WO2004092726A1 - Ex-vivo-hautorganmodell aus schweinehaut - Google Patents

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WO2004092726A1
WO2004092726A1 PCT/DE2004/000782 DE2004000782W WO2004092726A1 WO 2004092726 A1 WO2004092726 A1 WO 2004092726A1 DE 2004000782 W DE2004000782 W DE 2004000782W WO 2004092726 A1 WO2004092726 A1 WO 2004092726A1
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skin
wound
pig
hair
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PCT/DE2004/000782
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Johanna Brandner
Ingrid Moll
Ute Siemann-Harms
Pia Houdek
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Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
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Publication date
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin

Definitions

  • the invention relates to methods for producing an ex vivo skin organ model, ex vivo skin organ models and their use and an arrangement for carrying out examinations of human and animal skin.
  • the skin is an important organ of the body of humans and animals.
  • the examination of human skin is of particular interest to medicine and the manufacturers of cosmetics.
  • Carrying out animal experiments is often undesirable or even prohibited by law. In addition, they cause high costs, for example because of the complex animal husbandry, and are often difficult to transfer to humans, for example in the case of rodents such as mice or rats.
  • the skin of rodents differs from human skin in many parameters, for example in wound healing the greater influence of wound contraction, in the epidermis thickness and the type of gap junctions and mast cells. The transferability to humans is significantly affected.
  • a skin equivalent i.e. Artificially grown skin is also only an inadequate alternative, since different cell types are also missing here.
  • hyperproliferative cells and the skin barrier, which is formed by the stratum corneum of the epidermis, is not yet fully developed. Skin equivalents are also very expensive.
  • the skin of the pig is very similar to human skin in many parameters (Meyer W., dermatologist 47 .178-182, 1996; Meyer et al., Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 92-99, 2001; Meyer et al. , Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 100-111, 2001), so that it is basically suitable for the examination of human skin, for example in an ex vivo skin organ.
  • Skin obtained from slaughter animals has comparatively uniform properties.
  • Ex vivo skin organ models from pig skin are generally known 5.
  • the skin organ models made from pig skin available so far are not suitable for many examinations, for example those for wound healing or those for examining skin barrier damage, since they provide incorrect, poorly reproducible or unreliable results.
  • previously available skin organ models are not suitable for examining wound healing due to their small thickness (1000 ⁇ m), since wounds that are still have a dermis portion, cannot be reproducibly generated.
  • the object is achieved by a method for producing an ex vivo skin organ model comprising the steps a) removing skin with dermis and epidermis from the body or body part of a pig, b) shortening hair located in the skin, the hair being shortened in in a manner such that the average transepidermal water loss (TEWL) of the skin with shortened hair essentially corresponds to the average transepidermal water loss of skin with uncut hair.
  • TEWL average transepidermal water loss
  • skin barrier means the outer layer of the epidermis, the horny layer (stratum corneum).
  • An intact skin barrier is understood to mean a horny layer that is not mechanically damaged and / or has a quantitative or qualitative ipid composition that is different from the normal state.
  • Impairment of the barrier function can be measured, for example, by measuring the transepidermal water loss (TEWL) determine. Increased TEWL values indicate an impaired barrier function.
  • TEWL transepidermal water loss
  • the porcine skin model produced by the method according to the invention is well suited for investigations of wound healing, e.g. for testing wound dressings such as gauze, wound ointments, wound creams, basic substances of such ointments and creams, cells such as keratinocytes, fibroblasts, melanocytes, Merkel cell tumor cells, melano cells, leukocytes, lymphocytes, granulocytes, mesenchymal stem cells, embryonic cells
  • Stem cells epidermal stem cells, liposomes, bacteria, fungi, viruses, prions etc.
  • the hair is shortened or removed, for example to ensure that wound dressings have sufficient contact with the skin.
  • the hair is shortened to such an extent that it ends approximately at or just above the level of the epidermis.
  • the hair is preferably shortened to such an extent that it ends one to four millimeters, particularly preferably one to two millimeters, above the epidermis. So far, for example, the hair has been removed by shaving the pig skin, which leads to mechanical damage to the skin barrier, which can be determined from an increased transepidermal water loss. The measuring method for this is known to the person skilled in the art in this field.
  • Whether the skin's barrier function has been impaired can be determined, for example, by measuring the average TEWL value of the skin or a section of skin before and after shortening / removing the hair. Also a comparative measurement with skin that otherwise treated the same, but whose hair has not been shortened or removed can be used for this.
  • it is advantageous to cut the hair for example with scissors, a knife, an electric or mechanical beard trimmer or the like, in such a way that mechanical contact with the epidermis is avoided or so minimal is that the average transepid ale water loss is essentially that of skin where the hair has not been trimmed.
  • the average transepidermal water loss of the skin with shortened hair essentially corresponds to the average transepidermal water loss of skin with uncut hair if the average transepidermal water loss of skin with uncut hair is at least 70%, preferably at least 90%, particularly preferably is at least 95%, more particularly preferably at least 98% of the average transepidermal water loss of skin with shortened hair.
  • a wound is preferably caused in the skin. This can happen that in one
  • Section of the skin the epidermis is removed, for example by punching out.
