aumento de la degradación del colágeno y de las fibras elásticas,
así como de otros constituyentes de la secuencia extracelular de la
dermis. Además, muchos trabajos han demostrado los efectos
inmunosupresores de los UVA a través de las células epidérmicas de
Langerhans que, tras la irradiación, interaccionan con los
linfocitos T y tienen un efecto sistémico a través de las citoquinas
y de los neuromediadores producidos en cascada por las células
epiteliales y por las fibras nerviosas (Meunier L., Eur. J.
Dermatol. 1999, 9: 269-271). A largo plazo, el
riesgo de cáncer de piel aumenta, las células precancerosas dejan
de ser reconocidas como células extrañas y, por tanto, dejan de ser
eliminadas por el sistema inmune.
Un estudio europeo de Helios (Zanetti R. y col.,
Br. J. Canc. 1996, 73: 1440-1454) muestra la
relación entre la exposición a los rayos UV, el fenotipo de la piel
y los carcinomas, y define la noción de riesgo directo unido a los
rayos UV.
Entre otros daños conocidos y que están
relacionados con las radiaciones, pueden citarse aquellos debidos a
un incremento en la temperatura por los rayos infrarrojos, que
inducen en los melanocitos la producción de proteínas de choque
térmico, así como efectos similares a los efectos inducidos por UVB
(Nakazawa y col., J. Invest. Dermatol. 1998; 110: 972–977);
aquellos debidos a las radiaciones del infrarrojo cercano que
afecta a la viabilidad de las células de la piel (Yoo B.H. y col.,
J. Cosmet. Sci. 2002; 53(3): 175-184);
aquellos debidos a la exposición a la luz visible (repetidas dosis)
que induce una mutagenicidad (Larko O., Lakartidningen 2002,
99(18): 2036-2040); aquellos debidos a las
radiaciones ionizantes que generan ulceraciones y cánceres (Lorette
G., Machet L., Cancer Radiother. 2001, 5(1):
116s-120s) o modificaciones del metabolismo celular
como la síntesis de colágeno de tipo I y III en la piel (Riekki R.,
y col., Arch. Dermatol. Res. 2002, 294(4):
178-184) o incluso modificaciones de la
proliferación y de la diferenciación epidérmica (Siran V. y col.,
Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys 2002, 53(2):
385-393); también aquellos debidos a los efectos
citogenéticos de las microondas (Zotti-Martelli L.,
y col., Mutat. Res. 2000, 472(1-2):
51-58) o a los efectos oncogénicos de la inhibición
de la ruta de las proteínas de choque térmico (HSP70 y HSP27) o por
generación de radicales libres debido a campos electromagnéticos y,
sobre todo, a aquellos generados por los teléfonos móviles (French
P.W. y col., Differenciation 2001 67(4-5):
93-97; Di Carlo y col., J. Cell Biochem. 2002;
84(3): 447-454; Lesczynski D., y col.,
Differenciation 2002; 70(2-3):
102-129; Moustafa Y.M., y col., J. Pharm. Biomed.
Anal. 2001, 26(4): 605-608).
Existen también otros factores tales como
ciertos agentes químicos (peróxido de hidrógeno, óxido nítrico,
metales pesados...) o agentes biológicos (virus, bacterias...)
incluso factores mecánicos (estiramiento, comprensión) que pueden
inducir un estrés celular.
Hasta ahora, todas las funciones celulares,
incluyendo proliferación, diferenciación y muerte celular, que
están controladas por numerosos genes y las rutas de señalización
celular, se analizan ex vivo (biopsia) o in vitro en
cultivos celulares en monocapa, generalmente de fibroblastos,
queratinocitos o melanocitos obtenidos a partir de donantes sanos o
patológicos, o a partir de líneas celulares. Además, no siempre es
posible encontrar datos sobre la expresión y la síntesis celular en
función de un estrés en particular, o los resultados obtenidos in
vitro algunas veces resultan contradictorios con aquello que se
pueden observar in vivo debido a la simplificación de los
modelos usados en la experimentación.
Durante varios años se han desarrollado algunos
modelos celulares tridimensionales para terapia celular, para
ensayos citotóxicos y pruebas de eficacia, alternativos a la
experimentación con animales. Podemos citar modelos de epidermis
(documento EP 0 789 074 A1 de Oreal; A. De Brugerolle de
Fraissinette y col., 1999, Cell Biol. Tox. 15:
121-135) usada para la predicción de la irritación
aguda o crónica de la piel, y también modelos de epitelios
reconstruidos (Schmalz G. y col, Eur. J. Oral. Sci. 2000, 108:
442-448; Nielsen y col., Int. J. Pharm. 2000, 200:
261-270) así como de pieles reconstruidas, pieles
reconstruidas pigmentadas y/o pieles reconstruidas
inmunocompetentes por ejemplo (Regnier M. y col., en Pour la science
(1999) 266: 154-159).
Si hoy en día alguno de estos modelos se usan
ampliamente en las evaluaciones
fármaco-toxicológicos y en los estudios de eficacia
de ingredientes farmacéuticos y cosméticos, los procedimientos de
análisis usados son esencialmente técnicas histológicas combinadas
con el análisis de imagen, el análisis de síntesis metabólica y de
su regulación por análisis electroforético, análisis por
Western-blot, Northern-blot y
RT-PCR. Las técnicas de secuencia de proteínas (o
MAPPing) y de secuencias de ADN, de electroforesis bidimensional o
de determinaciones combinadas de citoquinas
(MAP-citoquina), en particular, no se han aplicado a
estos modelos tridimensionales que se cultivan bajo condiciones de
cultivo estándar, en comparación con las condiciones de cultivo
bajo las cuales estos modelos experimentan un estrés, sea de
naturaleza física, química, biológica o mecánica.
En contraste, estas tecnologías han sido
desarrolladas y usadas en sistemas celulares en monocapa como, por
ejemplo, en el estudio del papel modulador de un estrés por
radiación ultravioleta en melanocitos humanos normales o malignos
(línea celular o melanocitos extraídos de tejido tumoral)(Valerj
C., Grob J.J. y Verrando P., en J. Invest. Dermatol. (2001) 117:
1471-1482).
El procedimiento para identificar una
modificación final de al menos un parámetro biológico comprende los
análisis de proteómica comparada y/o transcriptómica comparada y/o
genómica comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite finalmente identificar al menos un parámetro que se modifica tras dicho estrés.
Este análisis proteómico o transcriptómico o
genómico permite definir dianas de acción para revertir o prevenir
la modificación de al menos un parámetro que se modifica durante el
estrés aplicado.
El objetivo de la presente invención es resolver
el nuevo problema técnico que consiste en proporcionar una
sustancia activa seleccionada por tal procedimiento y su uso para
preparar una composición cosmética o farmacéutica.
En el contexto de esta invención, por "estudio
genómico", los inventores quieren decir: el acto de diseñar una
invención y llevar a cabo el estudio de al menos una parte del
total de los genes de un organismo con la intención de estudiar su
función.
Por "estudio transcriptómico", los
inventores quieren decir: el acto de diseñar una invención y llevar
a cabo el estudio de al menos una parte del total de los ARN
transcritos del genoma.
Por "estudio proteómico", los inventores
quieren decir: el acto de diseñar una invención y llevar a cabo el
estudio de al menos una parte de las proteínas expresadas.
El procedimiento de identificación de una
modificación final de al menos un parámetro biológico, está
caracterizado porque comprende los análisis de proteómica comparada
y/o transcriptómica comparada y/o genómica comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional, que permite finalmente identificar al menos uno parámetro biológico que se modifica tras dicho estrés.
Las células denominadas "células de
referencia" son células que no han sufrido el estrés estudiado.
Será fácil de entender para la persona experta en la técnica que,
con la intención de optimizar la invención descrita, las células de
referencia son células expuestas lo menos posible a cualquier
estrés. Estas células serán, sobre todo, extraídas de biopsias
protegidas, es decir, aquellas que no han sido muy expuestas a
radiaciones solares (mama, abdomen, etc.), o células que no se han
expuesto a estrés de ningún tipo sea cual sea (estrés
físico-químicos, biológico o mecánico).
Las células denominadas células "sometidas a
estrés" son células procedentes de biopsias tomadas en áreas
expuestas al sol (mano, cara, etc.), o células que estén expuestas
a estrés (estrés físico, químico o biológico), incluyendo los
estreses: UVA, UVB, luz solar, infrarrojo, infrarrojo cercano,
térmico, campos magnéticos, radiaciones de ondas hertzianas
incluyendo las microondas y las ondas de los teléfonos móviles,
radiaciones ionizantes incluyendo beta, gamma y rayos X, así como
aquellos sufridos durante una exposición accidental o no accidental
a tal radiación, etc. Las células pueden proceder de varias
biopsias, del mismo donante o de donantes diferentes.
El parámetro biológico corresponde en general
con cualquier modificación de la expresión de un gen, con cualquier
modificación de la secreción de una proteína, o con cualquier
modificación que pueda ser detectada en el metabolismo de la células
de referencia.
