JP2015505243A - 皮膚色素沈着を引き起こす機構についての仮説を検証するためのヒト皮膚サンプリング方法及びモデル - Google Patents

皮膚色素沈着を引き起こす機構についての仮説を検証するためのヒト皮膚サンプリング方法及びモデル Download PDF

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Abstract

皮膚色素沈着を引き起こす機構についての仮説を検証するための、ヒト皮膚組織サンプリング方法及びモデル、並びにエックスビボ皮膚組織において皮膚色素レベルを引き起こすための方法。この方法は、第１の培養ヒト皮膚組織サンプルを準備する工程、及び皮膚色素沈着を引き起こすための試験薬剤の効果を試験する工程、並びに処理されたヒト皮膚組織サンプルから生成された転写プロファイルを、対照の転写プロファイルと比較し、その試験薬剤が皮膚色素沈着を引き起こすという仮説を検証する工程を含む。

Description

本発明の１つの態様は、皮膚色素沈着を引き起こす機構についての仮説を検証するための、新規エックスビボ皮膚モデル及びスクリーニング方法に関する。
皮膚色素沈着レベル及び調節は相互に関連する遺伝子、タンパク質、並びに細胞内及び細胞外化合物の環境の複雑な系により決定され、制御され、そのうちのいくつかは更に解明されなければならない。皮膚色素沈着経路（単数又は複数）に不可欠な細胞プロセスの態様を模倣することができる皮膚モデルは、それゆえ、例えば、皮膚色素沈着の調整において有効な皮膚活性薬剤を特定するために所望される。
皮膚生理学及び薬剤への皮膚応答を研究するモデリング技術は歴史的に、単細胞種又は少数の共に混合された細胞種の培養から、ヒト組織均等物の製作、動物モデルの開発まで、様々な特定の技術を含んだ。しかしながら、これらの比較的単純なモデルは多くの場合、ヒト皮膚の細胞内及び細胞間の複雑性の多くを欠く。例えば、単細胞種の細胞培養は容易に利用されるが、非常に単純化されたものであり、結果をヒト皮膚に一般化することについてはひどく限定される。第１に、そのような培養物は、単に培養されることにより変えられ、特定の場合には、容易な細胞継代及び維持を促進するための遺伝子操作により変えられた細胞を含有する。第２に、そのような培養物は１単位として一定に相互作用する細胞の固有の複雑なマトリックスを説明することはできない。多細胞培養物は、天然組織の統合された機械的構造を作成することと、その細胞が正常な生理学的レベルでの細胞遺伝子発現を維持するために必要な細胞外成分を含むことを確実にすることと、における困難さのために限定される。ヒト皮膚を模倣するよう処理された幹細胞を含むモデルは、それらの意図された目的のために好適であるが、同様の問題及び限定に見舞われる。
より複雑な皮膚モデルは、動物モデル及び皮膚均等物モデルを含む。追加の複雑さを有する一方で、動物モデルはヒト皮膚に関する遺伝的変異を含む限定に悩まされる。すなわち、得られた結果の分析において、ヒト組織は動物組織とは異なって反応するという問題が常に存在し、結果を一般化する能力は妥協による。例えば、皮膚の動物モデルは天然色素レベルにおいて、又は特定の遺伝子を上方調節する能力において、ヒトの皮膚と実質的に異なり得る。更に、受容体レベルでのわずかな変化でさえも、試験薬剤が異なる反応速度論で結合する、若しくは全く結合しない、又は様々な代替の内部経路若しくは遺伝子を活性化する若しくは不活性化するような様式で結合するかどうかにより、ヒト皮膚応答において見られ得るものに関連して、より少ない、より多い、又は外見上特有である応答を引き起こし得る。更に、外因性因子が動物での試験結果に影響することがあり、試験薬剤に関連しないストレッサーもまた結果に影響し得る。
皮膚均等物モデルは、細胞の相互接続性、浸透性問題、及び解剖学的単純さの欠如により限定される。皮膚均等物モデルでのより最近の試みは器官型ヒト組織均等物として示され、不活性ポリカーボネートフィルター上で培養されるケラチノサイト等のヒト細胞のインビトロ再構築を含み得る。これらのモデルはまさにそれらの性質により、それらが試験薬剤に対する異常な感受性を引き起こし得る、バリア機能の減少を有し得る点で限定される。このモデルはまた、（ケラチノサイト及び線維芽細胞、又はケラチノサイト及びメラノサイト等の）１つ又は２つの細胞種をおそらく有するが、内皮細胞、又は更にはケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラノサイトの完全な組み合わせ等の追加の細胞を欠いて、ヒト皮膚より複雑でない。更に、器官型皮膚均等物モデルは、皮膚応答に影響し得る腺等の正常な皮膚構造もまた欠いている。
最も複雑な皮膚モデルは、ヒト皮膚組織サンプルのエックスビボ培養物を含む。分析モデルとしてエックスビボヒト皮膚を利用する先行の試みは、低い活力又は生存能力での短い寿命等の限定を有した。そのようなモデルでの先行の試みは、皮膚の正常な環境と類似しない培地中に直接浮遊する皮膚の小生検を含み、そのため、その組織は限定された寿命を有した。一過性の培養物は、発明者及び研究者が、エックスビボブタ皮膚移植での試みが７日間に限定されることを示したように、不十分であり得ることが、本分野で知られている（Ｖｉｅｌｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ ｖｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ Ｍｏｄｅｌ、米国特許公報第ＵＳ２００９／０２９８１１３号）。
更により最近のエックスビボモデルは、金属格子上で皮膚外植片を培養する試み（Ｍｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ、米国特許公報第ＵＳ２００９／０１１０７０９号）、及び受精した卵巣の卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）への皮膚移植（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｖｉａｎ−Ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｒａｆｔｓ、米国特許公報第ＵＳ２００９／００６４３４９号）を含んだ。しかしながら、そのようなモデルは構築の一過性、精巧さ、及び更に異種間問題によりやはり限定される。エックスビボ皮膚の寿命を改善する１つの試みは、欧州特許第ＥＰ ２ ０１９ ３１６（Ｂ１）号に示される。
米国特許公報第ＵＳ２００９／０２９８１１３号 米国特許公報第ＵＳ２００９／０１１０７０９号 米国特許公報第ＵＳ２００９／００６４３４９号 欧州特許第ＥＰ ２ ０１９ ３１６（Ｂ１）号
これらの進歩に関わらず、固有のドナー毎の組織変動性を扱うのに十分強固であり、弱い及び強い色調薬剤の両方を特定するのに十分な期間にわたり安定であり、ドナー組織の遺伝子トランスクリプトミクスの分析に基づいて予測できる、敏感及び予測的なエックスビボヒト皮膚組織スクリーニング方法についての要求が存在し続ける。遺伝子トランスクリプトミクスの計測は比較的速く、倍変化はエックスビボ組織サンプル中で生成された又は阻害されたメラニン量の計測等の、他の終点より短い期間で確かに確認できるので、後者は色調薬剤の低スループットスクリーニング方法において特に有用である。
本明細書で後により完全に議論されるように、色調薬剤の実際のスクリーニング方法の開発に関連する問題及び不確実性は多くある。非限定的な例は、ドナー毎の皮膚タイプ変動性の効果、外科的抽出後のドナー毎の皮膚状態変動性の効果（例えば、炎症状態及び生存能力）、培養条件が遅延及び即効活性色調薬剤の両方を評価するために十分な期間、組織サンプルの生存能力を確立し得るかどうか、エックスビボ皮膚組織が必要とされる期間にわたり遺伝子トランスクリプトミクスレベルで適切に調節され得るかどうか、エックスビボ皮膚組織の遺伝子トランスクリプトミクスの分析がインビボ結果を予測し得るかどうか、適切な陽性対照が満足なスクリーニング方法を開発するために十分に高い割合の組織サンプルでの使用のために特定され得るかどうか、及びこれらの変数が、エックスビボ皮膚組織サンプルに対する色調薬剤の効果が単離され、統計的有意性のレベルまで繰返し可能であると解釈され得る点まで制御され得るかどうかを含む。
したがって、本研究者は、色調に特異的な応答のために使用することができ、これらの問題及び不確実性のうちの１つ以上を扱う、エックスビボヒト皮膚モデル及びスクリーニング方法を開発した。
本明細書に開示される様々な実施形態に従って、ある薬剤を皮膚色調（例えば、美白）効果をもたらすのに有効であると特定するための方法が提供される。１つの実施形態に従って、この方法は、第１のヒト皮膚組織サンプルを培養する工程であって、その第１のヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、そのヒト皮膚組織サンプルを少なくとも１つの試験薬剤と接触させる工程と、その第１のヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、その転写プロファイルが図１０から選択された少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、図１０から選択されたその少なくとも２つの遺伝子が無処理の対照組織サンプルと比較して、発現レベルで方向的に適切な増加又は減少を示すとき、その少なくとも１つの試験薬剤を皮膚色調効果をもたらすのに有効であると特定する工程と、を含む。
本明細書に開示される追加の実施形態に従って、スクリーニング方法における使用のためのエックスビボ皮膚組織の調製方法が提供される。１つの実施形態に従って、この方法は、成人ヒト皮膚組織サンプルを準備する工程と、その成人ヒト皮膚組織サンプルから皮下脂肪層を除去する工程と、その成人ヒト皮膚サンプルを均一な大きさにトリミングする工程と、その成人ヒト皮膚サンプルを約２℃〜約６℃で保存する工程と、を含み、その成人ヒト皮膚組織サンプルはＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｓｃａｌｅで約２〜約４等級のドナーからのものである。
本明細書に開示される追加の実施形態は、皮膚色素沈着を引き起こす特定の機構についての仮説を検証する方法を提供する。１つの実施形態に従って、方法は、皮膚色素沈着を引き起こすための少なくとも１つの候補薬剤を特定する工程と、少なくとも１つの候補薬剤が皮膚色素沈着を引き起こすということを仮定する工程と、皮膚色素沈着を引き起こすための少なくとも１つの候補薬剤の効果を試験するために好適な条件下で、ある期間、培養ヒト皮膚組織サンプルを準備する工程であって、ヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、ヒト皮膚組織サンプルを当該期間中、少なくとも１つの候補薬剤と接触させる工程と、処理済みヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、転写プロファイルが図１０から選択された少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、図１０から選択された少なくとも２つの遺伝子の全てが無処理の対照組織サンプルと比較して発現レベルにおいて増加したもののうちの少なくとも１つであるとき、又は図１０から選択されたその少なくとも２つの遺伝子の全てが無処理の対照組織サンプルと比較して、発現レベルにおいて減少したとき、少なくとも１つの候補薬剤が皮膚色素沈着を引き起こすという仮説を検証する工程と、を含む。
