JP2014171441A - シワ形成抑制剤及び/又は抗炎症剤のスクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】表皮細胞に側面方向から圧力負荷を加える工程を含み、該表皮細胞が放出する炎症性因子の活性を指標として、シワ形成抑制剤及び/又は抗炎症剤をスクリーニングする方法。前記炎症性因子の活性が被検物質を添加した細胞における炎症性因子を構成する蛋白質をコードする発現量で現わされ、被検物質を添加しなかった細胞におけるものと比較する。
【選択図】図1
Description
近年解明されてきたこのシワ形成のメカニズムに基づいて、エラスターゼやマトリックスメタロプロテアーゼといったタンパク質分解酵素を阻害することによりシワ・タルミの形成を予防したり改善したりする研究がなされ、種々のエラスターゼ阻害剤を有効成分として配合したシワ・タルミの形成予防又は改善用の化粧料が開示されている(特許文献1〜11等)。
炎症性因子は、一般に炎症応答等で細胞から放出されることが知られているが、表皮細胞に上から頂底軸方向に圧力負荷を加えた場合や、表皮細胞を連続的に伸縮した場合にもIL1αやTNFα等のいくつかの炎症性因子が放出されることが報告されている(非特許文献4〜5)。また、CSF2、CXCL1、IL1α、TNFα等いくつかの炎症性因子については、シワ形成に関与するタンパク質発現機構の上流に位置することが知られている(特許文献11〜12等)。
しかしながら、表皮細胞に側面方向から圧力負荷を加えた場合に炎症性因子が放出されることは知られていない。
そのため、より高い効果が得られる新しい機序によるシワ・タルミの形成抑制のための化粧料の開発を目指して、新規有効成分を探索するためのスクリーニング方法を確立することを本発明の課題とする。
[1]表皮細胞に側面方向から圧力負荷を加える工程を含み、該表皮細胞が放出する炎症性因子の活性を指標として、シワ形成抑制剤及び/又は抗炎症剤をスクリーニングする方法(以下、「本発明のスクリーニング方法」とも記す)。
[2]前記炎症性因子の活性が、炎症性因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量であり、
被検物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して小さい場合に、前記被検物質はシワ形成を抑制する作用及び/又は抗炎症作用を有すると判定する、[1]に記載の方法。
[3]前記被検物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における前記遺伝子の発現量の90%以下である場合に、前記被検物質はシワ形成を抑制する作用及び/又は抗炎症作用を有すると判定する、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記炎症性因子が、LTB、IL16、IL23A、CSF2、CXCL1、CXCL5、IL24、SPP1、IL1α、IL8、TNFα及びVEGFAから選択される、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の方法によりシワ形成を抑制する作用を有すると判定された物質を含有する組成物。
[6]皮膚外用剤である、[5]に記載の組成物。
[7]化粧料(ただし、医薬部外品を含む)である、[5]又は[6]に記載の組成物。[8]シワ形成抑制用である、[5]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[9][1]〜[4]のいずれかに記載の方法によりシワ形成を抑制する作用を有すると判定された物質を組成物に配合する工程を含むことを特徴とする組成物の製造方法。
本発明における炎症性因子とは、炎症応答に関与し、好中球を呼び寄せ得る性質を有するタンパク質をいう。炎症性因子が呼び寄せた好中球が放出するタンパク質分解酵素はシワ・タルミ形成を引き起こすため、炎症性因子の活性を抑制する物質はシワ・タルミ形成抑制剤となり得るし、また抗炎症剤ともなり得る。従来のシワ・タルミの形成予防又は改善用の化粧料が好中球エラスターゼやマトリックスメタロプロテアーゼの阻害によるものであるのに対し、さらにシワ・タルミ形成の機序の上流段階でこれを抑制する点で、本発明により新たなアプローチによるシワ形成抑制用の化粧料が提供され得る。
なお、本発明において「シワ」は、皮膚表面に形成される溝状の形態であるいわゆる皺のほか、皮膚の重力方向の変形であるタルミなど、皮膚のハリや弾力が失われたことによる肌の変形を広く意味する語句である。
また、例えば、当該タンパク質の細胞内存在量を、常法で定量的に測定して、遺伝子の発現量としてもよい。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行
を妨げない、具体的には炎症性因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
加える圧力負荷は、表皮細胞の頂底軸に直交する平面方向の長径が好ましくは10〜50%、より好ましくは15〜33%減少するまで圧力負荷を加える。圧力負荷を加える時間は、好ましくは3〜48時間、より好ましくは6〜24時間である。
圧力負荷を加える手段は、特に限定されず任意の手段を採ることができる。例えば、伸縮性の培養容器を予め横方向に伸展させておき、そこに表皮細胞を播種した後、培養容器の伸展を解除することにより表皮細胞の側面方向に圧力負荷を加えることができる。
側面方向に圧力負荷が加えられた状態で、表皮細胞は炎症性因子を放出する。本発明のスクリーニング方法では、前述のようにこの炎症性因子の活性を測定して、指標として用いる。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、1,3−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される1種乃至は2種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物1質量に対して、溶媒を1〜30質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び/又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