El modelo tisular se define como un modelo
tisular, también denominado modelo tridimensional, que puede
sembrarse con células vivas, sobre todo con el objetivo de
reconstituir un tejido de un ser vivo, en particular, el modelo
tisular se define como capaz de ser un modelo de secuencia
conectiva, denominada dermis en el caso de la piel y denominada
corión en el caso de una membrana mucosa, que contiene
principalmente células estromales, un modelo epitelial constituido
principalmente de células epiteliales, un modelo de epidermis
constituido principalmente por queratinocitos, un modelo de piel
constituido por una epidermis y por una dermis, un modelo de
membrana mucosa constituida por un epitelio y un corión, un modelo
de biopsias (o explantes) mantenidas viables, así como los modelos
en monocapa, o en suspensión, haciendo uso de las células presentes
en los modelos descritos anteriormente.
En estos modelos pueden usarse células normales,
sanas o patológicas, o células procedentes de líneas celulares;
estas células pueden ser de origen humano o de origen animal.
Los modelos tisulares definidos anteriormente se
usan, al final del cultivo, para hacer análisis genómicos y
proteómicos, lo cual permite en particular, la selección, la
identificación y la caracterización de dianas potenciales para
luchar contra los efectos del estrés.
Las dianas potenciales se corresponden con los
parámetros biológicos que han de revertirse o cuya modificación ha
de prevenirse.
Tras la definición de las dianas, estos mismos
modelos y procedimientos de detección puede ser usados para la
selección de principios activos cosméticos o farmacéuticos. Estos
mismos modelos y procedimientos de detección puede usarse para
demostrar la eficacia de formulaciones cosméticas o farmacéuticas
que contengan, o no, los activos.
Estos modelos y procedimientos de detección
pueden también usarse para demostrar la toxicidad de activos,
cosmético o farmacéutico, o de formulaciones cosméticas o
farmacéuticas, esta toxicidad es inducida por un estrés, en
particular, por fototoxicidad.
Entre las técnicas analíticas usadas pueden
citarse, en particular, las siguientes:
- -
- para el análisis del perfil proteómico: electroforesis bidimensional y/o secuencias de proteínas y/o citoquinas, y/o determinaciones de ELISA combinadas,
- -
- para el análisis del perfil genómico: secuencias de ADN, y/o reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex), y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR tiempo real),
- -
- para el análisis del perfil transcriptómico: secuencias de ARN, secuencias de ADNc y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa múltiplex (RT-PCR-multiplex) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real).
Un procedimiento de identificación de una
modificación final de al menos un parámetro biológico comprende el
análisis de proteómica comparada y/o transcriptómica comparada y/o
genómica comparada:
- a)
- de células vivas que están sujetas a estrés, denominadas células sometidas a estrés,
- b)
- de células vivas que no están sujetas a ese mismo estrés, denominadas células de referencia,
- c)
- siendo usadas al menos una de estas dos clases de células en un modelo tisular tridimensional que permite finalmente identificar al menos un parámetro que se modifica tras dicho estrés.
Un procedimiento de identificación de una
modificación final de al menos un parámetro biológico,
comprende:
- a)
- el análisis proteómico y/o transcriptómico y/o genómico, parcial o completo, de células vivas que están sujetas a un estrés, denominadas células sometidas a estrés, sembradas en un modelo tisular;
\global\parskip0.950000\baselineskip
- b)
- comparar el análisis llevado a cabo en a) con el análisis proteómico y/o transcriptómico y/o genómico, parcial o completo, de células vivas que no estén sujetas a dicho estrés, denominadas células de referencia; y
- c)
- finalmente identificar al menos un parámetro biológico que se modifica después de dicho estrés.
De forma ventajosa, se usan las células de
referencia y las células sometidas a estrés en un modelo tisular
tridimensional.
De forma ventajosa, dicho parámetro biológico,
que se modifica durante un estrés, se define por al menos una
diferencia entre el metabolismo de las células denominadas células
sometidas a estrés y el metabolismo de las células denominadas
células de referencia.
Según una forma de realización ventajosa, el
paso a) citado anteriormente comprende las siguientes etapas:
- a1)
- exponer uno o más tipos de células a un estrés, de este modo las células serán llamadas células sometidas a estrés:
- a2)
- usar estas células sometidas a estrés, en un modelo celular, es decir, en una monocapa, o en suspensión, y/o modelo tisular, es decir, tridimensional. Células que se someten a un estrés físico, este estrés es seleccionado entre los estreses: UVB, y/o luz solar.
Según una forma de realización ventajosa, las
células de referencia son células obtenido de biopsias que no están
muy sometidas a estrés por la radiación solar como la mama, el
abdomen, el prepucio, o células que no están sometidas a estrés por
un estrés tal como estrés físico por UVB y/o radiación solar
tipo.
De forma ventajosa, dichas células sometidas a
estrés son células de al menos un ser humano o de al menos un
animal.
De forma ventajosa, dicho estudio comprende al
menos un análisis seleccionado entre los siguientes procedimientos
de análisis:
- -
- para el análisis del perfil proteómico: electroforesis bidimensional y/o secuencias de proteínas y/o secuencias de citoquinas, y/o determinaciones de ELISA combinadas,
- -
- para el análisis del perfil genómico: secuencias de ADN, y/o reacción en cadena de la polimerasa multiplex (PCR-multiplex), y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR tiempo real),
- -
- para el análisis del perfil transcriptómico: secuencias de ARN, secuencias de ADNc y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa múltiplex (RT-PCR-multiplex) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y/o transcripción inversa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real).
De forma ventajosa, dicho modelo tisular se
cultiva y/o conserva bajo condiciones que mantengan, al menos
parcialmente, el metabolismo celular.
De forma ventajosa,dicho modelo tisular
comprende por lo menos fibroblastos o queratinocitos.
De forma ventajosa, dicho modelo comprende:
células normales, sanas o patológicas, o células procedentes de
líneas celulares, siendo estas células preferiblemente de origen
humano o animal.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular se
selecciona entre los siguientes modelos: un modelo de secuencia
conectiva, denominada dermis en el caso de la piel o denominada
corión en el caso de una membrana mucosa, que contenga
principalmente células estromales; un modelo de epitelio
constituido principalmente por células epiteliales, uno modelo de
epidermis constituido principalmente por queratinocitos, un modelo
de piel constituido por una epidermis y una dermis, un modelo de
membrana mucosa constituida por un epitelio y un corión.
De forma ventajosa, dicho modelo es un modelo
tisular de secuencia conectiva (dermis o corión) que comprende un
soporte de secuencia preferiblemente seleccionado a partir de:
- -
- un soporte inerte seleccionado entre el grupo consistentes en una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana de nitrocelulosa semipermeable, una membrana de nilón semipermeable, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM, una membrana semipermeable de poliéster, una membrana o una película de ácido poliglicólico. En este grupo, se encuentran por ejemplo los modelos dérmico Skin^{2TM} modelo ZX1100 y Dermagraft® y Transcyte® (Advanced Tissue Sciences);
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- un plástico para cultivo celular tratado (formación de una hoja dérmica: Michel M. y col. en In Vitro Cell. Dev. Biol.-Aminal (1999) 35: 318-326);
- -
- un gel o membrana compuesta por ácido hialurónico (Hyalograft® 3D-Fidia Advanced Biopolymers) y/o en colágeno y/o en fibronectina y/o en fibrina; en este grupo se puede encontrar por ejemplo el modelo dérmico Vitrix^{R} (Organogenesis);
- -
- una membrana porosa, revestida o no revestida, hecha de colágeno capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o, finalmente, chitosan (EP 0 296 078 A1 de CNRS, WO 01/911821 y WO 01/92322 de Coletica); en este grupo, se encuentra el modelo dérmico Mimederm® (Coletica), por ejemplo, estas secuencias de soporte contienen células estromales, fibroblastos en concreto.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular es un
modelo tisular de epidermis o modelo tisular de epitelio que
comprende un soporte de secuencia seleccionado preferiblemente de
entre:
- -
- un soporte inerte seleccionado entre el grupo consistente en una membrana sintética semipermeables, en concreto una membrana semipermeable de nitrocelulosa, una membrana semipermeables de nilón, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeables de policarbonato o polietileno, polipropileno, de tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeables Biopore-CM, una membrana semipermeables de poliester; en este grupo se encuentran los modelos de epidermis y epitelio reconstruidos (Skinethic®) así como los modelos EpiDerm®, EpiAirway®, EpiOccular® (Mattek Corporation);
- -
- una película o una membrana compuesta por ácido hialurónico y/o en colágeno y/o en fibronectina y/o en fibrina. En este grupo, podemos citar, en particular, los modelos Mimetop® (Coletica), Laserskin® (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin® (L'Oreal).
Estos modelos se siembran de antemano con
células estromales, en particular, con fibroblastos, y luego con
células epiteliales y en particular, con queratinocitos.