追加の実施形態は、エックスビボ皮膚組織における色素レベルの駆動剤（刺激剤）を特定する方法を提供する。１つの実施形態に従って、方法は、エックスビボ皮膚組織において色素レベルを引き起こす（刺激する）工程を含み、当該工程は、ヒト皮膚組織サンプルを培養することであって、ヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含むことと、そのヒト皮膚組織サンプルを、細胞の色素沈着機構を上方調節する、エンドセリン１、幹細胞因子、メラノサイト刺激ホルモン、フォルスコリン、又は紫外光からなる対照群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることと、を含む、工程と、未知物が同様に色素沈着を上方調節する効果について評価する工程と、を含む。
５％ナイアシンアミドを用いた２つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩ組織サンプル、並びに５％ナイアシンアミド及び７．５％ナイアシンアミドを用いた１つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｖ組織サンプルにおける、ある遺伝子の、媒体対照と比較した、倍調節変化を示す。 ２４時間対照と比較した８日間にわたる無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩ組織サンプルのある遺伝子の倍変化を示す。 ２４時間対照と比較した８日間にわたる無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｖ組織サンプルのある遺伝子の倍変化を示す。 ＤＭＥＭ中で直接培養された皮膚組織の４ｍｍパンチについて、ＭＴＴ分析（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物分析）で評価された、エックスビボ皮膚組織の生存能力を示す棒グラフである。 ＤＭＥＭ及びＳＷ培地中の膜上で培養された１ｃｍサンプルについて、ＭＴＴ分析で評価された、エックスビボ組織皮膚の生存能力を示す棒グラフである。 ３３℃で組織により培地中に放出されたＩＬ−１βサイトカインのグラフである。 ３７℃で組織により培地中に放出されたＩＬ−１βサイトカインのグラフである。 ８日間の過程にわたるＦｉｔｚｐａｔｉｃｋ ＩＩＩ組織サンプルの、ある炎症及び色調遺伝子の倍変化を示す、熱マップである。 無処理の対照と比較した、４日間及び７日間での、ある色調遺伝子の倍調節変化を示す、熱マップである。 １１日間の過程にわたり３７℃で９５％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真を含む。 １０日間の過程にわたり３７℃で５０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の一連の顕微鏡写真を含む。 １１日間の過程にわたり３３℃で７０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真を示す。 １９日間の過程にわたり３３℃で７０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真を示す。 特定の実施形態で、転写分析が行われ得る、特異的な、非限定的な色調遺伝子を示す表である。 ２つの濃度のヘキサミジンでの処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１１Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 ナイアシンアミドでの処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１２Ａに示されるデータについての倍調節を示す表である。 コウジ酸及びトラネキサム酸での処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１３Ａに示されるデータについての倍調節を示す表である。 ２つの濃度のＮ−アセチルグルコサミンでの処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１４Ａに示されるデータについての倍調節を示す表である。 ２つの濃度のウンデシレノイルフェニルアラニンでの処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子についての、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１５Ａに示されるデータについての倍調節を示す表である。 色素沈着経路を上方調節することが知られる様々な化合物への露出後のエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、倍変化を示す棒グラフである。 図１６Ａに示されるデータについての倍調節を示す表である。 幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせに露出されたエックスビボ組織対無処理の対照からの表皮組織染色を示す。 幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせに露出されたエックスビボ組織からの顕微鏡写真を示し、矢印はメラノファージと考えられる構造を示す。 ２つの濃度のヘキサミジンでの処理後に内因的に引き起こされたエックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図１９Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 ナイアシンアミドでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより引き起こされた）エックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図２０Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 コウジ酸及びトラネキサム酸での処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより引き起こされた）エックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図２１Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 ２つの濃度のＮ−アセチルグルコサミンでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより引き起こされた）エックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図２２Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 ２つの濃度のウンデシレノイルフェニルアラニンでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより引き起こされた）エックスビボ皮膚組織における、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 図２３Ａに示されるデータについての倍調節変化を示す表である。 紫外線への露出後の、ある問題の色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍変化を示す棒グラフである。 ヒトエックスビボ前臨床モデルにおける臨床製剤による顕著な下方調節を示す、エックスビボモデル倍調節変化を示す、２つの各表を示す。 ヒトエックスビボ前臨床モデルにおける臨床製剤による顕著な下方調節を示す、エックスビボモデル倍調節変化を示す、２つの各表を示す。
本研究者は、色素特異的応答を計測し、現在の技術の問題及び不確実性を克服するために使用され得るエックスビボヒト皮膚モデル及びスクリーニング方法を開発した。説明のために、本発明の特異的な、非限定的な実施形態が本明細書に示される。当業者は、本明細書中の装置及び方法は単に例示であり、本発明の趣旨及び範囲から離れることなく変形がなされ得ることを、容易に理解するであろう。本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、限定的であるとは意図されないこともまた理解されるべきである。本発明の明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、同様に複数形を含むものとする。
特に定義しないかぎり、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明するためのみであり、本発明を制限することを目的としていない。
別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される、成分の量を表す全ての数値、分子量等の特性、反応条件等は用語「約」により全ての場合において調整されると理解されるべきである。
更に、本明細書及び特許請求の範囲中の任意の範囲の開示は、その範囲自体及びその中に包含される任意のもの、並びに終点も含むと理解されるべきである。別途記載のないかぎり、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値的性質は、本発明の実施形態において得ることが求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるけれども、具体的な実施例に示される数値は、できるかぎり正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は、それらのそれぞれの測定値に認められる誤差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に包含する。
エックスビボ皮膚スクリーニング方法の様々な実施形態の非限定的な態様及び実施例がここで示されるであろう。様々な実施形態が対照、培養条件、遺伝子トランスクリプトミクス、皮膚組織のプロセッシング、ｍＲＮＡプロセッシングの文脈において後に示されるが、本明細書に提供される詳細は単に例示であることが意図され、多くの改変、追加、削除、及び他の変化が本明細書中の教示に照らして可能であることが理解されるであろう。
エックスビボ皮膚スクリーニング方法／分析は概して、以下のもの：外科的廃棄物ドナー組織を回収する工程、培養のために組織を調製する工程、組織を局所適用で又は培養培地に適用して試験物質で処理する工程、組織を特定の期間、培養する工程、１つ以上の問題の終点（例えば、遺伝子転写等）を計測する工程、のうちの１つ以上を含む。これらの様々な態様の非限定的な説明は以下のとおりである。
Ｉ．ドナー組織