  • the upper part of the dermis is preferably also removed.
  • the wound model produced in this way is suitable for examining the effectiveness of active substances, wound dressings, ointments, etc. on wound healing.
  • the pig skin is preferably disinfected in a suitable manner in order to prevent or inhibit bacterial and / or fungal contamination. Such contamination can, for example, in the case of longer examinations over several days, as are possible with the present skin model, lead to undesirable changes in the pig skin or to falsification of measurement results.
  • the method of disinfection chosen should also not damage or impair the skin barrier, whereby it is important not to influence the lipid composition of the horny layer.
  • Disinfectants that are suitable for disinfecting surfaces have proven to be suitable, for example hand disinfectant solutions such as Sterillium ® (Bode Chemie Hamburg; 45 g 2-propanol, 30 g 1-propanol, 0.2 g me- tronium etilsulfate ( INN) in 100 g solution), Cutasept S, (Bode Chemie) or Desderman N (Schülke & Mayr). Disinfection allows long-term examinations in the range from one to several days, which can easily be carried out with the present skin model, to avoid or minimize impairment of the measurement results by bacterial or fungal attack. A heat treatment, for example in the form of a brewing step, for disinfection or sterilization is avoided in the present invention.
  • the method preferably comprises bringing the pig skin into contact with a medium, preferably an aqueous medium, the dermis (corium, dermis) being essentially surrounded by the medium.
  • the epidermis is particularly preferably a gas phase, preferably air, preferably with CO 2 , for example in a concentration of 5% (volume amounts / volume) is enriched, exposed ("air-liquid-interphase" culture).
  • an active substance for example a substance to be investigated, can be added to the medium.
  • the active ingredient directly to the epidermis of the pig skin and / or into the wound of the model. It is also possible to apply the active ingredient intradermally, for example by injection.
  • the active ingredient can also be contained in a wound dressing or the like, for example.
  • the pig skin used must be cleaned. This can be done, for example, by simple or multiple washing with water.
  • the pig skin comes from the ear of a pig, preferably the inside of the ear, particularly preferably an area of the inside of the ear which has bulge-like thickenings (plicae scaphae). It has been shown that skin from such areas is particularly well suited for the purposes of the invention.
  • the invention also relates to ex vivo porcine skin organ models obtainable by one of the methods described above.
  • the invention also relates to the use of ex vivo skin organ models according to the invention for examining wound healing processes and for examining the influence of an active ingredient on skin, in particular on wound healing of skin.
  • wound dressings can be, for example, alginate fibers, hydrocolloids, foils (e.g. polyurethane foils), foams, (e.g. polyurethane foams), hydrogels, active carbon dressings, etc.
  • Wound ointments and wound creams can e.g. Zinc ointments and the like.
  • the active substance whose effect on the skin is to be examined is preferably selected from the group consisting of proteins, DNA, RNA, amino acids, amino acid derivatives, oligopeptides, oligonucleotides, hormones, growth factors, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals or metal ions , Insulin, glucose, honey, bovine serum albumin (BSA), vasoactive substances, plant extracts and their constituents, algae extracts and their constituents, neuroactive substances, pigment activating or inhibiting substances, proliferation promoting or inhibiting substances, migration promoting or inhibiting substances, pH changing substances, radical-generating or inhibiting substances, osmolarity-changing substances, anti-aging agents, cosmetic raw materials (e.g.
  • the active ingredient can be examined, for example, by adding it to the aqueous medium and / or by applying it to the
  • the active ingredient can also be contained, for example, in a wound dressing or the like.
  • the invention also relates to an arrangement for carrying out examinations of human or animal skin, which comprises an ex vivo skin organ model according to the invention.
  • the dermis is preferably brought into contact with a preferably aqueous medium and the epidermis is exposed to a gas phase, preferably air, which can be enriched, for example, with CO 2 .
  • a gas phase preferably air
  • An active ingredient to be investigated is contained in the aqueous medium, for example.
  • the active substance can also be applied to or introduced into the epidermis.
  • the active ingredient can also, alternatively or additionally, be applied to or introduced into the wound.
  • the active ingredient is preferably selected from the group consisting of proteins, DNA, RNA, amino acids, amino acid derivatives, oligopeptides, oligonucleotides, hormones, growth factors, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals or metal ions, insulin, glucose, honey, Bovine serum albumin (BSA), vasoactive substances, plant extracts and their components, algae extracts and their components, neuroactive substances, pigment-activating or -
  • BSA Bovine serum albumin
  • L0 inhibiting substances proliferation-demanding or - inhibiting substances, migration-promoting or -inhibiting substances, pH-changing substances, radical-generating or -inhibiting substances, osmolarity-changing substances, anti-aging agents, cosmetic raw materials, anti
  • L5 inflammatory and inflammatory substances UN light damage-preventing substances, pain-inhibiting substances, allergy-triggering substances, anti-allergic substances, bactericidal and virussatic substances, anti-drug substances, energy-giving substances (e.g. ATP,
  • Fig. 1 A pig's ear immediately after separation from a slaughtered pig
  • FIG. 2 The inside of a cleaned and disinfected pig's ear, in which the hair has been shortened and removed from the skin section ("punching").
