JP2015509382A - 組織構築体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
人工組織構築体(TC)、TCを作出する方法、その使用、およびTCを含むキットが提供される。TCは、ヒト成人用、ヒト非新生児用、および新生児用のワクチンの評価に有用である。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年3月7日付で出願された米国仮特許出願第61/607,796号および2012年3月30日付で出願された米国仮特許出願第61/617,874号の米国特許法第119条(e)の下での恩典を主張するものであり、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2012年3月7日付で出願された米国仮特許出願第61/607,796号および2012年3月30日付で出願された米国仮特許出願第61/617,874号の米国特許法第119条(e)の下での恩典を主張するものであり、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本明細書において開示される態様は、免疫調節剤、微生物、微生物成分、アジュバント、およびワクチンの評価に関する。具体的には、本明細書において開示される態様は、ヒト成人用、ヒト新生児用およびヒト非新生児用のワクチンの評価のための方法、人工組織構築体装置およびキットに関する。
本明細書において開示される態様は、免疫調節剤、微生物、微生物成分、アジュバント、およびワクチンの評価に関する。具体的には、本明細書において開示される態様は、ヒト成人用、ヒト新生児用およびヒト非新生児用のワクチンの評価のための方法、人工組織構築体装置およびキットに関する。
発明の背景
過去10年の間、努力によって、三次元系で単核細胞(MC)を培養できることが示されている。実際に、これらの原理は、成人ワクチン応答の評価のためのプラットフォームの開発に取り入れられている。しかしながら、これまで、公表された組織工学研究では、生物における免疫の年齢依存的な変化が考慮されておらず、その変化の一部は、ヒト自家血漿の可溶性成分の差異に依っている。新生児および乳児の免疫応答は異なっており、その細胞性成分および体液性(すなわち、可溶性)成分の両方の差異によって成人の免疫応答からは予想できない。新生児の白血球、特に単球および樹状細胞は、遊走、Th1極性化サイトカインの産生、および抗原提示細胞(APC)-リンパ球間相互作用の障害を示す。注目すべきは、既知の組織工学系では、ウシ胎仔血清のような異種材料が利用されているか、または熱処理されプールされたヒト血清が利用されており、それゆえ、インタクトな自家新生児血漿に特有の免疫調節成分が考慮されていない。
過去10年の間、努力によって、三次元系で単核細胞(MC)を培養できることが示されている。実際に、これらの原理は、成人ワクチン応答の評価のためのプラットフォームの開発に取り入れられている。しかしながら、これまで、公表された組織工学研究では、生物における免疫の年齢依存的な変化が考慮されておらず、その変化の一部は、ヒト自家血漿の可溶性成分の差異に依っている。新生児および乳児の免疫応答は異なっており、その細胞性成分および体液性(すなわち、可溶性)成分の両方の差異によって成人の免疫応答からは予想できない。新生児の白血球、特に単球および樹状細胞は、遊走、Th1極性化サイトカインの産生、および抗原提示細胞(APC)-リンパ球間相互作用の障害を示す。注目すべきは、既知の組織工学系では、ウシ胎仔血清のような異種材料が利用されているか、または熱処理されプールされたヒト血清が利用されており、それゆえ、インタクトな自家新生児血漿に特有の免疫調節成分が考慮されていない。
概要
本明細書において開示される態様は、組織構築体、そのような組織構築体(TC)を作出および使用する方法、ならびにヒト成人用、ヒト非新生児用および新生児用のワクチンの評価のためのキットに関する。
本明細書において開示される態様は、組織構築体、そのような組織構築体(TC)を作出および使用する方法、ならびにヒト成人用、ヒト非新生児用および新生児用のワクチンの評価のためのキットに関する。
異種(非ヒト)材料をほとんどまたは全く含まないヒト材料から主にまたは完全に構成され、それゆえ、ヒト用のワクチン製剤の評価に適した、ならびに同様に、ヒト用の候補となる免疫調節剤およびアジュバントの評価に適したヒト組織構築体を提供することが本明細書において開示される態様の目標である。
別の目標は、新生児のワクチン接種において用いられるはずのワクチンを試験するのに適したヒト組織構築体を提供することである。本明細書に記載されるヒト組織構築体は、免疫調節剤、アジュバント、およびワクチン製剤を含むがこれらに限定されない、作用物質の試験に適している。ヒト組織構築体により、人は臨床前のインビトロの設定で新しい免疫応答刺激剤の安全性および有効性を評価することができる。
1つの態様において、試験の目的は、新しい製剤のワクチン製剤安全性、ワクチン反応性、および/またはワクチン毒性を評価するのに役立つ。1つの態様において、評価は、開示されるヒト組織構築体および新しいワクチン製剤を用いてデータを作り出し、これらのデータを、認可および承認されたワクチンに類似のヒト組織構築体で得られたデータと比較することにより、すなわち、既知の、認可および承認されたワクチンに対するベンチマーク試験にかけることにより達成される。本明細書に記載されるヒト組織構築体は、その中の構成要素が新生児およびヒトの免疫細胞および免疫系によく似ており、それを再現しているので、適している。そのようなヒト組織構築体は、新生児および/またはヒト由来のヒト材料から本質的に構成され、非限定的な例としては、ヒト臍帯血に由来する初代白血球、インタクトなヒト新生児血漿およびヒト新生児乏血小板血漿が挙げられる。さらに、血漿（例えば、乏血小板血漿）は、細胞シグナル伝達および免疫応答の成分（例えば、二価陽イオン、可溶性補体、母親由来抗体、および免疫調節性アデノシンを作出する血漿プリン代謝酵素などを含む）が枯渇していない。
本明細書において用いられる場合、1つの態様において、血漿またはヘパリン添加血漿/血液との関連で「インタクトな」という用語は、血漿が熱処理されていないことを意味する。別の態様において、血漿またはヘパリン添加血漿/血液との関連で「インタクトな」という用語は、血漿がいずれの血漿成分も枯渇していないことを意味する。いくつかの態様において、「インタクトな」および「無傷の」という用語は、互換的に用いられる。
本明細書において用いられる場合、無傷の、が血漿をいう場合の「無傷のヘパリン血漿」という用語は、血漿が全く熱処理または枯渇処理されていないことを意味する。
1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションと、該マトリックスクッション(すなわち、細胞外マトリックスのクッション)の上のヒト内皮細胞の単層と、ヒト内皮細胞(EC)の単層を通って遊出して細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成し、かつ遊走樹状細胞に分化したヒト単核細胞(MC)とを含む組織構築体(TC)が本明細書において提供される。
1つの態様において、そのような組織構築体(TC)を作出する方法であって、細胞外マトリックスのクッションを提供する段階、ヒト内皮細胞(EC)を、該細胞がヒト血漿の存在下で単層を形成するのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上で培養する段階、ヒト単核細胞(MC)をヒトECの単層に添加する段階、ならびに、ヒトMCを、該MCがヒト内皮細胞の単層を通って自律的に遊出するのに十分な期間、ヒト血清アルブミンの存在下で培養し、それによってヒト内皮細胞の単層下の細胞外マトリックスのクッションでのMCのコロニー形成を促進する段階、ならびに、MCの遊走樹状細胞への自律的分化を可能にする段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
本明細書において用いられる場合、「MCの遊走樹状細胞への分化」は、「遊走樹状細胞へと発達および転換する」と同じ意味であり、互換的に用いられる。
1つの態様において、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、本明細書に記載される組織構築体(TC)にヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を導入する段階、マトリックスクッションから逃れてヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出し戻った、分化したヒト遊走樹状細胞の自律的生成を可能にするのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤とともにTCをインキュベートする段階、ならびにアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下で未成熟および成熟抗原提示細胞へと発達した逆遊出した樹状細胞を回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、まず、内皮単層で覆われた細胞外マトリックスのクッション中の遊出したヒト単核細胞(MC)を含む組織構築体(TC)を調製または提供する段階であって、該ヒトMCが遊走樹状細胞へと分化している段階、次いで、該組織構築体にヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤を導入する段階、細胞外マトリックスのクッションおよび内皮細胞の単層からの、分化したヒト遊走樹状細胞の逆遊出(reverse-transmigration)を可能にするのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともにTCをインキュベートする段階、ならびに、アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下で未成熟および成熟抗原提示細胞へと発達した逆遊出した樹状細胞を回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、(a) 単層を得るのに十分な期間、ヒト血漿の存在下、細胞外マトリックスのクッション上でヒト内皮細胞(EC)を培養する段階; (b) ヒトECの単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階; (c) ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成し、最終的に遊走樹状細胞へと分化することを可能にするのに十分な期間、ヒトMCをヒト血清アルブミンの存在下で培養する段階; (d) 段階cにおける期間の後に遊出しなかったMCを除去する段階; (e) ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤を段階dの培養物に導入する段階; (f) 細胞外マトリックスのクッションおよびECの単層からの、分化した遊走樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間、段階(e)の培養物をインキュベートする段階; ならびに(g) アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下で未成熟および成熟抗原提示細胞へと発達した逆遊出した樹状細胞を回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
1つの態様において、ワクチンに対する免疫応答の誘発におけるワクチンの有効性をインビトロで評価するための方法であって、試験されているワクチン製剤の存在下およびヒト血漿の存在下で発達した抗原提示細胞であるヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とをヒト血漿の存在下で共培養する段階; CD4+ CD45RO+ T細胞になるようにCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の一次活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 培養物における得られた活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を、ヒト血漿の存在下で、試験されているワクチン製剤の存在下およびヒト血漿の存在下で発達した抗原提示細胞であるヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるCD4+ CD45RO+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞の第2集団および活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、樹状細胞の添加がない場合と比べてのプロスタグランジンE2 (PGE2)の産生によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。新規のワクチン製剤により誘導された、認可されたワクチンと比べて非常に高いPGE2産生によって、ワクチンの反応性(例えば、局所反応または発熱)の可能性も示唆されうる。
1つの態様において、抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤に対する免疫応答を誘発する際のアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の有効性をインビトロで評価するための方法であって、試験されているアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下およびヒト血漿の存在下で発達した抗原提示細胞であるヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とをヒト血漿の存在下で共培養する段階; CD4+ CD45RO+ T細胞になるようにCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の一次活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 培養物における得られた活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を、ヒト血漿の存在下で、試験されているアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下およびヒト血漿の存在下で発達した抗原提示細胞であるヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるCD4+ CD45RO+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞の第2集団および活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、試験されているアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤がヒト免疫応答の刺激(例えばアジュバントの場合)を刺激または促進する際の有効なワクチンであることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、樹状細胞の添加がない場合と比べてのPGE2の産生によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。
1つの態様において、抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤に対する免疫応答を誘発する際のアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の有効性をインビトロで評価するための方法であって、試験されているアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下およびヒト血漿の存在下で発達した抗原提示細胞であるヒト樹状細胞の第1および第2集団を提供する段階; ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞の第1集団とヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを共培養する段階; CD4+ CD45RO+ T細胞になるようにCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 培養物における得られた活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を、ヒト血漿の存在下で、ヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるCD4+ CD45RO+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞の第2集団および活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、当該アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤が、ヒト免疫応答の刺激(例えば、アジュバント)を刺激または促進する際の、それぞれ、有効なアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤であることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、樹状細胞の添加がない場合と比べてのPGE2の産生によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。1つの態様において、ヒト血漿はヒトPPPである。1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団、ならびにヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞は自家性であり、すなわち、それらの細胞は全て、1人の個人に由来する。別の態様において、産生されたサイトカインのパターン（例えば、Th1、Th2、Th17）を分析することもでき、樹状細胞の添加がない場合の産生されたサイトカインのパターンと比較することができ、認可されたワクチンと比較することもできる。認可されたワクチンとの比較は、ベンチマーキングとして公知である。
