WO2004092354A2 - Ex-vivo-hautorganmodell, insbesondere für männliche haut - Google Patents

Ex-vivo-hautorganmodell, insbesondere für männliche haut Download PDF

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WO2004092354A2
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Ingrid Moll
Athanasios Tsianakas
Pia Houdek
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Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
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    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts

Definitions

  • the invention relates to a method for producing an ex vivo skin organ model, in particular for male skin, ex vivo skin organ models, the use of the ex vivo skin organ models and an arrangement for carrying out studies on human and animal skin.
  • the skin is an important organ of the body of humans and animals.
  • the examination of human skin is of particular interest to medicine and the manufacturers of cosmetics.
  • Carrying out animal experiments is often undesirable or even prohibited by law. In addition, they cause high costs, for example because of the complex animal husbandry, and are often difficult to transfer to humans, for example in the case of rodents such as mice or rats.
  • the skin of rodents differs from that in important parameters Human skin, for example in wound healing due to the greater influence of wound contraction, the epidermis thickness and the type of gap junctions and mast cells. The transferability to humans is clearly affected.
  • a skin equivalent i.e. Artificially grown skin is also only an inadequate alternative, since different cell types are also missing here.
  • the object is achieved by a method for producing an ex vivo skin organ model, comprising removing skin with dermis and epidermis from the body or body part of an animal, and bringing the skin into contact with an androgen.
  • Androgen means any androgenic substance, i.e. any substance that affects the formation of the primary and secondary male genital organs and / or spermiogenesis.
  • the androgen-substituted ex vivo skin organ model produced using the method according to the invention is particularly re very suitable as a model for male human skin. Reliable and easily transferable results can be achieved without the need for animal testing.
  • the model also makes it possible to standardize examinations of human and animal skin, for example for screenings.
  • the skin for the model preferably comes from the pig (Sus scrofa).
  • the skin of the pig is very similar to human skin in many parameters (Meyer W., dermatologist 47: 178-
  • the androgen is selected from the group consisting of testosterone, dihydrotestosterone, androsterone, 5-dehydro-androsterone.
  • a medium which is preferably aqueous.
  • the dermis (corium, leather skin) is particularly preferably surrounded by the medium.
  • the epidermis is preferably exposed to a gas phase, for example air, which is preferably enriched with CO 2 , for example in a concentration of 5% (volume / volume) ("air-liquid interphase" culture).
  • the androgen is contained in the medium.
  • the androgen can also, alternatively or additionally, be applied to the skin's epidermis.
  • the androgen is preferably used in an average physiological concentration for human men.
  • this can be, for example, a concentration of 5 ng / ml.
  • an active substance can be added to the medium, which can be selected, for example, from the group consisting of proteins, DNA, RNA, amino acids, amino acid derivatives, oligopeptides, oligonucleotides, hormones, growth factors, cytokines, Steroids, retinoids, ions, metals or metal ions, insulin, glucose, honey, bovine serum albumin (BSA), vasoactive substances, plant extracts and their constituents, algae extracts and their constituents, neuroactive substances, pigment activating or - inhibiting substances, proliferation-promoting or - inhibiting substances , migration-demanding or -inhibiting substances, pH-changing substances, radical-generating or -inhibiting substances, osmolarity-changing substances zen, anti-aging ingredients, cosmetic raw materials (e.g. wool wax, beeswax, essential oils etc.), anti-inflammatory and inflammatory substances, UV light damage-preventing substances, pain-relieving substances, anti-allergic
  • the hair on the skin also usually needs to be shortened or even removed. It has been shown that the type of hair shortening has an impact on how well the skin model is suitable, at least for certain examinations. In order to obtain reproducible results, it is
  • skin barrier means the outer layer of the epidermis, the horny layer (stratum corneum).
  • An intact skin barrier is understood to mean a horny layer that is not mechanically damaged and / or has a quantitative or qualitative lipid composition that is different from the normal state.
  • An impairment or damage to the barrier function can be determined, for example, by measuring the transepidermal water loss (TEWL). The measuring method for this is known to the person skilled in the art in this field. Increased TEWL values indicate an impaired barrier function.
  • Um whether the barrier function of the skin has been impaired can be determined, for example, by measuring the average TEWL value of the skin or of a skin section before and after shortening / removing the hair. A comparison measurement with skin that was otherwise treated the same, but whose hair was not shortened or removed, can also be used for this.
  • the average transepidermal water loss of the skin with shortened hair essentially corresponds to the average transepidermal water loss of skin with uncut hair.
  • the average transepidermal water loss of the skin with shortened hair corresponds essentially to the average transepidermal water loss of skin with uncut hair if the average transepidermal water loss of skin with uncut hair is at least 70%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95 %, more particularly preferably at least 98% of the average transepidermal water loss of skin with shortened hair.
  • the skin is preferably disinfected in a suitable manner in order to prevent or inhibit bacterial and / or fungal contamination. Such contamination can lead to undesirable changes in the skin or falsification of measurement results, particularly in the case of examinations which are carried out over several hours or days.
  • the chosen method of disinfection should also not damage or impair the skin barrier.
  • Disinfectants that are suitable for disinfecting surfaces have proven to be suitable, for example hand disinfectant solutions such as Sterillium ® (Bode Chemie Hamburg; 45 g 2-propanol, 30 g 1-propanol, 0.2 g Mecetronium etilsulfate ( INN) in 100 g solution), Cutasept S, (Bode Chemie) or Desderman N (Schülke & Mayr).
  • Disinfection allows long-term examinations in the range from one to several days, which can easily be carried out with the present skin model, to avoid or minimize impairment of the measurement results by bacterial or fungal attack.
  • a heat treatment for example in the form of a brewing step, for disinfection or sterilization is avoided in the present invention.
  • the skin originates from the ear of a pig, preferably the inside of the ear, particularly preferably an area of the inside of the ear which has bead-like thickenings (plicae scaphae). It has been shown that skin from such areas is particularly well suited for the purposes of the invention. .5
  • a wound is advantageously caused in the skin. This can be done by placing the epidermis in a section of the skin, for example by
  • Punch 0 is removed.
  • the epidermis can be removed, for example, before the skin is brought into contact with the androgen or afterwards.
  • the upper part of the dermis is preferably also removed.