  • Fig. 3 shows an "air-liquid interphase" culture of a pig skin punch.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of an ex vivo skin culture model according to the invention before the wound is placed.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of the ex vivo skin culture model according to the invention with a wound.
  • the ear 7 of a slaughtered pig was placed between two compresses soaked in physiological saline immediately after slaughter. The ear 7 thus prepared was processed as soon as possible. The ear 7 was washed under running water for at least 5 minutes. The hair was then carefully cut off with scissors so that the skin barrier remained intact (see FIG. 2). The ear 7 was washed again under running water. A disinfectant (Sterillium ® ) was then run on both sides. After a contact time of about 2 minutes Sterillium® of the ear 7 with the outside of the ear 7 after being added below individually impregnated with Sterillium® ® gauze.
  • Sterile gauze was also placed on the inside of the ear 7 and soaked with Sterillium ® . After 10 minutes of exposure, the ear 7 was lifted up with sterile gloves and rinsed thoroughly with sterile saline. The ear 7 was dabbed with sterile gauze and placed in a sterile bowl. skin sections
  • the adipose tissue was removed from the punches 9.
  • the epidermis 2 and the upper part of the dermis 3 were removed from the central area of the punch 9 with the aid of a 3 mm biopsy punch (from Stiefel), so that a wound 6 was formed.
  • the skin punches 9 were placed with the epidermis side up in a hole 10 in a 12-well plate (see FIG. 3), the bottom of which was covered with gauze 5.
  • the hole 10 was filled with medium to such an extent that the dermis 3 was surrounded by medium, but the epidermis 2 was in air contact.
  • the top of the punch 9 was lightly blotted with gauze.
  • the model (1) was treated immediately or only after a defined time (depending on the test requirements, e.g. after 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d) with, for example
  • Wound dressings eg gauze, hydrogels, alginate fibers, hydrocolloids, etc.
  • wound ointments / wound creams Raw materials for wound ointments / wound creams
  • Growth factors hormones, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals, insulin, glucose, honey, BSA, other energy-giving substances (eg ATP, NADH, phosphoenol pyruvate, phosphcreatine), vasoactive substances, plant extracts and their individual substances, algae extracts and their individual substances, neuroactive substances, pigment-active or inhibitory substances, other chemical active substances - fibrin / thrombin, blood, serum, plasma
  • Inhibitors / activators for enzymes e.g. metallomatrix proteinases, collagenases, elastases etc.
  • enzymes e.g. metallomatrix proteinases, collagenases, elastases etc.
  • enzyme-absorbing substances e.g. high-molecular absorbers
  • Inhibitors and activators of the build-up of the skin barrier for example stratum corneum proliferation-promoting and proliferation-inhibiting substances migration-promoting and inhibiting substances cells, for example keratinocytes, fibroblasts, melanocytes, Merkel cell tumor cells, melanoma cells, lymphocytes, granulocytes, leukocytes in general, adult stem cells mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, epidermal stem cells pH-changing substances, osmolarity-changing substances - radical-generating and inhibiting substances
  • stratum corneum proliferation-promoting and proliferation-inhibiting substances migration-promoting and inhibiting substances cells
  • cells for example keratinocytes, fibroblasts, melanocytes, Merkel cell tumor cells, melanoma cells, lymphocytes, granulocytes, leukocytes in general, adult stem cells mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, epidermal stem cells pH-changing substances, osmolarity-changing substances - radical-generating and inhibiting substances
  • UVA UVA
  • UVB sunlight
  • DNA e.g. single-stranded DNA, double-stranded DNA, plasmids
  • RNA e.g. single-stranded RNA, double-stranded RNA, siRNA
  • amino acids amino acid derivatives
  • oligopeptides e.g. single-stranded RNA, double-stranded RNA, siRNA
  • cosmetic raw materials e.g. wool wax, beeswax, essential oils etc.
  • the model was treated "systemically” (via the medium) or “topically” (applied to the punch or the wound edge or into the wound).
  • the experiments were stopped at different times (e.g. after 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6d, d).

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Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells aus Schweinehaut bereit, das insbesondere zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen geeignet ist. Bei dem Verfahren werden Haare der Haut so gekürzt, daß dabei die Hautbarriere der Epidermis intakt bleibt. Das nach dem Verfahren hergestellte Hautorganmodell erlaubt die topische und systemische Untersuchung von Wirkstoffen unter standardisierten Bedingungen und in großem Umfang, insbesondere im Rahmen eines Screening.

Description

EX-VIVO-HAUTORGANMODELL AUS SCHWEINEHAUT
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Ex- vivo-Hautorganmodells, Ex-vivo-Hautorganmodelle und deren Verwendung sowie eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher und tierischer Haut.
Die Haut ist ein wichtiges Organ des Körpers von Menschen und Tieren. Die Untersuchung der menschlichen Haut ist insbesondere für die Medizin und die Hersteller von Kosmetika von großem Interesse.