1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤に対する免疫応答を誘発する際のアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の有効性をインビトロで評価するための方法であって、コラーゲンおよび/またはフィブロネクチンのようなヒト細胞外マトリックス材料を含む細胞外マトリックスのクッションを提供する段階、コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスクッションをインキュベートする段階、細胞外マトリックスのクッションにヒトECを播種する段階、ヒト血漿の存在下でコンフルエントな単層へヒトECを培養する段階、熱で不活化されていないヒト血清アルブミンの存在下でヒトECのコンフルエントな単層にヒトMCを導入する段階、MCがヒト内皮細胞のコンフルエントな単層から自律的に遊出し、遊出したヒトMCが遊走樹状細胞に分化することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階、ならびに遊出しなかったヒトMCを除去することによって予め調製された組織構築体に、ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤を導入する段階; 分化した遊走樹状細胞がヒトECのコンフルエントな単層に逆遊出し、分化した遊走樹状細胞が、添加されたアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達するのに十分な期間、組織構築体をインキュベートする段階; 逆遊出した樹状細胞を回収する段階; ヒト血漿の存在下でヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞と抗原提示樹状細胞とを共培養する段階; CD4+ CD45RO+ T細胞になるようにCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 得られた活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を、ヒト血漿の存在下で、ヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるヒトCD4+ CD45RA+活性化T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で樹状細胞および活性化ヒトCD4+ CD45RO+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、当該アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤がヒト免疫応答の刺激を刺激または促進する際の、それぞれ、有効なアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤であることが示される前記方法が、本明細書において提供される。1つの態様において、樹状細胞の添加がない場合と比べてのPGE2の産生によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。1つの態様において、ヒト血漿はヒトPPPである。1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団、ならびにヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞は自家性であり、すなわち、それらの細胞は全て、1人の個人に由来する。1つの態様において、ヒト血漿はヒト新生児由来である。1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団、ならびにヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞は自家性であり、ヒト新生児に由来する。他の態様において、分泌型サイトカイン、細胞内サイトカイン、表面細胞マーカーおよびリンパ球増殖のような他のバイオマーカーの測定は、免疫応答の誘発を評価するために行われる。1つの態様において、樹状細胞の添加がない場合と比べてのPGE2の産生によって、試験されているワクチン製剤がヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。非刺激条件、関係のない抗原および/または認可されたワクチンによる刺激のような、適切な陰性および陽性対照に対するこれらのバイオマーカーの測定の比較(すなわち「ベンチマーキング」)によって、候補となる新規のアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤が安全である可能性が高いかどうか、ならびにヒト、例えば、ヒト新生児における一次および/または二次/リコールヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンである可能性が高いかどうかが示唆されうる。
記載されるいずれかの方法の1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団は、評価されている同じアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤の存在下で発達する。1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団は、同じTC中で発達する; すなわち抗原提示細胞は同時におよび同じ手順で発達する。例えば、回収された抗原提示細胞を2つのバッチに分け、1つのバッチは、CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とともにインキュベートされるヒト樹状細胞の第1集団である。残りのバッチは、CD4+ CD45RO+ T細胞とともにインキュベートされるヒト樹状細胞の第2集団である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿はヒト乏血小板血漿である。分泌されたサイトカインの産生の測定は、免疫応答、例えば、適応性免疫応答が抗原提示樹状細胞の存在下で誘発されたかどうかを評価するために用いられる。他の態様において、他のパラメータの分析は、抗原提示樹状細胞の存在下で免疫応答の誘発が存在するかどうかを評価するために行われる。研究されうるパラメータの非限定的な例としては、細胞内サイトカイン、PGE2、表面細胞マーカーおよび細胞増殖が挙げられる。これらの測定値を、アジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤が、それぞれ、一次および/または二次/リコールヒト免疫応答の刺激における有効なアジュバント/抗原/ワクチン製剤/免疫応答刺激剤であるかどうかを判定するために、非刺激条件(例えば、抗原提示樹状細胞がない場合)および関係のない抗原による刺激のような、適切な陰性および陽性対照に対して比較することができる。そのような応答を、認可されかつ政府の承認を得た免疫調節剤、小児用および成人用ワクチン製剤との比較によって「ベンチマーク試験にかける」ことができる。1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1および第2集団、ならびにヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞は自家性であり、すなわち、それらの細胞は全て、1人の個人に由来する。
1つの態様において、本明細書に記載されるヒト組織構築体を作出するためのキットが本明細書において提供される。別の態様において、インビトロで樹状細胞の集団を調製するためのキットが本明細書において提供される。別の態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の有効性の評価のためのキットが本明細書において提供される。このキットは、ヒト組織構築体を調製するのに必要な成分を含み、この成分は、少なくとも、組織構築体を保持または含有するための容器、例えば、組織培養容器、少なくとも1つのタイプの細胞外マトリックス、ヒト内皮細胞、およびグルコース-6-リン酸を含むが、これらに限定されることはない。したがって、少なくとも、ヒト組織構築体を保持または含有するための容器; 少なくとも1つの細胞外マトリックス; およびグルコース-6-リン酸を含むキットが本明細書において提供される。当該キットは、また、ヒト内皮細胞を含んでもよい。あるいは、当該キットは少なくとも1つの組織構築体を提供する。1つの態様において、キットはアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の有効性の年齢特異的な評価のために用いられる。
本明細書において用いられる場合、「有効性の年齢特異的な評価」は、特定の年齢または年齢層のヒト、例えば、新生児、青年、小児、成人または22〜30歳、31〜40歳、41〜50歳などである成人において免疫応答を誘発する際のアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の有効性を評価することを意味する。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションはコラーゲンを含む。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、細胞外マトリックスのクッションは少なくともコラーゲンを含む。
記載される方法またはTCのいずれかの他の態様において、コラーゲンはヒトコラーゲン、ウシコラーゲンまたはブタコラーゲンである。
記載される方法またはTCのいずれかの他の態様において、コラーゲンは1型コラーゲンである。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトコラーゲンはヒト1型コラーゲンである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、コラーゲンはグリコシル化または糖化されている。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、コラーゲンはグルコース-6-リン酸の存在下でグリコシル化または糖化されている。本明細書において用いられる場合、糖化(非酵素的グリコシル化と呼ばれることもある)は、酵素の制御作用なしでの、フルクトースまたはグルコースなどの糖分子とタンパク質または脂質分子との、典型的には共有結合性の、結合の結果である。糖化コラーゲンは、酵素触媒反応の結果ではない付加された糖を有する。本明細書において用いられる場合、グリコシル化は、タンパク質または脂質分子への、酵素により制御された糖付加である。グリコシル化コラーゲンは、酵素触媒反応によって付加された付加糖を有する。コラーゲンのグリコシル化または糖化によって、コラーゲンは、その上部での内皮細胞の培養を受け入れられるようになる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、グリコシル化または糖化コラーゲンの付加糖は、内皮細胞付着の接着部位となる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、用いられるヒトコラーゲンは成熟したヒトコラーゲンである。本明細書において用いられる場合、「成熟コラーゲン」という用語は、グルコース-6-リン酸の存在下でグリコシル化または糖化されたコラーゲンと定義される。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒトコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で最大5日間成熟されたヒトコラーゲンである。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒトコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で約2日間〜約5日間成熟されたヒトコラーゲンである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションはフィブロネクチンをさらに含む。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、フィブロネクチンはヒトフィブロネクチンである。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションは、少なくとも、コラーゲンおよびフィブロネクチンの混合物を含む。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、細胞外マトリックスのクッションは、少なくとも、ヒトコラーゲンおよびヒトフィブロネクチンの混合物を含む。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ECはヒトECである。1つの態様において、ECはヒト初代ECである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECは、インタクトなヒト血漿中で培養されかつ増殖し、すなわち血漿は、血小板に富む画分および血小板に乏しい画分に分画されていない。非限定的な、他の例示となるインタクトなヒト血漿は、インタクトなヒト新生児血漿およびインタクトなヒト成人血漿である。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代ECはインタクトなヒト新生児血漿の存在下で培養される。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児血漿は、2人以上の新生児から回収された血漿からプールされたヒト新生児血漿である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代ECは単一のドナーから得られる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代ECが用いられる場合、ヒト初代ECはヒト臍帯、胎盤、またはヒト死体組織から得られる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代内皮細胞はコンフルエントな単層へと培養される。1つの態様において、コンフルエントな単層は少なくとも90%コンフルエントである。他の態様において、コンフルエントな単層は約90%〜約100%コンフルエントである。他の態様において、コンフルエントな単層は約95%〜約100%コンフルエントである。別の態様において、コンフルエントな単層は約100%コンフルエントである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、単層を得るための期間は少なくとも24時間である。他の態様において、単層を得るための期間は約24時間〜約5日間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは新生児、または成人、青年もしくは小児である非新生児から得られるかまたはそれに由来する。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿はヒト新生児血漿である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは熱で不活化されていない。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは熱で不活化されている。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は、本明細書に記載される方法および組織構築体において用いられるヒトMC、樹状細胞および/またはCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞に対して自家性のインタクトな血漿である。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒト血漿は熱で不活化されていないヒト血漿である。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒト血漿はヒト乏血小板血漿である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は少なくとも40%で用いられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は約40%〜約100%で用いられる。