  • the wound model produced in this way is suitable for examination
  • the invention also relates to an ex vivo skin organ model, in particular for male skin, which is characterized by one of the above. described method is available.
  • the invention also relates to the use of ex vivo skin organ models according to the invention for the investigation of wound healing processes.
  • the ex vivo skin organ model according to the invention is preferably used to investigate the influence of 5 wound dressings, wound creams, wound ointments and their components on wound healing processes in male skin.
  • Wound dressings can be, for example, alginate fibers, hydrocolloids, foils (for example polyurethane foils), foams (for example polyurethane foams), hydrogels, activated carbon dressings, etc.
  • Wound ointments and wound creams can be, for example, zinc ointments and the like.
  • ex vivo skin organ model according to the invention can also advantageously be used to investigate the influence of shaving creams, L5 after-shave products, aftershave and the like.
  • the invention also relates to an arrangement for carrying out studies on human or animal skin, which comprises a skin section with dermis and epidermis from the body or body part of an animal, preferably a pig, the skin section being brought into contact with an androgen.
  • the androgen is preferably contained in an aqueous medium, while the epidermis of the skin section is exposed to a gas phase, preferably air, which can be enriched with CO 2 .
  • the androgen is selected, for example, from the group consisting of testosterone, dihydrotestosterone, androsterone, 5-dehydro-androsterone.
  • the androgen is advantageously in one average physiological concentration for human men.
  • the physiological concentration for testosterone in men is usually between 3, 5 and 9 ng / ml.
  • the epidermis is removed in a section of the skin, so that a wound is formed in the skin.
  • This embodiment is well suited for the investigation of wound healing processes in male skin.
  • an active ingredient is added to the aqueous medium, which can be selected, for example, from the group consisting of proteins, DNA, RNA, amino acids, amino acid derivatives, oligopeptides, oligonucleotides, hormones, growth factors, cytokines, steroids, retinoids , Ions, metals or metal ions, insulin, glucose, honey, bovine serum albumin (BSA), vasoactive substances, plant extracts and their constituents, algae extracts and their constituents, neuroactive substances, pigment activating or inhibiting substances, proliferation-promoting or inhibiting substances, migration-promoting or inhibiting substances, pH-changing substances, radical-generating or inhibiting substances, os olarity-changing substances, anti-aging agents, cosmetic raw materials (e.g.
  • Substances anti-allergic substances, bactericidal and virus-static substances, antiandrogenic substances, energy donating substances (e.g. ATP, NADH, phosphoenol pyruvate, phosphcreatine), enzymes, enzyme inhibitors and activators, liposomes, eukaryotic and prokaryotic cells (e.g. blood cells), fungi, viruses and prions. 5
  • energy donating substances e.g. ATP, NADH, phosphoenol pyruvate, phosphcreatine
  • enzymes enzyme inhibitors and activators
  • liposomes eukaryotic and prokaryotic cells (e.g. blood cells), fungi, viruses and prions. 5
  • the active ingredient can also, alternatively or additionally, be applied to the epidermis. It is also possible to apply or apply the active ingredient directly into the wound and / or to apply it intradermally, for example by injection.
  • the active ingredient can also be present, for example, in a wound dressing or the like.
  • Fig. 1 A pig's ear immediately after separation from a slaughtered pig
  • Fig. 2 The inside of a cleaned and disinfected 20 pig ear, in which the hair has been shortened and the skin sections ("punching") were removed.
  • Fig. 3 shows an "air-liquid interphase" culture of a pig skin punch. > 5
  • the ear 7 of a slaughtered pig was placed between two compresses soaked in physiological saline immediately after slaughter. The ear 7 thus prepared was processed as soon as possible. The ear 7 was washed under running water for at least 5 minutes. The hair was then carefully cut off with scissors so that the skin barrier remained intact (see FIG. 2). The ear 7 was washed again under running water. A disinfectant (Sterillium ® , Bode Chemie Hamburg) was then run on both sides. After an exposure time of the Sterillium ® of about 2 minutes, the ear 7 was placed individually with the outside of the ear 7 downward on gauze soaked with Sterillium ® .
  • Sterile gauze was also placed on the inside of the ear 7 and soaked with Sterillium ® . After 10 minutes of exposure, the ear 7 was lifted up with sterile gloves and rinsed thoroughly with sterile saline. The ear 7 was dabbed with sterile gauze and placed in a sterile bowl. Skin sections (punches) 9 (8 mm in diameter) were removed at points 8 from the inside of the ear 7 in the region of bulging thickenings (plicae scaphae) 11 of the ear 7 while avoiding pressure artifacts (see FIG. 2) and into one given sterile dish with medium.
  • the punches 9 were won carefully by "screwing" a "Biopsy Punch” (from boots.) The punches 9 were deeply cut in the fat tissue with scissors to remove Sterillium ® -.. And saline groups were 9 briefly swung the punches in medium.
  • the medium had the following composition: DMEM (Biochrom) 5% FCS (Biochrom)
  • the adipose tissue was removed from the punches 9.
  • the skin punches 9 were placed with the epidermis side up in a hole 10 in a 12-well plate (see FIG. 3), the bottom of which was covered with gauze 5.
  • the hole 10 was filled with medium to such an extent that the dermis 3 was surrounded by medium, but the epidermis 2 was in air contact.
  • the top of the punch 9 was lightly blotted with gauze.
  • the skin model 1 thus created was “systemically” (via the medium) after various points in time (eg 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h, 96 h, etc.) , as well as “topical” (application to the punch). In this way their influence on various parameters could be examined.
  • Growth factors hormones, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals, insulin, glucose, honey, BSA, other energy-giving substances (eg ATP, NADH, phosphoenol pyruvate, phosphcreatine), vasoactive substances, plant extracts and their individual substances, algae extracts and their individual substances, neuroactive substances, pigment-active or inhibitory substances, other chemical active substances - inhibitors / activators of enzymes (eg testosterone-converting enzymes, metallomatrix proteinases, collagenases, Elastases) including enzyme absorbing substances
  • enzymes eg testosterone-converting enzymes, metallomatrix proteinases, collagenases, Elastases
  • Inhibitors and activators of the build-up of the skin barrier e.g. stratum corneum proliferation-promoting and proliferation-inhibiting substances migration-promoting and inhibiting substances pH-changing substances osmolarity-changing substances radical-generating and inhibiting substances - ÜNA, DNB, sunlight
  • DNA e.g. single-stranded DNA, double-stranded DNA, plasmids
  • RNA e.g. single-stranded RNA, double-stranded RNA, siRNA
  • amino acids amino acid derivatives, oligopeptides - oligonucleotides
  • Anti-aging liposomes cosmetic raw materials eg wool wax, beeswax, essential oils etc.