ドナー組織サンプルは、非限定的に、腹壁形成術又は体全体のリフト手順を含む、広く様々な手順の任意のものからの外科的廃棄物組織であり得る。本研究者により発見された１つの態様は、組織サンプルをあるＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアに限定することが望ましいことである。特定の実施形態では、ＩＩ〜ＩＶのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアを有する、又は更にスクリーニング方法においてＩＩ又はＩＩＩのいずれかであるスコアを有する、ドナー組織サンプルを使用することが所望され得る。Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアは皮膚の色についての数値分類スキーマである。タイプＩは非常に白色であり、タイプＩＩは白色であり、タイプＩＩＩはベージュ色であり、タイプＩＶは茶色の色合いを有するベージュ色であり、タイプＶは濃い茶色であり、タイプＶＩは黒色である。本研究者は、タイプＩの皮膚は、問題の色素沈着遺伝子について信頼性のあるトランスクリプトミクスデータを提供するのに十分なユーメラニン（色素）を生成しないこと、及びより高いＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアは、それらは使用され得るが、ストレス／炎症により影響される色素沈着遺伝子についての分析に、より高い変動性を導入するように見えることを発見した。例えば、タイプＶは７．５％の濃度で陽性対照に十分に応答し得るが（問題の遺伝子がその陽性対照により適切に調節されていることを意味する）、一方、この濃度の活性剤はタイプＩＩ及びＩＩＩにとって毒性であり得る。これは、より濃い色の皮膚組織は手術後にあまりストレスを受けず、それゆえ、優れた抗酸化保護として働くより大きい内蔵メラニン濃度のために、より高い濃度の陽性対照により導入されるストレスに耐えることができるという、本研究者の観測結果のためであり得る。また、本研究者は、少なくとも１つのタイプＶ組織サンプルにおいて、問題の色調遺伝子が（おそらく組織全体におけるより少ないストレスを示して）上方調節される代わりに下方調節され、タイプＶ皮膚サンプルに関連する追加の所望されない変動性を示したことを観測した。図１を参照して、５％ナイアシンアミドでＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｖドナーを、統計的有意性を伴って、下方調節することは、同じ濃度のナイアシンアミドで２つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩドナーを下方調節するより、困難であることが理解され得る。図２を参照して、無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩドナーと無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｖドナーとの比較が示される。図２に見られ得るように、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩドナーの色素沈着遺伝子はＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｖドナーにおけるより一貫して、時間全体で上方調節された。
受け取りに際して、組織は約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約６℃等の室温未満の温度で最大約２４時間保存され得る。本研究者は、より低温での保存は、組織復温に際して再び始まるであろう炎症の発展を休止し得ることを発見した。
組織サンプルをその後、皮下層を除去するためにトリミングすることができる。脂肪層の除去は培養中の組織への培地の吸収を改善し得る。脂肪層のトリミングはまた試験薬剤の局所又は培地送達のいずれかに好適である組織モデルを可能にする。組織サンプルをその後、より小さな断片（例えば、１．２５ｍｍ×１．２５ｍｍ角）に更に分けることができ、それらを多数ウェル組織プレートに入れる。特定の実施形態では、そのより小さな断片のそれぞれをウェル内の膜（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、８マイクロメートル、６ウェル膜インサート）上に置く。膜の使用は培養中の組織サンプルの生存能力を顕著に改善することができる。このことは図３Ａ及び３Ｂに示され、培地中で培養される４ｍｍエックスビボ皮膚パンチと、膜上で培養される１ｃｍ断片エックスビボ皮膚サンプルとの比較が示される。９６時間で、１ｃｍサンプルに対して、４ｍｍパンチの生存能力において著しい減少がある。
組織サンプルを、真皮を湿った状態及び表皮を乾燥した状態で保つために、等浸透圧溶液上に真皮側を下にしてプレートウェルに設置することができる。等浸透圧（又は等張）溶液はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）であってよい。更に、組織サンプルを非浸透圧（非等張）溶液に入れることもできる。溶液のいずれもそれらの中に、又は別に組織に提供される、抗真菌又は抗菌試薬を随意に有し得る。
ＩＩ．培養条件：温度、時間、湿度
本研究者は、温度、時間、及び湿度のうちの１つ以上を含む、エックスビボ組織培養条件は色調薬剤のエックスビボ皮膚スクリーニング方法のいくつかの関連する態様に影響し得ることを発見した。第１に、温度について、本研究者は、培養温度がドナー組織での（問題の色調遺伝子のはじめの上方調節の量に影響し得る）内因性炎症の量に影響することを発見した。第２に、本研究者は、陽性対照及び／又はより弱い色調薬剤が問題の色調遺伝子を下方調節するのにかかる時間は変化することができ、それは次に培養時間がどのくらい長く又は短くあるべきかに影響を与えることを発見した。第３に、本研究者は、湿度は組織生存能力に影響し得ること、及び湿度レベルの減少は組織生存能力及び／又は内因性炎症レベルに過度に影響を与えることなく、培養温度を上昇させる柔軟性を提供し得ることを発見した。
温度
内因的に調節される組織サンプル（問題の色調遺伝子を上方調節する特別な意図を伴って組織に適用された化合物がないことを意味する）では、ドナー組織サンプルは、試験化合物による問題の色調遺伝子の下方調節が観察され得るように、その遺伝子の上方調節をもたらすのに十分なレベルの内因性炎症を有するべきである。上方調節の量はドナー毎の変動性を説明するのに十分であるべきであり、これは、強固なスクリーニング方法は広いドナー集団にわたり問題の色調遺伝子の十分な量の上方調節を引き起こす培養条件を利用するべきであることを意味する。これは、試験化合物が（陽性対照がそうであるように）その色調遺伝子を下方調節することができるかどうかについての一貫した決定を可能にする。しかしながら、混乱することには、本研究者は、ドナー組織があまりに強く上方調節された場合、より弱い色調薬剤及び／又は陽性対照がドナー集団の十分な部分にわたり一貫して色調遺伝子を下方調節することができない可能性があることを観測した。本研究者は、温度選択は湿度レベルの機能でもあり得ることもまた発見した（例えば、湿度が低ければ低いほど、組織サンプルが生存したままで耐え得る温度が高くなる）。
概して、培養温度が高ければ高いほど、組織サンプルの炎症状態は大きくなる。例えば、図４Ａ（３３℃）及び４Ｂ（３７℃）に示されるように、温度が（３３℃から３７℃に）上昇するにつれ、ＩＬ−１βサイトカイン放出が増加することが観測され得る（本研究者は、培養前に、組織サンプルが２℃〜１０℃で保存され得ることを示した）。ＩＬ−１βサイトカイン放出の総量及び放出パターンは異なる温度では異なった（放出はより早い時点で３３℃でより３７℃で２倍高かった）。本研究者は、エックスビボ組織サンプルにおける炎症状態が高ければ高いほど、問題の色調遺伝子が対応して、より上方調節されることを発見した。例えば、図５は、８日間の過程にわたり培養され、分析される組織を示す（無処理）。図５では、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＩＩＩドナー組織における炎症遺伝子（ＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＴＮＦ）が上方調節されるにつれて、問題の色調遺伝子（例えば、ＰＯＭＣ、ＭＣ１Ｒ、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＴＧＦＢ１、ＥＤＮ１、及びＳＬＣ１１Ａ２）も上方調節されることが見られ得る。興味深いことに、本研究者は、少なくとも１つのタイプＶ組織ドナーにおいて同様の調節を観測しなかった。したがって、本研究者は、エックスビボ組織サンプルの炎症状態と問題の色調遺伝子の上方調節との間の相関を示した。この相関は、大きなドナー集団にわたり内因的に色調遺伝子の十分な上方調節を有することが可能であることを意味するので、重要である。
上記考慮に基づいて、特定の実施形態では、エックスビボ皮膚組織の培養温度は、約３０℃〜約４０℃、又は約３３℃〜約３７℃である。これらの温度範囲は、スクリーニング方法における使用ための、かなり一貫した及び十分なレベルの内因性炎症及び組織生存能力を有する培養組織サンプルを可能にする。ヒトの皮膚は様々な場合に３７℃よりもっと低い温度に露出されるので、皮膚の外部体温はこれより低いであろうから、およそ３７℃での成功は予想外である。更に、３３℃は代謝を遅め、皮膚が通常経験するよりずっと低い温度を提供するであろう。しかしながら、培養温度は、観察される組織毒性、所望のレベルの内因性炎症、湿度レベル、及び所望の培養時間の機能として、これらの範囲を超えて更に上昇し、又は下降し得ることが理解されるであろう。
時間
色調薬剤の強固なエックスビボ皮膚分析／スクリーニング方法は（短い期間で問題の遺伝子の調節に影響し得る）強い色調薬剤及び（問題の遺伝子の観測可能な調節に影響するためにより長い期間を必要とし得る）より弱い色調薬剤を特定するのに十分感受性であるべきである（必ずしもその必要はないが）。例えば、ある、より弱い色調薬剤は５〜１０日間、又はそれより長い日数まで、問題の色調遺伝子の信頼性のある、及び十分な下方調節を提供し得ない。理想的には、組織サンプルはより弱い色調薬剤を特定するのに十分な培養期間にわたり生存するべきである。更に、ドナー組織は、陽性対照がドナー集団の大多数にわたり色調遺伝子の適切な調節を示すのに必要な期間にわたり生存するべきである。関連して、ドナー組織集団は概して、選択された期間中、問題の遺伝子の一貫した調節を示すべきである。期間が長ければ長いほど、このことは益々そのようにあるべきである。
本研究者は、ナイアシンアミド、ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヘキサミジン、トラネキサム酸、コウジ酸、及びＮ−アセチルグルコサミンを含む、いくつかの可能性のある陽性対照を選択し、試験し、分析した。図６を参照して、本研究者は、４日間超、好ましくは６日間超の培養期間がドナー集団にわたり内因性炎症に対する色調遺伝子の一貫した下方調節を示すためにナイアシンアミドについて所望されることを発見した。本研究者は、ある実施形態で、様々な基準について２４時間〜７日間の培養期間における一貫性を発見した。ウンデシレノイルフェニルアラニン等の、ある陽性対照はより速く応答することができ、一方で、他の陽性対照は更に長いことを必要とし得る。したがって、様々な場合における期間は２４時間〜１４日間、又はそれ以上であり得る。ある例示的な場合には、期間は６〜８日間である。薬剤がその組織にとってひどくストレスを与えると分かる場合、又は組織全体の生存能力を減少させる場合、又は非常に活性若しくは有効である場合には、有効な及び意味のある結果を得るために、時間過程を短縮することができ、又は用量応答のレベルを作成することができる（又は両方であり得る）。例えば、これらの場合、時間は２４〜２８時間であり得る。