1つの態様において、ヒト血漿は約50%で用いられる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は少なくとも50%の濃度で用いられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は約50%〜約100%で用いられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は約100%で用いられる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血清アルブミンは少なくとも0.05%で用いられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は約0.05%〜約10%で用いられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は約0.1%で用いられる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンはキレート剤を含有しない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンはヘパリンを用いて調製される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンはキレート剤の非存在下で調製される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、キレート化イオンはマグネシウムまたはカルシウムである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは2人以上のドナー、例えば、新生児からプールされる。別の態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは1人のドナー由来である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは、ヒト臍帯血、胎盤血または循環末梢血から得られる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血清アルブミンは、熱で不活化されていないか、または熱処理されていない。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血清アルブミンは発熱物質を含まない。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血清アルブミンは臨床等級のヒト血清アルブミンである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、用いられるヒト血漿、ヒト血清アルブミン、ヒト乏血小板血漿、ヒトEC、ヒトMC、ならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球は、予め凍結保存されたものである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、新生児、または成人、青年もしくは小児である非新生児に由来する。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、ヒト新生児MCまたはヒト新生児CD33+かつ/もしくはCD14+選択単球である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、1人のドナーに由来する。1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+もしくはCD14+選択単球は、2人以上のドナーからプールされていない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、ヒト臍帯血、胎盤、骨髄または循環末梢血から得られる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCはヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、ヒト血清アルブミンの存在下で培養される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない。外因性サイトカインの非限定的な例としては、GM-CSFおよびIL-4が挙げられる。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、GM-CSFの存在下では培養されない。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、外因的に加えられたIL-4の存在下では培養されない。記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、外因的に加えられたGM-CSFおよびIL-4の存在下では培養されない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿は自家性であり、それらが1人のドナー、すなわち、同じドナーに由来することを意味する。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球細胞が内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、少なくとも0.5時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球が内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、約0.5時間〜約4時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球が内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、約1.5時間〜約2時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、アジュバント/抗原/免疫応答刺激剤は、抗原提示樹状細胞になるように、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球に由来するヒト樹状細胞の発達、転換および/または分化を誘導または刺激しうる任意の作用物質である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、免疫応答刺激剤はワクチンである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、抗原または免疫応答刺激剤はアジュバントである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、アジュバント、抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤は、病原体である。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、病原体は、その断片/不完全な部分またはインタクトな病原体全体である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、内皮細胞の単層からのヒト樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、少なくとも24時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、内皮細胞の単層からのヒト樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、約24時間〜約48時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、内皮細胞の単層からのヒト樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、約48時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞はCD45RO陰性である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、樹状細胞およびヒト乏血小板血漿は自家性であり、それらが1人のドナーに由来することを意味する。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は熱で不活化されていない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、培養下のナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間は、少なくとも1日間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、培養下のナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間は、少なくとも7日間、約7日間、または約7〜約21日間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、評価されているアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を評価する際に用いられる樹状細胞の第1および第2集団を産生するためにインビトロで用いられるのと同じアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ワクチン有効性のインビトロでの評価方法は、細胞増殖について活性化T細胞を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖または細胞数の増加によって、評価されているアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤がヒトナイーブ新生児抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ワクチン有効性のインビトロでの評価方法は、サイトカインおよび細胞増殖の分析の前に、活性化T細胞の培養下の細胞を、樹状細胞の第3集団に曝す段階をさらに含み、ここで樹状細胞の第3集団は、本方法において用いられる樹状細胞の第1および第2集団を産生する際に用いられたのと同じアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤に曝露されている。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、抗原をワクチン接種したヒト新生児の樹状細胞の第3集団も、評価されている同じ抗原で産生される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、分析される非限定的なサイトカインは、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γおよびTNF-αからなる群より選択される。新規の製剤があまりに反応性が高く潜在的に有毒でありうる可能性(例えば、新規の製剤がはるかに高いレベルの炎症誘発性サイトカインを誘導するかどうか)をベンチマーク試験にかけて評価するために、新規のワクチン製剤により誘導された組織構築体におけるサイトカインの濃度を、認可されたワクチンにより誘導されたものと比較することができる。
発明の詳細な説明
別段の説明がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, 刊行はJones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 刊行はBlackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 刊行はVCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出されうる。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
別段の説明がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes IX, 刊行はJones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 刊行はBlackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 刊行はVCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出されうる。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
別段の定めのない限り、本発明は、例えば、Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)における、当業者に公知の標準的な手順を用いて行われたが、それらの文献はどれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬などに限定されず、したがって変更可能であることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を記述するためのものにすぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限するものとは意図していない。
実施例以外において、または他に指定のない場合、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表現する全ての数値は、いずれの場合にも「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。割合に関連して用いられる場合、「約」という用語は、±1%を意味する。
特定される全ての特許および刊行物は、例えば、本発明に関連して用いられうるそのような刊行物において記載されている方法論を記述および開示する目的のために、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。この点に関して、本発明者らが、以前の発明のせいでまたは他の何らかの理由のためにそのような開示に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこれらの文献の内容に関する表現は全て、出願人が入手可能な情報に基づいており、かつ、これらの文献の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
本明細書において用いられる場合、「を含む」という用語は、組織構築体および方法、ならびに組織構築体および方法の態様に不可欠であるその各成分に関して用いられるが、不可欠であろうとなかろうと、不特定の要素を包含する余地がある。「を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
本明細書において開示される態様は、組織構築体、そのような組織構築体(TC)を作出および使用する方法、ならびにヒト成人、ヒト新生児、ヒト乳児、ヒト青年またはヒト小児用のワクチンの評価のためのキットに関する。このキットは、ヒト成人、ヒト新生児、ヒト乳児、ヒト青年もしくはヒト小児用のアジュバント、抗原、ワクチン製剤、または免疫応答刺激剤を評価するためのものであってもよい。
本明細書において開示される態様は、現在知られているTCおよびワクチン評価方法が成人免疫系を特に標的としており、新生児、または成人免疫系とは全く異なる新生児免疫系には特に対処していないという所見に基づいている。さらに、非ヒト異種材料およびインタクトではない、非自家性の、多くの場合には異種の血漿/血清(例えば、ウシ胎仔血清)を利用する現在のTCおよび関連した方法は、液相因子が免疫応答において重要な役割を果たすので、ヒト、成人または新生児のインビボでの免疫環境を再現していない。
本明細書において用いられる場合、「新生児」という用語は、出生直近の、および出生後28日目までのまたは出生後の最初の4週間のヒト乳児をいう。「新生児（newborn）」および「新生児（neonatal）」という用語は、互換的に用いられる。
新生児および年少乳児は、微生物感染のリスクがより高い。世界保健機関は、6ヶ月齢未満の乳児および新生児2,000,000人超が感染症によって毎年死亡していると推定している。それゆえ、幼少時にワクチン接種を通じてこれらの疾患を予防する、満たされていない医学的必要性が存在している。
新生児抗原(Ag)提示細胞(APC)は、Th1極性化応答を展開する能力が低減している。新生児はまた、抗原特異的な記憶応答の障害を示し、低い補体レベル、増大した阻害性アデノシン、および母親由来抗体(Ab)を含めて、血漿中の免疫調節成分が異なる。これらの他と異なる特徴は、新生児および乳児の異なる免疫応答に寄与し、感染に対するその感受性に寄与しうる。
新生児および乳児は、頻繁な感染に苦しんでおり、多くのワクチンに対する応答が障害されているので、この影響を受けやすい集団を防御する努力を妨げている。感染に対する新生児の感受性およびそのワクチン応答の障害は、新生児独特の免疫に原因があった。例えば、新生児の体液性の免疫調節成分は、成人のものとは異なる。新生児は、より低い補体レベル、より低い血漿中濃度の抗微生物タンパク質およびペプチド、高濃度の免疫調節性アデノシン(Th1極性化サイトカインの産生を選択的に阻害する)を有し、転換成長因子-β、プロゲステロンおよびプロスタグランジンE2のような胎盤由来メディエータを有し、かつ妨害性、経胎盤性の母親由来抗体を有する。さらに、新生児の白血球の障害には、高い存在量の機能的に未成熟なかつ寛容原性の胸腺移出T細胞(ナイーブT細胞)、移行B細胞の優位性(T非依存性B細胞抗体応答の障害)、TLR媒介性のTh1極性化応答の低下(より低いTh1:Th2比)、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン-α(IFN-α)およびIFN-γの少なさ、単一細胞での多機能応答の低減、CD4リンパ球増殖の弱さ、B細胞に対するT細胞の助けの低さ、単球および単球由来DCによるTLR媒介性IL-6の高さ、ならびに抑制性調節性T細胞(Treg細胞)の数および活性の増加が含まれる。それゆえ、これに関連して、新生児免疫の異なる局面を特徴付けることは、新生児用にデザインされた新しい小児アジュバント、免疫調節剤、ワクチン製剤および治療用物質のトランスレーショナル開発に重要である。