  • the experiments were stopped at different times (e.g. after 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6d, 7d).
  • the ear was treated as described in Example 1. However, punches 9 with a diameter of only 6 mm were produced. Before the punches 9 were placed in the multi-well plate, the epidermis 2 and the upper part of the dermis 3 were removed from the central area of the punch 9 using a 3 mm biopsy punch (from Stiefel), so that a Wound 6 arose.
  • the model was used to examine, for example
  • Wound dressings e.g. gauze, hydrogels, alginate fibers, hydrocolloids, etc.
  • wound ointments e.g. wound creams
  • Raw materials for wound ointments / wound creams Active substances, eg growth factors, hormones, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals, insulin, glucose, honey, BSA, other energy-giving substances (eg ATP, NADH, phosphoenolpyruvate, phosphcreatine), vasoactive substances, plant extracts and their individual substances, algae extracts and their individual substances, neuroactive substances, pigment-active or inhibitory substances, other chemical active substances fibrin / thrombin, blood, serum, plasma inhibitors / activators for enzymes (eg metallomatrix proteinases, collagenases, elastases etc.) including enzyme-absorbing substances (eg high-molecular absorbers) Inhibitors and activators of signal transduction pathways in the cell
  • Active substances eg growth factors, hormones, cytokines, steroids, retinoids, ions, metals, insulin, glucose, honey, BSA, other energy-giving substances (eg ATP, NA
  • Inhibitors and activators of the cytoskeleton Inhibitors and activators of cell-matrix compounds Inhibitors and activators of the structure of the basement membrane Inhibitors and activators of gap junctions - Inhibitors and activators of desmosomes and adherence compounds
  • Inhibitors and activators of tight junctions Inhibitors and activators of the build-up of the skin barrier, e.g. stratum corneum - proliferation-promoting and proliferation-inhibiting substances migration-promoting and inhibiting substances cells, e.g. Keratinocytes, fibroblasts, melanocytes, Merkel cell tumor cells, melanoma cells, blood cells (erythrocytes, leukocytes such as lymphocytes, granulocytes and
  • Monocytes, platelets Monocytes, platelets), adult stem cells, mesenchyma le stem cells, embryonic stem cells, epidermal stem cells pH-changing substances, osmolarity-changing substances - radical-generating and inhibiting substances
  • DNA e.g. single-stranded DNA, double-stranded DNA, plasmids
  • RNA e.g. single stranded RNA, double stranded RNA, siRNA
  • amino acids amino acid derivatives

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Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells für männliche Haut bereit. Das Verfahren umfaßt das Entnehmen von Haut mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Schweins, und das In-Kontakt-bringen der Haut mit einem Androgen, beispielsweise Testosteron. Das nach dem Verfahren hergestellte Hautorganmodell erlaubt die topische und systemische Untersuchung von Wirkstoffen unter standardisierten Bedingungen und in großem Umfang, insbesondere im Rahmen eines Screening.

Description

EX-VIVO-HAUTORGANMODELL, INSBESONDERE FÜR MÄNNLICHE HAUT
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, insbesondere für männliche Haut, Ex-vivo-Hautorganmodelle, die Verwendung der Ex-vivo- Hautorganmodelle und eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher und tierischer Haut.
LO
Die Haut ist ein wichtiges Organ des Körpers von Menschen und Tieren. Die Untersuchung der menschlichen Haut ist insbesondere für die Medizin und die Hersteller von Kosmetika von großem Interesse.
L5
Die Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen, Hautauflagen, Grundstoffen von Salben und Cremes usw. auf die menschliche Haut kann nur in Ausnahmefällen unmittelbar am Menschen vorgenommen werden. Es sind daher zahlreiche Alternativen zur iO direkten Anwendung am Menschen vorgeschlagen und angewendet worden. Beispiele hierfür sind Tierversuche, Einzelzeil- Kulturen, Co-Kulturen, Hautäquivalente und humane Hautorgankulturmodelle .
15 Diese Alternativen weisen aber häufig Nachteile auf.
Die Durchführung von Tierversuchen ist vielfach unerwünscht oder gar gesetzlich verboten. Darüber hinaus verursachen sie, beispielsweise wegen der aufwendigen Tierhaltung, hohe Kosten 0 und sind häufig, etwa im Fall von Nagern wie Mäusen oder Ratten, nur schlecht auf den Menschen zu übertragen. Die Haut von Nagern unterscheidet sich in wichtigen Parametern von der Haut des Menschen, beispielsweise in der Wundheilung durch den größeren Einfluß der Wundkontraktion, in der Epidermis- dicke und der Art der Gap-Junctions und Mastzellen. Die Übertragbarkeit auf den Menschen ist dadurch deutlich beeinträch- 5 tigt.
Einzel- und Co-Kulturen bilden das komplexe Organ Haut nur sehr unzureichend nach, da in der Regel verschiedene Zelltypen und vor allem die speziellen Gewebeverbände fehlen. 0
Ein Hautäquivalent, d.h. eine künstlich gezüchtete Haut, ist ebenfalls nur eine unzureichende Alternative, da auch hier verschiedene Zelltypen fehlen. Zusätzlich handelt es sich um hyperproliferative Zellen und die Hautbarriere, die durch die
L5 Hornschicht (stratum corneum) der Epidermis gebildet wird, ist noch nicht komplett ausgebildet. Zudem sind Hautäquivalente sehr teuer.