湿度
本研究者は、培養物の寿命が独特の条件、例えば、湿度を減少させた条件下で、もっとより長い期間、結果の大きな一貫性を伴って維持され得ることを驚くべきことに発見した。これは、上記に議論されるように、より弱い色調薬剤を特定するために延長された期間、培養すること、並びに／又は陽性対照による問題の色調遺伝子の適切な及び一貫した調節のために十分な時間を提供することが必要とされ得る場合に有用であり得る。更に、湿度を減少させることにより、本研究者は、組織生存能力及び一貫した遺伝子調節をなおも維持する一方で、別のより高い温度で培養することが可能であることを発見した。具体的には、湿度に関して、本研究者は、培養物の寿命が湿度を減少した条件下でもっとより長い期間維持され得ることを、驚くべきことに発見した。標準の培養技術は９５％以上に達する、非常に高い湿度を有する傾向がある。本研究者は、湿度を減少させることは皮膚サンプル生存能力に対して意味深い効果を有することを発見した。
図７ａを参照して、３７℃及び９５％湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織が最小限ＤＭＥＭ中で到着日から１１日まで示される（最小限ＤＭＥＭは追加の変数を最小限にするために可能な限りほとんど成分を添加しないＤＭＥＭを言う）。観察され得るように、組織形態はこの期間にわたり実質的に退化した。比較として、図８は、１１日までの、７０％湿度及び３３℃で培養されたエックスビボ組織サンプルを示し、組織の形態はこの期間にわたり大部分は無傷のままである。
特定の実施形態では、ヒト皮膚組織サンプルは１００％未満の湿度環境で培養される。様々な場合、ヒト皮膚組織サンプルは約５０％〜約９０％、若しくは約５０％〜約７０％の相対湿度、及び／又は約３０℃〜約４０℃、若しくは約３５℃〜約４０℃の培養温度の組み合わせで培養される。実際に、本研究者は、組織生存能力及び／又は形態をなおも維持しながら、エックスビボ皮膚組織を（例えば、７０％湿度及び３３℃で）１９日まで培養した（例えば、図９を参照のこと）。別の実施形態では、組織サンプルは約５０％相対湿度及び約３７℃で培養され得る（例えば、図７ｂを参照のこと）。培養物は密閉されていてもされていなくてもよく、内部湿度に影響し得るカバー又は上面を有していても有していなくてもよい。培養物はまた、特定の実施形態で、２４時間〜１０日間培養され得る。
温度、時間及び湿度についてのある範囲が本明細書中で提供されるが、これらの示される範囲のうちの１つ以上が増加又は減少され得ることが理解されるであろう。例えば、温度、湿度及び培養時間は、利用される陽性対照（単数又は複数）により影響され得る。組織毒性は培養時間を限定することがあり、その限定された培養時間は今度はその組織サンプル中の所望のレベルの内因性炎症を提供するための温度及び湿度の選択を決定し得る。
試験薬剤及び組織供給
特定の実施形態では、エックスビボ皮膚組織を少なくとも１つの問題の試験薬剤と接触させる。エックスビボ皮膚組織は、局所製剤の毎日の適用、及び／又は以前に適用された任意の非吸収製剤若しくは化学物質を除去するためのサンプルのふき取り前に乾燥され得る。ある場合には、サンプルの水和レベルを１回又は複数回試験することができ、サンプルを、最適な結果を生成するために１回若しくは複数回又は供給毎に乾燥させることができる。エックスビボ皮膚組織は細胞の代謝速度に基づいて供給され得る。供給は１日に多数回、毎日、１日おき、又は（２、３、又はそれ以上等の）多週間をとおした特定の日であり得る。３７℃で維持される培養物については毎日の供給、３３℃で維持される培養物については１日おきのように、供給は温度依存的であり得る。
ＩＶ．遺伝子トランスクリプトミクス及び陽性対照
エックスビボ皮膚分析を開発するとき、本研究者は、タンパク質終点（例えば、ユーメラニン）及び／又はｍＲＮＡ終点に対して分析するかどうかの選択に直面した。皮膚サンプルにおいて、タンパク質レベルは可変であり得、タンパク質単離は大きな、可溶性の乏しいマトリックス分子の量のために複雑である。ｍＲＮＡ終点が現代のマイクロアレイ技術により提供される、より高い分析スループット速度のために魅力的である一方で、非限定的に、エックスビボ皮膚は十分な期間、トランスクリプトミクスレベルで適切に調節され得るかどうか、ドナー集団の十分な割合にわたり問題の色調遺伝子の一貫した及び適切な調節を提供した、適切な陽性対照が特定され得るかどうか、トランスクリプトミクス分析がインビボ結果の予測となり得るかどうか、及び十分なＲＮＡが分析のために得られ、ＲＮＡを分解し得るＲＮアーゼの導入について多数の可能性のある源を考慮して維持され得るかどうか、を含む、顕著な問題及び不確実性がこの終点の計測に関連している。陽性対照は理想的には、必ずしも必要ではないが、概して、可能性のある問題の試験薬剤と同じ効果／遺伝子調節の方向性（典型的には下方調節）を提供するよう選択されるべきである。陽性対照としてこの役割を果たす既知の色調基準薬剤の能力は、追加の不確実性であった。
更に、エックスビボ皮膚組織は本質的にストレス状態にあるので、本研究者が直面した混乱させる要素は、可能性としてストレス関連遺伝子でもある（又はストレス関連遺伝子と相互作用する）、色調調節遺伝子の二重関係に関連した。制御された様式で遺伝子を増加させる又は減少させる薬剤の利用は、投与、時間、及び色調遺伝子に対しても効果を有し、又は色調遺伝子によっても調節され得る、遺伝的ストレッサー応答により複雑化され得る固有の遺伝子状態により複雑化される。色調及びストレス応答を調節する遺伝子のそのような二重関係は容易に結果分析を混乱させ、データ結果及び解釈を複雑化させ得る。更なる不確実性は、基準が（臨床的な保証を示す、可能性のある基準でさえも）大きなドナー集団（例えば、組織サンプルの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、又は更に８０％）にわたり陽性対照として使用されるよう、遺伝子レベルで十分に一貫して働き得るかどうかであった。陽性対照は、ドナー組織における問題の色調遺伝子が試験条件下で適切に調節されるかどうか（例えば、問題の遺伝子、又は組織状態について予想されるように上方若しくは下方調節される遺伝子）を評価するために、及び試験化合物に関連するトランスクリプトミクスデータの解釈を援助するために使用される。したがって、陽性対照として既知の基準色調化合物を選択し、利用することにより、皮膚色素沈着に関連する遺伝子配列について、遺伝子発現を決定することができ、ドナー集団の関連する部分にわたり一貫した、統計的に有意なトランスクリプトミクスパターンがおそらく得られ得る。このパターンはその後、試験中のドナー組織の適切な調節を確実にするために、及び皮膚色素沈着に影響する新規薬剤の適用による同じ遺伝子に対する効果を分析し、遺伝子調節パターンにより臨床的成功を予測するために使用され得る。このようにして、組織サンプルのゲノム状態に関連するドナー毎の変動性はスクリーニング方法においてもまた取り扱われ得る。
本研究者は、いくつかの「ハウスキーピング」遺伝子と共に、ｍＲＮＡ終点分析の可能性のある候補として約１５個の真皮及び表皮遺伝子を特定した。これらの遺伝子は図１０に列挙される。文献に示される色素沈着プロセスに関連する真皮及び表皮遺伝子が概略され、試験に保証を与える候補遺伝子のリストが選択される。ハウスキーピング遺伝子は、処理されても変わらないままであると予測された遺伝子として選択された。このことを確認するために、多数のハウスキーピング遺伝子を選択した。サンプルはおよそ同じ大きさのものであり、サンプル当たりのおよそ等しい細胞数の考慮を確実にするために、結果をハウスキーピング遺伝子について正規化した。表皮遺伝子としては、プロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム（Dochrachrome）互変異性化酵素、形質転換成長因子−β １、及びエンドセリン１が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子は単純さの目的のために本明細書で後に議論されるが、これは本明細書の方法での使用に好適な遺伝子の非限定的な選択であり、他の遺伝子が追加又は置換され得、図１０に示される遺伝子の全てが本明細書に示される方法に組み込まれる必要はないことが理解されるであろう。
このリストから、本研究者は、表皮遺伝子間でさえもかなりの量の変動性はあったが、表皮遺伝子は概して、可能性のある陽性対照（例えば、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、及びトラネキサム酸、並びにウンデシレノイルフェニルアラニン等の基準色調化合物）により、真皮遺伝子より一貫して調節されることを発見した。図１１〜１５を参照して、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びウンデシレノイルフェニルアラニン（それぞれ、２〜１０回の実験）についての、３７℃及び７０％湿度で内因的に引き起こされたエックスビボ組織系における無処理の対照に対する９個の表皮色調遺伝子の調節について、実施例が示される。データは、基準化合物の間でいくらかの変動性があることを示唆する。例えば、９個の表皮遺伝子のうち、少なくとも１つの化合物（ヘキサミジン）は９個の遺伝子を調節し（ｐ＜０．１又はそれより良い統計的有意性で）、一方、２つの化合物は５個又はそれ以下の遺伝子を調節した（ｐ＜０．１又はそれより良い）。以下の表１は、ｐ≦０．１の統計的有意性で、内因的に引き起こされた組織サンプルにおいて、ある物質により調節される表皮遺伝子の数を要約する。
Figure 2015505243
スクリーニング方法の特定の実施形態では、転写プロファイルは群、プロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム互変異性化酵素、形質転換成長因子１、及びエンドセリン１から選択される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータからなる。他の実施形態では、転写プロファイルはプロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム互変異性化酵素、形質転換成長因子１、及びエンドセリン１の転写に関連するデータからなる。
特定の実施形態では、エックスビボスクリーニング方法は、（特定の実施形態では、図１０からの２〜９個の遺伝子を含む）２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の問題の遺伝子を、ｐ≦約０．１又はｐ≦約０．０５で調節する１、２、３、４又はそれ以上の陽性対照を利用する。陽性対照の浸透特性により、薬剤（単数）若しくは薬剤（複数）は培地に添加され、又は（非限定的な例として、表皮への局所適用を含む）局所適用され得る。例えば、ヘキサミジンは局所でのその低い浸透のために培地に添加され得る。