ヒト免疫を研究する際の主要課題は、免疫調節薬、アジュバントおよびワクチン製剤の安全性および有効性の前臨床評価のために生理的に適切な方法でインビトロでの免疫反応をモデル化することである。ワクチンに対する応答の鍵になるのは、抗原提示細胞(APC)、つまりワクチン抗原をプロセッシングし、それらをMHC-IIとの関連においてリンパ球に提示し、副刺激シグナルをもたらし、それによって適応性免疫応答を誘因する白血球である。最も強力かつ活性なAPCのなかには、樹状細胞(DC)がある。循環血液単球(Mo)の活性化は、Mo由来樹状細胞(MoDC)へのその分化を誘導しうる。新生児APCの最も多く公表された研究は、プラスチック培養プレート上へのMoの培養ならびにIL-4およびGM-CSFのような外因性サイトカインを高濃度で用いた処理によって得られたMoDCに焦点を合わせていた。これらの外因性サイトカイン主導のDCは有用なモデル系であるが、インビボに存在するDCとのその関連性は、対象における真のインビボ免疫環境を完全には再現していない。実際に、研究対象の年齢、培地の組成および血漿の包含、ならびに白血球と内皮細胞とのおよび細胞外マトリックスとの相互作用を含めて、複数の可変要素が免疫応答に影響を与える。
新生児および年少乳児の免疫は、若年期感染の負担を低減する重要な利益をもたらす。出生は、世界中に接触する健康管理の最も信頼性の高いポイントであり、かくして、新生児の免疫は、より高いワクチン接種率をもたらし、多くの2/4/6ヶ月の免疫スケジュールに固有の感染性の領域を狭めるであろう。
小児用ワクチンはワクチン市場の大部分に相当するが、新しいワクチンを出すことは莫大な投資に相当する。発見および徹底的に行われる前臨床評価から臨床試験、登録および生産に至るまで、候補薬には、10億ドルと10年超の作業が費やされうることが知られている。この過剰な費用および時間についての1つの重要な理由が、開発の後期に認められる高い失敗率である。動物試験は役に立つが、しかしヒト免疫応答を予測するうえで100%信頼できないことが一般に認められている。ひいては、候補ワクチンの、より信頼できる前臨床評価が成功率を高める助けになりうるともいえよう。ここから、インビボで認められる通りのワクチンに対する免疫応答性を忠実に再現する初代ヒト培養物を用いるという考えが非常に魅力的になっており; これは、前臨床評価のための動物モデルおよび成人ヒト細胞がヒト新生児のおよび乳児の応答を予測するものではない新生児ワクチンには特に当てはまる。関連する重要なニーズは、候補の免疫調節薬、アジュバントまたはワクチン製剤の安全性の前臨床評価を改善して、あまりに反応性/毒性でありうるものを除外することである。インビボでの反応性の例としては、局所的腫脹および疼痛、発熱、熱性発作、ならびにその他のより深刻な有害事象が挙げられる(Ahmed, SS et al., Sci. Trans. Med. 2011を参照のこと)。
出生時のワクチン接種は、ヒツジの経口子宮内免疫を行う獣医学および卵内に日常的にワクチン接種を行う鶏肉産業において成功裏に証明されている。新生児のワクチン接種はまた、結核の場合BCG (ウシ結核菌(Mycobacterium bovis))およびB型肝炎の場合HBVのようなワクチンによりヒト新生児において安全かつ有効でありうる。しかしながら、出生時に安全かつ有効であると証明されたワクチンの数は、一つには、新生児の免疫応答の不完全な特徴付けによって、非常に限られている。新生児はその先天性および適応性免疫応答に対する明確な偏りを示すことを示唆する証拠が増えているので、成人での研究は、新生児の応答を予測するものではない(PrabhuDas M, et al., Nat, Immunol. 2011 Mar;12(3): 189-94)。
アジュバントは、インビボでワクチン抗原の免疫原性を増強するワクチン成分である。候補アジュバントに関する情報は大幅に増加しているが、ヒトのワクチンに用いるために現在承認されているものは少ない。抗原の製造業者から得られるミョウバン、MF59および天然の内毒素は、最も一般的である。この制限のほかにも、生まれたばかりの子どもにとって有効かつ安全でありうる新しいアジュバントを探索する必要がある。
若年期に投与される安全かつ有効なワクチンに対する満たされていないニーズを考慮して、ヒト新生児由来の初代細胞を用いるインビトロの試験系を開発した。そのような系は、ワクチンに対して予想される新生児免疫反応性のいっそう正確なデータを提供する。さらに、ヒト以外の異種材料を用いない完全にヒトのインビトロ試験系を開発することはまた、ヒト新生児およびヒト非新生児、例えば、成人、青年および小児を試験する場合にワクチンに対して予想される免疫反応性のいっそう正確なデータを提供するであろう。開示されるインビトロ試験系のさまざまな態様において、細胞を得た個体(すなわち、新生児)の年齢および同年齢の個体の流体/血漿相に固有の複雑性が考慮されることが本明細書において包含される。
1998年に、Gwendalyn J. Randolphは、インビトロで自律的に遊出した単球がいかにして48時間の刺激後に強力なAPCへと自律的に分化したかを実証する論文を発表した(Science Oct 16; 282 (5388): 480-3)。彼女は、組織構築体の設定においてヒト初代内皮細胞、および成人末梢血単核細胞(PBMC)を用いた。しかしながら、彼女は、無傷の自家ヒト血漿の免疫調節性の生物活性を反映していない、20%の熱で不活化された他家ヒト血清を有するM199培地を利用していた。成人細胞しか用いていない類似の系が米国特許出願公開第US20100287630号および同第US20050282148号に記載されている。注目すべきは、これらの系の全てが、加熱処理されたウシ胎仔血清または加熱処理されたヒト血漿を使用しており、これらは、本明細書に記載されるインビトロの試験系に含まれる組織構築体(TC)の研究において用いられた改変されていない自家のヘパリン添加され凍結保存された血漿の生物活性を反映していない。陽イオンキレート剤は、一般に用いられる標準的な抗凝固剤である。これらの陽イオンの非除去は、はるかに良い(インビボ様の)生物活性の一因となる。さらに、公表された研究または特許のどれも新生児の、臍帯血もしくは胎盤血細胞、非加熱血漿の使用について教示しておらず、または初代白血球、とりわけ新生児の細胞の応答性に重大な影響を及ぼすことが知られている血漿アデノシン系を考慮に入れていない。(Levy O. J. Immunol 2006; Coombs, MRP et al., Expert Reviews in Anti-Infective Therapy 2011)。さらに、公表された研究または特許のどれも、ヒトでのワクチンに対する免疫反応性を評価するTCを作出するためにヒトのみに由来する材料の使用について教示していない。
三次元のマイクロ生理的な、完全にヒト新生児の組織構築体(NTC)、および本明細書において成人の組織構築体(ATC)といわれる完全にヒト非新生児の組織構築体が本明細書において開示される。これらの完全にヒトのTCによって、自律的に発達した単球由来樹状細胞(MoDC)の特徴付け、およびより生理学的な条件、つまりヒトのインビボ環境をより厳密に再現する条件の下で自家リンパ球とのその相互作用が可能になる。
1つの態様において、NTCは、新生児ワクチンの有効性を評価するための試験として用いることができる。NTCを含むインビトロの試験系の態様では、新生児臍帯血または胎盤由来血液から、ヒト白血球および約50%〜約100%の自家ヒトヘパリン添加乏血小板血漿を得て用いる。NTCは、新生児由来の初代ヒト細胞から作出された免疫反応性の3次元の微小血管間質である。TCの態様では、自律的に遊出したヒト臍帯血単核白血球を有する細胞外マトリックス(ECM)クッションと、その上の初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のコンフルエントな静止期の単層とを含む。1つの態様において、NTCは100%の自家ヒトヘパリン添加血漿およびモデル循環試験中に適用されるジャイロスコープ運動を含む。
本明細書において用いられる場合、「白血球」および「リンパ球」という用語は、互換的に用いられる。白血球は白血球細胞である。それらは身体の免疫細胞を構成する。
いくつかの態様において、NTCは、(1) 提供された細胞外マトリックス(ECM)上にコンフルエントな静止期の内皮を有しかつ(2) ECM区画内部に単核白血球を有する場合に試験される。さまざまなアジュバントまたはワクチン製剤が、100%自家の無傷のまたはインタクトな(すなわち、加熱処理も、いずれの成分の枯渇もされていない)ヘパリン添加血漿を用いて調製され、NTCに適用される。48時間の、37℃および5% CO2での培養ならびにジャイロ移動の後、初期に遊出した白血球のなかには、アジュバントおよびワクチンに応答して強力な抗原提示細胞(APC)になるようにNTC ECM区画から出る自律的な遊走(逆遊出)を示すものもある。これらの培養物由来の上清は、ワクチンおよびアジュバントが用いられる場合に多くの炎症性サイトカインを含有する。これらのNTCは非常に特殊な方法で、さまざまなワクチンおよびアジュバントに応答する。ワクチンおよびアジュバントを一般的な免疫反応性について検証するために、これらの異なる免疫応答性プロファイルを、同じ刺激剤に応じたインビボでの免疫応答性プロファイルの相関物とのベンチマーク試験にかけることができる。ワクチン有効性を評価するために、さまざまなNTCによって作出されたAPCが、無傷の自家ナイーブCD4+ T細胞のリンパ球増殖および活性化を刺激する能力について試験される。言い換えれば、新生児での一次適応性免疫応答の開始(すなわち、ワクチン接種)にワクチンがどれくらいよいか、およびそのワクチンによるワクチン接種の用量がどれくらいかを試験することが、そのような免疫反応を提供するために必要とされよう。
NTC由来またはATC由来樹状T細胞を無傷の自家ナイーブCD4 T細胞と共培養することによる、無傷の自家CD4 T細胞の活性化方法も本明細書において開示される。NTC由来またはATC由来の樹状T細胞を調製する際に非異種材料を用いること、ならびに自家の細胞およびヘパリン添加血漿を用いることにより、開示されるTCおよび方法は、現在使われているTCの欠陥を克服する。ワクチンを評価するためのプラットフォームとして本明細書において具現化されるTCを用いることの独自の特徴のいくつかは、熱による不活化、カルシウムおよびマグネシウムキレート剤、ある種の割合のM199培地、陽性選択されたナイーブCD4+ T細胞、ならびに/またはアロジェニックなリンパ球増殖を用いることなくTCが作出されたということである。記載される方法およびTCのいくつかの態様において、ウシコラーゲンおよび/またはウシ胎仔血清を用いることなくTCが作出された。
出生時、幼年時および成人時のヒトにおいて用いられた場合に安全かつ有効であることが、またはあまり安全ではない(例えば、あまりに反応性である)ことが示されている市販のワクチンを用いてベンチマーク試験にかけることにより、本明細書に記載されるTCによって誘導された反応性を、インビボで誘導された反応性応答と関連付けて検証することができる。NTCは、新生児用候補ワクチンの臨床前の生物安全性および有効性を評価するのに適したインビトロの試験系でもある。この最初の適用は、ワクチンおよびアジュバントに固有の免疫反応性について試験するためである。多くの他のタイプの治療用物質の一般的な反応性の前臨床評価のためにNTCを検証することもできる。1つの態様において、NTCおよびATCは、試験個体および対照個体と同じヒト個体について同時に行われる前臨床評価を可能にし、試験個体および対照個体が異なる個体である場合の臨床試験によって認められる固有のバラツキを抑える。
1つの態様において、NTCは、TCにコロニー形成させるために臍帯血単核細胞(CBMC)を利用する。1つの態様において、CBMCはFICOLL分離によって得られる。CBMCを得る他の方法は、当技術分野において公知である。他の態様において、NTCは、全血またはその他任意の所望の、予め選択されたその血液成分、例えば白血球の亜集団(単球、リンパ球、好中球)、血小板、赤血球などを用いる。他の態様において、NTCは、健常白血球と病的白血球を比較するために用いることができ; 静脈内適用を対象とした任意のタイプの薬物を試験するために用いることができ; および迅速な先天性免疫反応性から進行の遅い抗原特異的な適応性免疫応答に及ぶ有意義な生体情報または免疫反応性を得るために用いることができる。
ATCおよびNTCの開発は、新生児および非新生児由来の免疫細胞の比較を可能にする。この比較によって、自律的に発達した新生児MoDCは、その成人対応物と比べて、遊走、免疫表現型および従来のワクチンに対する機能的応答が異なることが明らかにされる。さらに、NTCによって、MoDC依存的なリンパ球増殖および分化を誘導するカルメットゲラン桿菌(Bacille Calmette-Guerin) (BCG)ワクチンの異なった能力が明らかにされる。例えば、単一用量ワクチンとして通常投与されるBCGによる強力な自家ナイーブCD4+ Tリンパ球増殖を実証する一方で、NTCは、インビボで防御を付与するのに3用量を通常要するHBVおよびPCVのような他の小児用ワクチンをパルスしたMoDCに応答してかなり低いリンパ球増殖を実証した。これは、とても若いヒト（例えば、新生児）向けのワクチン製剤を評価するために、完全にヒトのNTCが使用されうることを実証するものである。
当技術分野において現在知られているものと比べてNTCおよびATCの利点がある。第一に、完全にヒトの組織工学系を現在用いている競合相手はいない。完全にヒトのTCはHUVECのようなECを成長させる効率を高める; HUVECは、現在知られているTCにおいて認められた5〜6日間と比べ、24時間のうちに細胞約100％のコンフルエントな単層を形成する。ヒト由来の材料しか用いていない場合でさえも、ウシ由来の材料、例えば、血清を用いた、現在知られているTCと比べて単球の遊走および分化の変化は認められない。外因性抗原の使用を回避することにより、稀有な抗原応答がワクチン応答によるものであって、ウシ残留物または構築体に存在するその他任意の非ワクチン異種成分由来のものではないことを確実にすることができる。
第二に、新生児は、従来の小児用ワクチンに対する免疫応答に障害を有し、新生児らに、感染を起こしやすくさせる、異なった免疫系を有する。出生は世界中に接触する健康管理の信頼性の高いポイントであるので、新生児の免疫は世界的規模の感染を低減する助けとなりうる。しかしながら、小児用ワクチンの開発は主に、場当たり的かつ経験的であって、免疫における個体発生を軽視することが多かった。樹状細胞は、機能が年齢依存的であるワクチン応答に欠かせない重要な抗原提示細胞である(例えば、Willems, F et al., Eur. J. Immunol. 2009による概説を参照のこと)。ヒト成人および動物での研究は、新生児のワクチン応答を確実に予測するものではなく、それゆえ、年齢特異的なヒト樹状細胞応答をモデル化することは、新生児を標的とするアジュバントおよびワクチンの安全性および有効性を予測する助けとなりうる。単球(Mo)由来樹状細胞(MoDC)のインビトロの研究では、典型的に、内皮細胞なし、細胞外マトリックスなし、かつ外因性サイトカインの使用ありの非自家培地中での培養を利用するが、しかしこのようにして作出された細胞と、インビボに存在する細胞との関係は不明である。外因性サイトカインの添加なく、自家血漿を含有する三次元マトリックス中で培養され、自律的に作出された樹状細胞に及ぼすワクチン製剤の効果を研究することで、免疫調節剤、アジュバントおよびワクチン製剤のインビボでの有効性を予測する新生児の免疫応答がより正確に反映されうる。
いくつかの態様において、TCおよび方法は年齢特異的な方法でアジュバント、ワクチン、または免疫応答刺激剤の有効性の評価を可能にする。例えば、特定の年齢層において免疫防御を誘発するうえでのアジュバント、ワクチン、または免疫応答刺激剤の有効性の評価。これは、ある種の年齢層のヒトがある種の感染性病原体の影響をより受けやすいので、有用である。
以下は、年齢特異的なTCを作出および使用する非限定的な方法である。ヒト細胞外マトリックス成分、初代ヒト内皮単層、および凍結保存された新生児臍帯血単核細胞(CBMC)または成人末梢血単核細胞(PBMC)を、その対応する自家血漿とともに用いて96ウェルの形式で三次元の微小血管間質として年齢特異的な組織構築体(TC)を作出する。TCを、他家CBMCもしくはPBMCによってコロニー形成させ、または自家ナイーブCD4+ Tリンパ球との相互作用に関するその後の研究用に抗原提示樹状細胞(APC)としても知られる骨髄抗原提示細胞の純粋な細胞集団を作出するため、精製CD33+単球(CD33+ Mo)でコロニー形成させる。カルメットゲラン桿菌(BCG)、B型肝炎ワクチン(HBV)、ジフテリア・破傷風・無細胞百日咳ワクチン(DTaP)、全細胞百日咳(wP)を含有する五価のワクチン、または肺炎球菌結合型ワクチン(PCV)を含む、アジュバントまたはワクチンでTCを刺激する。TC由来のMoDCを、48時間の時点で回収し、多色フローサイトメトリーによって免疫表現型を判定する。培養上清に関しての26-サイトカイン多重ビーズアレイを用いてサイトカインの産生を測定することができる。CD33+ Moがコロニー形成した組織構築体によって自律的に作出されたワクチンをパルスしたAPCを、自家ナイーブCD4+ Tリンパ球と共培養して、リンパ球増殖およびサイトカイン産生を評価することができる。