Auch menschliche Hautorgankultur-Wundmodelle sind eingesetzt .0 worden. Menschliche Haut ist aber nur in geringer Menge verfügbar. Die Haut stammt häufig von Menschen unterschiedlichen Alters und Geschlechts. Da in der Regel Hautabschnitte verwendet werden, die bei Operationen anfallen, ist die Vergleichbarkeit von Resultaten, die mit solchen Hautmodellen !5 gewonnen werden, auch durch die unterschiedlichen Vorerkrankungen und Vorbehandlungen der Operierten in Frage gestellt. Zudem sind die Gewebestücke, die für die Gewinnung der Hautorganmodelle zur Verfügung stehen, kurz vorher einem größeren Gewebeverband bzw. Hautstück entnommen worden und sind in der 0 Regel nicht sehr groß. An den Rändern dieser Gewebestücke finden massive Veränderungen durch Einsetzen der Wundheilung statt. Die für die Hautorganmodelle entnommenen Gewebeab- schnitte ("Stanzen") müssen häufig in der Nähe der Randbereiche genommen werden und unterliegen daher dem Einfluß der "primären" Wundheilung. Standardisierte Untersuchungen sind daher häufig mit diesen Modellen entweder nur begrenzt oder 5 gar nicht möglich. Die Durchführung von Screenings ist aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von Haut mit sehr ähnlichen Ausgangseigenschaften unmöglich.
Die dermatologisch-kosmetische Forschung hat sich bislang vor 0 allem auf die Haut der Frau konzentriert. Es ist aber zunehmend auch wirtschaftlich interessanter geworden, bessere Kenntnis über männliche Haut zu erhalten, die sich deutlich von weiblicher Haut unterscheidet.
L5 Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Modell für männliche Haut zur Verfügung zu stellen, bei dem auf Tierversuche verzichtet werden kann und das die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
!0 Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, umfassend das Entnehmen von Haut mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Tieres, und das In-Kontakt-bringen der Haut mit einem Androgen .
5
Unter Androgen wird jede androgen wirkende Substanz verstanden, d.h. jede Substanz, die auf die Ausbildung der primären und sekundären männlichen Geschlechtsorgane und/oder die Spermiogenese einwirkt.
0
Das mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte androgensubstituierte Ex-vivo-Hautorganmodell ist insbesonde- re sehr gut als Modell für die männliche menschliche Haut geeignet. Es können zuverlässige und gut übertragbare Ergebnisse erzielt werden, ohne daß Tierversuche vonnöten sind. Eine Standardisierung von Untersuchungen zu menschlicher, aber auch tierischer Haut, beispielsweise für Screenings, wird mit Hilfe des Modells ebenfalls möglich.
Bevorzugt stammt die Haut für das Modell vom Schwein (Sus scrofa) . Die Haut des Schweins ist der menschlichen Haut in vielen Parametern sehr ähnlich (Meyer W. , Hautarzt 47 :178-
182, 1996; Meyer et al . , Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 92-99, 2001; Meyer et al . , Münch. Tierärztl. Wschr. 114: 100-111, 2001) , so daß sie für die Untersuchung der menschlichen Haut, beispielsweise in einem Ex-vivo-Hautorganmodell, gut geeignet ist. Haut von geschlachteten Schweinen ist darüber hinaus in ausreichender Menge, vergleichbarem Alter (jung adult) und, insbesondere aufgrund des Fehlens von Vorbehandlungen oder Vorerkrankungen, in vergleichsweise einheitlicher Qualität verfügbar .
Aufgrund der früh (spätestens im Alter von 6 Wochen) erfolgenden Kastration männlicher Schweine ist reife männliche Schweinehaut nicht in ausreichender Menge und Qualität erhältlich. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, hier einen geeigneten Ersatz bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Androgen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5-Dehydro-androsteron. Es können aber auch andere Substanzen eingesetzt werden, die an- drogene Wirkung aufweisen. Bevorzugt wird die Dermis der Haut mit einem Medium in Kontakt gebracht, das vorzugsweise wäßrig ist. Besonders bevorzugt ist die Dermis (Corium, Lederhaut) dabei von dem Medium umgeben. Die Epidermis ist vorzugsweise einer Gasphase, bei- spielsweise Luft, die bevorzugt mit C02, z.B. in einer Konzentration von 5 % (Volumen/Volumen) angereichert ist, ausgesetzt ( "Air-Liquid-Interphase" -Kultur) .
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Androgen in dem Medium enthalten. Das Androgen kann aber auch, entweder alternativ oder zusätzlich, auf die Epidermis der Haut aufgebracht werden.
Bevorzugt wird das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration eingesetzt. Dies kann im Falle des Testosterons beispielsweise eine Konzentration von 5 ng/ml sein.
Zur Untersuchung des Einflusses von Wirkstoffen auf männliche (menschliche) Haut kann dem Medium ein Wirkstoff zugesetzt werden, der beispielsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Me- tallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder - hemmenden Substanzen, proliferationsfordernden oder - hemmenden Substanzen, migrationsfordernden oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritätsverändernden Substan- zen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc.), antientzündlichen und entzündungsfordernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, anti- 5 allergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen
Substanzen, antiandrogenen Substanzen, Enzymen (beispielsweise solchen, die in den AndrogenstoffWechsel eingreifen) , Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und prokaryontischen Zellen (z.B. Blutzellen), Pilzen, Viren 10 und Prionen.
Es ist aber auch möglich, den Wirkstoff unmittelbar auf die Epidermis der Haut aufzubringen oder in die Haut zu injizieren. L5
In der Regel ist es erforderlich, die verwendete Haut zu reinigen. Dies kann beispielsweise durch einfaches oder gegebenenfalls mehrfaches Waschen mit Wasser geschehen.
.0 Auch die Haare der Haut müssen in der Regel gekürzt oder gar entfernt werden. Dabei hat sich gezeigt, daß die Art und Weise der Haarkürzung einen Einfluß darauf hat, wie gut das Hautmodell zumindest für bestimmte Untersuchungen geeignet ist. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, ist es vor-
!5 teilhaft, die Kürzung bzw. Entfernung in einer Weise vorzunehmen, daß die Hautbarriere intakt bleibt. Unter Hautbarriere wird in der vorliegenden Anmeldung die äußere Schicht der Epidermis, die Hornschicht (stratum corneum) , verstanden. Unter einer intakten Hautbarriere wird eine Hornschicht ver- 0 standen, die nicht mechanisch beschädigt ist und/oder eine gegenüber dem Normalzustand veränderte quantitative oder qualitative Lipidzusammensetzung aufweist. Eine Beeinträchtigung bzw. Schädigung der Barrierefunktion kann beispielsweise durch Messung des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) festgestellt werden. Das Meß-Verfahren hierzu ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Erhöhte TEWL-Werte zeigen ei- ne beeinträchtige Barrierefunktion an. Um Ob die Barrierefunktion der Haut eine Beeinträchtigung erfahren hat, kann beispielsweise durch Messung des durchschnittlichen TEWL- Werts der Haut bzw. eines Hautabschnitts vor und nach dem Kürzen/Entfernen der Haare bestimmt werden. Auch eine Ver- gleichsmessung mit Haut, die ansonsten gleich behandelt wurde, deren Haare aber nicht gekürzt oder entfernt wurden, kann hierzu herangezogen werden.