特定の実施形態では、第２のヒト皮膚組織サンプルは陽性対照として基準色調薬剤を伴ってスクリーニングされる（そして、ヒトドナー組織サンプルは、特定の場合、少なくとも第１及び第２のヒト組織サンプルに分けられ得る）。基準色調薬剤は、特定の実施形態では、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、ウンデシレノイルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びそれらの組み合わせであり得る。第２のヒト皮膚組織サンプルについてのスクリーニングプロセスは図１０からの２つ以上の遺伝子に関連する転写プロファイルの生成を更に含むことができ、基準色調薬剤の使用を含むことができ、基準色調薬剤は皮膚色調効果の上昇させる又は下降させる（図１０からの２つ以上の遺伝子等の）遺伝子を上方調節又は下方調節する。皮膚色調効果は、全体的な又は局所的な皮膚色調及び／又は皮膚色素沈着における任意の変化であり得る（例えば、年齢によるしみ（age sport）又は老人性ほくろにおけるように）。
特定の実施形態では、図１０から選択される遺伝子に関連するｍＲＮＡ調節の分析は、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＹＲＰ１）、又はドーパクロム互変異性化酵素（ＴＹＲＰ１又はＤＣＴ）等の、メラニンレベルにおける変化を直接的に引き起こす遺伝子の概略を含み、分析は、（転写因子、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）等の）メラニンレベルに間接的に影響し得る遺伝子の分析から分離され得る又はそれとの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡレベルの分析は、（特定の実施形態では、ｐ値を含む）統計的分析、又は（図形表示を通して又は表中のｍＲＮＡレベルから示されるように）視覚的に観測可能な統計的に有意な変化、傾向、若しくはパターンについての倍変化若しくは倍調節を含み得る。他の特定の実施形態では、ヒト皮膚組織サンプルが処理に対する応答を示さない場合、実験を繰り返すことができ、この場合、第２の実験は、実験結果が偽陰性のためではないことを確認するために行われ得る。
スクリーニングされた試験サンプルは、特定の場合、外科的廃棄物組織からのものであり、膜上で培養され、又は皮下脂肪層を含み、若しくは皮下脂肪層を除去されたサンプルを含むことができる（そして、ヒトドナー組織サンプルが少なくとも第１及び第２のヒトドナー組織サンプルに分けられる特定の実施形態では、皮下脂肪層は分割前に除去され得る）。ある実施形態におけるスクリーニングは複数の試験薬剤についての、同じ又は異なるドナーからの組織でのスクリーニングの繰返しを含む。スクリーニングは皮膚組織表現型を模倣するために組織にエネルギー源を適用することもまた含むことができ、年齢によるしみ又は光応答である皮膚組織表現型を含むことができ、及び／又はパラクリン剤の局所適用を更に含み得る（例えば、ある場合には、幹細胞因子及び／又はエンドセリン−１はそれぞれ、４０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである）。スクリーニングは、試験薬剤を含む化粧品スキンケア組成物の製剤化もまた含み得る。スクリーニングは成人ヒト皮膚組織サンプルもまた含むことができ、サンプルは真皮及び表皮側を有し、真皮側を、真皮を湿った状態で、及び表皮を乾燥した状態で保つために等浸透圧溶液に真皮側を下にして設置する。
本研究者は、５０〜７５％の成功率を提供することができ、そのため、何百〜何千のエックスビボ組織サンプルを試験するとき、そのスクリーニング方法を利用することができる、陽性対照を特定した。この成功レベルは、何百ものスクリーニングにわたる化合物スクリーニングのための器官系の使用が、以前に見られなかった、及び統計的比較のために最小限のサンプルサイズしか典型的に必要としない初期の学究的な調査研究の一貫性のレベルを大きく超えた、あるレベルの一貫性を必要とするという事実のために有用である。
ＩＶ．化合物及びエネルギー駆動スクリーニング方法
内因的に引き起こされたスクリーニング方法は、基準の選択及びトランスクリプトミクス一貫性について、化合物駆動スクリーニング方法に優り、ある効果を有する一方で、特定の実施形態では、化合物又はエネルギー（例えば、電磁エネルギー又は光源）駆動スクリーニング方法が所望され得る。化合物駆動スクリーニング方法では、１つ以上の化合物が局所適用され、又は組織培養培地に添加され、内因性組織炎症により提供される上方調節を超えて、問題の色調遺伝子のうちの１つ以上の上方調節を増加させ、又は年齢によるしみ等の組織表現型を模倣し得る。エネルギー駆動スクリーニング方法では、紫外光等の電磁エネルギー源が組織サンプルに与えられ、内因性組織炎症により提供される上方調節を超えて、問題の色調遺伝子のうちの１つ以上の上方調節を増加させ、又は組織表現型を模倣し得る。
化合物駆動エックスビボ皮膚組織方法
非限定的に、インターロイキン１ α、インターロイキン１ β、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１７、フォルスコリン、ＭＳＨ、エンドセリン１、幹細胞因子、及びそれらの組み合わせを含む、組織炎症を増加させる様々な薬剤が利用され得る。特定の実施形態では、インターロイキン１７若しくはインターロイキン１又は腫瘍壊死因子αは、炎症を増加させるために皮膚組織サンプルに適用され得る。他の実施形態では、パラクリン剤又は１つ以上のサイトカインが様々な種類の炎症を引き起こすために遺伝子を上方調節するよう利用され得る。利用される任意のストレッサーは培養開始２４時間以内に様々な実施形態で適用され得る。
図１６を参照して、色素沈着経路を刺激することが知られる様々な化合物（例えば、フォルスコリン、幹細胞因子、及びα−ＭＳＨ）はエックスビボ組織培養物において、ｐ≦０．１で、１つ以上の問題の色調遺伝子をそのように上方調節し得ることを見ることができる（結果はそれぞれ最低２〜１０回の実験を含む）。このことは、問題の色調遺伝子が、（おそらく何百又は何千の様々なドナーが使用される）生存能力のある市販のスクリーニング方法を作成するために十分な、ドナー集団の少なくとも一部にわたり一貫して、エックスビボ組織培養物において適切に調節され得ることを示すのみでなく、このある遺伝子の上方調節は、例えば、年齢によるしみ等の、ある組織表現型を模倣するためにもまた使用され得る。
幹細胞因子は年齢によるしみの形成に関連していることが示唆されている（Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ ｉｓ Ｏｖｅｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｌｅｎｔｉｇｏ Ｓｅｎｉｌｉｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ ５ ｏｆ ２００４，ｐｐ １２５６〜６５を参照のこと）。エンドセリンが年齢によるしみの形成に関連していることもまた示唆されている（Ｉｍｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ ａｓ ａ Ｎｅｗ Ｍｅｌａｎｏｇｅｎ：Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉｔｓ Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ ｉｎ ＵＶＢ−Ｅｘｐｏｓｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９５），１０５，ｐｐ ３２〜３７）。
エックスビボ組織培養物への、エンドセリン１との組み合わせの幹細胞因子の適用は、驚くべきことに年齢によるしみ表現型を模倣するように見える組織学的結果を生成した。図１７を参照して、エックスビボ組織培養物の表皮調製物のＦｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色は、幹細胞因子／エンドセリン１の組み合わせへの露出後に、対照に対して増加した色素沈着を示す。したがって、エックスビボ組織サンプルにおいて色調に関連する、ある組織表現型を複製することは可能であり得るように見える。スクリーニング方法の特定の実施形態では、エックスビボヒト皮膚組織サンプルはエンドセリン１又は幹細胞因子のうちの少なくとも１つに露出される。エンドセリン１の濃度は約４０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬであることができ、幹細胞因子の濃度は約４０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬであり得る。
化合物又は物質はエックスビボ組織サンプルにおいて問題の色調遺伝子を上方調節するために、局所的に又は培養培地に添加され得るが、本研究者は、ある場合に試験薬剤又は陽性対照によるこれらの遺伝子の下方調節を一貫して検出することはより困難であり得ることを発見した。図１９〜２３を参照して、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びウンデシレノイルフェニルアラニンについて、３７℃及び７０％湿度で幹細胞因子及びエンドセリンの組み合わせにより引き起こされたエックスビボ組織における、無処理の対照に対する９個の表皮色調遺伝子の調節について、（それぞれ２〜１０回の実験の）実施例が示される。データは、内因的に引き起こされた系についてより、基準化合物の中でより変動性があることを示す（例えば、図１１〜１５を参照のこと）。例えば、９個の表皮遺伝子のうち、少なくとも１つの化合物（ウンデシレノイルフェニルアラニン）は５個の遺伝子を調節し（ｐ＜０．１又はそれより良い統計的有意性で）、一方、２つの化合物は２個又はそれより少ない遺伝子を調節した（ｐ＜０．１又はそれより良い）。以下の表２は、ｐ≦０．１の統計的有意性で、幹細胞因子／エンドセリン１で引き起こされた組織サンプルにおいて、ある物質により調節された表皮遺伝子の数を要約する。
Figure 2015505243
エックスビボ皮膚組織を伴う、化合物駆動スクリーニング方法を利用することは有益であり得る。しかしながら、そのようなスクリーニング方法は内因的に引き起こされたスクリーニング方法と同じレベルの、陽性対照及び／又は試験化合物（両方とも下方調節化合物である）による問題の色調遺伝子の一貫した及び検出可能な調節を提供し得ないように見える。
エネルギー駆動エックスビボ皮膚組織方法
特定の実施形態では、例えば、スクリーニング方法において使用され得る、光応答又は日焼け表現型を誘発するためのように、エックスビボ組織サンプルを電磁放射源に供することが所望され得る。紫外光はヒト皮膚組織サンプルの１つ以上の問題の色調遺伝子を上方調節するために使用することができ、その後、無処理の対照と比較した遺伝子発現変化を評価するために、遺伝子転写分析を行ってもよい。特定の実施形態では、組織サンプルを約５０ｍＪ〜約１０Ｊのエネルギーに約２時間〜約４８時間、又は約２時間〜約２４時間の期間、供することができ、エネルギーは紫外スペクトル（例えば、約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ）内である。他の実施形態では、組織サンプルを約２Ｊ〜約１０Ｊのエネルギーに約２時間〜約４８時間の期間、供することができる。遺伝子転写分析は、電磁放射源への露出後２時間〜約９６時間、又はそれ以上の間に、行われ得る。
