JP7206725B2 - 肌状態改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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本発明は、かかる状況に鑑み、新たなアプローチにより肌状態改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立することを課題とする。
[1]骨格筋細胞におけるマイオカインの分泌活性を指標として、肌状態改善剤をスクリーニングする方法。
[2]被験物質を添加した骨格筋細胞における前記マイオカインの分泌活性が、被験物質を添加しなかった骨格筋細胞における分泌活性と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は肌状態改善作用を有すると判定する、[1]に記載の方法。
[3]前記肌状態が、ハリ・弾力、色素沈着、炎症、バリア機能、及び薄毛から選択される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記マイオカインが、真皮線維芽細胞及び/又は表皮細胞において、肌状態に関連する遺伝子の発現量を変動させるものである、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。[5]前記マイオカインが、マイオネクチン、アディポネクチン、カテプシンB、MCP-1、FSTL1、IL-4、及びCCL20から選択される、[4]に記載の方法。
[6]前記遺伝子が肌状態を向上させる機能を有し、かつ前記発現量の変動が亢進である、[4]又は[5]に記載の方法。
[7]前記遺伝子が、COL18A1、ELN、FGF7、HAS1、LAMA1、FLG、KRT2及びKRT4から選択される、[6]に記載の方法。
[8]前記遺伝子が肌状態を低下させる機能を有し、かつ前記発現量の変動が抑制である、[4]又は[5]に記載の方法。
[9]前記遺伝子が、IL-6、MMP2、MMP11、MMP12、MMP15、MMP16、MMP25、PTGIS、及びEDN1から選択される、[8]に記載の方法。[10][1]~[9]のいずれかに記載のスクリーニング方法を行う工程、及び前記工程により選択された物質を含有させる工程を含む、肌状態改善用組成物の設計方法。
[11]前記組成物が皮膚外用剤又は飲食品である、[10]に記載の設計方法。
本発明者らは、筋肉から分泌されるマイオカインが、皮膚において種々機能し肌状態に関与する遺伝子の発現を変動させることを見出した。かかる遺伝子としては、例えば、ハリ・弾力、色素沈着、炎症、バリア機能、及び薄毛等の肌状態の変化に関与する酵素やサイトカイン等の遺伝子が挙げられ、これらの発現が変動すると肌状態が向上又は低下する。
かかるフローにおいて、骨格筋細胞におけるマイオカインの分泌活性を増強又は減弱させることによって、前記肌状態に関連する遺伝子が肌状態を向上させる又は悪化させない方向に発現が変動させれば、肌状態を改善することができる。言い換えると、皮膚において所定の遺伝子の活性を亢進又は抑制させるマイオネクチンの骨格筋細胞における分泌活性を増強又は減弱させるような物質は、肌状態改善剤となり得る。
ここで、マイオカインが、真皮線維芽細胞及び/又は表皮細胞において、前記発現量を変動させるか否かは、例えばマイオカインを添加した真皮線維芽細胞及び/又は表皮細胞における発現量を測定することにより確認することができ、前記発現量が、マイオカインを添加しなかった細胞における発現量(コントロール)と比較して大きい又は小さい場合に、前記マイオカインは該遺伝子の発現量を変動させるものであると判断する。ここで、発現量とは、肌状態に関連する遺伝子のmRNAの転写量と、該タンパク質の翻訳量との何れかを指すものとする。また、変動が大きい方の程度としてはコントロールに対して120%以上が好ましく、変動が小さい方の程度としてはコントロールに対して80%以下が好ましい。
また、肌状態に関連する遺伝子が肌状態を向上させる機能を有するものである場合、本発明のスクリーニング方法において指標とするマイオカインは、前記遺伝子の発現量を亢進させるものである。また、肌状態に関連する遺伝子が肌状態を低下させる機能を有するものである場合、本発明のスクリーニング方法において指標とするマイオカインは、前記発現量の変動を抑制させるものである。
表5に、上記マイオカインと、それにより発現が変動する遺伝子の組み合わせを例示するが、これらに限定されない。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的にマイオネクチンの分泌活性(分泌量等)の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用い
た抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、1,3-ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物1質量部に対して、溶媒を1~30質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び/又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