Es hat sich herausgestellt, daß das Kürzen der Haare bei- spielsweise durch Rasieren ungeeignet ist, weil dies zu einer Beschädigung der Hautbarriere führt, die sich anhand eines erhöhten transepidermalen Wasserverlusts feststellen läßt. Um eine Beschädigung oder Veränderung der Hautbarriere zu vermeiden bzw. minimal zu halten, ist es vorteilhaft, die Haare in Höhe der Epidermis oder knapp oberhalb der Epidermis, beispielsweise mit einer Schere, einem Messer, einem elektrischen oder mechanischen Bartschneider oder dergleichen, so abzuschneiden, daß ein mechanischer Kontakt mit der Epidermis unterbleibt oder minimal ist. Die Haare werden dabei bei- spielsweise soweit gekürzt, daß sie etwa ein bis vier, bevorzugt ein bis zwei Millimeter oberhalb der Epidermis enden. Der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren entspricht im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit un- gekürzten Haaren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung entspricht der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren, wenn der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust von Haut mit ungekürzten Haaren mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 %, weiter besonders bevorzugt mindestens 98 % des durchschnittlichen transepidermalen Wasserverlusts von Haut mit gekürzten Haaren beträgt.
Vorzugsweise wird die Haut in geeigneter Weise desinfiziert, um eine Verkeimung mit Bakterien und/oder Pilzen zu verhindern oder zu hemmen. Eine solche Verkeimung kann, insbesonde- re bei Untersuchungen, die über mehrere Stunden oder Tage vorgenommen werden zu unerwünschten Veränderungen der Haut oder einer Verfälschung von Meßergebnissen führen. Die gewählte Methode zum Desinfizieren sollte die Hautbarriere ebenfalls nicht beschädigen bzw. beeinträchtigen. Als geeig- net haben sich Desinfektionsmittel erwiesen, die zum Desinfizieren von Oberflächen geeignet sind, beispielsweise Hände- Desinfektionslösungen wie Sterillium® (Bode Chemie Hamburg; 45 g 2-Propanol, 30 g 1-Propanol, 0,2 g Mecetronium etilsul- fat (INN) in 100 g Lösung) , Cutasept S, (Bode Chemie) oder Desderman N (Schülke & Mayr) . Die Desinfektion erlaubt es, bei längerfristigen Untersuchungen im Bereich von einem bis zu mehreren Tagen, die mit dem vorliegenden Hautmodell ohne weiteres durchführbar sind, eine Beeinträchtigung der Meßergebnisse durch Bakterien- oder Pilzbefall zu vermeiden bzw. zu minimieren. Eine Wärmebehandlung, z.B. in Form eines Brühschritts, zur Entkeimung bzw. Sterilisation wird bei der vorliegenden Erfindung vermieden. Des weiteren ist es vorteilhaft, das Unterhaut-Fettgewebe der Haut zu entfernen, so daß die Haut nur noch die Epidermis und Dermis umfaßt. Dadurch kann die Versorgung des Gewebes opti- 5 mal gewährleistet werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn Transportprozesse untersucht werden sollen oder die Versuche längere Zeit (mehrere Tage) andauern.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens entstammt L0 die Haut dem Ohr eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs, der wulstartige Verdickungen (plicae scaphae) aufweist. Es hat sich gezeigt, daß Haut aus solchen Bereichen besonders gut geeignet ist für die Zwecke der Erfindung. .5
Für Untersuchungen zur Wundheilung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Hautorganmodells wird vorteilhafterweise eine Wunde in der Haut hervorgerufen. Dies kann dadurch geschehen, daß in einem Abschnitt der Haut die Epidermis, etwa durch Aus-
0 stanzen, entfernt wird. Das Entfernen der Epidermis kann beispielsweise vorgenommen werden, bevor die Haut mit dem Androgen in Kontakt gebracht wird oder aber auch danach. Bevorzugt wird dabei auch der obere Teil der Dermis mit entfernt. Das derart hergestellte Wundmodell eignet sich zur Untersuchung
5 der Wirksamkeit von Wirkstoffen, Wundauflagen, Salben usw. auf die Wundheilung.
Die Erfindung betrifft auch ein Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut, das durch eines der vorstehend . beschriebenen Verfahren erhältlich ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch die Verwendung erfindungsgemäßer Ex-vivo-Hautorganmodelle zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Ex-vivo-Hautorganmodelle zur Untersuchung des Einflusses von 5 Wundauflagen, Wundcremes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungsprozesse in männlicher Haut verwendet. Wundauflagen können beispielsweise Alginatfasern, Hydrokolloide, Folien (z.B. Polyurethanfolien), Schaumstoffe, (z.B. Polyurethanschäume), Hydrogele, Aktivkohleverbände usw. sein. 0 Wundsalben und Wundcremes können z.B. Zinksalben und dergleichen sein.
Das erfindungsgemäße Ex-vivo-Hautorganmodelle kann vorteilhaft auch zur Untersuchung des Einflusses von Rasiercremes, L5 After-Shave-Produkten, Rasierwasser und dergleichen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher oder tierischer Haut, die !0 einen Hautabschnitt mit Dermis und Epidermis vom Körper oder Körperteil eines Tieres, bevorzugt eines Schweines, umfaßt, wobei der Hautabschnitt in Kontakt gebracht ist mit einem Androgen .
5 Bei der Anordnung ist das Androgen vorzugsweise in einem wäßrigen Medium enthalten, während die Epidermis des Hautabschnitts einer Gasphase, vorzugsweise Luft, die mit C02 angereichert sein kann, ausgesetzt ist.