De forma ventajosa, en la parte epitelial además
de las células epiteliales se introducen células pigmentarias,
células inmunocompetentes, células nerviosas, siendo las células
inmunocompetentes, preferiblemente, células de Langerhans.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular es una
piel reconstruida o un modelo tisular de membrana mucosa que
comprende un soporte de secuencia dérmica o coriónica
preferiblemente seleccionadas de:
- -
- un soporte inerte seleccionada entre el grupo consistente en una membrana sintética semipermeable, en particular, una membrana de nitrocelulosa semipermeable, una membrana de nilón semipermeable, una membrana de teflón o una esponja de teflón, una membrana semipermeable de policarbonato o polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno (PET), una membrana semipermeable inorgánica Anopore, una membrana de acetato de celulosa o de éster de celulosa (HATF), una membrana semipermeable Biopore-CM, una membrana semipermeable de poliéster, conteniendo dicho soporte inerte células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- un gel compuesto de colágeno y/o de ácido hialurónico y/o de fibronectina y/o de fibrina que comprenda células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una secuencia porosa, revestida o no revestida, hecha de colágeno capaz de contener uno o más glicosaminoglicanos y/o, finalmente, chitosan, integrando estas secuencias porosas células estromales, en particular, fibroblastos,
- -
- una dermis desepidermizada o dermis muerta, humana o animal.
En este grupo pueden citarse, en particular, los
modelos Mimeskin® (Coletica), Apligarf® (Organogenesis),
ATS-2000 (CellSystems® Biotechnologie Vertrieb), así
como Skin^{2TM} (ZX1200-1300-2000
-Advanced Tissue Science).
Además, existen otros modelos dedicados a la
terapia tisular que pueden ser objeto de estos estudios. Pueden
citarse los modelos Epidex^{TM} (Modex Therapeutiques), Epibase®
(Laboratoire Genevrier), Epicell^{TM} (Genzyme), Autoderm^{TM} y
Transderm^{TM} (Innogenetics).
Entonces, el soporte de secuencia se siembra con
células epiteliales con el fin de obtener una membrana mucosa
reconstruida o con queratinocitos con el fin de obtener una piel
reconstruida.
De forma ventajosa, dicho modelo tisular usado
comprende un modelo en el que al menos se incorpora un tipo celular
adicional, preferiblemente células endoteliales (CE) y/o células
inmunes como linfocitos, macrófagos, células dendríticas y/o células
adiposas y/o apéndices de la piel tales como vello, pelo, glándulas
sebáceas.
Un procedimiento definido anteriormente permite
llevar a cabo la selección de al menos una sustancia potencialmente
activa capaz de revertir al menos un parámetro biológico que se
modifique durante un estrés según se ha definido antes.
La invención trata del uso de al menos una
sustancia potencialmente activa capaz de proporcionar una
prevención de la modificación de al menos un parámetro biológico
que se modifique durante un estrés como se ha definido
antes.
antes.
La invención trata del uso de una sustancia
activa seleccionada por un procedimiento como se define
anteriormente, para preparar al menos una composición cosmética y/o
farmacéutica.
Según otro aspecto, la invención trata de una
sustancia que es activa en el campo de la cosmética o de la
farmacia y que se seleccione por un procedimiento definido
anteriormente.
Según otro aspecto, la invención trata de una
sustancia activa capaz de revertir un parámetro biológico que se
identifica como modificado durante un estrés físico, químico o
biológico, y/o de prevenir la modificación consecuente, siendo
identificado este parámetro por medio de estudios comparativos
entre los modelos celulares que usan las células denominadas
"células sometidas a estrés" y los modelos celulares que usan
las células denominadas "células de referencia"; siendo al
menos uno de estos modelos un modelo tisular que comprende al menos
fibroblastos o queratinocitos.
Otros objetivos, características y ventajas de
la invención saldrán claramente a la luz en la descripción
explicativa que sigue y que se hace en referencia a los ejemplos
que se dan simplemente como ilustración y que de ninguna manera
limita el alcance de la invención. Los ejemplo constituyen una
parte integral de la presente invención, y cualquier característica
nueva que aparezca con respecto al cualquier estado actual del tema
se reclama como una parte integral de la invención en su función y
en su generalidad. En los ejemplos todos los porcentajes se dan por
peso, la temperatura se da en grados Celsius, la presión es presión
atmosférica, a menos que se indique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las células que se denominan "células de
referencia" son:
- \bullet
- células extraídas de biopsias, de donantes de edad variable, cuyas biopsias no están sometidas a estrés por el sol y obtenidas preferiblemente por cirugía plástica abdominal y mamaria o, finalmente, gingival o vaginal.
Las células que se denominan "células
sometidas a estrés" son:
- \bullet
- células extraídas de biopsias, de donantes de edad variable, cuyas biopsias se obtienen por cirugía plástica de áreas sometidas a estrés solar (cara, cuello, mano).
Los tipos de células obtenidas pueden ser
fibroblastos extraídos por la técnica de explantes o por digestión
enzimática, por ejemplo, con colagenasa, queratinocitos o
melanocitos extraídos tras la disociación enzimática
dermoepidérmica, en particular, con dispasa, termolisina o
tripsina-EDTA.
Tras la extracción, los fibroblastos se
amplifican en medio DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco)/Ham
F-12 glutamax 50/50 volumen/volumen, complementado
con un 10% de suero de ternera, con penicilina a una concentración
final de 100 Ul/mililitro, con gentamicina a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro, con amfotericina B a una concentración
final de 1 microgramo/mililitro. Los fibroblastos se amplifican por
tripsinización tan pronto como se obtiene una confluencia del
90%.
Tras la extracción, los queratinocitos se
amplifican en medio K-SFM (Medio sin suero para
queratinocitos–Invitrogen) que contiene extracto de glándula
pituitaria bovina complementado con penicilina a una concentración
final de 100 Ul/mililitros, con gentamicina a una concentración
final de 1 microgramo/mililitro, con anfotericina B a una
concentración final de 1 microgramo/mililitro. Los queratinocitos se
amplifican por tripsinización tan pronto como se obtiene una
confluencia del 90%.
Tras la extracción, los melanocitos se
amplifican en medio MMK2 (kit de Medio para Melanocitos–Sigma)
complementado con penicilina a una concentración final de 100
Ul/mililitro, con gentamicina a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, con anfotericina B a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro y con geneticina a razón de 100
microgramos/mililitro durante 3 días hasta eliminar los
queratinocitos residuales. El cultivo se continua entonces en el
mismo medio a excepción de la geneticina. Los melanocitos se
amplifican por tripsinización tan pronto como se obtiene una
confluencia del 90%.
\newpage
Ejemplo
2
Se siembran 500.000 fibroblastos obtenidos a
partir de una mezcla de tres biopsias de referencia (biopsia
mamaria), que se amplificaron según se describe en el ejemplo 1, en
un sustrato dérmico compuesto de colágeno que se entrecruza con
difenilfosforil azida, en un medio DMEM-glutamax
complementado con un 10% de suero de ternera, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 nanogramos/mililitro,
con penicilina a una concentración final de 100 Ul/mililitro, con
gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, con
anfotericina B a una concentración final de 1 microgramo/mililitro
durante un periodo de 21 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se siembran 500.000 fibroblastos originados a
partir de una biopsia de referencia(biopsia mamaria), que se
amplifican como se describe en el ejemplo 1, en un sustrato dérmico
compuesto por colágeno entrecruzado con difenilfosforil azida, en
un medio DMEM-glutamax complementado con un 10% de
suero de ternera, con ácido ascórbico–2-fosfato a
una concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de
crecimiento epidérmico a una concentración final de 10
nanogramos/mililitro, con penicilina a una concentración final de
100 Ul/mililitro, con gentamicina a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, con anfotericina B a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro, durante un periodo de 15 días. Entonces
se cultivan durante una semana más en medio sin suero (FBM, Medio
Basal para Fibroblastos-Promocell).
Al final del experimento, las dermis
reconstruidas se lavan con tampón fosfato (PBS) pH 7,4 y entonces
se ponen en placas de Petri pequeñas que contengan 1 ml de PBS a pH
7,4. Algunas muestras se conservan a temperatura ambiente (dermis
reconstruidas denominadas "dermis de referencia"), y otras se
irradian con dosis crecientes
(0-5-10-15-20-25-30-30
J/cm^{2}) de UVA (365 nm).
Entonces, las dermis reconstruidas que
comprenden las células denominadas "células sometidas a
estrés" o "células de referencia" se incuban en un medio sin
suero (FBM, Promocell) durante 24 horas. La viabilidad de las
células en las secuencias se evalúa mediante una prueba con MTT
(metiltiazoltetrazolio) y se expresa como porcentaje del control no
irradiado. Los medios son recogidos, centrifugados y el contenido en
citoquinas se determina por el kit MAP Fluoroquina (R&B
Systems). Brevemente, 50 \mul de los estándar o de las muestras se
pipetean dentro de pocillos identificados. Se añaden en los
pocillos 50 \mul de anticuerpos específicos de las distintas
citoquinas inmovilizados en micropartículas en función de un plan
de placa predefinido. Tras una hora de incubación con agitación
orbital, y la eliminación por lavado de las sustancias no fijadas,
se añaden en los pocillos anticuerpos marcados específicos de las
diferentes citoquinas y se incuban durante 2 horas con agitación
orbital. Tras lavar, las micropartículas se resuspenden en tampón
de lavado, se agitan durante 1 hora con agitación orbital.