したがって、本明細書において開示される態様では、当技術分野において公知の他の内皮TCと比べてヒト免疫系のインビボの免疫環境をよりよく再現するようにデザインされている内皮TCを提供する。そのようなヒト内皮TCの態様は、成人の免疫系、非新生児の免疫系または新生児の免疫系に対するインビトロでのワクチン有効性評価のために特別にデザインしかつ使用することができる。すなわち、評価されるワクチンまたは抗原が新生児のワクチン接種に用いるためであるなら、ヒト内皮TCは、新生児のインビボの免疫環境を再現するように特別にデザインされよう。例えば、ヒト新生児血漿または血清、ヒト新生児MC、ヒト新生児CD33+またはCD14+選択単球などを用い、かつ同じ個体由来の細胞および血漿または血清を用い、すなわち、細胞、血漿または血清は自家である。他方で、評価されるワクチンまたは抗原が成人、青年または小児のワクチン接種に用いるためであるなら、ヒト内皮TCは、新生児以外のヒトの各年齢特異的な層のインビボの免疫環境を再現するように特別にデザインされよう。例えば、同年齢のヒト血漿もしくは血清、ヒト単核細胞、ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球などを用い、かつ/または同じ個体由来の細胞および血漿または血清を用い、すなわち、細胞、血漿または血清は自家である。いくつかの態様において、成人の同年齢の細胞は、21〜30歳、31〜40歳、41〜50歳、51〜60歳、61〜70歳、および70歳を上回る年齢層の成人由来の細胞である。1つの態様において、青年の同年齢の細胞は、11〜20歳の青年由来の細胞である。いくつかの態様において、小児の同年齢の細胞は、2〜6歳および6〜11歳の小児由来の細胞である。
1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECの単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成し、かつ遊走樹状細胞へと分化しているヒトMCとを含むTCが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、ヒトECおよび/またはヒトMCは、新生児、成人、青年または小児由来である。いくつかの態様において、ヒトECおよび/またはヒトMCは、21〜30歳、31〜40歳、41〜50歳、51〜60歳、61〜70歳、および70歳を上回る年齢層の成人由来である。1つの態様において、ヒト単核細胞は、ヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球である。
本明細書において用いられる「含む」という用語は、TCおよび方法に関して用いられる場合、その各成分はそれぞれTCおよび方法に不可欠であるが、組織構築体および方法は、不可欠かそうでないかを問わず、不特定の要素の包含の余地があることを示す。
本明細書において用いられる場合、「から本質的になる」という用語は、記載されるTCおよび方法の所与の態様に必要とされる要素をいう。この用語は、TCおよび方法のその態様の基本かつ新規のまたは機能的な特徴に物質的に影響を与えない要素の存在を可能にする。
1つの態様において、ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECの単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成しているヒトMCとを含むTCが、本明細書において提供される。1つの態様において、TCは主に、ヒト成分: ヒトコラーゲン、ヒト血漿中で培養されたヒト内皮細胞、ならびにヒト血清アルブミン中で培養されたヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球を含む。
1つの態様において、ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECの単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成しているヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球とを含むヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成しているヒトMCとを含むヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッション内に埋まり、細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成しているヒトMCとを含み、ヒトECおよびヒトMCが単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。1つの態様において、内皮単層から遊出し、細胞外マトリックスクッションにコロニー形成するプロセスの間に、MCが発生し、遊走樹状細胞へと転換する。1つの態様において、ヒトECおよびヒトMCは新生児由来でありうる。他の態様において、ヒトECおよびヒト単核細胞は成人、青年または小児由来でありうる。これらの態様において、各組織構築体のヒトECおよびヒトMCは、理想的には、少なくとも同年齢のものまたは代表的な同年齢層のものとすべきである。すなわち、例えば、ヒトECが小児由来であるなら、ヒトMCも小児由来とすべきであり; ヒトECが年齢55の成人由来であるなら、ヒトMCも理想的には、年齢層51〜60の成人由来とすべきである。
記載されるTCの別の態様において、ヒトECおよびヒトMCは、同年齢のものではない。例えば、ヒトECは年齢25の成人由来であり、ヒトMCは年齢層51〜60の成人由来である。
記載されるTCの1つの態様において、ヒトECおよびヒトMCは自家性であり、ヒトECおよびヒトMCの両方が同じ個人から得られることを意味する。
記載されるTCの別の態様において、ヒトECおよびヒトMCは自家性ではなく、ヒトECおよびヒトMCの両方が同じ個人から得られないことを意味する。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒト新生児MCとを含み、ヒトECおよびヒト新生児MCが単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒトMCとを含み、ヒトECおよびヒトMCが単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られ、かつヒト内皮細胞およびヒトMCが臍帯から得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッション、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層、ならびにヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球を含み、ヒトECおよびヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+選択単球とを含み、ヒトECおよびヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+選択単球が単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球とを含み、ヒトECおよびヒトCD33+選択単球が単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られ、かつヒトECおよびヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が臍帯から得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
1つの態様において、成熟ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションと、クッション上部のヒトECのコンフルエントな単層と、ヒトECの単層を通って遊出しており、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成しているヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+選択単球とを含み、ヒトECおよびヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+選択単球が単一のドナーまたは同年齢のドナーから得られる、ヒトTCが、本明細書において提供される。
新生児の免疫系または年齢特異的な非新生児の免疫系と同様に、成人免疫系における免疫応答の予測される刺激を評価する、インビトロでのワクチン、アジュバント、抗原または他の免疫応答刺激剤の有効性評価のためにそのような内皮TCを作出する方法および使用する方法も提供される。
1つの態様において、TCを調製する方法であって、細胞外マトリックスのクッションを提供する段階、ヒト血漿の存在下で細胞が単層を形成するのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上でヒトECを培養する段階、ヒト単核細胞をヒトECの単層に添加する段階、ならびにMCがヒトECの単層を通って自律的に遊出してヒトECの単層の下の細胞外マトリックスのクッションにおいてコロニー形成し、続いてMCが遊走樹状細胞へと自律的に分化するのに十分な期間、ヒト単核細胞をヒト血清アルブミン中で培養する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションはコラーゲンを含む。1つの態様において、コラーゲンはアルカリ性条件下で、例えば、実施例の項において記載されている0.1 N NaOHの存在下で凝固するように誘導されている。
記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、細胞外マトリックスのクッションはフィブロネクチンをさらに含む。1つの態様において、フィブロネクチンはヒトフィブロネクチンである。
記載される方法またはTCのいずれかのいくつかの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、種々の供給源に由来することができ、非限定的な例はヒト、ウシおよびブタである。したがって、記載される方法またはTCのいずれかのいくつかの態様において、コラーゲンはヒトコラーゲン、ウシコラーゲンまたはブタコラーゲンである。他の組み換えコラーゲンも本明細書において包含される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、I型コラーゲンである。例えば、ヒトコラーゲンが用いられるなら、ヒトコラーゲンはヒト1型コラーゲンである。記載される方法またはTCのいずれかの他の態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。記載される方法またはTCのいずれかの他の態様において、用いられるコラーゲンは、いくつかのタイプのコラーゲンの混合物であることができ、それは、1型、II型、III型、IV型、およびV型コラーゲンから選択されるコラーゲンの群の混合物である。
内皮細胞の単層が成長する細胞外マトリックスのクッションの作出において用いるために、他の細胞外マトリックス材料も企図される。細胞外マトリックスのクッションを構成しうる他の細胞外マトリックス材料の非限定的な例は、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびケラタン硫酸のような繊維である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、グリコシル化または糖化されている。1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、組織構築体におけるマトリックスの形成前にはグリコシル化または糖化されていない。言い換えれば、細胞外マトリックスのクッションを作出するための出発材料の供給源としてのコラーゲンは、例えば、ヒト死体からまたはウシからではグリコシル化または糖化されていなかった。コラーゲンがグリコシル化または糖化されている場合、それは「成熟」しているとみなされる。成熟コラーゲンは短期間内に、例えば2日以内に、細胞のコンフルエントな単層を作り出す内皮細胞にいっそう適した細胞付着表面を提供する。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟される。1つの態様において、ヒトコラーゲンが細胞外マトリックスのクッションに用いられる場合、ヒトコラーゲンはグルコース-6-リン酸の存在下で成熟される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、グルコース-6-リン酸は約20 mM〜約500 mMの濃度で用いられる。他の態様において、グルコース-6-リン酸は、約20 mM〜約500 mM間の全ての濃度を含めて、約50 mM〜約400 mM、約50 mM〜約350 mM、約50 mM〜約250 mM、約100 mM〜約400 mM、約100 mM〜約250 mM、約150 mM〜約250 mM、約150 mM〜約300 mM、または約200 mM〜約250 mMの濃度で用いられる。他の態様において、グルコース-6-リン酸は、約20 mM〜約500 mM間の全ての濃度を含めて、約20 mM、約50 mM、約70 mM、約100 mM、約120 mM、約150 mM、約170 mM、約190 mM、約210 mM、約225 mM、約250 mM、約275 mM、約290 mM、約315 mM、約325 mM、約350 mM、約370 mM、約390 mM、約400 mM、約420 mM、約440 mM、約460 mM、約485 mM、約500 mMの濃度で用いられる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、グルコース-6-リン酸は使用前にpH中性化される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている。記載される方法またはTCのいずれかのいくつかの態様において、細胞外マトリックスのクッションに用いられるコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で、2、2.5、3、3.5、4、4.5、または5日間成熟されている。約2〜約5日間の日の端数も企図される。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトコラーゲンが細胞外マトリックスのクッションに用いられる場合、ヒトコラーゲンは、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、グルコース-6-リン酸の存在下での成熟のために許容される期間は、少なくとも48時間でありかつ最大5日間である。いくつかの態様において、期間は2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECはヒト初代ECである。1つの態様において、ヒトECはヒト成人、ヒト青年、ヒト小児由来またはヒト新生児由来である。さまざまな供給源由来のヒトECが用いられうることが本明細書で包含される。非限定的な例は、成人肺組織由来のヒト肺EC、赤ちゃん誕生後のヒト臍帯由来のヒト内皮細胞、および成人骨髄由来のヒトECである。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代内皮細胞は、ヒト臍帯または静脈から得られる。MILLIPORE(登録商標)およびCell Application Inc.由来のヒト臍帯静脈EC (HUVEC)のような、ヒトECの商業的供給源も本明細書で包含される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代ECはただ1人のドナーから得られる。例えば、単一のヒト臍帯もしくは静脈、または単一の成人、青年もしくは小児由来の骨髄からである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は、予め凍結保存されたものである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、TCを作出するための全ての細胞、血清および細胞外マトリックス材料は、予め凍結保存されたものである。例えば、ヒトEC、ヒト血漿、ヒトMC、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球、ヒト血清アルブミン、ならびにヒト臍帯血。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECはヒト血漿の存在下で培養される。1つの態様において、ヒト血漿は、成人、青年または小児から得られた血漿のようなヒト新生児血漿または非新生児血漿である。1つの態様において、ヒト血漿はインタクトな血漿であり、すなわち、血漿は、血漿中に天然に存在しているいずれの成分も枯渇していない。例えば、血漿は、免疫活性化および免疫応答の誘発にどれも重要な、二価イオン、補体成分またはアデノシン生成プリン作動性酵素が枯渇していない。1つの態様において、インタクトなヒト血漿は、血小板および/または二価イオンが枯渇していない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は熱で不活化されているか、または熱で不活化されていない。1つの態様において、ヒト血漿は、2人以上のドナーからプールされた血漿である。1つの態様において、ヒト新生児血漿はヒト臍帯血から得られる。ヒト新生児血漿は、1人のヒト臍帯血由来であってよく、または幾人かのヒト臍帯血由来であってもよく、すなわち、幾人かの新生児由来の臍帯血からプールされてもよい。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は、血液中の二価イオンがキレートされないように、キレート剤を含有しないヘパリンを用いて調製される。通常キレート化される二価イオンの例は、マグネシウムおよびカルシウムである。1つの態様において、ヒト血漿は、白血球活性化および免疫応答の生成に重要であるマグネシウムおよびカルシウムイオンのような内在性二価イオンが実質的に枯渇していない。記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿は、内在性二価イオンのマグネシウムおよび/またはカルシウムイオンが実質的に枯渇していない。