0 Das Androgen ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5- Dehydro-androsteron. Vorteilhaft liegt das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration vor. Beispielsweise liegt die physiologische Konzentration für Testosteron beim Mann in der Regel zwischen 3 , 5 und 9 ng/ml .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Anordnung ist in einem Abschnitt der Haut die Epidermis entfernt, so daß eine Wunde in der Haut gebildet ist. Diese Ausführungsform eignet sich gut für die Untersuchung von Wundheilungsprozessen bei männlicher Haut.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dem wäßrigen Medium ein Wirkstoff zugesetzt, der beispielsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligo- nukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroi- den, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumalbumin (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenex- trakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferati- onsfördernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfördern- den oder -hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, os olaritäts- verändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle, Wollwachsalkohole, Duftstoffe, Konservierungsstoffe, Emulga- toren, Harnstoff, Ceramide) , antientzündlichen und entzün- dungsfördernden Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden
Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energie- spendenden Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat , Phosphcreatin) , Enzymen, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und prokaryontischen Zellen (z.B. Blutzellen) , Pilzen, Viren und Prionen. 5
Der Wirkstoff kann auch, alternativ oder zusätzlich, auf die Epidermis aufgebracht werden. Es ist auch möglich, den Wirkstoff direkt in die Wunde ein- bzw. aufzubringen und/oder intradermal zu applizieren, beispielsweise durch Injektion. Der 10 Wirkstoff kann auch beispielsweise in einer Wundauflage oder dergleichen vorliegen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbei- spielen und der Figuren näher erläutert. Es zeigt: L5
Fig. 1 Ein Schweineohr unmittelbar nach dem Abtrennen von einem geschlachteten Schwein
Fig. 2 Die Innenseite eines gereinigten und desinfizierten 20 Schweineohrs, bei dem die Haare gekürzt worden sind und dem Hautabschnitte ("Stanzen") entnommen wurden.
Fig. 3 Eine "Air-Liquid-Interphase" -Kultur einer Schweinehautstanze. >5
Fig. 4 Eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautorganmodells
Fig. 5 Eine schematische Darstellung einer weiteren Ausfüh- 0 rungsform des erfindungsgemäßen Ex-vivo-Hautorganmodells Beispiel 1
Das Ohr 7 eines geschlachteten Schweins (s. Fig. 1) wurde sofort nach der Schlachtung zwischen zwei mit physiologischer Kochsalzlösung getränkte Kompressen gegeben. Die Verarbeitung des so vorbereiteten Ohres 7 erfolgte so bald wie möglich. Das Ohr 7 wurde mindestens 5 min unter fließendem Wasser ge- waschen. Anschließend wurden die Haare vorsichtig mit einer Schere abgeschnitten, so daß die Hautbarriere intakt blieb (s. Fig. 2). Das Ohr 7 wurde nochmals unter fließendem Wasser gewaschen. Anschließend wurde über beide Seiten ein Desinfektionsmittel (Sterillium®, Bode Chemie Hamburg) laufen gelas- sen. Nach einer Einwirkzeit des Sterillium® von etwa 2 Minuten wurde das Ohr 7 mit der Außenseite des Ohrs 7 nach unten einzeln auf mit Sterillium® getränkte Gaze gelegt. Auf die Innenseite des Ohrs 7 wurde ebenfalls sterile Gaze gelegt und diese mit Sterillium® getränkt. Nach 10 min Einwirkzeit wurde das Ohr 7 mit sterilen Handschuhen hochgehoben und mit steriler Kochsalzlösung gründlich abgespült. Das Ohr 7 wurde mit steriler Gaze abgetupft und in eine sterile Schale gelegt. Hautabschnitte (Stanzen) 9 (8 mm im Durchmesser) wurden an Stellen 8 von der Innenseite des Ohres 7 im Bereich wulstar- tiger Verdickungen (plicae scaphae) 11 des Ohres 7 unter Vermeidung von Druckartefakten entnommen (s. Fig. 2) und in eine sterile Schale mit Medium gegeben. Die Stanzen 9 wurden vorsichtig durch „Eindrehen" einer "Biopsy Punch" (Fa. Stiefel) gewonnen. Die Stanzen 9 wurden tief im Fettgewebe mit einer Schere abgeschnitten. Zum Entfernen von Sterillium®- und Kochsalzresten wurden die Stanzen 9 kurz in Medium geschwenkt. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung: DMEM (Fa. Biochrom) 5% FCS (Fa. Biochrom)
59,9 μg/ml Penicillin (Fa. Grunenthal) 0,125 mg/ml Streptomycin (Fa. HEFA Pharma)
5 ng/ml Testosteron (Fa. Sigma)
Das Fettgewebe wurde von den Stanzen 9 entfernt. Die Hautstanzen 9 wurden mit der Epidermisseite nach oben in ein Loch 10 einer 12-Well-Platte gegeben (s. Fig. 3), deren Boden mit Gaze 5 bedeckt war. Das Loch 10 wurde soweit mit Medium aufgefüllt, daß die Dermis 3 von Medium umgeben, die Epidermis 2 aber in Luftkontakt war. Die Oberseite der Stanze 9 wurde leicht mit Gaze abgetupft.
Das so entstandene Hautmodell 1 wurde nach definierten Zeitpunkten (z.B. 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 48 h, 96 h, etc.) mit verschiedenen Wirkstoffen sowohl „systemisch" (über das Medium) , als auch „topisch" (Auftragung auf die Stanze) behandelt. Auf diese Weise konnte deren Einfluß auf verschiedene Parameter untersucht werden.