まず、プレ培養した骨格筋細胞に被験物質を添加し、24~48時間インキュベーションする。その後、培養上清中のマイオカイン濃度を、ELISA等で定量的に測定する。コントロールとして被験物質を添加しなかった骨格筋細胞においても培養上清中のマイオカイン濃度を測定する。被験物質を添加した細胞におけるマイオカイン濃度が、被験物質を添加しなかった細胞におけるマイオカイン濃度(コントロール)に対して大きい又は小さい場合、前記被験物質は肌状態改善作用を有すると判定する。具体的には、指標とするマイオカインが、肌状態を向上させる機能を有する遺伝子の発現量を亢進させるものである場合、又は肌状態を低下させる機能を有する遺伝子の発現量を抑制させるものである場合、被験物質を添加した細胞におけるマイオカイン濃度がコントロールに対して大きいときに、前記被験物質は肌状態改善作用を有すると判定する。また、指標とするマイオカインが、肌状態を向上させる機能を有する遺伝子の発現量を抑制させるものである場合、又は肌状態を低下させる機能を有する遺伝子の発現量を亢進させるものである場合、被験物質を添加した細胞におけるマイオカイン濃度がコントロールに対して小さいときに、前記被験物質は肌状態改善作用を有すると判定する。該判定された物質は、肌状態改善用の組成物に好適に含有し得る肌状態改善剤となり得る。また、指標としたマイオカインが発現量を変動させる遺伝子が関与する肌状態の種類により、前記判定された物質が改善しうる具体的な肌状態を推定することができる。
なお、マイオカイン濃度等の分泌活性の変動の程度としては、変動が増強の場合はコントロールに対して110%以上が好ましく、120%以上がより好ましく、150%以上がさらに好ましい。また、変動が減弱の場合はコントロールに対して90%以下が好ましく、80%以下がより好ましく、50以下がさらに好ましい。
また、該組成物には、本発明のスクリーニングにより肌状態を改善する作用を有すると判定された物質以外の肌状態改善用成分、例えば他のハリ・弾力改善剤、色素沈着改善剤、美白剤、抗炎症剤、抗シワ剤、バリア機能改善剤、薄毛改善剤等もともに配合してもよい。
かかる任意成分としては例えば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、1,3-ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。
該皮膚外用組成物は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより製造することができる。また、その形態は、例えば、ローション剤型、乳化剤型、オイル剤型など任意の剤型とすることができる。
かかる任意成分としては例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味料及び香味料等を用いることができる。炭水化物としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など;二糖類、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など;及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及び、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味料としては、天然香味料(タウマチン、ステビア抽出物等)及び合成香味料(サッカリン、アスパルテーム等)を使用することができる。その他に、前述の医薬組成物で用いられる添加物であって通常食品にも添加されるものを同様に用いてもよい。
、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品等の即席食品;農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル(穀物加工品)等の農産加工品;水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品;畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品;加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品;バター、マーガリン類、植物油等の油脂類;しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料;調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類;素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品;キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子等の菓子類;炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類;これら以外の食品等に、本発明に係る肌状態改善剤を添加してもよい。
本発明に係る食品組成物を肌状態改善用途、ハリ・弾力改善用途、色素沈着改善・美白用途、抗炎症・抗シワ用途、バリア機能改善用途、薄毛改善用途等とする場合、製品化の際にその有する有用性や機能性に関する表示を付してもよい。
かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、「肌状態の改善用」「美白用」「肌のハリ・弾力改善用」、「抗炎症・抗シワ用」、「バリア機能改善用」、「薄毛改善用」といった用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装、容器等に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表、カタログ、パンフレット、POP等の販売現場における宣伝材等、若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的(インターネット等)方法により提供する行為等が挙げられる。なお、本発明の食品組成物が保健機能食品等の行政が定める各種制度に基づいて認可を受けその認可のもとで実施される場合は、該認可に基づく態様で表示することが好ましい。
HuMedia-KG2培地(クラボウ製)及びDMEM培地(Thermo FisherScientific製)を用いて、正常ヒト表皮細胞(クラボウ製、成人女性Hispanic由来、Lot:00703)及び正常ヒト真皮線維芽細胞(クラボウ製、成人女性Hispanic由来、Lot:00702)をそれぞれ24ウェルプレートに2×104cells/ウェル播種し培養した。播種24時間後にマイオカイン(アディポネクチン、マイオネクチン、カテプシンB、MCP-1、FSTL1、IL-4、CCL20)を各ウェルに一種類ずつ終濃度100ng/mLとなるように添加し、さらに培養した。24時間後に細胞を回収し、QIAcube(QIAGEN)にてRNAを抽出・精製した。精製したRNAサンプルをClariom S Assay, human(Thermo Fisher Scientific)を用いて解析した。そのデータをTranscriptome Analysis Console(TAC)ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)を用いて解析し、各細胞種のコントロールと比較して、各マイオカイン添加による遺伝子発現のシグナル比が>1.2又は<-1.2で、かつp値が<0.05の遺伝子であり、肌状態に関連することが知られている遺伝子を抽出した。
結果を表6に示す。マイオカインの添加により、線維芽細胞又は表皮細胞において肌状態に関連する遺伝子の発現量が変動することが分かる。
以下の手順で、マイオネクチンの分泌量を指標に、肌状態改善剤のスクリーニングを行った。
SkGM2培地(Lonza製)を用いて、ヒト太腿由来筋芽細胞(クラボウ製、新生児男性Caucasian由来、Lot:04211)を24ウェルプレートに1×104cells/ウェルで播種し、培養した。播種24時間後に表7に記載の被験試料を各ウェルに1種類ずつ添加した。2日後、マイオネクチンのELISAキット(Cloud-Clone Corp製、製品番号:SEU540Hu)を用いて培養上清のマイオネクチン濃度を解析した。コントロール細胞の培養上清のマイオネクチン濃度を100%としたときの、被験試料を添加した細胞の培養上清の相対マイオネクチン濃度を算出した。
一方、ハスエキス及びフキタンポポエキスは筋芽細胞におけるマイオネクチンの分泌を抑制し、温泉水及びマタタビエキスは筋芽細胞におけるマイオネクチンの分泌に影響を与えなかった。
Claims (9)
- 骨格筋細胞におけるマイオカインの分泌活性を指標として、肌状態改善剤をスクリーニングする方法であって、
前記マイオカインが、真皮線維芽細胞及び/又は表皮細胞において、肌状態に関連する遺伝子の発現量を変動させるものであり、
前記マイオカインが、マイオネクチン、アディポネクチン、カテプシンB、MCP-1、FSTL1、IL-4、及びCCL20から選択される、方法。 - 被験物質を添加した骨格筋細胞における前記マイオカインの分泌活性が、被験物質を添加しなかった骨格筋細胞における分泌活性と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は肌状態改善作用を有すると判定する、請求項1に記載の方法。
- 前記肌状態が、ハリ・弾力、色素沈着、炎症、バリア機能、及び薄毛から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記遺伝子が肌状態を向上させる機能を有し、かつ前記発現量の変動が亢進である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、COL18A1、ELN、FGF7、HAS1、LAMA1、FLG、KRT2及びKRT4から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記遺伝子が肌状態を低下させる機能を有し、かつ前記発現量の変動が抑制である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が、IL-6、MMP2、MMP11、MMP12、MMP15、MMP16、MMP25、PTGIS、及びEDN1から選択される、請求項6に記載の方法。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を行う工程、前記工程により肌状態改善作用を有すると判定された被験物質を選択する工程、及び前記選択された物質を組成物に含有させることを決定する工程を含む、肌状態改善用組成物の設計方法。
- 前記組成物が皮膚外用剤又は飲食品である、請求項8に記載の設計方法。
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