図２４を参照して、２Ｊ及び６Ｊ処理は、ＵＶエネルギーに供されない対照と比較して、ＵＶ露出２４時間後に計測されたとき、様々な問題の色調遺伝子を上方調節したことが見られ得る。具体的には、図２８は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシン関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）、ドーパクロム互変異性化酵素（ＤＣＴ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦＢ１）、及びエンドセリン１（ＥＮＤ１）の誘発を示す。図１Ｂは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ｖ−ＫＩＴ（ＫＩＴ−幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体）、エンドセリン受容体Ｂ（ＥＤＮＲＢ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）、ＢＣＬ−２関連タンパク質（ＢＡＸ）、リンパ様エンハンサ結合１因子（ＬＥＦ１）を示す。
エックスビボ皮膚組織は皮膚色調表現型を誘発させるために、化合物又は放射源のいずれかにより操作され得る。エックスビボ皮膚組織におけるこれらの表現型のうちの１つ以上の誘発はその後、これらの表現型を鎮静させる、減少させる、逆行させる、若しくは改善する、又はそうでなければ、引き起こされた皮膚組織において上方調節された１つ以上の問題の色調遺伝子を下方調節する、試験化合物をスクリーニングするために使用され得る。
ＶＩ．ｍＲＮＡプロセッシング
本研究者はまた、このスクリーニング方法にとってあまり必須ではないことが分かったが、それでもなお利点を提供し、そのスクリーニング方法の進歩にとって必然であることが分かった変数を説明すること（とりわけ、データ分析のための組織収集、輸送、及び組織回収における変数を説明すること等）により、驚くべき画期的な点を提供した。
本明細書に示される方法及びモデルは（ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の物質を得るために、又はこれらの物質を分析するために）物質の分析又は追加の分析のために粉砕され又は均質にされた、ヒト皮膚組織サンプルを含み得る。
本明細書に示される方法及びモデルは、完全な又は部分的なヒト皮膚組織サンプルからの、又は（レーザー顕微解剖、若しくは物理的な細胞若しくは細胞層の除去、又は本分野において既知の他の方法を通してのように）そのようなサンプルから除去された単細胞種からの、ＲＮＡ分析を含み得る。真皮及び表皮層を除去し、別々に又は共に分析することができる。プロファイルはヒト皮膚組織サンプル（単数）又はサンプル（複数）の、そのような個々の細胞、層、又は複数の細胞、層、部分（又は全体）から生成され得る。
色調を調節することが知られるパネルの遺伝子に関連する、薬剤の試験後のｍＲＮＡ調節の分析は、薬剤が皮膚色調効果の提供に有効であると特定するための基礎を提供し得る。例えば、非限定的な例では、色調を調節することが知られる遺伝子を含む、色素沈着遺伝子パネルを決定することができ、そのパネルはＰＯＭＣ、ＭＣＲ１、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＴＧＦＢ１、及びＥＤＮ１等の遺伝子についてのｍＲＮＡ分析を含む。
様々な非限定的な実施例では、薬剤を皮膚色調効果の提供に有効であると特定することは、このパネルの遺伝子を含み、無処理の対照と比較して、方向的に適切な発現レベルの増加又は減少を観察し得る。薬剤が有効であるとの決定は（増加した又は減少した）遺伝子のうちの２つに関連することがある。他の実施例では、このパネルのうちの５個の遺伝子又は８個全ては、適用された薬剤に応答して、発現レベルを変えられた。他では、このパネルは１０個の遺伝子からなり、（２、３、５、８、１０等の）様々な数の遺伝子が有効性の決定に関連している。薬剤が有効であるという決定は、反復ウェル又は試験の、統計的試験及び／又は統計的有意性もまた含み得る。例えば、反復は３又は５又は１０又はそれ以上のサンプルの大きさ（ｎ）に関連し得る。更に、ｍＲＮＡレベルの統計的有意性は０．０５、０．０１、０．０１、０．００１未満又はそれに等しく設定することができ、又は代替のレベルで設定することができる。
ＶＩＩ．層スクリーニング
ある実施形態では、スクリーニング方法は繰り返して使用される。スクリーニング方法は準備する、接触させる、生成する、比較する、及び特定する工程の繰返しを含むことができ、各繰返しのためのヒト皮膚組織サンプルは異なるドナーからのものである。各繰返しは異なる試験薬剤もまた含み得る。複数の試験薬剤をスクリーニングしてもよい。ある実施形態では、約５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００超、及び／又は約１０００若しくは８００未満の試験薬剤をスクリーニングしてもよい。
本明細書に示されるスクリーニング方法はまた、層スクリーニングプロセスを提供するために他のスクリーニング方法と組み合わせてもよい。層はレベル当たりの複雑さの増加に関連する。すなわち、各層が追加のデータを提供するという事実のために、有望な薬剤により正確に集中して結論を引き出すことができる。それゆえ、より高次の層は、有効であることのより高い確率を有する可能性のある、より少ない数の薬剤に関連する。
層は以下のように進み得る。酵素分析、細胞ベースの培養、インビトロ分析、及び本発明に係るエックスビボ皮膚分析。酵素分析はタンパク質機能の分析を含み、細胞ベースの培養は単に、主に培養プレート中の細胞培養を含み、インビトロ分析は組み合わされた細胞種でのより複雑な培養条件を含む。最初の層は、より高い出力で比較的より迅速に完了することができ、一方で、高度な層は追加の時間を含み、より低いスループットに関連する。各層の徹底的な分析は、色調関連薬剤の成功の確率を増加させる最終的なデータを提供する。
ＶＩＩＩ．化粧品組成物
様々な美容的皮膚色調効果を消費者に提供することが望ましいため、本明細書に記載されるスクリーニング方法のうちの１つ以上によって特定される試験薬剤又は化合物を、皮膚への局所適用に好適な化粧品組成物に組み込むことが有益であり得る。つまり、化粧品組成物に成分として試験薬剤を含むことが所望され得る。ある実施形態では、化粧品組成物は、皮膚科学的に許容できる担体、試験薬剤、及び提供される特定の化粧品組成物に一般的に含まれる種類の１つ以上の任意の成分を含んでもよい。そのような任意の成分としては、ビタミン、ペプチド及びペプチド誘導体、並びに糖アミンが挙げられるが、これらに限定されない。他の任意の成分は、日焼け止め活性剤（又は日焼け止め薬剤）及び／又は紫外光吸収体を含む。ある実施形態では、化粧品組成物は着色剤、界面活性剤、フィルム形成組成物、及び／又は流動調整剤を含み得る。本明細書の好適な化粧品組成物は、例えば、乳濁液、ローション、乳、液体、固体、クリーム、ジェル、マウス、軟膏、ペースト、血清、スティック、スプレイ、トニック、エアロゾル、フォーム、鉛筆形のもの等を含む、本分野において既知の様々な形態のうちの任意の１つであってよい。化粧品組成物は、例えば、ジェル、フォーム、ローション、及びクリームを含む、ひげ剃り予備製品に組み込まれることもまたでき、エアロゾルタイプと非エアロゾルタイプの両方を含む。他の化粧品組成物は、発汗抑制剤、防臭剤、並びに石鹸及びシャンプー等の身体洗浄組成物を含む。
本明細書に示される方法を用いて特定された試験薬剤を組み込んだ組成物は、概して、組成物及び局所組成物を作製する、本分野において知られるような従来の方法により調製され得る。かかる方法は、典型的には、加熱、冷却、真空の適用等を用いて又はそれらを用いずに、１つ又はそれ以上の工程で、成分を比較的均一な状態になるまで混合する工程を伴う。典型的に、乳濁液は、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後２相を適宜組み合わせて、所望の連続相を得ることにより調製される。組成物は、好ましくは、安定性（物理的安定性、化学的安定性、光安定性等）及び／又は活性物質の送達を最適化するように調製される。本組成物は、治療期間にとって十分な量の組成物を保存するように寸法設定されたパッケージで提供されてもよい。パッケージの寸法、形状、及びデザインは広く異なり得る。あるパッケージの例は、米国特許第Ｄ５７０，７０７号、同第Ｄ３９１，１６２号、同第Ｄ５１６，４３６号、同第Ｄ５３５，１９１号、同第Ｄ５４２，６６０号、同第Ｄ５４７，１９３号、同第Ｄ５４７，６６１号、同第Ｄ５５８，５９１号、同第Ｄ５６３，２２１号、米国特許公報第２００９／００１７０８０号、同第２００７／０２０５２２６号、及び同第２００７／００４０３０６号に示される。
ＩＸ．実施例
以下は、本明細書に記載される方法の様々な態様の非限定的な実施例である。実施例は、その多くの変形が可能であるので、例示の目的のためにのみ与えられ、本発明の限定として解釈されるべきでない。
（実施例１）
皮膚調製
個々の実験は概して、関連するエックスビボ（外植片）研究に使用されるヒト外科的廃棄物皮膚のプロセッシングを含む。例示的実施形態をここで以下に示す。
調製のための材料は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ及びＧｌｕｔａｍａｘ、抗生物質及び抗真菌剤、１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−ｃａ、−ｍｇ））、１５０×１５ｍｍ滅菌培養皿、滅菌ゲージ４×４、使い捨て安全外科用メス、４ｍｍ使い捨て生検パンチ、６ウェル細胞培養インサート、消毒済みピンセット、綿棒、６ウェル培養皿罫線付き消毒済みまな板（１２×１２）、スクレーパーハンドル、組織凍結培地、生検カセット、凍結組織凍結容器、１０％ホルマリン、固定組織用の輸送用容器、及びバイオハザード／鋭利物容器を含んだ。
皮膚調製は、皮膚の到着に先立つ培地の調製を含んだ。（３Ｘ培地は５００ｍＬ ＤＭＥＭ、並びに１５ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤を含む。３Ｘはインキュベーションの開始１時間に使用される抗生物質／抗真菌剤の３倍レベルについて言及したものである。１Ｘ培地は５００ｍＬ ＤＭＥＭ、並びに５ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤である。）皮膚は滅菌培養皿中の滅菌ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上で真皮（脂肪）側を下にして到着した。培養皿はテープで閉じられ、バイオハザードジップロック袋に入れられ、第２の容器中の氷のう上にあった。
到着に際して、皮膚を袋から取り出し、３Ｘ ＤＭＥＭ培地に浸漬し、４℃で１時間保存した。１時間後、皮膚を３Ｘ ＤＭＥＭから除去し、滅菌１Ｘ ＰＢＳですすいだ。皮膚を１Ｘ ＤＭＥＭに浸漬したガーゼを含有する清潔な培養皿に入れた。サンプルを到着と同日に培養し始めたが、ある実施形態ではサンプルを４℃で一晩置く。