本明細書において用いられる場合、ヒト血漿および/またはヒト血清中のマグネシウムおよびカルシウムイオンのような二価イオンに関連して「実質的に枯渇し」という用語は、その中の各二価イオンの濃度が、特定のドナー由来のヒト血漿および/もしくはヒト血清中に天然に存在する濃度の、またはドナーの集団由来のヒト血漿および/もしくはヒト血清中に天然に存在する平均濃度の少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、または約100%であることを意味する。別の態様において、「実質的に枯渇し」は、血漿の自然凝固を可能にするイオンのその濃度よりも低い任意の他の濃度をいう。
本明細書において用いられる場合、マグネシウムおよびカルシウムイオンのような二価イオンに関連して「内在性」という用語は、ドナーから取り除かれるヒト血漿および/またはヒト血清中の二価イオンの天然の量をいう。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECは、ウシ胎仔血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ胎仔血清またはウマ血清の存在下では培養されない。言い換えれば、ヒトECは任意の他の異種の(すなわち、ヒト以外の)血清または血漿の存在下では培養されない。別の態様において、ヒトECは非ヒト由来の血清または血漿の存在下では培養されない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト初代ECは、少なくとも40%のヒト血漿の存在下で培養され、すなわち、細胞外マトリックスのクッション上でヒトECを培養する際に用いられる細胞培地は、少なくとも40%のヒト血漿を含む。別の態様において、細胞培地は、少なくとも50%のヒト血漿を含む。1つの態様において、細胞培地は、約50%のヒト血漿を含む。別の態様において、50%〜100%の間の可能な全ての割合を含めて、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%のヒト血漿が、ヒトECを培養するために用いられる。他の態様において、細胞培地は、約40%〜100%のヒト血漿を含む。他の態様において、細胞培地は、約40%〜90%、約40%〜80%、約40%〜70%、約40%〜60%、約40%〜50%、約45%〜95%、約45%〜85%、約45%〜75%、約45%〜65%、約45%〜55%、約50%〜90%、約50%〜80%、約50%〜70%、約50%〜60%、約55%〜95%、約55%〜85%、約55%〜75%、約55%〜65%、約55%〜60%、および約40%〜100%の間の可能な全ての範囲のヒト血漿を含む。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ECは、細胞外マトリックスのクッション上でコンフルエントな単層へと培養される。別の態様において、ヒト初代ECは、細胞外マトリックスのクッション上でコンフルエントな単層へと培養される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ECのコンフルエントな単層は少なくとも90%コンフルエントである。他の態様において、コンフルエントな単層は少なくとも91%コンフルエント、少なくとも92%コンフルエント、少なくとも93%コンフルエント、少なくとも94%コンフルエント、少なくとも95%コンフルエント、少なくとも96%コンフルエント、少なくとも97%コンフルエント、少なくとも98%コンフルエント、少なくとも99%コンフルエント、または少なくとも100%コンフルエントである。
記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ECのコンフルエントな単層は約92%〜100%コンフルエントである。他の態様において、コンフルエントな単層は約94%〜約100%コンフルエント、約96%〜約100%コンフルエント、約98%〜約100%コンフルエント、約92%〜約98%コンフルエント、約92%〜約96%コンフルエント、約92%〜約94%コンフルエント、約91%〜約100%コンフルエント、約91%〜約99%コンフルエント、約91%〜約97%コンフルエント、約91%〜約95%コンフルエント、約91%〜約93%コンフルエント、約93%〜約99%コンフルエント、約93%〜約97%コンフルエント、約93%〜約95%コンフルエント、約93%〜約94%コンフルエント、約95%〜約100%コンフルエント、約95%〜約98%コンフルエント、約95%〜約99%コンフルエント、約95%〜約97%コンフルエント、約95%〜約96%コンフルエント、および約90%〜約100%の間の可能な全ての範囲においてコンフルエントである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ECがヒト血漿の存在下で単層を形成するのに十分な期間は、少なくとも24時間である。他の態様において、ECがヒト血漿の存在下で単層を形成するのに十分な期間は、少なくとも30時間、少なくとも36時間、少なくとも42時間、少なくとも48時間、少なくとも54時間、少なくとも60時間、少なくとも66時間、少なくとも72時間、および少なくとも、約24時間〜約72時間の間の可能な全ての整数時間である。他の態様において、ECがヒト血漿の存在下で単層を形成するのに十分な期間は、約30時間、約36時間、約42時間、約48時間、約54時間、約60時間、約66時間、約72時間、および約24時間〜約72時間の間の可能な全ての整数時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ECが単層を形成するのに十分な期間は、約24時間〜約5日間である。他の態様において、単層を得るための期間は、約24時間〜約2日間、約24時間〜約1.5日間、約30時間〜約3日間、約30時間〜約2日間、約30時間〜約1.5日間、約36時間〜約3日間、約36時間〜約2日間、約36時間〜約2.5日間、約1.5〜約3日間、約1.5〜約2日間、約2〜約5日間、および約24時間〜約5日間の間の可能な全ての整数時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECの単層から自律的に遊出してヒトECの単層下の細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成するヒトMCは、ヒト新生児MCである。1つの態様において、ヒト新生児MCはヒト臍帯血から得られる。1つの態様において、ヒト新生児MCは単一のドナー、例えば、単一の新生児のヒト臍帯血由来である。別の態様において、ヒト新生児MCは2人以上のドナー、例えば、幾人かの新生児由来のヒト臍帯血または胎盤血からプールされる。例えば、産科病棟から廃棄されたヒト臍帯を回収することができ、これらの廃棄されたヒト臍帯由来の臍帯血を、MCの単離のために収集およびプールすることができる。1つの態様において、ヒト新生児MCは2人以上のドナーからプールされ、これらのドナーは遺伝学的に同一であるか、または遺伝学的に関連している。例えば、ドナーは一卵性の双生児、三つ子または四つ子であり; これらのドナーは遺伝学的に同一であろう。例えば、ドナーは二卵性の双生児、三つ子、四つ子、五つ子、六つ子、七つ子、八つ子、九つ子または十つ子などである。これらのドナーは遺伝学的に関連しているであろうが、しかし遺伝学的に同一ではない。例えば、ドナーは、異なる時間および年に生まれた兄弟姉妹である。これらのドナーは遺伝学的に関連しているであろうが、しかし遺伝学的に同一ではない。ヒト新生児MCは1人目の兄弟姉妹から収集され、凍結保存される。その後、2人目の兄弟姉妹が生まれた時に、その新生児MCが収集される。第二子由来の新生児MCをその後、凍結保存することができる。細胞外マトリックスのクッションに播種するのに必要とされる時に、第一子および第二子由来の新生児MCをそれに応じて融解し、プールし、用いることができる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトECの単層から自律的に遊出してヒトECの単層下の細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成するヒト単核細胞(MC)は、成人、新生児、乳児、青年または小児に由来する。1つの態様において、ヒトMCは循環末梢血から得られる。1つの態様において、ヒトMCは単一のドナー、例えば、単一の成人、新生児、乳児、青年または小児の循環末梢血由来である。別の態様において、ヒトMCは2人以上のドナー、例えば、幾人かの成人、青年または小児から回収された循環末梢血からプールされる。1つの態様において、プールされたヒトMCは、1つの代表的なクラスのドナーからプールされ、プールされたヒトMCが成人だけに由来し、青年だけまたは小児だけに由来することを意味する。すなわち、プールされたヒトMCは、成人および青年からプールされた、成人、青年もしくは小児からプールされた、成人および小児からプールされた、または青年もしくは小児からプールされたヒトMCを含有しない。いくつかの態様において、プールされたヒトMCが1つの代表的な年齢層のドナーからプールされる場合、すなわち、ドナーは同年齢である。
ヒトMCは循環末梢血、骨髄または臍帯血から単離することができる。例えば、血液のサンプルからMCを調製する方法は当技術分野において公知であり、血液のMC画分は、実施例の項において記載されるようにパーコールまたはフィコール密度勾配遠心分離法によって得ることができる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCは1人のドナーに由来する。別の態様において、ヒトMCは2人以上のドナーからプールされていない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCは、予め凍結保存された細胞である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCはヒトCD33+単球である。別の態様において、ヒトMCはヒトCD14+単球である。別の態様において、ヒトMCはヒトCD33+かつCD14+単球である。言い換えれば、ヒトMCはCD33および/またはCD14細胞表面マーカーについて正に選択される。ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、いくつかの供給源に由来することができる; CD33+かつ/またはCD14+単球の供給源の非限定的な例は、ヒト臍帯血、循環末梢血および骨髄である。いくつかの態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、ヒト成人、ヒト青年またはヒト小児の循環末梢血または骨髄より得ることができる。別の態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、新生児のヒト末梢血より得ることができ、それゆえ、それはヒト新生児CD33+単球、ヒト新生児CD33+, CD14+単球またはヒト新生児CD14+単球と名付けられる。限定されるわけではないが、CD33+かつ/またはCD14+細胞の迅速単離について、白血球分離、密度勾配分画、免疫選択、示差付着分離（differential adhesion separation）などのようないくつかの技法が知られている。非限定的な例として、MCを密度勾配遠心分離法によって得ることができ、磁気ビーズ結合抗CD33抗体または抗CD14+抗体で標識することができ、1つまたは複数の磁気カラムに通して、それぞれ、正に選択されたCD33+またはCD14+細胞を得ることができる。さらにまたは代わりに、MCをCD33またはCD14に対する蛍光抗体で標識することができ、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)により選別して、それぞれCD33+またはCD14+細胞を得ることができる。得られるCD33+細胞またはCD14+細胞の収率および純度は、供給源および細胞を精製するために用いられる方法に依って変わりうる。磁気カラムを通じた標識細胞の通過1回の後に得られる純度は、例えば、75%〜95%でありえ、それに続くFACSの後、純度を95%〜100%に高めることができよう。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+単球は、精製済みの陽性単離されたCD33+単球である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児MCはCD33+選択された単球である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+単球は依然として、いくらかの単球不均質性(例えばCD14-弱陽性/陰性CD16+単球)を保存している。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児CD33+単球はTC中で遊出することが可能となる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、遊出したヒト新生児CD33+は、TC中で逆遊出した成熟樹状細胞(DC)へと自律的に分化する。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、樹状細胞は少なくともHLA-DR+および/またはCD86高および/またはCCR7+である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、予め凍結保存された細胞である。本明細書に記載される全ての凍結保存細胞は、当技術分野において公知の標準的な方法にしたがって融解することができ、本明細書に記載される方法において用いることができる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、新生児CD33+かつ/またはCD14+単球であり、すなわち、新生児から得られる。1つの態様において、ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球は、1人または複数人の新生児から得られ、その後、一緒にプールされる。1つの態様において、ヒト新生児CD33+単球は、1人または複数人の新生児のヒト臍帯血から得られ、その後、一緒にプールされる。
記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、ヒト非新生児から得られる。いくつかの態様において、ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、成人、青年または小児から得られる。いくつかの態様において、ヒトCD33+単球は、1人もしくは複数人の成人、1人もしくは複数人の青年または1人もしくは複数人の小児から得られ、プールされる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはCD33かつ/もしくはCD14選択単球は、1人のドナーに由来し、すなわち、成人由来、青年由来、小児由来または新生児由来のヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、単一のドナーから得られる。別の態様において、成人由来、青年由来、小児由来または新生児由来のヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはCD33かつ/もしくはCD14選択単球は、2人以上のドナーからプールされない。