Inmediatamente se lleva a cabo la lectura en un Analizador Luminex
100 (R&D Systems). El contenido de las diferentes citoquinas
presentes en los medios analizados se determina en virtud de curvas
de calibrado hechas con citoquinas humanas recombinantes altamente
purificadas. Esta técnica permite hacer un experimento para analizar
la secreción celular de varias citoquinas
(IL-1\beta, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10, TNF\alpha, GM-CSF,
G-CSF, VEGF, bFGF, G-CSF,
IFN\gamma).
Los procedimientos de la invención permiten ver
como el estrés (aquí una radiación UVA), inducen un descenso de la
viabilidad celular, así como un aumento de la síntesis de
interleuquinas proinflamatorias: puede ser interesante, por tanto,
reducir estos aumentos de la síntesis usando principios activos
correctamente seleccionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se siembran 4,10^{6} queratinocitos de
referencia, que aquí no han sido expuestos a la radiación UVB
(biopsia mamaria), y que se amplifican según se ha descrito en el
ejemplo 1 hasta el pase 1 (primera amplificación por
tripsinización), en insertos tipo cámara de Boyden (membrana de
porosidad 0,4 \muM y 25 mm de diámetro), las cuales han sido
sembradas de antemano con una subcapa nutritiva de fibroblastos, en
un medio de cultivo DMEM-Glutamax/Ham
F-12 (relación 3/1 v/v) complementada con un 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico–2-fosfato a una concentración final de 1
milimolar, con EGF o factor epidérmico de crecimiento a una
concentración final de 10 ng/mL, con hidrocortisona a una
concentración final de 0,4 microgramos/mililitros, con umulina a una
concentración final de 0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una
concentración final de 0,4 microgramos/mililitro, con
triiodotironina a una concentración final de 2,10^{-9} molar, con
adenina a una concentración final de 24,3 microgramos/mililitros,
con penicilina a una concentración final de 100 Ul/mililitro, con
anfotericina B a una concentración final de 1 microgramo/ml, y con
gentamicina a una concentración final de 20 microgramos/mililitro,
y durante un periodo de cultivo por inmersión de 3 a 8 días.
Entonces los cultivos de queratinocitos se
colocan en la interfase aire-líquido durante 12 a
18 días en el mismo medio de cultivo usado para el cultivo en
inmersión, excepto por el suero de ternera, la hidrocortisona, el
isuprel, la triiodotironina y la umulina.
Al final del cultivo, 6 muestras no sufrieron
tratamiento (modelo que comprende las células de referencia
=
control).
control).
Se pueden inducir diferentes estreses en un
total de 6 epidermis reconstruidas. Por ejemplo se pueden usar
diferentes protocolos, para cada tipo de estrés seleccionados de
entre la siguiente lista:
Estrés químico: se aplican distintos
agentes a las epidermis reconstruidas de 10 minutos a una hora y se
eliminar por lavado con PBS, pH 7,4, así por ejemplo: lauril
sulfato sódico (SLS) al 2%, tretionina al 0,05%, peróxido de
hidrógeno (3 a 300 \muM), óxido nítrico (NO) (MAHMA nonoato 0,1 a
1 \muM), hipóxia por saturación con CO^{2} y por humo de
cigarrillo.
Estrés biológico: Se aplican varios
agentes a las epidermis reconstruidas durante una hora y después se
eliminan por lavado con PBS, pH 7,4, así por ejemplo: TGF\beta
(5-10 ng/ml), TNF\alpha
(50-100-200 Ul/ml), IL1
(5-10 ng/ml), LPS (lipopolisacárido
5-10 ng/ml).
Estrés mecánico: las epidermis
reconstruidas se cortan o se comprimen durante 1 hora.
Estrés térmico: las epidermis
reconstruidas se colocan durante 1 hora a 37ºC, 40ºC y 43ºC.
Campos magnéticos: las epidermis
reconstruidas se colocan durante una hora bajo un campo magnético,
por ejemplo, de 835 MHz/0,6 W y 1.800 MHz/0,125 W (radiofrecuencia
de los teléfonos móviles).
Microondas: las epidermis reconstruidas
se someten a microondas: frecuencias 2,45 y 7,7 GHz y 30
mW/cm^{2} de poder.
Radiaciones ionizantes: las epidermis
reconstruidas se someten a dosis de 0,2 a 10 mGy de Rayos X.
Estrés UV: UVA (0-60
J/cm^{2}), UVB (0-100 mJ/cm^{2}), luz solar
(0-3.500 kJ/m^{2}).
En este experimento, hemos elegido llevar a cabo
una irradiación de tipo UVB. Para esto, se elimina el medio de
cultivo y se reemplaza por PBS pH 7,4 y algunas epidermis
reconstruidas presentes en los insertos se irradian con dosis
crecientes de UVB (312 mm) de 0 a 100 mJ/cm^{2}. Otras se
reservan bajo las mismas condiciones sin irradiación (epidermis
denominadas "epidermis de referencias no sometidas a estrés").
Las epidermis reconstruidas tratadas así se incuban entonces durante
24 horas más en medio de emersión. La determinación de las
citoquinas se lleva a cabo por MAP Floroquina como se ha descrito
en el ejemplo 3. La viabilidad celular se evalúa por determinación
de proteínas (kit del ácido bicinconinico para determinación de
proteínas–Sigma St Louis, USA) o por cualquier otra prueba de
viabilidad celular que permita la determinación de la actividad
enzimática de la fosfatasa alcalina (incubación durante 2 horas a
37ºC en una solución que contenga 5 mM de
p-nitrofenil fosfato, 0,1 M de acetato sódico, 0,1%
de Triton X100 pH 5 y, entonces, la neutralización con 10% de NaOH
1 N y se lee la absorbancia a
405 nm).
405 nm).
En la siguiente tabla se expresan los resultados
como porcentajes del control no irradiado:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimiento de la invención permiten ver
que el estrés (aquí una irradiación UVB), induce una disminución
significativa de la viabilidad celular, así como un aumento de la
síntesis de interleuquinas proinflamatorias: puede ser interesante,
por tanto, reducir estos aumentos de la síntesis y limitar la
mortalidad celular usando correctamente los principios activos
seleccionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se siembran de 1 a 2,10^{6} células de la
membrana mucosa gingival denominadas "células epiteliales de
referencia de la membrana mucosa gingival" (biopsia gingival,
pase 3 (3ª amplificación por tripsinización)), extraídas como se ha
descrito en el ejemplo 1, en insertos tipo cámara de Boyden
(membrana de porosidad 0.4 \muM y 10 mm de diámetro -subcapa
nutritiva de fibroblastos), en medio de cultivo
DMEM-Glutamax/Ham F-12 (relación 3/1
v/v) complementada con un 10% de suero de ternera Hyclone II, con
ácido ascórbico–2-fosfato a una concentración final
de 1 milimolar, con EGF a una concentración final de 10 ng/mL, con
hidrocortisona a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitros, con umulina a una concentración final de
0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración final
de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de 24,3
microgramos/mililitros, con penicilina a una concentración final de
100 Ul/mililitro, con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/ml, y con gentamicina a una concentración final de 20
microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo de 3 a 8 días
por inmer-
sión.
sión.
Entonces, los cultivos de células epiteliales se
mantienen en inmersión durante 12 a 18 días en el mismo medio de
cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto porque el
porcentaje de suero de ternera se reduce de 10% a
1%.
1%.
Al final del experimento, se elimina el medio y
se reemplaza por PBS, pH 7,4 y los epitelios reconstruidos
presentes en los insertos se someten a estrés por varios agentes
potencialmente irritantes o sensibilizadores, a la proporción de 20
\mul por epitelio y durante una hora: 5% de lauril sulfato sódico
(SLS), lipopolisacáridos (LPS) a 1000 U/ml, un agente
antiinflamatorio: la Prednisolona a 10 mM (Sigma) y un activo:
Inhipasa® al 3% (extracto de raíces de Pueraria lobata, Coletica)
también a una proporción de 20 \mul por epitelio, durante una
hora. Entonces los agentes aplicados sobre los epitelios
reconstruidos se eliminan y los epitelios reconstruidos se incuban
durante 24 horas más en medio de inmersión sin suero de ternera.
Algunos epitelios reconstruidos se analizan en términos de
viabilidad celular por la prueba con MTT (metiltiazoltetrazolio).
Otros epitelios reconstruidos se raspan y se ponen en Tri Reagent®
(T9424 Sigma, St. Louis USA) y, entonces, se extraen con cloroformo.
Tras la centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC, los ARN
aparecen en la capa superior.