Die Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen, Hautauflagen, Grundstoffen von Salben und Cremes usw. auf die menschliche Haut kann nur in Ausnahmefällen unmittelbar am Menschen vorgenommen werden. Es sind daher zahlreiche Alternativen zur direkten Anwendung am Menschen vorgeschlagen und angewendet worden. Beispiele hierfür sind Tierversuche, Einzelzell-
Kulturen, Co-Kulturen, Hautäquivalente und humane Hautorgankulturmodelle .
Diese Alternativen weisen aber häufig Nachteile auf.
Die Durchführung von Tierversuchen ist vielfach unerwünscht oder gar gesetzlich verboten. Darüber hinaus verursachen sie, beispielsweise wegen der aufwendigen Tierhaltung, hohe Kosten und sind häufig, etwa im Fall von Nagern wie Mäusen oder Rat- ten, nur schlecht auf den Menschen zu übertragen. Die Haut von Nagern unterscheidet sich in vielen Parametern von der Haut des Menschen, beispielsweise in der Wundheilung durch den größeren Einfluß der Wundkontraktion, in der Epidermis- dicke und der Art der Gap-Junctions und Mastzellen. Die Übertragbarkeit auf den Menschen ist dadurch deutlich beeinträchtigt .
Einzel- und Co-Kulturen bilden das komplexe Organ Haut nur sehr unzureichend nach, da in der Regel verschiedene Zeiltypen und vor allem die speziellen Gewebeverbände fehlen.
Ein Hautäquivalent, d.h. eine künstlich gezüchtete Haut, ist ebenfalls nur eine unzureichende Alternative, da auch hier verschiedene Zelltypen fehlen. Zusätzlich handelt es sich um hyperproliferative Zellen und die Hautbarriere, die durch die Hornschicht (stratum corneum) der Epidermis gebildet wird, ist noch nicht komplett ausgebildet. Zudem sind Hautäquivalente sehr teuer.
Auch menschliche Hautorgankultur-Wundmodelle sind eingesetzt worden. Menschliche Haut ist aber nur in geringer Menge ver- fügbar. Die Haut stammt häufig von Menschen unterschiedlichen
Alters und Geschlechts. Da in der Regel Hautabschnitte verwendet werden, die bei Operationen angefallen sind, ist die Vergleichbarkeit von Resultaten, die mit solchen Hautmodellen gewonnen werden, auch durch die unterschiedlichen Vorerkran- kungen und Vorbehandlungen der Operierten in Frage gestellt. Zudem sind die Gewebestücke, die für die Gewinnung der Haut- organmodelle zur Verfügung stehen, kurz vorher einem größeren Gewebeverband bzw. Hautstück entnommen worden und sind in der Regel nicht sehr groß. An den Rändern dieser Gewebestücke finden massive Veränderungen durch Einsetzen der Wundheilung statt. Die für die Hautorganmodelle entnommenen Gewebeabschnitte ("Stanzen") müssen häufig in der Nähe der Randberei- ehe genommen werden und unterliegen daher dem Einfluß der "primären" Wundheilung. Standardisierte Untersuchungen sind daher entweder nur begrenzt oder gar nicht möglich. Die Durchführung von Screenings ist aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von Haut mit sehr ähnlichen Ausgangseigenschaften unmöglich.
Die Haut des Schweins ist der menschlichen Haut in vielen Parametern sehr ähnlich (Meyer W. , Hautarzt 47 .178-182, 1996; Meyer et al . , Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 92-99, 2001; Meyer et al., Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 100-111, 2001), so daß sie für die Untersuchung der menschlichen Haut, beispielsweise in einem Ex-vivo-Hautorgan odell, grundsätzlich geeignet ist.
L5
Haut von geschlachteten Schweinen ist darüber hinaus in ausreichender Menge verfügbar. Da Schweine bei der Schlachtung auch etwa im gleichen Alter (jung adult, ca. 6 Monate) sind und darüber hinaus in der Regel keine Vorerkrankungen vorlie- 0 gen oder Vorbehandlungen erfolgt sind, weist die von den
Schlachttieren gewonnene Haut vergleichsweise einheitliche Eigenschaften auf .
Ex-vivo-Hautorganmodelle aus Schweinehaut sind grundsätzlich 5 bekannt. Die bisher verfügbaren Hautorganmodelle aus Schweinehaut sind aber für viele Untersuchungen, beispielsweise solche zur Wundheilung oder solche zur Untersuchung einer Hautbarriereschädigung, nicht geeignet, da sie falsche, schlecht reproduzierbare oder unzuverlässige Ergebnisse lie- 0 fern. Beispielsweise sind bisher verfügbare Hautorganmodelle für die Untersuchung der Wundheilung aufgrund ihrer geringen Dicke (1000 μm) nicht geeignet, da sich Wunden, die noch ei- nen Dermisanteil haben, nicht reproduzierbar generieren lassen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ex-vivo- Hautorganmodell aus Schweinehaut zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Modelle nicht aufweist, insbesondere zur Untersuchung der Wundheilung geeignet ist und standardisierte Untersuchungen und Scree- nings erlaubt .