培養物の調製では、以下のことを行った。まな板上で、表皮が下になり、脂肪が露出されるように、皮膚をひっくり返した。脂肪を、滅菌鋸歯状鉗子で皮膚の１つの角部を慎重につかみ、皮膚に対して４５°の角度で握った刃で脂肪を削り取ることにより、使い捨て外科用メスで除去した。脂肪を除去した後、外科的端を直定規ガイドに沿ってスクレーパーを用いて外科用メスで切り落とし、皮膚はそこに保持した。スクレーパーをガイドとして用いて、皮膚を、幅を計測するために（まな板のもの等の）定規を用いて１．２５ｃｍ（格子上の２×２角）幅の条片に切った。この条片を１Ｘ ＰＢＳを含有する１００ｍｍ培養皿ですすいだ。条片を１．２５ｃｍ2角に切り、それらを３０分後に培養し始めるまで、１００ｍｍ培養皿中の１Ｘ ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上に設置した（様々な非限定的な実施例において使用される１５分、３０分、４５分、又は１時間の時点で）。
（実施例２）
培養
エックスビボ皮膚を用いた培養の例の実施形態は本明細書で以下に示される。
培養は培養プレートの設定を含んだ。２．５ｍＬの培地又は処理を６ウェル組織プレートの各ウェルに入れ、各ウェルに１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ培養インサートを加え、１００μｌの１Ｘ ＤＭＥＭを各インサート膜の中心の上に入れた。角をランダムに選択し、膜上の培地の上部上の、各インサートに設置した（１インサート当たり１片の皮膚）。プレートを３３℃で保存した（追加の非限定的な実施例は実験終点により３７℃であろうが）。対照として、基準組織計測を余剰の廃棄物から回収した（低温学を急速凍結のために使用した）。基準の生検回収はＭＴＴ用の２つの４ｍｍパンチを含んだ。１つの４ｍｍパンチを新鮮な組織構造のためにＯＣＴ中で急速凍結させた。１つの４ｍｍパンチを１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋のために発送した。ＰＣＲ基準もまた、液体窒素中で急速凍結した６個の４ｍｍパンチでとった。
モデルの培養及び処理は、ｎ＝５の反復を含んだ（ｎ＝６等の追加の量の反復を使用してもよいが）。皮膚の培地投与は（ＰＢＳ、培地、アルコール、及びＤＭＳＯを含む）適切な溶媒中で使用される可溶化（solublizing）を含んだ。（ＤＭＳＯの使用では、プレート中の最終濃度は０．０１％に制限された。）適切な希釈を処理のために行った。処理のために１日当たり１プレート当たり１５ｍＬの培地が必要とされ、細胞培養インサート下の１ウェル当たり２．５ｍＬの培地が必要とされた。培地を事前に温め、実験中毎日交換した。
皮膚に局所投与した。そのようにするために、問題の化合物の製剤を得た。可能な限り試験処方に近い媒体を有することにより変動を最小限にした（グリセリン濃度が同じであったことを確認すること、処方にビタミンパッケージがあったかどうかを決定すること、ナイアシンアミド（niacimamide）が存在したかどうかを決定すること、これらの全ては媒体対照処方と試験処方との間で同じであった）（理想的な実施形態では、唯一の相違は未知の試験化合物である）。皮膚を２０μｌの製剤で容積流量ピペットを用いて処理した。適用後、処方を広げ、その中で擦りつけるために滅菌綿棒を使用した。培地を毎日交換した。培地を吸引し、１ウェル当たり２．５ｍＬのレベルで新鮮な温めた培地と置換した。
培養プロセスは生存能力のある培養物を維持し評価するプロセス、及びｍＲＮＡ分析のための組織の回収のために前もって調製するプロセスを含んだ。これらのプロセスは生存能力試験のための様々な調製工程を用いるために、及び（時点実験のための）培養物終点分析のために調製することにより、調製された。細胞生存能力を評価するために、ＭＴＴ比色分析を利用した（ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物））。低温学をサンプル回収のために使用した。
実験を開始する前に、全ての管及びプレートに適切に標識を付けた。まな板、鉗子、４ｍｍパンチ、液体窒素バケツ、及びＭＴＴプレートを使用可能にした。また、１組の管をＲＮＡを得るために取得した（特定の実施形態では、６個の基準サンプルが回収された）。ＭＴＴプレートに事前に標識を付け、ＤＭＥＭ培地中の１ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ ６００μｌを各ウェルに添加した。全てのサンプルは４ｍｍ生検であった。（事前にアルコールで清潔にした）工芸用まな板上で（Ｓｋｌａｒ ４ｍｍ生検パンチ等の）生検パンチ及びハンマーを用いて、ＲＮＡ用の２パンチ、並びにＭＴＴ用の１パンチを取った。全ての必要なパンチを取るために、１度にマット上で（ｎ＝５又はｎ＝６等の）１つの処理群について作業して、生検を取るためにハンマーを軽くたたいた。２つのパンチをスクリューキャップ管に入れ、液体窒素中で急速凍結した。ＭＴＴプレート中の１ウェル当たり、１つのパンチを設置した。作業を手早く行った。全てのサンプルを回収するための処理群当たりの時間は５分であった（５〜１０分が回収時間の非限定的な例である）。全ての群がプロセスされたら、ＭＴＴプレートをインキュベーターに２４時間入れた。
ＭＴＴ評価はインキュベーター中での２４時間のインキュベーションを含んだ。ウェルプレート（２ｍＬの深さ）に１サンプル当たり１ｍＬのイソプロパノールを準備した。１ウェル当たり１サンプルを設置し、そのウェルを密閉し、標識を付した。プレートを３日間の抽出のために４℃に入れた（サンプルは読み取り前に少なくとも３日間抽出しなければならず、より長い抽出が、ある実施形態で考えられる）。
ＭＴＴプレートを以下の様式で読み取った。９６ウェル透明平底プレートを使用した（任意の細胞培養プレートがおそらく使用され得るが）。深いウェルプレート中でイソプロパノールを混合し、その後、１５０μｌの各サンプルを新規９６ウェルプレートにピペットで入れた。ＧＥＮ５ソフトウェアを伴うＥＰＯＣＨプレートリーダーを使用し、吸収終点を（１つの実施例では５６２で）使用のために選択した。プレートをリーダーに入れ、読み取った。データを操作及び使用のためにエクセルシートにエクスポートした。
（実施例３）
ｍＲＮＡプロセッシング、ナノドロップ定量及び純度評価、ＲＮＡ定量ゲルプロトコル、ｃＤＮＡ合成、並びにＰＣＲ設定
ｍＲＮＡプロセッシング
ｍＲＮＡをエックスビボ皮膚方法のためにプロセスした。例の実施形態を本明細書で以下に示す。
凍結調製及び抽出のために、以下の装置を得、調製した。２ｍＬ丸底管に１ｍＬのＴＲＩＺＯＬを調製し、各サンプルについて５ｍｍのステンレススチールビーズを準備した。ドライアイスバケツを得、液体窒素をそのバケツに入れた。生検パンチをドライアイス上で維持し、サンプルを凍結したままにした。凍結袋及びｃｏｖａｒｉｓ ｃｒｙｏｐｒｅｐをサンプルの凍結破砕において使用した。サンプルを凍結破砕するために、生検を凍結袋（サンプル当たり２つ）に入れ、液体窒素に浸し、その後、ｃｒｙｏｐｒｅｐ（設定４）に入れた。サンプル袋を取り出し、窒素に再び浸した。平坦なディスクを除去し、ＴＲＩＺＯＬを有する対応する２ｍＬ管に入れた。ディスクをＴＲＩＺＯＬ中で凍結したまま維持した。管を閉じ、急速凍結し、管全体を液体窒素に入れた。全てのサンプルでこのプロセスを繰り返した後、サンプルを箱に入れ、次の工程まで−８０で保存した。
サンプルを融解する前に、ＰＬＧ Ｈｅａｖｙ管を準備し（１２０００ｒｐｍで２分間、事前に遠心分離し）、（１度に２４個のサンプルについて作業して）準備した。サンプルを含有する凍結丸底管を融解した。サンプルを３０００ｒｐｍで３分間、ビーズ拍動させた。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。この時間の間、１．５ｍＬ管に２００μｌクロロホルムを含有する管を準備した。ＴＲＩＺＯＬ上清を取り、クロロホルム管に添加し、その後ボルテックスした（１５秒間）。総量１．２ｍＬの上清及びクロロホルムをＰＬＧ管に添加した。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相をＰＬＧ管から除去し、２ｍＬの深いウェルに入れ、２４個の各セットを同じプレートに回収し、添加と添加との間、４℃で保存した（様々な実施形態では、サンプルが同じ日にＭａｇｍａｘ上に設置されない場合、プレートを凍結することができる）。
次に、Ｍａｇｍａｘ磁気ビーズＲＮＡ抽出を行った。水相を含有する深いウェルのプレートを融解した。プレートを以下に示される表３に示されるように準備した。緩衝液が瓶に添加された適切なアルコール量を有することを確認するために洗浄緩衝液のチェックを行った。修正洗浄１をマイクロＲＮＡ抽出を得るために使用した（瓶中の１２ｍＬ＋１２ｍＬイソプロピルアルコール）。二次洗浄も行った。溶離緩衝液は事前に作られたものであり、任意の添加物を必要としなかった。
Figure 2015505243
プレートをＭａｇｍａｘ用に準備したら、機械を作動させ、適切なプロトコルを選択し、プレートをロードした。本研究者は、抽出が加熱工程であり、抽出場所での余分な時間はＲＮＡを分解するであろうことに気付いたので、３５分間のランサイクルを行い、プレートを除去した。溶離プレートをホイルで密閉し、蓋をホイルの上に設置した。ＲＮＡを必要になるまで−８０で保存した。
ナノドロップ定量及び純度評価
ナノドロップ定量及び純度評価を行った。ＲＮＡを含有する溶離プレートを、ナノドロップ読み取りを行う前に、完全に融解した。ＥＰＯＣＨプレートリーダーを作動させ、ＴＡＫＥ３付属プレートを取り出し、リーダーに入れた。スライドを使用前、サンプルとサンプルとの間、及び片付ける前に、水、その後、アルコールで清潔にした。Ｇｅｎ５ソフトウェアを開き、ＴＡＫＥ３セッションを選択し、サンプルの種類についてナノドロップを選択した。３μｌの溶離緩衝液をスライドの両方のカラム上に多重チャネルピペットを用いて入れた。付属品を静かに閉じた。読み取りブランクをソフトウェア上で選択した。スライドを清潔にした。３μｌのサンプルを各カラムに添加した。読み取りをサンプルについて選択し、ソフトウェアは自動的に、データをエクセルにエクスポートした。結果をエクスポートし、保存した。
ＲＮＡ定量ゲルプロトコル
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｉｐ ＲＮＡ−Ｎａｎｏを用いて、ＲＮＡ定量ゲルを行った。試薬を調製した。
以下のＡｇｉｌｅｎｔ試薬を４℃の冷蔵庫から取り出した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｕｅ（色素）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ（ナノラダー、使用前に７０°で２分間加熱し、氷上に置き、管に５μｌずつ等分し、−２０°で保存した）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｒｅｅｎ、及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｒｅｄ（ゲル）。試薬を１０分間、室温まで温めた。５５０μｌのＡｇｉｌｅｎｔ Ｒｅｄ（ゲル）をピペットでフィルターカラムに入れ、室温で１５００ｇで１０分間遠心分離した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｕｅ（色素）を１０秒間、ボルテックスした。６５μｌのフィルターを通したゲルを管に等分し、１μｌのＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｕｅ（色素）を添加し、その管を１３０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、Ａｇｉｌｅｎｔチップを９μｌのゲル−色素混合物と共にプライミングステーションにロードした。プライミングステーションを３０秒間閉じ、続いてプランジャを引いた。プライミングステーションの残りの２Ｇウェルを９μｌのゲル−色素混合物でロードした。ラダーサンプルのロードに関して、以下のものを使用した。ラダーウェルを含む各ウェルに５μｌのＡｇｉｌｅｎｔ Ｇｒｅｅｎをピペットで入れ（使用されないウェルには、６μｌのＡｇｉｌｅｎｔ Ｇｒｅｅｎを添加した）、１μｌのＡｇｉｌｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ（ナノラダー）をラダーウェルに添加し、１μｌのサンプルを各ウェルに添加した。チップ振とう器内でのボルテックスを１分間行い、それに際してＡｇｉｌｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した。
ｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡサンプルから、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ反応を、はじめにマスターミックス、その後、サンプル体積、最後に水を伴って、０．２ｍＬＰＣＲストリップ管中で行った。蓋を閉じ、混合及びスピンダウンを行った。管をサーマルサイクラーに入れ、作動させ、サンプルを４度で保ち、その後続いて、ＰＣＲ反応に必要になるまで−２０で保存した。
ＰＣＲ設定
ＰＣＲをＲＯＸを伴うＱｕａｎｔａ Ｐｅｒｆｅｃｔａ Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎマスターミックスを用いて行った。ＰＣＲプレートにプロジェクトの番号を付した。全てのプレートにＰＣＲに必要なプライマーを事前に入れた。試薬を混合し、その後、反応混合物をプレート全体に等分して、１ウェル当たり２０μｌ入れた。プレート設定は１２×８サンプルであり、プレート下に向かって８サンプル、横に向かって１２遺伝子であった。設定反応を０．５ｍＬ管中で行った。ＰＣＲプレートを使用前に室温にした。マスターミックスを使用前に遠心分離した。ＰＣＲ分析はＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア、並びにハウスキーピング遺伝子及び幾何学的手段の使用を含んだ。
（実施例４）
エンドセリンでの色調駆動
例示的実施形態では、色調を幹細胞因子及び／又はエンドセリンの適用により引き起こす（皮膚調製、培養、及びｍＲＮＡプロセッシングは先に説明されるように完了した）。１つの例の実施形態では、皮膚サンプルを、１ウェル当たり２．５ｍＬの培地を有する、６ウェルプレートに入れる。８０ｎｇ／ｍＬの濃度の幹細胞因子及び８０ｎｇ／ｍＬのエンドセリンをウェル中の組織に適用し、培地を毎日新しくした。培養物を７日間維持した。色調関連遺伝子の阻害剤を適用した。ヘキサミジン及びウンデシレノイルフェニルアラニンを、それぞれ０．１％及び０．２５％で媒体中で毎日、局所適用した。
（実施例５）
紫外光（ＵＶ）での色調駆動
本研究者は色調を引き起こすためにＵＶ処理を利用した。１つの例の実施形態が本明細書中以下に示される。
皮膚を先に説明されるように得て、培養した。皮膚をＵＶ照射範囲で処理し、色素沈着機構のＵＶ駆動調節を調べるために時間過程を取った。ＵＶ処理を適用するために、プレートを日光刺激器に入れ、ＵＶＡ及びＵＶＢ光線を与えた。具体的には、皮膚を０、１、２、４、及び６Ｊで処理した。組織を５及び２４時間でＰＣＲ用に収集した。サンプルを２４及び９６時間まで維持した。２ ＆ ６Ｊ ＵＶ処理は、外植片系において、ＰＯＭＣ、ＭＣ１Ｒ、ＭＩＴＦ、Ｔｙｒ、ＴＲＰ２、及びＥＮＤＯ １を上方調節した。より低い２Ｊの照射量を用いて、ＵＶ後９６時間まで待つと、先に見られなかった、これらの遺伝子の劇的により高い倍変化、並びにＤＣＴ（ドーパクロム互変異性化酵素（ＴＹＲＰ２））の２倍増加が生成された。更に、成長因子ＦＧＦ２及びＨＧＦ、並びにエンドセリン受容体Ｂはこの条件で上方調節された。最後に、９６時間で（アポトーシスに対して保護する）ＢＣＬ２はほぼ３倍上がったが、一方で、Ｂａｘ（アポトーシスマーカー）は上方調節されなかった。
（実施例６）
スクリーニング方法により特定される薬剤、並びに特定された薬剤のインビトロ及びインビボデータ
エックスビボスクリーニング方法は、インビトロ研究と一致し、臨床的に陽性であることが証明された、薬剤を特定した。１つのそのような例はヘキシルデカノールである。ヘキシルデカノールはインビトロモデルで試験したとき、色調を調整することができる薬剤として保証された。例えば、メラニン総量分析を、メラニンを生成することが知られるラット黒色腫系を用いて行った。ヘキシルデカノールは対照と比較して、そのような細胞培養物により生成されるメラニン総量を減少させた。エックスビボモデルはこれらの結果を確認した（下方調節を示すエックスビボデータについては図２５ａ及び２５ｂを参照のこと）。それゆえ、インビトロモデル及びエックスビボモデルから特定されたヘキシルデカノール等の有望な色調薬剤を臨床設定で試験した。
例えば、ヘキシルデカノールを、９週間を通して、媒体対照及び陽性対照（５％ナイアシンアミド＋１％ウンデシレノイルフェニルアラニン）と比較した。具体的には、試験は、３３０人の対象が試験製品を受ける、１週間の正規化期間を含む、ランダム化、二重盲検、総当たり、媒体対照、分割面設計での、９週間の臨床研究を含んだ。新規化合物処理は、媒体に対してｐ値＜０．１０（１面で）である場合、有意差があるとされた。ヘキシルデカノールは統計的に媒体対照より優れていた。この薬剤はしみ領域断片において対照とは顕著に異なること（顔面当たりのしみの総領域が対照群と比較して減少したこと）、及びメラニンは媒体対照と比較して均等であったことが分かった。
任意の相互参照又は関連特許若しくは関連出願を包含する本明細書に引用される全ての文献は、明確に除外ないしは別の方法で限定されない限り、その全てを本明細書に参照により組み込まれる。いかなる文献の引用も、それが本明細書において開示されているか若しくは「特許請求の範囲」に記載されているいずれかの発明に関する先行技術であることを認めるものではなく、あるいはそれが単独で又は他のいかなる参考文献（単数若しくは複数）とのいかなる組み合わせにおいても、かかる発明を教示する、提案する、又は開示することを認めるものではない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。
本発明は本明細書に示される特定の実施例に限定されると考えられるべきでない。種々の修正、同等のプロセス、並びに本発明が適用可能であり得る多くの構造及びデバイスは、当業者に容易に明らかとなるであろう。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われてもよく、それが、本明細書に記載されるものに限定されると見なされるものではないことを理解するであろう。

Claims (15)

  1. 皮膚色素沈着を引き起こす機構についての仮説を検証する方法であって、
    皮膚色素沈着を引き起こすための試験薬剤を特定する工程と、
    前記試験薬剤が皮膚色素沈着を引き起こすことを仮定する工程と、
    第１の培養ヒト皮膚組織サンプルを準備して、ある期間、好適な条件下で、皮膚色素沈着を引き起こすための前記試験薬剤の効果を試験する工程と、
    前記ヒト皮膚組織サンプルを、前記期間中、前記試験薬剤と接触させる工程と、
    前記処理されたヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、前記転写プロファイルが図１０から選択された少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、及び、
    対照と比較した際、図１０から選択された全ての前記遺伝子の発現レベルが変化しているとき、前記試験薬剤が皮膚色素沈着を引き起こすという仮説を検証する工程と、
    を含む、方法。
  2. 第２の培養ヒト皮膚組織サンプルを、前記対照として使用するための基準色調薬剤と接触させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記基準色調薬剤が、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、ウンデシレノイルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１及び第２の培養ヒト皮膚組織サンプルのうちの少なくとも１つが、ヒトドナー組織サンプルである、請求項２又は請求項３に記載の方法。
  5. 前記ヒトドナー組織サンプルから皮下脂肪層が除去されている、請求項４に記載の方法。
  6. 前記基準色調薬剤が、前記第２のヒト皮膚組織サンプルにおいて、図１０から選択された前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを、皮膚色調効果を提供するために適切な方向に、上方調節又は下方調節する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１の培養ヒト皮膚組織サンプルが、ＩＩ〜ＩＶのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第１の培養ヒト皮膚組織サンプルが、３０℃〜４０℃の温度で、５０％〜９０％の相対湿度で、２４時間〜１０日間の期間、培養される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１のヒト組織サンプルが、培養される前に約４℃〜約１０℃で保存される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記期間中、真皮を湿った状態で及び表皮を乾燥した状態で保つために、等浸透圧溶液中に前記サンプルを真皮側を下にして設置する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１のヒト皮膚組織サンプルを、前記期間中、皮膚組織表現型を模倣するために、エネルギー源又は１つ以上の化合物のうちの１つに供する工程を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１のヒト皮膚組織サンプルを、前記期間中、培地中で、又は局所適用として、のいずれかで、パラクリン剤と接触させる工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記試験薬剤がエンドセリン１及び幹細胞因子のうちの少なくとも１つである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記試験薬剤を含む化粧品スキンケア組成物を製剤化する工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. エックスビボヒト皮膚組織サンプルを、エンドセリン１、幹細胞因子、メラノサイト刺激ホルモン、ドブタミン、フォルスコリン、及び紫外光からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることにより、前記エックスビボヒト皮膚組織サンプルにおける色素レベルを変化させる工程を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
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