\newpage
La determinación de los ARNm de los epitelios se
hace por Expression Array (RD System), según el protocolo definido
por los proveedores. Los resultados se expresan como un factor de
variación con respecto a los controles no sometidos a estrés:
[(resultados de las células sometidas a estrés/resultados de las
células no sometidas a estrés)
x100].
x100].
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la invención permiten ver
como el estrés (aquí la aplicación de un agente de tipo irritante o
sensibilizador) induce la modificación de varios marcadores de
inflamación. Se demuestra la eficacia del principio activo
Inhipase® en comparación con la referencia antiinflamatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las células extraídas son aquellas obtenidas de
una biopsia mamaria fotoprotegida.
Se siembran 400.000 fibroblastos denominados
"fibroblastos jóvenes" (mezcla de tres donantes de menos de 35
años de edad) y "fibroblastos viejos" (mezcla de tres donantes
de más de 55 años de edad) que se extraen y amplifican hasta el pase
5 (5ª amplificación por tripsinización) como se ha descrito en el
ejemplo 1, en las dos caras de sustratos dérmicos revestidos.
\newpage
Brevemente, los sustratos dérmicos se preparan
según el siguiente protocolo:
- -
- Secar a 25ºC un gel de colágeno al 0,75% con el fin de que forme una película.
- -
- Depositar la película de colágeno sobre un gel de colágeno al 0,75%.
- -
- Liofilizar durante 24 h y entrecruzar con DPPA (difenilfosforil azida a 50 \mul/g de colágeno en solvente dimetilformamida y tampón borato pH 8,9).
- -
- Tras lavar con agua desmineralizada, los sustratos dérmicos revestidos se liofilizan una vez más.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio usado para el cultivo de los
fibroblastos es un medio DMEM-Glutamax complementado
con un 10% de suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de crecimiento
epidérmico a una concentración final de 10 ng/ml, con penicilina a
una concentración final de 100 Ul/mililitro, con anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y con
gentamicina a una concentración final de 20 microgramos/mililitro.
La obtención de dermis reconstruidas necesita un periodo de cultivo
de 14 días.
Entonces, 400.000 queratinocitos denominados
"queratinocitos jóvenes" (mezcla de tres donantes de menos de
35 años de edad) y "queratinocitos viejos" (mezcla de tres
donantes de mas de 55 años de edad), que se extraen y se amplifican
hasta el pase 2 (2ª amplificación por tripsinización) como se
describe en el ejemplo 1, se siembran en los equivalentes dérmicos
revestidos, sobre el lado de la película de colágeno, en medio de
cultivo DMEM-Glutamax/Ham F-12
(relación 3/1 v/v) complementada con un 10% de suero de ternera
Hyclone II, con ácido ascórbico–2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/mL, con hidrocortisona a una concentración final de
0,4 microgramos/mililitros, con umulina a una concentración final de
0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración
final de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de
24,3 microgramos/mililitros, con penicilina a una concentración
final de 100 Ul/mililitro, con anfotericina B a una concentración
final de 1 microgramo/ml, y con gentamicina a una concentración
final de 20 microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo
por inmersión de 7
días.
días.
Entonces, los cultivos se sitúan en la interfase
aire/líquido durante 14 días en el mismo medio de cultivo usado
para el cultivo por inmersión, excepto por el suero de ternera, la
hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la
umulina.
umulina.
Al final del experimento, se elimina en medio y
se sustituye con PBS a pH 7,4, y las pieles reconstruidas presentes
en los insertos se incuban durante una hora a 37ºC (modelo que
comprende las células de referencia) y durante una hora a 43ºC
(modelo que comprende las células sometidas a estrés). Las epidermis
reconstruidas tratadas de este modo se incuban entonces durante 24
horas más en medio de inmersión. Las muestras que comprenden a las
"células sometidas a estrés" y las "células de
referencia" con choque térmico se analizan por secuencia
de
ADNc.
ADNc.
- -
- Brevemente, los ARN de las muestras se extraen (finalmente tras homogeneización en nitrógeno líquido con la ayuda de un biopulverizador) y se purifican según el protocolo del proveedor de Tri Reagent® (Sigma) para la total eliminación del ADN.
- -
- Los ARN purificados se analizan cualitativa y cuantitativamente.
- -
- La siguiente fase fue la purificación de las mezclas de ARN mensajeros (ARNm) por hibridación de los extremos poly(A) de los ARNm con cebadores oligo(dT) biotinilados y con la captura selectiva por bolas de estreptavidina, según el protocolo de Atlas Pure (Clontech). Las sondas de ADN se marcan repetidamente con ^{32}P mediante transcripción inversa de los ARNm unidos a las bolas de poly(dT), con la ayuda de un grupo de cebadores específicos de las secuencias inmovilizadas en las secuencias, en presencia de [\alpha^{33}P]-dATP. Las sondas marcadas se purifican en una columna cromatográfica de exclusión; la calidad y la equivalente de las sondas marcadas se evaluó por recuento con líquido de cente- lleo.
- -
- Las membranas Custom ATLAS se pretratan y entonces, los ADNc inmovilizados en cada membrana se hibridan (68ºC, una noche) con las correspondientes sondas marcadas; los filtros se lavan antes del análisis.
- -
- Análisis por autorradiografía y cuantificación de la radioactividad de las manchas con ayuda de un Cyclone Phosphorimager (Packard Instrument; 3 horas y, entonces, 72 horas de adquisición) y del software QuantArray, Packard.
\newpage
- -
- Identificación de los genes de interés que varían entre las diferentes condiciones experimentales; donantes jóvenes frente a donantes que ha sufrido o no estrés térmico. Los resultados se expresan como porcentaje de variación entre el modelo de vejez y el modelo de juventud, en condiciones de no exposición a estrés y de exposición a estrés.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (aquí un choque térmico), induce, por un lado, la
modificación de numerosos marcadores y por otro lado, una respuesta
diferente al estrés en función de la edad de los donantes. Este
modelo permite, por tanto, definir dianas de acción que proporcionan
un indicio del mismo o de cómo revertir el efecto de un choque
térmico. Además, este modelo permite definir una estrategia
diferente para desarrollar principios activos en función del grupo
de edad en cuestión.
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Ejemplo
7
Generación de células dendríticas
indiferenciadas e inmaduras capaces de orientarse por si mismas de
forma preferente hacia la ruta de diferenciación de las células de
Langerhans:
La sangre periférica circulante se recogió
tomando una muestra de sangre venosa a partir de uno o más donantes
humanos, en tubos de vacío complementados con productos
anticoagulantes normales como la heparina de
litio.
litio.
La separación de los monocitos (CD14^{+}) a
partir de esta sangre circulante puede hacerse de forma ventajosa
según el protocolo descrito por Geissmann y col., en J. Exp. Med.
Vol 187, Nº 6, 16 de marzo de 1998, páginas 961-966
publicado por The Rockefeller University Press, de la siguiente
forma:
- -
- tras la centrifugación en un gradiente de Ficoll® (diatrizoato sódico/polisacarosa con densidad 1,077; Lymphoprep Abcys 1053980), se recuperan las células mononucleadas de la sangre circulante y se marcan de forma indirecta con una mezcla de anticuerpos (principalmente anti-CD3, anti-CD7, anti-CD19, anti-CD45RA, anti-CD56 anti-IgE) unidos a bolas magnéticas.
- -
- tras el paso por una columna magnética, sólo eluyen los monocitos no marcados magnéticamente.
Los monocitos CD14^{+} se recuperan del
eludido usando cualquier procedimiento físico de separación bien
conocido por la persona experta en la técnica y, sobre todo, por
sedimentación o centrifugación, y se eluyen así para cultivos
sucesivos.
Entonces los monocitos CD14^{+} se ponen en
cultivo, a la proporción de aproximadamente 1 millón por mililitro,
en medio de cultivo RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute)
complementado con 10% de suero fetal de ternera descomplementado, y
que contiene inicialmente dos citoquinas, denominadas citoquina
GM-CSF a una concentración de 400 Ul/ml y citoquina
TGF\beta1 a una concentración de 10 ng/ml.
El cultivo se realiza a 37ºC en una atmósfera
saturada de vapor de agua que contenga 5% de CO^{2}.
El medio de cultivo se complementa inicialmente
con una tercera citoquina, denominada citoquina
IL-13 a una concentración de 10 ng/ml. Antes de
máximo 2 días de cultivo, se añade el mismo medio de cultivo pero
sin que contenga la IL-13, hasta el 6º día de
cultivo. Al 6º día, se generan células dendríticas indiferenciadas e
inmaduras capaces de orientarse por sí mismas preferentemente hacia
la ruta de diferenciación de las células de Langerhans:
- -
- aproximadamente del 60% al 80% de las células dendríticas generadas in vitro expresan intracelularmente la langerina, y el CCR6 que es el receptor específico de MIP-3\alpha;
- -
- las células dendríticas generadas in vitro son fuertemente atraídas quimiotácticamente por MIP-3\alpha, y esto demuestra la funcionalidad del receptor CCR6, las células dendríticas generadas in vitro son fuertemente atraídas de forma química por MIP-3\alpha, y esto demuestra la funcionalidad del receptor CCR6,
- -
- las células dendríticas generada in vitro son inmaduras ya que no expresan los marcadores de madurez CD83, DC-LAMP y CCR7.