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells umfassend die Schritte a) Entnehmen von Haut mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Schweins, b) Kürzen von in der Haut befindlichen Haaren, wobei das Kürzen der Haare in einer Weise erfolgt, daß der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust (TEWL) der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren entspricht.
Es hat sich herausgestellt, daß bei den bisherigen Schweinehaut-Modellen die Hautbarriere nicht intakt ist. Unter Hautbarriere wird in der vorliegenden Anmeldung, die äußere Schicht der Epidermis, die Hornschicht (stratum corneum) , verstanden. Unter einer intakten Hautbarriere wird eine Hornschicht verstanden, die nicht mechanisch beschädigt ist und/oder eine gegenüber dem Normalzustand veränderte quantitative oder qualitative ipidzusa mensetzung aufweist. Eine Beeinträchtigung der Barrierefunktion läßt sich beispielsweise durch Messung des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) feststellen. Erhöhte TEWL-Werte zeigen eine beeinträchtige Barrierefunktion an.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Schwei- nehautmodell eignet sich gut für Untersuchungen der Wundheilung, z.B. zum Testen von Wundauflagen wie beispielsweise Gaze, Wundsalben, Wundcremes, Grundstoffen solcher Salben und Cremes, Zellen wie Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzelltumorzellen, Melano zeilen, Leukocyten, Lymphocy- ten, Granulocyten, mesenchymalen Stammzellen, embryonalen
Stammzellen, epidermalen Stammzellen, Liposomen, Bakterien, Pilzen, Viren, Prionen etc.
Es hat sich herausgestellt, daß das Kürzen bzw. Entfernen der Haare der verwendeten Schweinhaut für den Erhalt einer möglichst intakten Hautbarriere problematisch ist. Die Haare werden gekürzt oder entfernt, um beispielsweise einen ausreichenden Kontakt von Wundauflagen mit der Haut zu gewährleisten. Die Haare werden dabei beispielsweise soweit gekürzt, daß sie etwa in Höhe der Epidermis oder knapp darüber enden. Bevorzugt werden die Haare soweit gekürzt, daß sie ein bis vier Millimeter, besonders bevorzugt ein bis zwei Millimeter oberhalb der Epidermis enden. Bisher wurden die Haare beispielsweise durch Rasieren der Schweinehaut entfernt, was zu einer mechanischen Beschädigung der Hautbarriere führt, die sich anhand eines erhöhten transepidermalen Wasserverlusts feststellen läßt. Das Meß-Verfahren hierzu ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Ob die Barrierefunktion der Haut eine Beeinträchtigung erfahren hat, kann beispielsweise durch Messung des durchschnittlichen TEWL-Werts der Haut bzw. eines Hautabschnitts vor und nach dem Kürzen/Entfernen der Haare bestimmt werden. Auch eine Vergleichsmessung mit Haut, die ansonsten gleich behandelt wurde, deren Haare aber nicht gekürzt oder entfernt wurden, kann hierzu herangezogen werden. Um eine Beschädigung oder Veränderung der Hautbarriere zu vermeiden bzw. minimal zu halten, ist es vorteilhaft, die Haare beispielsweise mit einer Schere, einem Messer, einem elektrischen oder mechanischen Bartschneider oder dergleichen so abzuschneiden, daß ein mechanischer Kontakt mit der Epidermis unterbleibt oder so minimal ist, daß der durchschnittliche transepider ale Wasserverlust im wesentlichen dem von Haut entspricht, bei dem die Haare nicht gekürzt wurden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung entspricht der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem durchschnittlichen transe- pidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren, wenn der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, weiter besonders bevorzugt mindestens 98 % des durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlusts von Haut mit gekürzten Haaren beträgt .
Für Untersuchungen zur Wundheilung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Hautorganmodells wird bevorzugt eine Wunde in der Haut hervorgerufen. Dies kann dadurch geschehen, daß in einem
Abschnitt der Haut die Epidermis, etwa durch Ausstanzen, entfernt wird. Bevorzugt wird dabei auch der obere Teil der Der- mis mit entfernt. Das derart hergestellte Wundmodell eignet sich zur Untersuchung der Wirksamkeit von Wirkstoffen, Wund- auflagen, Salben usw. auf die Wundheilung. Die Schweinehaut wird bevorzugt in geeigneter Weise desinfiziert, um eine Verkeimung mit Bakterien und/oder Pilzen zu verhindern oder zu hemmen. Eine solche Verkeimung kann beispielsweise bei längeren Untersuchungen über mehrere Tage, wie sie mit dem vorliegenden Hautmodell möglich sind, zu unerwünschten Veränderungen der Schweinehaut oder einer Verfälschung von Meßergebnissen führen. Die gewählte Methode zum Desinfizieren sollte die Hautbarriere ebenfalls nicht beschädigen bzw. beeinträchtigen, wobei es hier auch darauf an- kommt, die Lipidzusammensetzung der Hornschicht nicht zu beeinflussen. Eine falsche Desinfektion kann beispielsweise cy- totoxisch wirken und die erhaltenen Meßergebnisse beeinflussen. Als geeignet haben sich Desinfektionsmittel erwiesen, die zum Desinfizieren von Oberflächen geeignet sind, bei- spielsweise Hände-Desinfektionslösungen wie Sterillium® (Bode Chemie Hamburg; 45 g 2-Propanol, 30 g 1-Propanol, 0,2 g Mece- tronium etilsulfat (INN) in 100 g Lösung) , Cutasept S, (Bode Chemie) oder Desderman N (Schülke & Mayr) . Die Desinfektion erlaubt es, bei längerfristigen Untersuchungen im Bereich von einem bis zu mehreren Tagen, die mit dem vorliegenden Hautmodell ohne weiteres durchführbar sind, eine Beeinträchtigung der Meßergebnisse durch Bakterien- oder Pilzbefall zu vermeiden bzw. zu minimieren. Eine Wärmebehandlung, z.B. in Form eines Brühschritts, zur Entkeimung bzw. Sterilisation wird bei der vorliegenden Erfindung vermieden.