記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、成人由来、青年由来、小児由来または新生児由来のヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、2人以上のドナーからプールされる。1つの態様において、プールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、1つの代表的な年齢層またはクラスのドナーからプールされ、プールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が成人だけに由来するか、青年だけまたは小児だけに由来することを意味する。すなわち、プールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球は、成人および青年からプールされた、成人、青年もしくは小児からプールされた、成人および小児からプールされた、または青年もしくは小児からプールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球の混合物ではない。いくつかの態様において、プールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1つの代表的なクラスまたは年齢層のドナーからプールされる場合、ドナーは同年齢である。例えば、プールされたヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が成人だけからプールされるなら、単球は21〜30歳の年齢層の成人だけ、31〜40歳の年齢層の成人だけ、41〜50歳の年齢層の成人だけ、51〜60歳の年齢層の成人だけ、61〜70歳の年齢層の成人だけ、または70歳を上回る年齢層の成人だけの成人由来である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、ヒト血清アルブミンの存在下で培養される。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは臨床等級のヒト血清アルブミンである。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは熱で不活化されていない。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは発熱物質を含まない。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは予め凍結保存または凍結されたものである。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血清アルブミンは、血液中の二価イオンがキレートされないように、キレート剤を含有しないヘパリンを用いて調製される。通常キレート化される二価イオンの例は、マグネシウムおよびカルシウムである。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは、マグネシウムおよびカルシウムイオンのような内在性二価イオンが実質的に枯渇していない。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは、内在性二価イオンのマグネシウムおよび/またはカルシウムイオンが実質的に枯渇していない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、少なくとも0.05%のヒト血清アルブミンの存在下で培養される。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、約0.05%〜約10%のヒト血清アルブミンの存在下で培養される。いくつかの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、約0.05%〜約10%の間の可能な全ての%範囲のヒト血清アルブミンを含めて、約0.1%〜約10%、約0.1%〜約5%、約0.1%〜約1%、約0.1%〜約0.5%、約0.1%〜約0.6%、約0.1%〜約0.7%、約0.1%〜約0.8%、約0.1%〜約0.9%、約0.2%〜約1%、約0.4%〜約1%、約0.6%〜約1%、約0.8%〜約1%、約0.1%〜約0.4%、約0.1%〜約0.3%、約0.1%〜約0.2%、約0.5%〜約1%、約0.5%〜約2%、約0.05%〜約0.4%、約0.05%〜約0.3%、約0.05%〜約0.2%、約0.05%〜約1%、約0.05%〜約2%のヒト血清アルブミンの存在下で培養される。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、少なくとも0.1%のヒト血清アルブミンの存在下で培養される。他の態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、約0.01%、約0.02%、約0.03%、約0.04%、約0.05%、約0.06%、約0.07%、約0.08%、約0.09%、約0.1%、約0.11%、約0.12%、約0.13%、約0.14%、または約0.15%のヒト血清アルブミンの存在下で培養される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、外因的に加えられたサイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない。外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の非限定的な例は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびインターロイキン-4 (IL-4)である。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、外因的に加えられたGM-CSFの存在下では培養されない。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、外因的に加えられたIL-4の存在下では培養されない。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、外因的に加えられたGM-CSFおよびIL-4の存在下では培養されない。
本明細書において用いられる「外因的に加えられた」という用語は、サイトカインまたは免疫応答刺激剤に関連して用いられる場合、外部供給源由来のサイトカインまたは作用物質を培地へ特異的に加え、それにより、そのようなサイトカインまたは作用物質の濃度を、特異的な添加が行われなかった場合のそれと比べて人為的に増加させることを意味する。1つの態様において、「外因的に加えられた」は、培地に加えられかつ培地を構成する血清または血漿において天然に見出されるサイトカインまたは免疫応答刺激剤を包含しない。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、血清の非存在下でECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することが可能である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球がECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、少なくとも0.5時間である。1つの態様において、当該期間は、約0.5時間、約0.6時間、約0.7時間、約0.8時間、約0.9時間、約1.0時間、約1.1時間、約1.2時間、約1.3時間、約1.4時間、約1.5時間、約1.6時間、約1.7時間、約1.8時間、約1.9時間、または約2.0時間である。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球がECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、約0.5時間〜約4時間、約0.5時間〜約3時間、約0.5時間〜約2時間、約0.5時間〜約1時間、約1時間〜約4時間、約1時間〜約3時間、約1時間〜約2時間、約1.5時間〜約4時間、約1.5時間〜約3時間、約1.5時間〜約2時間、約2時間〜約4時間、または約2時間〜約3時間である。1時間の端数も本明細書に包含される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球がECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、約1.5時間〜約2時間である。1つの態様において、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球がECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間は、わずかに約2時間である。理論によって束縛されることを望むわけではないが、この自律的な遊出の期間中またはその直後に、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は遊走樹状細胞へと転換または分化するものと考えられる。この自律的な遊出の期間の終わりに、細胞外マトリックスのクッションはヒト遊走樹状細胞の集団によってコロニー形成される。クッションへ遊出し、かつ48時間後の培養後にクッション内に滞留した細胞は、樹状細胞発生と一致する細胞マーカーの、非常に低い発現を示す。細胞外マトリックスへの遊出後、これらの細胞は自律的に、樹状細胞として組織構築体の内腔の区画へ内皮単層を越えて逆遊出し戻ることができる。逆遊出は刺激なしでさえも起こり、主に未成熟な遊走樹状細胞をもたらす。しかしながら、逆遊出の程度も逆遊出した樹状細胞の免疫表現型(例えば、成熟度および生物活性の度合い)もともに、免疫調節剤、アジュバント、およびワクチン製剤のような刺激への曝露により著しく調節される。したがって、これらの細胞は、免疫応答刺激剤の存在下でまたは免疫応答刺激剤への曝露時に逆遊出することができる。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、記載されるTCは組織培養ウェル中で調製される。別の態様において、組織構築体は組織培養ウェルの底面に位置する。
記載される方法またはTCのいずれかのいくつかの態様において、6ウェル、12ウェル、24ウェル、48ウェル、または96ウェル組織培養プレートを構成する複数の組織培養ウェルにおいて複数のTCが作出される。
記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、TCの細胞外マトリックスのクッションは前もって調製され、後続の、内皮細胞の単層の培養ならびにヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球の自律的な遊出の段階の前に貯蔵される。1つの態様において、記載される細胞外マトリックスクッションは、さらなる使用の前に一定期間、約4℃で貯蔵することができる。1つの態様において、貯蔵時間は最大で約1週間まででありうる。いくつかの態様において、記載されるTCは、調製後の約1週間以内に用いられる。
記載される内皮TCを、成人または新生児の免疫系の刺激におけるワクチン有効性のインビトロ試験のために用いる方法も提供される。この方法は、記載される内皮組織構築体を、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製するために用いる段階を含む。1つの態様において、このようにして産生されたヒト樹状細胞の集団は、特定の抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤に曝露される樹状細胞を含む。1つの態様において、このようにして産生されたヒト樹状細胞の集団は、特定の抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤に曝される樹状細胞を含む。1つの態様において、このようにして産生されたヒト樹状細胞の集団は、特定の抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤に応答して成熟する樹状細胞を含む。あるいは、樹状細胞は、特定の抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤の群またはコレクションに、曝露され、曝されかつ/または応答して成熟する。他の態様において、試験された特定の抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤と併せて、アジュバントが試験されている。
本明細書において用いられる場合、「抗原」という用語は、体内における免疫応答（例えば、限定されるわけではないが、抗体の産生）を誘導する任意の物質である。別の態様において、「抗原」は、体内で免疫応答を誘導するのではないかと疑われる任意の物質である。1つの態様において、抗原は外来物質、すなわち、対象の体内において天然には見出されない物質でありうる。例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、および身体にとって外来かつ有害と思われる物質。別の態様において、抗原は非外来物質、すなわち、対象の体内において天然に見出される物質でありうる。毒素、化学物質、薬物、および外来粒子(表在性異物など)のような非生物物質も抗原でありうる。免疫系は、これらの抗原を含有する物質を認識および破壊する。
体内で誘導される免疫応答には、(1) ある種の免疫細胞による抗原提示、(2) 抗原を特異的に認識および結合する抗体の産生、(3) 抗体産生細胞の産生および増殖、ならびに(4) 免疫記憶をもたらす抗体産生記憶細胞の産生を含む、適応性免疫応答が含まれる。あるいは、体内で誘導される免疫応答には、感染部位への免疫細胞の動員、補体カスケードの活性化、ならびに特殊化した白血球による、器官、組織、血液およびリンパ液に存在する外来物質の特定および除去を含む、先天性免疫応答が含まれる。
本明細書において用いられる場合、「ワクチン」という用語は、対象の細胞媒介性および抗体媒介性の長期保護をもたらし、それによって1つまたはいくつかの疾患に対する免疫を与える記憶T細胞および/またはB細胞のような記憶応答の生成を刺激するために用いられる物質である。いくつかの態様において、ワクチンは、疾患を誘導せずに抗原として作用するように処理された、疾患の原因物質、その生成物、または合成代替物から調製される。例えば、ワクチンは、対象における抗体の産生を刺激するために注射される弱毒化されたまたは死んだ病原性微生物またはがん細胞の懸濁液からなることができる。
本明細書において用いられる場合、「免疫応答刺激剤」という用語は、対象における免疫応答を誘導する任意の作用物質をいう。1つの態様において、この作用物質は非特異的な先天性免疫応答を誘導する。別の態様において、この作用物質は、以下の現象のうちいずれか1つまたは複数をもたらす特異的な適応性免疫応答を誘導する: 樹状細胞のような免疫細胞による抗原の貪食、樹状細胞としての免疫細胞による抗原提示、抗原を特異的に認識および結合する抗体の産生、抗体産生細胞の産生および増殖、ならびに免疫記憶をもたらす抗体産生記憶細胞の産生。
本明細書において用いられる「免疫調節剤」は、免疫系の定性的または定量的変化、改変または修飾を引き起こすまたは促進する、例えば、免疫応答を誘発する作用物質である。いくつかの態様において、免疫応答は、サイトカイン、ケモカイン、抗体の産生を包含し、細胞増殖を増大させうる。
「作用物質」という用語は、細胞、組織または対象に投与されるレベルで通常は存在しないかまたは存在しない任意の実体をいう。作用物質は、化学物質; 小分子; 核酸配列; 核酸類似体; タンパク質; ペプチド; アプタマー; ナノ粒子; 抗体; またはその機能的断片を含む群より選択することができる。いくつかの態様において、作用物質は、合成によるおよび天然に存在する非タンパク質性の実体を非限定的に含む、任意の化学的な、実体または成分である。ある種の態様において、作用物質は、化学的部分を有する小分子である。
1つの態様において、抗原、ワクチンまたは免疫応答刺激剤により「成人免疫系を刺激する」または「新生児の免疫系を刺激する」とは、成人、青年、小児または新生児である対象における免疫応答の誘導を意味する。別の態様において、「成人免疫系を刺激する」または「新生児の免疫系を刺激する」は、対象における免疫応答の誘導を促進または支持することを意味しうる。
1つの態様において、免疫応答の誘導は対象においてではなく、むしろ誘導はエクスビボである。例えば、免疫応答は対象由来の細胞において誘導され、免疫応答はエクスビボで、例えば、組織培養状況で誘導される。1つの態様において、対象に由来しかつ抗原またはワクチンに応答する細胞は、対象の免疫系の一部の細胞である。1つの態様において、当該細胞は、対象の免疫系の一部である未成熟細胞または成熟細胞でありうる。対象の免疫系の一部である非限定的な細胞には、例えば、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球、ならびにTヘルパー細胞が含まれる。誘導される免疫応答は、非特異的な先天性免疫応答または特異的な適応性免疫応答でありうる。いくつかの態様において、刺激される免疫応答は、以下の現象のうちいずれか1つまたは複数を包含する: 樹状細胞のような免疫細胞による抗原の貪食、樹状細胞としての免疫細胞による抗原提示、抗原を特異的に認識および結合する抗体の産生、抗体産生細胞の産生および増殖、ならびに免疫記憶をもたらす記憶Tリンパ球および/または抗体産生記憶B細胞の産生。
したがって、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、本明細書に記載されるTCにヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を導入する段階、ECの単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともにTCをインキュベートする段階、および抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の存在下で成熟した樹状細胞へと発達した逆遊出したMCを回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
したがって、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、まず、細胞外マトリックスのクッション中の遊出したヒトMCを含むTCを調製または提供する段階、次いで、該TCにヒト血漿の存在下で抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を導入する段階、ECの単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに該TCをインキュベートする段階、および抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達した逆遊出したMCを回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。TCは、ヒト血漿の存在下で単層を得るのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上でヒトECを培養する段階、ヒトECの単層にヒトMCを導入する段階、ヒトMCがECの単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間、ヒトMCを培養する段階、ならびに直前の段階における期間の後に遊出しなかったMCを除去する段階を含む方法によって調製される。