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El modelo tisular se lleva a cabo entonces según
el protocolo:
Doscientos mil fibroblasto extraídos de una
biopsia abdominal, denominadas células de referencia, se
amplifican, según se describe en el ejemplo 1, y entonces se
siembran en un sustrato dérmico compuesto por
colágeno-glicosaminoglicano-chitosan,
en un medio de cultivo DMEM–Glutamax complementado con 10% de suero
de ternera Hyclone II, con ácido ascórbico–2-fosfato
a una concentración final de 1 milimolar, con EGF o factor de
crecimiento epidérmico a una concentración final de 10 ng/ml, con
penicilina a una concentración de 100 Ul/mililitro, anfotericina B a
una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y gentamicina a
una concentración final de 20 microgramos/mililitro, y por un
periodo de cultivo de 21 días. El cultivo se continúa durante una
semana más en el medio descrito excepto por el EGF.
Entonces, 2,10^{5} queratinocitos extraídos de
una biopsia abdominal, que comprende las células denominadas
"células de referencia" y amplificados hasta el pase 1 (1ª
amplificación) según se ha descrito en el ejemplo 1, y de 1 a
3,10^{5} células dendríticas indiferenciadas generadas in
vitro se siembran en los equivalentes dérmicos en un medio de
cultivo DMEM–Glutamax/Ham F-12 (relación 3/1 v/v)
complementada con un 10% de suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico–2-fosfato a una concentración final de 1
milimolar, con EGF a una concentración final de 10 ng/ml, con
hidrocortisona a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitros, con umulin a una concentración final de
0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración
final de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de
24,3 microgramos/mililitros, penicilina a una concentración final
de 100 Ul/mililitro, con anfotericina B a una concentración final
de 1 microgramo/mililitro, y con gentamicina a una concentración
final de 20 microgramos/mililitro, y durante un periodo de cultivo
en inmersión de 7 días.
Los cultivos entonces se sitúan en la interfase
aire/líquido durante 20 días en el mismo medio de cultivo usado
para el cultivo en inmersión, excepto por el suero de ternera, la
hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la
umulina.
umulina.
En estas condiciones, las células de Langerhans
se localizan en la epidermis, mientras que las células dendríticas
intersticiales, los macrófagos y las células endoteliales lo hacen
en la dermis.
Se añade o no el liposacárido bacteriano (LPS) a
los medios sumergidos a una concentración de 10 ng/ml durante 6 y
24 horas.
Al final del experimento, las pieles
reconstruidas inmunocompetentes se analizan por secuencia de ADNc
según se describe en el ejemplo 6. Los medios de cultivos recogidos
y congelados se analizan por Fluoroquina MAP según se ha descrito
en el ejemplo 3. Los resultados se presentan en pg/ml, en
particular, para la parte de regulación prematura por interleuquina
1 y TNF\alpha y en porcentajes de la síntesis de citoquinas
([(resultados de células sometidas a estrés/resultados de células
no sometidas a estrés)x100]) para la secuencia de ADN.
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Estos resultados demuestran una activación más o
menos rápida de los genes que codifican para la regulación de la
respuesta inflamatoria debida a interleuquina 1 y a TNF alfa. El
descenso observado en el caso de los marcadores CD1a, CD40 y CD86
no es debido a un fenómeno de regulación génica sino más bien a la
desaparición de las células dendríticas, inicialmente presentes en
el modelo tridimensional, bajo el efecto del estrés debido al
lipopolisacárido, seguido de su migración al medio de cultivo
presente bajo en inserto.
Los procedimientos de la invención también
permiten hacer una selección de principios activos capaces de
proporcionar un indicio o de modular las diferentes modificaciones
observadas tras el estrés generado.
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Ejemplo
8
Las células extraídas se obtienen a partir de
una biopsia mamaria no expuesta al estrés estudiado. Se siembran
400.000 fibroblastos, amplificados hasta el pase 5 (5ª
amplificación por tripsinización) como se describe en el ejemplo 1,
en sustratos dérmicos compuestos por esponjas recubiertas de
colágeno, en un medio de cultivo DMEM-Glutamax
complementado con un 10% de suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico–2–fosfato a una concentración final de 1 milimolar, con
EGF o factor de crecimiento epidérmico a una concentración final de
10 ng/ml, con penicilina a una concentración final de 100
Ul/mililitro, con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, y con gentamicina a una concentración final de
20 miligramos/mililitros, y por un periodo de cultivo de 14
días.
Entonces, se siembran 400.000 queratinocitos y
10.000 melanocitos, amplificados hasta el pase 2 (2ª amplificación
por tripsinización) como se ha descrito en el ejemplo 1, se
sembraron en los equivalentes dérmicos en medio de cultivo
DMEM-Glutamax/Ham F-12 (relación 3/1
v/v) complementado con un 10% de suero de ternera de Hyclone II, con
ácido ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 ng/ml, con hidrocortisona a una concentración final de
0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una concentración final de 0,4
microgramos/mililitro, con triiodotironina a una concentración final
de 2,10^{-9} molar, con adenina a una concentración final de 24,3
miligramos/mililitro, con penicilina a una concentración fina de
100 Ul/ml, con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro, y con gentamicina a una concentración fina de
20 microgramos/mililitro, y por un periodo de cultivo en inmersión
de 7 días.
Los cultivos entonces se ponen en la interfase
aire-líquido durante 14 días en el mismo medio de
cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto por el suero de
ternera, la hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina y la
umulina.
Dos veces por semana y durante dos semanas, el
medio de inmersión se elimina y se cambia por PBS a pH 7,4. Algunas
pieles reconstruidas pigmentadas presentes en los insertos se
conservan a temperatura ambiente; este modelo comprende células
denominadas "células de referencia". Otras pieles pigmentadas
reconstruidas presente en los insertos se irradian a 561 KJ/m^{2}
(que corresponde con un promedio de una hora de exposición en
Europa Central) con la ayuda de un irradiador solar Suntest CPS+
(ATLAS); este modelo comprende células denominadas "células
sometidas a estrés". Fuera de los periodos de irradiación, las
pieles reconstruidas se cultivan a 37ºC bajo un 5% de CO_{2} en
medio de inmersión.
Se aplican 8 \mul de una formulación cosmética
que contiene o no un activo antioxidante al 3%; por ejemplo,
Flavagrum® (Laurato de hesperitina, Coletica), Flavenger®
(Caprilato de quercitina, Coletica) en las pieles reconstruidas
pigmentadas durante 10 días.
Al final del tratamiento, las pieles
reconstruidas pigmentadas se sumergen durante 24 horas más en medio
de inmersión, y entonces se evalúa la eficacia del tratamiento
antioxidante mediante análisis de:
- -
- La viabilidad celular (prueba con MTT-metiltiazoltetrazolio) en las pieles reconstruidas pigmentadas que comprenden las células "sometidas a estrés" o las células "de referencia". Los resultados se expresan como porcentaje de variación con respecto al control no irradiado.
- -
- La secreción de interleuquina cuantificada por el kit de Fluoroquina MAP en el medio de cultivo recogido según se describe en el ejemplo 3. Los resultados se expresan en picogramos/ml.
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Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (radiación solar aquí), induce un descenso de la
viabilidad celular, así como un incremento en la síntesis de
interleuquinas proinflamatorias: es interesante, por tanto, limitar
la síntesis de moléculas proinflamatorias usando principios activos
seleccionados correctamente. Entre los principios activos
seleccionados, dos de ellos, Flavagrum® y Flavenger®, muestran una
eficacia capaz de hacer que los niveles de referencia de esos dos
parámetros tiendan a restablecerse.
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Ejemplo
9
Las pieles reconstruidas se hacen según el
protocolo descrito en el ejemplo 6.
La mitad de las muestras que comprenden células
"sometidas a estrés" se irradian con UVB a razón de 50
mJ/cm^{2}. Las otras muestras se conservan a temperatura ambiente
bajo las mismas condiciones, y constituyen las muestras que
comprende células "de referencia". Las muestras se incuban
entonces durante 24 horas más en presencia o no de un activo (1% y
3% de Flavenger®, es decir quercitina acilada, Coletica,
Francia).
Al final del experimento, se evalúa por la
técnica de RT-PCR en tiempo real el contenido del
ARNm de la tropoelastina, colágeno de tipo I y colágeno de tipo III.
Para ello, se usan parejas de cebadores que permiten la
amplificación de fragmentos específicos de tropoelastina, de
colágeno de tipo I y de colágeno de tipo III (sentido
18/antisentido 19 y sentido 18/antisentido 20, respectivamente) y
cebadores para la secuencia de la actina (541 pares de bases).
Después de la extracción con Tri Reagent® (Sigma) y la purificación
de los ARN según el protocolo de los proveedores, se llevan a cabo
las reacciones de RT-PCR (Transcripción inversa de
la reacción en cadena de la polimerasa) cuantificando la
RT-PCR en tiempo real con la ayuda del sistema
"Opticon" (MJ Research).