Bevorzugt umfaßt das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der Schweinehaut mit einem Medium, vorzugsweise einem wässrigen Medium, wobei die Dermis (Corium, Lederhaut) im wesentlichen von dem Medium umgeben ist. Besonders bevorzugt ist die Epidermis dabei einer Gasphase, vorzugsweise Luft, die bevorzugt mit C02, z.B. in einer Konzentration von 5 % (Volu- men/Volumen) angereichert ist, ausgesetzt ( "Air-liquid- interphase" -Kultur) .
Dem Medium kann beispielsweise ein Wirkstoff, beispielsweise eine zu untersuchende Substanz, zugefügt werden. Es ist aber auch möglich, den Wirkstoff unmittelbar auf die Epidermis der Schweinehaut und/oder in die Wunde des Modells aufzubringen. Ebenso ist möglich, den Wirkstoff intradermal zu applizieren, beispielsweise durch Injektion. Der Wirkstoff kann beispiels- weise auch in einer Wundauflage oder dergleichen enthalten sein.
In der Regel muß die verwendete Schweinehaut gereinigt werden. Dies kann beispielsweise durch einfaches oder mehrfaches Waschen mit Wasser geschehen.
Des weiteren ist es vorteilhaft, das Unterhaut-Fettgewebe der Schweinehaut zu entfernen, so daß die Schweinhaut nur noch die Epidermis und Dermis umf ßt. Dadurch kann die Versorgung des Gewebes optimal gewährleistet werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn Transportprozesse untersucht werden sollen oder die Versuche längere Zeit (mehrere Tage) andauern .
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens entstammt die Schweinhaut dem Ohr eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs, der wulstartige Verdickungen (plicae scaphae) aufweist. Es hat sich gezeigt, daß Haut aus solchen Bereichen besonders gut geeignet ist für die Zwecke der Erfindung. Die Erfindung betrifft auch Ex-vivo-Hautorganmodelle aus Schweinehaut, die durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch die Verwendung erfindungsgemäßer Ex-vivo-Hautorganmodelle zur Untersuchung von Wundheilungsprozes en sowie zur Untersuchung des Einflusses eines Wirkstoffs auf Haut, insbesondere auf die Wundheilung der Ha t. Es kann auch der Einfluß von Wundauflagen, Wundcre- mes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungspro- zesse untersucht werden. Wundauflagen können beispielsweise Alginatfasern, Hydrokolloide, Folien (z.B. Polyurethanfolien), Schaumstoffe, (z.B. Polyurethanschäume), Hydrogele, Ak- tivkohleverbände usw. sein. Wundsalben und Wundcremes können z.B. Zinksalben und dergleichen sein.
Der Wirkstoff, dessen Wirkung auf die Haut untersucht werden soll, ist dabei bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, migrati- onsfördernden oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätverändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachsalkohole, Duftstoffe, Konservierungsstoffe, Emulgatoren, Harnstoff, Cera ide) , antientzündlichen und entzündungsfördernden Substanzen, UV- Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, an- tiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin) , Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und prokaryontisehen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
Der Wirkstoff kann untersucht werden, indem er beispielsweise in das wässrige Medium gegeben wird und/oder indem er auf die
Epidermis - wenn eine Wunde vorhanden ist, um die Wunde herum (auf den Wundrand) - und/oder auf die Wunde selbst gegeben wird. Es ist auch möglich, den Wirkstoff intradermal in die
Epidermis und/oder die Wunde zu applizieren, beispielsweise durch Injektion. Der Wirkstoff kann auch beispielsweise in einer Wundauflage oder dergleichen enthalten sein.
Die Erfindung betrifft auch eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher oder tierischer Haut, die ein erfindungsgemäßes Ex-vivo-Hautorganmodell umfaßt.