Mögliche Parameter waren:
- Transepidermaler Wasserverlust
- Corneometrische Auswertung Eindringtiefe von Farbstoffen, Proliferationsrate
- Enzymaktivitäten - Cytokinprofil und -dynamik - Expression, Synthese und Aktivierung von Androgen- und Östrogenrezeptoren und Androgen/Östrogen verstoffwech- selnden Enzymen
- Veränderung von stratum corneum und Zellverbindungen be- züglich der Morphologie und der Zusammensetzung
Veränderung der direkten Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions
- Ausschüttung von neuroaktiven oder -hemmenden Substanzen Veränderung von Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzellen, Langerhangerhanszellen (Morphologie, Anzahl, etc . )
- Morphologie der Epidermis und der Adnexe
Mögliche Wirkstoffe:
antiandrogene Stoffe
Kosmetika für den Mann und deren Grundstoffe bzw. deren einzelne Wirkstoffe
Rasiercremes - Rasierwasser
Aftershafe-Produkte
Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Steroide, Retinoi- de, Ionen, Metalle, Insulin, Glucose, Honig, BSA, andere energiespendende Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenol- pyruvat, Phosphcreatin) , vasoaktive Substanzen, Pflanzenextrakte und deren Einzelsubstanzen, Algenextrakte und deren Einzelsubstanzen, neuroaktive Substanzen, pigmentaktive oder hemmende Substanzen, sonstige chemische Wirkstoffe - Inhibitoren/Aktivatoren von Enzymen (z.B. testosteronum- setzende Enzyme, Metallomatrixproteinasen, Collagenasen, Elastasen) einschließlich enzymabsorbierender Substanzen
(z.B. hochmolekulare Absorber)
Inhibitoren und Aktivatoren von Signaltransduktionswegen in der Zelle - Inhibitoren und Aktivatoren des Cytoskeletts
Inhibitoren und Aktivatoren von Zell-Matrix-Verbindungen
Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Basalmembran
Inhibitoren und Aktivatoren von Gap Junctions
Inhibitoren und Aktivatoren von Desmosomen und Adhärenz- Verbindungen
Inhibitoren und Aktivatoren von Tight Junctions
Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Hautbarriere, z.B. stratum corneum proliferationsfördernde und proliferationshemmende Sub- stanzen migrationsfördernde und -hemmende Substanzen pH-Wert-verändernde Substanzen osmolaritätsverändernde Substanzen radikalerzeugende und -hemmende Substanzen - ÜNA, DNB, Sonnenlicht
Bakterien
Viren
Allergene
Pilze - Parasiten
Prionen
DNA (z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Plasmide) RNA (z.B. Einzelstrang-RNA, Doppelstrang-RNA, siRNA) Aminosäuren, Aminosäurederivate, Oligopeptide - Oligonukleotide
Liposomen Anti-aging-Wirkstof fe kosmetische Rohstoffe (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc . ) antientzündliche (antiphlogistische) Stoffe
- entzündungsfördernde Substanzen Desinfektionsmittel
- Antiseptika, bakterizide und virusstatische Substanzen UV-Licht-Schäden verhindernde Substanzen
- schmerzhemmende Substanzen
- antiallergische Substanzen
Die Versuche wurden zu verschiedenen Zeitpunkten abgestoppt (z.B. nach 6 h, 12 h , 18 h, 24 h, 48 h, 3 d, 4 d, 5 d, 6d, 7d) .
Beispiel 2 (Wundheilungsmodell)
Das Ohr wurde wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt. Es wurden allerdings Stanzen 9 mit nur 6 mm Durchmesser herge- stellt. Bevor die Stanzen 9 in die Multi-Well-Platte gegeben wurden, wurde aus dem zentralen Bereich der Stanze 9 mit Hilfe einer 3 mm Biopsy-Punch (Fa. Stiefel) die Epidermis 2 und der oberen Teil der Dermis 3 entfernen, so daß eine Wunde 6 entstand.
Das Modell diente zur Untersuchung von beispielsweise
Wundauflagen (z.B. Gaze, Hydrogele, Alginatfasern, Hydro- kolloide usw. ) - Wundsalben/Wundcremes
Grundstoffen zu Wundsalben/Wundcremes Wirkstoffen, z.B. Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine, Steroide, Retinoide, Ionen, Metalle, Insulin, Glucose, Honig, BSA, andere energiespendende Substanzen (z.B. ATP, NADH, Phosphoenolpyruvat, Phosphcreatin) , vasoaktive Süb- stanzen, Pflanzenextrakte und deren Einzelsubstanzen, Algenextrakte und deren Einzelsubstanzen, neuroaktive Substanzen, pigmentaktive oder hemmende Substanzen, sonstige chemische Wirkstoffe Fibrin/Thrombin, Blut, Serum, Plasma - Inhibitoren/Aktivatoren für Enzyme (z.B. Metallomatrix- proteinasen, Collagenasen, Elastasen usw.) einschließlich enzymabsorbierender Substanzen (z.B. hochmolekulare Absorber) Inhibitoren und Aktivatoren von Signaltransduktionswegen in der Zelle
Inhibitoren und Aktivatoren des Cytoskeletts Inhibitoren und Aktivatoren von Zell-Matrix-Verbindungen Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Basalmembran Inhibitoren und Aktivatoren von Gap Junctions - Inhibitoren und Aktivatoren von Desmosomen und Adhärenz- verbindungen
Inhibitoren und Aktivatoren von Tight Junctions Inhibitoren und Aktivatoren des Aufbaus der Hautbarriere, z.B. stratum corneum - proliferationsfördernden und proliferationshemmenden Substanzen migrationsfördernden und -hemmenden Substanzen Zellen, z.B. Keratinocyten, Fibroblasten, Melanocyten, Merkelzelltumorzellen, Melanomzellen, Blutzellen (Ery- throcyten, Leukocyten wie Lymphocyten, Granulocyten und
Monocyten, Thrombocyten) , adulte Stammzellen, mesenchyma- le Stammzellen, embryonale Stammzellen, epidermale Stammzellen pH-Wert-verändernden Substanzen osmolaritätsverändernden Substanzen - radikalerzeugenden und -hemmenden Substanzen
UNA, UVB, Sonnenlicht
Bakterien
Viren
Allergenen - Pilzen
Parasiten
Prionen
DNA (z.B. Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Plasmide)
RNA (z.B. Einzelstrang-RNA, Doppelstrang-RNA, siRNA) - Aminosäuren, Aminosäurederivate, Oligopeptide - Oligonukleotide
Liposomen

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines Ex-vivo-Hautorganmodells, insbesondere für männliche menschliche Haut, umfassend das Entnehmen von Haut mit Dermis (3) und Epidermis (2) vom Körper oder Körperteil eines Tieres, und das In- Kontakt-bringen der Haut mit einem Androgen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Schwein ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, Androsteron, 5- Dehydroandrosteron.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, und die Dermis (3) der Haut mit einem vorzugsweise wäßrigen Medium (4) in Kontakt gebracht wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dermis (3) der Haut von dem Medium (4) umgeben und die Epidermis (2) der Haut einer Gasphase, vorzugsweise Luft, ausgesetzt ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in dem Medium (4) enthalten ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen auf die Epidermis (2) der Haut aufgebracht wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend die Schritte
- Reinigen der Haut, - Kürzen der Haare der Haut in einer Weise, daß der durchschnittliche transepidermale Wasserverlust der Haut mit gekürzten Haaren im wesentlichen dem von Haut entspricht, bei dem die Haare nicht gekürzt wurden,
- Desinfizieren der Haut, - Entfernen des Unterhaut-Fettgewebes der Haut.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Haut dem Ohr eines Schweins, bevorzugt der Innenseite des Ohrs, besonders bevorzugt einem Bereich der Innenseite des Ohrs mit wulstartigen Verdickungen (plicae scaphae) , entstammt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Abschnitt der Schwei- nehaut die Epidermis, bevorzugt auch der obere Teil der Dermis, zur Erzeugung einer Wunde (6) entfernt wird.