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La mezcla de reacción (50 \mul) introducida en
el pocillo es la siguiente, para cada muestra:
- -
- 10 \mul de ARN a una concentración de 5 ng/\mul.
- -
- Los cebadores de los distintos marcadores usados.
- -
- Mezcla de reacción (Qiagen-25 \mul 2xQuantiTect SYBR Green RT-PCR mezcla original que contiene MgCl_{2} 5 mM + 0,5 \mul de mezcla QuantiTect RT), el marcador SYBR Green I se inserta por si mismo en la doble hélice de ADN durante la etapa de elongación).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de RT-PCR son
las siguientes:
- -
- Transcripción inversa: 30 min a 50ºC.
- -
- Reacciones de PCR: [15 seg a 94ºC, 30 seg a 60ºC y 30 seg a 72ºC], 50 ciclos.
\vskip1.000000\baselineskip
La ausencia de contaminación y la pureza de los
productos amplificados se verifica por las curvas de fusión de los
productos de PCR amplificados. Se eliminan los productos que
presentan un pico doble o una temperatura de fusión anormal.
\vskip1.000000\baselineskip
La incorporación de fluorescencia al ADN
amplificado se evalúa continuamente durante los ciclos de PCR. Este
sistema permite obtener curvas de medida de fluorescencia en función
del número de ciclos de PCR y de ese modo, evaluar una cantidad
relativa de ADN amplificado.
Con el fin de tener en cuenta la población
celular presente en las pieles reconstruidas, todos los resultados
se atribuyen a la señal de la "actina", usado como gen
constitutivo.
Según el experimento, el umbral de medida de
C(U) (= ciclo umbral) se fija para U entre 0,05 y 0,01 y se
calcula una unidad de medida arbitraria para cada gen según la
fórmula:
Sgen\
\text{"x"}= 10^{7} x (1/2)^{C(U)gene\
\text{"x"}}
C(U)gen "x" significa el
umbral de medida del C(U) (Ciclo Umbral) del gen
"x".
\newpage
Los valores de los genes que interesan se
atribuyen a la señal de la actina calculando la proporción:
R =
Sgen\text{"x"}/Sactina
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Se comparan estas proporciones entra las
muestras tratadas y no tratadas.
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Los procedimientos de la invención permiten ver
que el estrés (aquí una irradiación con UVB), induce un incremento
rápido de los ARN que codifican para la síntesis de moléculas de la
secuencia extracelular tales como el colágeno de tipo I, de tipo
III y la elastina. La aplicación de un principio activo Flavenger®
permite limitar los efectos del estrés inducido por UVB
reestableciendo, de una manera dosis-dependiente, la
síntesis de estas molécu-
las.
las.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Las dermis reconstruidas se hacen según se
describe en el ejemplo 3, durante 3 semanas.
Algunas dermis reconstruidas se mantienen a
temperatura ambiente; este modelo comprende a las células denominas
"células de referencia". Otras dermis reconstruidas se irradian
a 561 KJ/m^{2} (que corresponde con un promedio de una hora de
exposición en Europa Central) con la ayuda de un irradiador solar
Suntest CPS+ (ATLAS); este modelo comprende células denominadas
"células sometidas a estrés".
Las dermis reconstruidas se irradian en
presencia o no de activo (3%) y entonces, se incuban durante 24
horas. Finalmente, los ARN se extraen según se describe en el
ejemplo 5.
La expresión de los genes de TGF latente y de
colágeno de tipo I (COL1) se analiza simultáneamente por
RT-PCR multiplex en tiempo real tras una rigurosa
selección de los cebadores (concentraciones de los componentes,
parámetros de los ciclos, condiciones de detección de la
fluorescencia).
Las sondas de hidrólisis de actina (20 a 30 mer)
se marcan en el extremo 5' con el fluorescente JOE (excitación
520-emisión 548) y en el extremo 3' con el
amortiguador TAMRA (Applied Biosystems-Foster City,
CA).
Las sondas de hidrólisis de los genes analizados
(20 a 30 mer) se marcan en el extremo 5' con el fluorescente FAM
(Excitación 495-Emisión 520) y en el extremo 3' con
el amortiguador TAMRA (excitación 555-emisión
576-Applied Biosystem).
Las condiciones de la RT-PCR son
las siguientes:
- \quad
- Kit Superscript de RT-PCR en una etapa con Taq platinum (Invitrogen)
- \quad
- Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems)
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- 10 \mul de ARN a una concentración de 5 ng/\mul.
- \quad
- 25 \mul de mezcla de reacción 2x.
- \quad
- 2,5 \mul de cebadores, cadenas sentido y antisentido, 10 \muM.
- \quad
- 1,8 \mul de SO_{4}Mg 50 mM.
- \quad
- 2 \mul de dNTP 5 mM.
- \quad
- 1 \mul de la hidrólisis de cada pareja de genes (actina/TGFI y actina/colágeno I) 10 \muM.
- \quad
- 1 \mul de RT/Taq mix.
- \quad
- agua qsq 50 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- RT 48ºC, 30 min
- \quad
- Desnaturalización de RT y activación de la polimerasa a 95ºC, 5 minutos 50 ciclos de: 94ºC 15 seg-60ºC 30 seg-72ºC 30 seg.
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El análisis de los resultados (cálculo de la
proporción R=Sgen"x"/Sactina) se lleva a cabo como se ha
descrito en el ejemplo 10. El efecto de los activos se analiza en
términos de potenciación de la activación de TGF latente inducido
debida a la irradiación solar de los activos, así como en términos
de efecto directo y/o efecto rebote (a través de la liberación de
TGF-\beta1 activo) en el colágeno de tipo I. Los
resultados de varios activos interesantes (extracto de trigo, Soft
Roe®, Coletica) se presentan como porcentajes de la variación con
respecto al control no irradiado y no tratado con el activo.
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Los procedimientos de la invención permiten
observar como el estrés (aquí una radiación UV), induce un aumento
de la síntesis de TGF beta y de colágeno I: por tanto, puede ser
interesante mimetizar estos aumentos de la síntesis usando
principios activos correctamente seleccionados. De este modo, aquí
están los resultados obtenidos para los dos extractos
seleccionados:
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\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo
11
Los péptidos antibióticos son moléculas de
pequeños tamaño (de 10 a 50 aminoácidos) capaces de destruir a
microorganismos tales como bacterias, hongos o virus, volviendo la
membrana celular permeable. La mayoría de los péptidos antibióticos
se encuentran en los tejidos epiteliales de animales, donde juegan
un papel preponderante como barrera inmune primaria (primera). Más
en particular, se ha demostrado que en el hombre se encuentran en
los sistemas gastrointestinal y respiratorio, así como en la piel y
en las membranas mucosas. Las defensinas constituyen la clase de
péptidos antimicrobianos más estudiada. Se distinguen dos clases de
defensinas, las \alpha-defensinas (6
representativas) y las \beta-defensinas presentes
en tres formas: hBD1, hBD2 y hBD3 (\beta-defensina
humana 1, 2 y 3).
Bajo un estrés que imita un ataque microbiano
(lipopolisacádiro o LPS, TNA alfa, Interferon gamma, etc), las
células pueden sintetizar estas moléculas a manera de defensa.
Para demostrar esto, se preparan cultivos de
queratinocitos en monocapa y en forma de epidermis reconstruida con
células extraídas a partir de la misma biopsia de prepucio. Los
queratinocitos humanas normales se cultivan en monocapa en placas
de cultivo de 96 pocillos, en un medio definido sin suero y
enriquecido en calcio (concentración final 1,7 mM).
Cuando se alcanza un 80% de confluencia, las
células se ponen en contacto con un estrés químico, es decir,
moléculas que mimetizan un ataque microbiano, como TNF\alpha (100
ng/ml) o IFN\gamma (100 ng/ml), durante 16 años. Los
queratinocitos no sometidos a estrés, es decir no se ponen en
contacto con las sustancias químicas que imitan un ataque
microbiano, se usan en el modelo de epidermis reconstruida.
Tras 16 horas, los sobrenadantes se recogen y
las células se congelan en seco a -80ºC tras un lavado con PBS.
El ARN total se extrae con la ayuda de kit de
extracción fluo de 96 pocillos en columnas de silica y se determina
a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro de 96 pocillo. Los ARN se
diluyen a 5 ng/ml.