Bei einer solchen Anordnung ist die Dermis bevorzugt in Kontakt mit einem vorzugsweise wäßrigen Medium gebracht und die Epidermis ist einer Gasphase, vorzugsweise Luft, die bei- spielsweise mit C02 angereichert sein kann, ausgesetzt. Ein zu untersuchender Wirkstoff ist beispielsweise in dem wäßrigen Medium enthalten. Alternativ oder zusätzlich kann der Wirkstoff auch auf oder in die Epidermis auf- bzw. eingebracht sein. Für den Fall, daß eine Wunde in der Haut gesetzt wurde, kann der Wirkstoff darüber hinaus auch, alternativ oder zusätzlich, auf oder in die Wunde auf- oder eingebracht sein. Der Wirkstoff ist dabei bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wach- 5 stumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -
L0 hemmenden Substanzen, proliferationsfordernden oder - hemmenden Substanzen, migrationsfordernden oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätsverändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen, anti-
L5 entzündlichen und entzündungsfordernden Substanzen, UN-Licht- Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antian- drogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen (z.B. ATP,
.0 ΝADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin) , Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und pro- karyontischen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbei- ,5 spielen und der Figuren näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 Ein Schweineohr unmittelbar nach dem Abtrennen von einem geschlachteten Schwein
50 Fig. 2 Die Innenseite eines gereinigten und desinfizierten Schweineohrs, bei dem die Haare gekürzt worden sind und dem Hautabschnitte ("Stanzen") entnommen wurden. Fig. 3 Eine "Air-Liquid-Interphase" -Kultur einer Schweinehautstanze.
Fig. 4 Eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautkulturmodells vor dem Setzen einer Wunde.
Fig. 5 Eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautkulturmodells mit einer Wunde.
Beispiel
Das Ohr 7 eines geschlachteten Schweins (s. Fig. 1) wurde sofort nach der Schlachtung zwischen zwei mit physiologischer Kochsalzlösung getränkte Kompressen gegeben. Die Verarbeitung des so vorbereiteten Ohres 7 erfolgte so bald wie möglich. Das Ohr 7 wurde mindestens 5 min unter fließendem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Haare vorsichtig mit einer Schere abgeschnitten, so daß die Hautbarriere intakt blieb (s. Fig. 2) . Das Ohr 7 wurde nochmals unter fließendem Wasser gewaschen. Anschließend wurde über beide Seiten ein Desinfektionsmittel (Sterillium®) laufen gelassen. Nach einer Einwirkzeit des Sterillium von etwa 2 Minuten wurde das Ohr 7 mit der Außenseite des Ohrs 7 nach unten einzeln auf mit Ste- rillium® getränkte Gaze gelegt. Auf die Innenseite des Ohrs 7 wurde ebenfalls sterile Gaze gelegt und diese mit Sterillium® getränkt. Nach 10 min Einwirkzeit wurde das Ohr 7 mit sterilen Handschuhen hochgehoben und mit steriler Kochsalzlösung gründlich abgespült. Das Ohr 7 wurde mit steriler Gaze abge- tupft und in eine sterile Schale gelegt. Hautabschnitte
(Stanzen) 9 (6 mm im Durchmesser) von der Innenseite des Ohres 7 an Stellen 8 im Bereich wulstartiger Verdickungen (pli- cae scaphae) 11 des Ohres 7 wurden unter Vermeidung von Druckartefakten entnommen (s. Fig. 2) und in eine sterile Schale mit Medium gegeben. Die Stanzen 9 wurden vorsichtig durch „Eindrehen" einer "Biopsy Punch" (Fa. Stiefel) gewon- nen. Die Stanzen 9 wurden tief im Fettgewebe mit einer Schere abgeschnitten. Zum Entfernen von Sterillium®- und Kochsalzresten wurden die Stanzen 9 kurz in Medium geschwenkt. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung:
DMEM (Fa. Biochrom)
5% FCS (Fa. Biochrom)
59,9 μg/ml Penicillin (Fa. Grunenthal)
0,125 mg/ml Streptomycin (Fa. HEFA Pharma)
Das Fettgewebe wurde von den Stanzen 9 entfernt. Aus dem zentralen Bereich der Stanze 9 wurde mit Hilfe einer 3 mm Biopsy-Punch (Fa. Stiefel) die Epidermis 2 und der obere Teil der Dermis 3 entfernt, so daß eine Wunde 6 entstand. Die Hautstanzen 9 wurden mit der Epidermisseite nach oben in ein Loch 10 einer 12-Well-Platte gegeben (s. Fig. 3), deren Boden mit Gaze 5 bedeckt war. Das Loch 10 wurde soweit mit Medium aufgefüllt, daß die Dermis 3 von Medium umgeben, die Epidermis 2 aber in Luftkontakt war. Die Oberseite der Stanze 9 wurde leicht mit Gaze abgetupft.