まず、細胞に前述のような手段で側面方向に圧力負荷を加えた後、被検物質を添加し、6時間インキュベーションする。その後、該細胞からmRNAを抽出し、指標とする炎症性因子をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてRT−PCRを行い、定量的に測定する。コントロールとして被検物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被検物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該の発現量(コントロール)に対して小さくなった場合、好ましくはコントロールに対して90%以下、より好ましくは85%以下、さらに好ましくは80%以下となった場合に、前記被検物質はシワ形成を抑制する作用及び/又は抗炎症作用を有すると判定する。該判定された物質は、シワ形成抑制剤及び/又は抗炎症剤となり得る。
組成物としては、化粧料、医薬部外品、医薬品などが好適に例示でき、日常的に使用できることから、化粧料、医薬部外品がより好ましい。その投与経路としては、特に限定されるものではないが、シワ形成抑制剤作用を発揮するために皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用して皮膚外用剤とすることが好ましい。
従来のシワ・タルミの形成予防又は改善用の化粧料が好中球エラスターゼやマトリックスメタロプロテアーゼを阻害し、それによりエラスチン等の真皮を構成するタンパク質が破壊されるのを抑えてシワ形成を抑制するものであった。これに対して、本発明のスクリーニングによりシワ形成を抑制する作用を有すると判定された物質(シワ形成抑制剤)は、シワ・タルミ形成の機序のさらに上流段階でこれを抑制する点で、本発明により新たなアプローチによるシワ形成抑制用の化粧料の有効成分となり得る。
また、組成物に含有させるシワ形成抑制剤の種類は、1種類のみでなく2種類以上であってもよい。
組成物の製造は、常法に従ってこれらの成分を処理・配合することにより、困難なく行うことができる。
シリコン製のストレッチチャンバー(STB−CH−4W、ストレックス株式会社)を水平方向の一方向に約1.5倍伸展させ、チャンバースタンドで伸展状態を保持しながら、IAC−50, Atelocell Native Collagen, Bovine Dermis(株式会社高研)にてチャンバー表面をコラーゲンでコートした。そこに、ヒト表皮細胞を、270000個/ウェルとなるように播種した後、1昼夜培養した。その後、チャンバーの伸展状態を解除した後(約33%収縮)、細胞を培養した。6時間後、細胞を回収してRNeasyMiniKit(QIAGEN社)のRLT bufferを添加してmRNAを抽出し、Superscript VILO cDNA Synthesis Kit(Life Technologies社)によりcDNAとした後、RT2 Profiler PCR Arrays −Human Cytokines & Chemokines(QIAGEN社)に付属のプライマーを用いてリアルタイムPCRを行いCSF2、CXCL1、CXCL5、IL16、IL23A、IL24、LTB、SPP1、IL1α、IL8、TNFα及びVEGFAのmRNA量をそれぞれ測定した。比較のため、伸展・収縮を行わなかったチャンバーで培養した表皮細胞における上記因子のmRNA量(コントロール)も測定した。
コントロールのmRNA発現量を「1」としたときの相対発現量を図1に示す。各因子において、圧力負荷時にコントロールに対して有意に大きいmRNA発現量が認められ、これらの因子の活性がスクリーニングの指標となり得ることが示された。
Claims (9)
- 表皮細胞に側面方向から圧力負荷を加える工程を含み、該表皮細胞が放出する炎症性因子の活性を指標として、シワ形成抑制剤及び/又は抗炎症剤をスクリーニングする方法。
- 前記炎症性因子の活性が、炎症性因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量であり、
被検物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して小さい場合に、前記被検物質はシワ形成を抑制する作用及び/又は抗炎症作用を有すると判定する、請求項1に記載の方法。 - 前記被検物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における前記遺伝子の発現量の90%以下である場合に、前記被検物質はシワ形成を抑制する作用及び/又は抗炎症作用を有すると判定する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記炎症性因子が、LTB、IL16、IL23A、CSF2、CXCL1、CXCL5、IL24、SPP1、IL1α、IL8、TNFα及びVEGFAから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法によりシワ形成を抑制する作用を有すると判定された物質を含有する組成物。
- 皮膚外用剤である、請求項5に記載の組成物。
- 化粧料(ただし、医薬部外品を含む)である、請求項5又は6に記載の組成物。
- シワ形成抑制用である、請求項5〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法によりシワ形成を抑制する作用を有すると判定された物質を組成物に配合する工程を含むことを特徴とする組成物の製造方法。
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