La RT-PCR cualitativa en una
etapa se realiza para actina, hBD2 y hBD3 con 50 ng de ARN
(inicial) en 96 pocillo. Los cebadores se usan a 0,5 \muM y
provienen de la literatura: cadena sentido para hDB2:
5'-CCAGCCAT
CAGCCATGAGGGT-3'; cadena antisentido para hBD2: 5'-GGAGCCCTTTC TGAATCCGCA-3' (Harder J. y col., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387: 861); cadena sentido para hBD3: 5'-AGCCTAGCAGCTAT
GAGGATC-3'; cadena antisentido para hBD3: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', cadena sentido para actina: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', cadena antisentido para actina: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. y col., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
CAGCCATGAGGGT-3'; cadena antisentido para hBD2: 5'-GGAGCCCTTTC TGAATCCGCA-3' (Harder J. y col., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997; 387: 861); cadena sentido para hBD3: 5'-AGCCTAGCAGCTAT
GAGGATC-3'; cadena antisentido para hBD3: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', cadena sentido para actina: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', cadena antisentido para actina: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. y col., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
Las muestras se sitúan en un termociclador y
siguen un programa de amplificación: 50ºC, 30 min; 94ºC, 2 min;
(94ºC, 30 seg; 60ºC, 30 seg; 68ºC, 30 seg) 32 ciclos para las
defensinas y 30 ciclos par la activa; 72ºC, 10 min; 14ºC,
infinito.
Tras la amplificación, los productos se mezclan
en una proporción de 3 \mul de productos de ampliación de activa
+ 6 \mul de productos de ampliación de hBD2 + 6 \mul de
productos de amplificación de hBD3. Se añaden 5 \mul de una mezcla
de tampón de relleno y agua (2/3) y los 20 \mul se depositan en
un gel de agarosa al 2% vertido previamente. Las muestras se hacen
migrar durante 30 minutos y las bandas se visualizan bajo una luz
UV en una cámara oscura y se fotografían digitalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
En insertos tipo cámara de Boyden (membrana de
porosidad 0,4 \mum y 10 mm de diámetro) se siembran de 1 a
2,10^{6} queratinocitos del prepucio, extraídos según se ha
descrito en el ejemplo 1, con una subcapa de fibroblastos
nutritivos, en medio de cultivo DMEM-Glutamax/HAM
F-13 (relación 3/1 v/v) complementado con un 10% de
suero de ternera Hyclone II, con ácido
ascórbico-2-fosfato a una
concentración final de 1 milimolar, con EGF a una concentración
final de 10 nanogramos/mililitro, con hidrocortisona a una
concentración finar de 0,4 microgramos/mililitro, con umulina a una
concentración final de 0,12 Ul/mililitro, con isuprel a una
concentración final de 0,4 microgramos/milkilitro, con
triiodotironina a una concentración final de 2,10^{-9} molar, con
adenina a una concentración final de 24,3 microgramos/mililitro, con
penicilina a una concentración 100 Ul/mililitro, con anfotericina B
a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, y con
gentamicina a una concentración final de 20 microgramos/mililitro,
y durante un periodo de cultivo en inmersión de 3 días.
Los cultivos de queratinocitos entonces se
colocan en la interfase aire/líquido durante 11 días en el mismo
medio de cultivo usado para el cultivo en inmersión, excepto por el
suero de ternera, la hidrocortisona, el isuprel, la triiodotironina
y la imulina.
Al final del experimento, la epidermis
reconstruida se trataron de la siguiente manera:
- -
- una muestra que no experimenta ningún tratamiento (modelo que comprende las células de referencia = control negativo).
- -
- una muestra que no experimenta tratamiento con los activos pero sufre los distintos tratamientos al final del cultivo (modelo que comprende las células sometidas a estrés = control positivo), por ejemplo, incubación en presencia de TNF\alpha a 100 ng/ml o IFN\gamma 100 ng/ml.
- -
- una muestra que experimenta el tratamiento con el activo (1% en el medio de cultivo durante 24 horas) y luego un estrés (equivalente al control positivo.
Entonces la epidermis reconstruida se incuba
durante 24 horas mas en presencia o no de los activos, se lava con
PBS y se extrae el ARN total y se determina a 260 y 280 nm en un
espectrofotómetro para 96 pocillos. Los ARN se diluyen a 5
ng/\mul y se tratan como ha sido descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fotografías de los geles se analizan con un
software de tratamiento de imagen que cuantifica la intensidad de
las bandas. Se compara la relación de la intensidad de las bandas
de hBD2/actina y hBD3/actina, por un lado, entre los modelo en
monocapa y el modelo 3D (epidermis reconstruida) en condiciones de
no-estrés, y, por otro lado, después del efecto del
estrés (células tratadas con TNF\beta o IFN\gamma).
Expresión de hBD2 y hBD3 en monocapa, comparado
con un modelo 3D de epidermis reconstruida, modelos con células de
referencia no sometidas a estrés:
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos del estrés en la expresión de hBD2 y
hBD3 en monocapa, comparada con modelos tridimensionales de
epidermis reconstruida:
\vskip1.000000\baselineskip
La respuesta de una síntesis de defensinas por
las células de la piel, durante un estrés que imita un ataque
microbiano es una respuesta de defensa que puede, por tanto, usarse
para imitar en la búsqueda de principios activos que son capaces de
estimularlas defensinas de la piel sin que tenga lugar una agresión
química.
Claims (7)
1. Uso de al menos un compuesto seleccionado de
laurato de hesperitina y caprilato de quercetina para fabricar una
composición cosmética o farmacéutica para limitar y/o prevenir la
modificación de al menos un parámetro biológico modificado con la
irradiación solar y particularmente con la irradiación solar
repetida.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
limitación y/o prevención de la modificación del parámetro
biológico es: el aumento de la viabilidad celular y/o la
disminución de la síntesis de interleucinas proinflamatorias.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
las interleucinas proinflamatorias son IL-1,
IL-6, IL-8 o TNF\alpha.
4. Uso de quercitina acilada, particularmente de
caprilato de quercitina para fabricar una composición cosmética o
farmacéutica para limitar y/o prevenir la modificación de al menos
un parámetro biológico modificado con una irradiación UVB.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la
limitación y/o prevención de la modificación del parámetro
biológico es: la disminución de la síntesis de moléculas de la
matriz extracelular.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que las
moléculas de la matriz extracelular son colágeno de tipo I, de tipo
III y/o elastina.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición se aplica
tópicamente.
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GB2485816A (en) * | 2010-11-25 | 2012-05-30 | Alcyomics Ltd | In vitro model for the prediction of immunogenicity, hypersensitivity or allergenicity |
BR112015003717A2 (pt) * | 2012-08-21 | 2016-02-23 | Ajinomoto Kk | método para a identificação de um metabólito altamente requerido por um animal industrial, e, método para a produção de uma composição de alimentação |
EP2944958A1 (en) * | 2014-04-04 | 2015-11-18 | Techno-Path (Distribution) | A method of predicting phenotypic instability in a cell |
CN112074596A (zh) * | 2018-02-09 | 2020-12-11 | 亥姆霍兹慕尼黑-德国健康与环境研究中心(有限公司) | 监测疤痕形成的装置和方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5718906A (en) * | 1994-03-23 | 1998-02-17 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Light-stable cosmetic composition |
US6426362B1 (en) * | 1999-10-08 | 2002-07-30 | Galileo Laboratories, Inc. | Formulations of tocopherols and methods of making and using them |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5834477B2 (ja) * | 1979-05-25 | 1983-07-27 | 三省製薬株式会社 | クエルセチンの脂肪酸エステル |
US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
US5700450A (en) * | 1988-03-30 | 1997-12-23 | The Trustees Of Boston University | Methods for enhancing melanin synthesis in melanocytes using diacyglycerols and uses thereof |
US5650279A (en) * | 1995-01-27 | 1997-07-22 | Allergan, Inc. | Gene sequence induced in skin by retinoids |
US6197575B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-03-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays |
US6323219B1 (en) * | 1998-04-02 | 2001-11-27 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Methods for treating immunomediated inflammatory disorders |
FR2778663B1 (fr) * | 1998-05-15 | 2001-05-18 | Coletica | Nouveaux esters de flavonoides,leur utilisation en cosmetique, dermopharmacie, en pharmacie et en agro-alimentaire |
WO1999064615A1 (en) * | 1998-06-08 | 1999-12-16 | Valentis, Inc. | Formulations for electroporation |
US5989837A (en) * | 1998-07-13 | 1999-11-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Immortalized human keratinocyte cell line |
FR2792650B1 (fr) * | 1999-04-20 | 2003-02-28 | Oreal | Equivalent de peau agee, son procede de preparation et son utilisation |
AU2001286727A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-04 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy |
DE10100122A1 (de) * | 2001-01-03 | 2002-07-11 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
EP1404809B1 (en) * | 2001-03-02 | 2013-12-11 | Stratatech Corporation | Improved skin substitutes and uses thereof |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US6426362B1 (en) * | 1999-10-08 | 2002-07-30 | Galileo Laboratories, Inc. | Formulations of tocopherols and methods of making and using them |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BONINA F et al.: "{}Flavonoids as potential protective agents against photo-oxidative skin damage"{} INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, AMSTERDAM, NL, vol. 145, no. 1-2, 1996, páginas 87-94, todo el documento. * |
BONINA F et al.: "Flavonoids as potential protective agents against photo-oxidative skin damage" INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, AMSTERDAM, NL, vol. 145, no. 1-2, 1996, páginas 87-94, todo el documento. * |
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