Das Modell (1) wurde sofort oder aber erst nach einer definierten Zeit (je nach Versuchsanforderung nach z.B. 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d) behandelt mit beispielsweise
- Wundauflagen (z.B. Gaze, Hydrogele, Alginatfasern, Hydro- kolloide usw. ) Wundsalben/Wundcremes Grundstoffen zu Wundsalben/Wundcremes
Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Steroide, Retinoi- de, Ionen, Metalle, Insulin, Glucose, Honig, BSA, andere energiespendende Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenol- pyruvat, Phosphcreatin) , vasoaktive Substanzen, Pflanzenextrakte und deren Einzelsubstanzen, Algenextrakte und deren Einzelsubstanzen, neuroaktive Substanzen, pigmentaktive oder hemmende Substanzen, sonstige chemische Wirkstoffe - Fibrin/Thrombin, Blut, Serum, Plasma
Inhibitoren/Aktivatoren für Enzyme (z.B. Metallomatrix- proteinasen, Collagenasen, Elastasen usw. ) einschließlich enzymabsorbierender Substanzen (z.B. hochmolekulare Absorber) - Inhibitoren und Aktivatoren von Signaltransduktionswegen in der Zelle
Inhibitoren und Aktivatoren des Cytoskeletts Inhibitoren und Aktivatoren von Zell-Matrix-Verbindungen Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Basalme bran - Inhibitoren und Aktivatoren von Gap Junctions
Inhibitoren und Aktivatoren von Desmosomen und Adhärenz- verbindungen
Inhibitoren und Aktivatoren von Tight Junctions
Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Hautbarriere, z.B. stratum corneum proliferationsfordernden und proliferationshemmenden Substanzen migrationsfördernden und -hemmenden Substanzen Zellen, z.B. Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzelltumorzellen, Melanomzellen, Lymphocyten, Granu- locyten, Leukocyten im allgemeinen, adulte Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, embryonale Stammzellen, epidermale Stammzellen pH-Wert-verändernden Substanzen osmolaritätsverändernden Substanzen - radikalerzeugenden und -hemmenden Substanzen
UVA, UVB, Sonnenlicht
Bakterien
Viren
Allergenen - Pilzen
Parasiten
Prionen
DNA (z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Plasmide)
RNA (z.B. Einzelstrang-RNA, Doppelstrang-RNA, siRNA) - Aminosäuren, Aminosäurederivate, Oligopeptide
Oligonukleotide
Liposomen
- Anti-aging-Wirkstoffe kosmetische Rohstoffe (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, äthe- rische Öle etc.)
- antientzündliche (antiphlogistische) Stoffe
- entzündungsfördernde Substanzen Desinfektionsmittel
- Antiseptika, bakterizide und virusstatische Substanzen - UN-Licht-Schäden verhindernde Substanzen schmerzhemmende Substanzen antiallergische Substanzen
Das Modell wurde „systemisch" (über das Medium) oder „to- pisch" (Auftragung auf die Stanze bzw. den Wundrand oder in die Wunde) behandelt. ie Versuche wurden zu verschiedenen Zeitpunkten abgestoppt (z.B. nach 6 h, 12 h , 18 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6d, d) .

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, umfassend die Schritte a) Entnehmen von Haut mit Dermis (3) und Epidermis (2) vom Körper oder Körperteil eines Schweins, b) Kürzen von in der Haut befindlichen Haaren, wobei das Kürzen der Haare in einer Weise erfolgt, daß der durchschnittliche transepidermale Wasserver- lust (TEWL) der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren entspricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt c) Entfernen der Epidermis (2) in einem Abschnitt der Haut zur Erzeugung einer Wunde (6) .
3. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Desinfizieren der Schweinehaut .
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kürzen der Haare durch Abschneiden der Haare mit einer Schere, einem Messer, einem elektrischen oder mechanischen Bartschneider erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Schweinehaut mit einem vorzugsweise wässrigen Medium (4), so daß die Dermis (3) im wesentlichen von dem Medium (4) umgeben ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Epidermis (2) einer Gasphase, vorzugsweise Luft, ausgesetzt ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend die Schritte
- Reinigen der Schweinehaut
- Entfernen des Unterhaut-Fettgewebes der Schweinehaut
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schweinhaut dem Ohr (7) eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs mit wulstartigen Verdickungen (plicae scaphae) (11) , ent- stammt.
9. Verfahren nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Abschnitt auch der obere Teil der Dermis (3) entfernt wird.
10. Ex-vivo-Hautorganmodell, erhältlich durch eines der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9.
11. Verwendung eines Ex-vivo-Hautorganmodells nach Anspruch 10 zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen.
12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Untersuchung des Einflusses von Wundauflagen, Wundcremes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungsprozesse .
13. Verwendung eines Ex-vivo-Hautorganmodells nach Anspruch 10 zur Untersuchung des Einflusses eines Wirkstoffs auf Haut, insbesondere auf die Wundheilung der Haut, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfak- toren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivieren- den oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfordernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfordernden oder - hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätve- rändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmeti- sehen Rohstoffen, antientzündlichen und entzündungsfordernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen, Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und prokary- ontischen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
14. Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu mensch- licher oder tierischer Haut, umfassend ein Ex-vivo-
Hautorganmodell nach Anspruch 10.
15. Anordnung nach Anspruch 14, wobei die Dermis (3) in Kontakt mit einem vorzugsweise wäßrigen Medium (4) gebracht ist und die Epidermis (2) einer Gasphase, vorzugsweise
Luft, ausgesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (4) einen Wirkstoff enthält und/oder ein Wirkstoff auf oder in die Epidermis (2) und/oder auf oder in die Wunde (6) auf- oder eingebracht ist.
16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumal- bumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfordernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfordernden oder - hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritäts- verändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen. Rohstoffen, antientzündlichen und entzündungsfördernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Sub- stanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen, Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontischen und prokary- ontischen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
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