12. Ex-vivo-Hautorganmodell für männliche Haut, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Verwendung eines Ex-vivo-Hautorganmodells nach Anspruch 12 zur Untersuchung von Wundheilungsprozessen.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Untersuchung des Einflusses von Wundauflagen, Wundcremes, Wundsalben und deren Bestandteilen auf Wundheilungsprozesse .
5
15. Anordnung zur Durchführung von Untersuchungen zu menschlicher oder tierischer Haut, gekennzeichnet durch einen Hautabschnitt (9) mit Dermis (3) und Epidermis (2) vom Körper oder Körperteil eines Tieres, wobei der Hautab- 0 schnitt (9) in Kontakt gebracht ist mit einem Androgen.
16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Schwein ist.
L5 17. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einem vorzugsweise wäßrigen Medium (4) enthalten ist und die Epidermis (2) des Hautabschnitts (9) einer Gasphase, vorzugsweise Luft, ausgesetzt ist.
!0
18. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Testosteron, Dihydrotestosteron, An- drosteron, 5-Dehydro-androsteron.
5
19. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Androgen in einer für menschliche Männer durchschnittlichen physiologischen Konzentration in dem Medium (4) vorhanden ist.
0
20. Anordnung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Abschnitt der Haut die Epider- mis (2) entfernt ist, so daß eine Wunde (6) in der Haut gebildet ist.
21. Anordnung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch ge- 5 kennzeichnet, daß das Medium (4) einen Wirkstoff enthält und/oder ein Wirkstoff auf oder in die Epidermis (2) oder auf oder in die Wunde (6) auf- oder eingebracht ist.
22. Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß L0 der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Proteinen, DNA, RNA, Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Oligopeptiden, Oligonukleotiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Steroiden, Retinoiden, Ionen, Metallen oder Metallionen, Insulin, Glukose, Honig, Rinderserumal- L5 bu in (BSA) , vasoaktiven Substanzen, Pflanzenextrakten und deren Bestandteilen, Algenextrakten und deren Bestandteilen, neuroaktiven Substanzen, pigmentaktivierenden oder -hemmenden Substanzen, proliferationsfördernden oder -hemmenden Substanzen, migrationsfördernden oder - 10 hemmenden Substanzen, pH-verändernden Substanzen, radikalerzeugenden oder -hemmenden Substanzen, osmolaritäts- verändernden Substanzen, Anti-aging-Wirkstoffen, kosmetischen Rohstoffen (z.B. Wollwachs, Bienenwachs, ätherische Öle etc.), antientzündlichen und entzündungsfördernden
5 Substanzen, UV-Licht-Schäden verhindernden Substanzen, schmerzhemmenden Substanzen, allergieauslösenden Substanzen, antiallergischen Substanzen, bakteriziden und virusstatischen Substanzen, antiandrogenen Substanzen, energiespendenden Substanzen, Enzymen, Enzyminhibitoren und -
0 aktivatoren, Liposomen, eukaryontisehen und prokaryontischen Zellen, Pilzen, Viren und Prionen.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013164436A1 (fr) 2012-05-03 2013-11-07 Genoskin Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1939279B1 (de) 2006-12-01 2012-07-11 Symrise AG Hautmodell
ATE509095T1 (de) 2008-05-28 2011-05-15 Symrise Ag Menschliches ex-vivo-hautmodell
EP2795320B1 (de) 2011-12-20 2019-08-21 The Procter and Gamble Company Menschlicher hautprobenverfahren und modelle zur validierung von hypothesen für mechanismen zur kontrolle der hautpigmentierung
FR3030572A1 (fr) 2014-12-18 2016-06-24 Galderma Res & Dev Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composes

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEPLEWSKI D. AND ROSENFIELD R.L.: "Role of Hormones in Pilosebaceous Unit Development" ENDOCRINE REVIEWS, Bd. 21, Nr. 4, 2000, Seiten 363-392, XP002301341 *
JACOBS JOHN J.L. ET AL.: "Methyl-green-pyronine staining of porcine organotypic skin explant cultures: an alternative model fro screening for skin irritants" ATLA, Bd. 28, 2000, Seiten 279-292, XP009038188 *
MEYER W. ET AL.: "Untersuchungen zur Struktur der Ohrhaut beim Hausschwein, unter besonderer Ber}cksichtigung einer Verwendung in der humandermatologischen Forschung: 2. Spezielle Histologie des Integuments" BERL. M]NCH. TIER[RZTL. WSCHR., Bd. 114, 2001, Seiten 100-111, XP009038241 in der Anmeldung erw{hnt *
TAMMI R ET AL: "MORPHOMETRIC ANALYSIS OF HUMAN EPIDERMIS TREATED WITH TESTOSTERONE AND DEHYDROEPIANDROSTERONE IN ORGAN CULTURE" ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, SPRINGER, INTERNATIONAL, BERLIN, DE, Bd. 281, Nr. 6, 1989, Seiten 417-423, XP002050306 ISSN: 0340-3696 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013164436A1 (fr) 2012-05-03 2013-11-07 Genoskin Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications
US9585381B2 (en) 2012-05-03 2017-03-07 Genoskin System for keeping alive and transporting skin biopsies and applications of said system

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