1つの態様において、インビトロでヒト樹状細胞の集団を調製する方法であって、ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションを提供する段階、コラーゲンが成熟することを可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階、細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階、ヒト血漿の存在下でコンフルエントな単層へとヒトECを培養する段階、熱で不活化されていないヒト血清アルブミンの存在下でヒトECのコンフルエントな単層にヒトMCを導入する段階、該MCがヒトECのコンフルエントな単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階、および遊出しなかったヒトMCを除去することによって予め調製されたTCに、ヒト血漿の存在下で抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を導入する段階; 遊出したヒトMCがヒトECのコンフルエントな単層に逆遊出するのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに該TCをインキュベートする段階; ならびに抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の存在下で成熟した樹状細胞へと発達した逆遊出したMCを回収する段階を含む前記方法が、本明細書において提供される。
理論によって束縛されることを望むわけではないが、ヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球は、免疫系の前駆細胞である。これらの前駆細胞は、まず、内皮細胞の存在下で遊走樹状細胞へと転換する。遊走樹状細胞は、高い細胞内活性および低いT細胞活性化能によって特徴付けられる。遊走樹状細胞は、ウイルスおよび細菌のような病原体の周囲環境を絶えずサンプリングする。これはToll様受容体(TLR)のようなパターン認識受容体(PRR)を通じて行われる。TLRは、一部の病原体に見出される特定の化学的痕跡を認識する。遊走樹状細胞はまた、ニブリングと呼ばれるプロセスで、生きている自身の細胞から少量の膜も貪食しうる。ひとたびそれらが提示可能な抗原と接触すると、それらは成熟樹状細胞へと活性化するようになり、リンパ節へ移動し始める。遊走樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小片に分解し、成熟後にMHC分子を用いてその細胞表面にそれらの断片を提示し、抗原提示樹状細胞になる。同時に、それらは、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、およびCD40のようなT細胞活性化における共受容体として働く細胞表面受容体を上方調節し、T細胞を活性化するその能力を大いに増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓にまたはリンパ系を通ってリンパ節に移動することを誘導する走化性受容体であるCCR7も上方調節する。ここでは遊走樹状細胞は抗原提示細胞として働く: それらは、非抗原特異的共刺激シグナルと並行して、病原体に由来する抗原をヘルパーT細胞およびキラーT細胞ならびにB細胞に提示することによってそれらを活性化する。
記載される方法のいずれかのいくつかの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト血漿は、新生児、成人、青年または小児から得られたヒト血漿である。他の態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト血漿は、新生児、成人、青年または小児に由来するヒト乏血小板血漿である。したがって、1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト血漿は、ヒト新生児の乏血小板血漿である。別の態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト血漿は、ヒト成人の乏血小板血漿である。他の態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト血漿は、ヒト青年または小児の乏血小板血漿である。
乏血小板血漿(PPP)は、非常に少数の血小板(10×103/μL未満)を有する血漿である。種々の方法を用いて、PPPを調製することができる。例えば、PPPは、赤血球とともに血小板をペレットとするように高速回転を用いて赤血球から血漿を分離することによって作出される。血小板は外来抗原のさらなる供給源を提供するので、血小板の分離が望ましい。装置、例えばGravitation Platelet System GPS (登録商標) III Systemを用いて、分離を達成することができる。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、熱で不活化されていない。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、少なくとも50%であり、すなわち、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を含む細胞培地は少なくとも50%のヒトPPPを含む。1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、約50%である。1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、約100%である。他の態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、50%〜100%の間の可能な全ての割合を含めて、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約87%、約90%、約92%、約95%、約97%である。1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、約50%〜100%で用いられる。他の態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、約50%〜90%、約50%〜80%、約50%〜70%、約50%〜60%、約55%〜95%、約55%〜85%、約55%〜75%、約55%〜65%、約55%〜60%、約60%〜100%、約60%〜99%、約60%〜95%、約60%〜90%、約60%〜80%、約60%〜70%、約70%〜80%、約70%〜85%、約70%〜90%、約70%〜95%、約70%〜99%、約70%〜100%、約80%〜90%、約80%〜92%、約80%〜95%、約80%〜97%、約80%〜99%、約80%〜100%、約85%〜90%、約85%〜92%、約85%〜95%、約85%〜97%、約85%〜99%、約85%〜100%、約90%〜92%、約90%〜95%、約90%〜97%、約90%〜99%、約90%〜100%、約92%〜95%、約92%〜95%、約92%〜97%、約92%〜99%、約92%〜100%、約95%〜97%、約95%〜100%、約97%〜100%および約50%〜100%の間の可能な全ての範囲のヒトPPPである。1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるPPPは、100%で用いられる。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、血液中の二価イオンがキレートされないように、キレート剤を含有しないヘパリンを用いて調製される。通常キレート化される二価イオンの例は、マグネシウムおよびカルシウムである。1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、マグネシウムおよびカルシウムイオンのような内在性二価イオンが実質的に枯渇していない。1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒトPPPは、内在性二価イオンのマグネシウムおよび/またはカルシウムイオンが実質的に枯渇していない。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンは熱で不活化されている。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの別の態様において、ヒト血漿、ヒトPPPまたはヒト血清アルブミンは熱で不活化されていない。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒトPPPまたはヒト血清アルブミンはキレート剤を含有しない。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児血漿、ヒト新生児PPPまたはヒト新生児血清アルブミンはキレート剤を含有しない。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンはヘパリンを用いて調製される。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児血漿、ヒト新生児PPPまたはヒト新生児血清アルブミンはヘパリンを用いて調製される。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト血漿、ヒトPPPまたはヒト血清アルブミンはキレート剤の非存在下で調製される。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、ヒト新生児血漿、ヒト新生児PPPまたはヒト血清アルブミンはキレート剤の非存在下で調製される。
本明細書に記載される方法またはTCのいずれかの1つの態様において、キレート剤は、マグネシウムおよび/またはカルシウムイオンのような、血漿または血清由来の二価イオンをキレートする。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションおよびECの単層からの遊走樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、少なくとも約24時間である。他の態様において、遊走樹状細胞の逆遊出に十分な期間は、少なくとも、約24時間〜約48時間の間の可能なほぼ全ての整数時間を含めて、少なくとも約26時間、少なくとも約28時間、少なくとも約30時間、少なくとも約32時間、少なくとも約34時間、少なくとも約36時間、少なくとも約38時間、少なくとも約40時間、少なくとも約42時間、少なくとも約44時間、少なくとも約46時間、少なくとも約48時間である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションおよびECの単層からの遊走樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、約24〜約48時間である。他の態様において、遊走樹状細胞の逆遊出に十分な期間は、約48時間である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、細胞外マトリックスのクッションおよびECの単層からの遊走樹状細胞の逆遊出を可能にするのに十分な期間は、約24時間である。他の態様において、遊走樹状細胞の逆遊出に十分な期間は、約28時間、約30時間、約32時間、約34時間、約36時間、約38時間、約48時間、約42時間、約44時間、約46時間、約48時間、および約24時間〜約48時間の間の可能なほぼ全ての整数時間である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、TC中のヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCおよびアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤とともに用いられるヒト新生児PPPは、自家性であり、それらが1人のドナーに由来することを意味する。本発明者らは、新生児および成人Mo-DCの自律的な発達における自家血漿について示し、自家材料の使用がインビボでの免疫応答を正確に再現しうることを示す。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、本明細書に記載される組織構築体中の遊走樹状細胞の、抗原提示樹状細胞への発達および転換を誘導または刺激しうる任意の作用物質である。別の態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、抗原提示樹状細胞へと発達および転換するように本明細書に記載されるTC中の遊走樹状細胞を活性化する任意の作用物質である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、本明細書に記載される組織構築体中の遊走樹状細胞の、抗原提示樹状細胞への発達を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である。別の態様において、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、本明細書に記載されるTC中の遊走樹状細胞を抗原提示樹状細胞へと活性化するその能力について試験される任意の作用物質である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、ワクチンである。例えば、公知のワクチン、しかし成人でのみ有効であることが公知のワクチン。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、アジュバントである。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤は、病原体である。1つの態様において、病原体はその断片もしくは不完全な部分またはインタクトな病原体全体である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、逆遊出した遊走樹状細胞は、TC中に導入されたアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の存在下でヒト抗原提示樹状細胞に活性化および転換されている。これらのヒト抗原提示樹状細胞を回収し、ナイーブT細胞との共培養において用いることができる。記載される方法のいずれかの1つの態様において、これらのヒト抗原提示樹状細胞は抗原特異的なヒト樹状細胞であり、すなわち、これらの細胞は特定のアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤で誘導され、それら自体が、同じ特定のアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤に応答するように他のナイーブT細胞を誘導、刺激、活性化および/または転換するであろう。理論によって束縛されることを望むわけではないが、1つの態様において、ヒト抗原提示樹状細胞は、その細胞表面に特定のアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の断片を呈する。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、組織構築体から回収された逆遊出したヒト抗原提示樹状細胞がナイーブT細胞と共培養される場合、ナイーブT細胞および逆遊出した成熟したヒト樹状細胞は自家性である(すなわち、同じ個人のドナー由来ではない)。理論によって束縛されることを望むわけではないが、成熟したヒト樹状細胞は、ナイーブT細胞に「シグナルを伝達」して、得られる成熟したT細胞が、TC中の成熟した樹状細胞への遊走樹状細胞の転換を誘導した最初の抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤に対する免疫応答を誘発しうるように成熟させる。1つの態様において、成熟したヒト樹状細胞は、ナイーブT細胞を成熟T細胞に活性化させる。1つの態様において、成熟したヒト樹状細胞は、その細胞表面上の特定の抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の断片によってナイーブT細胞を成熟T細胞に活性化させる。成熟したT細胞は、細胞増殖能が増強されており、かつ、いくつかのサイトカインを産生する。1つの態様において、活性化された成熟T細胞は、最初の抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を認識し、細胞増殖および/またはサイトカインの産生によってその存在に応答する。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、成熟した自家ヒト樹状細胞とナイーブ自家T細胞との間の「シグナル伝達」によって、ワクチン接種による免疫手順の間のインビボでの細胞間相互作用が得られる。
したがって、インビトロでのワクチンの有効性評価のためにTCまたは逆遊出した成熟樹状細胞を用いる方法が本明細書において提供される。
1つの態様において、ワクチンに対する免疫応答を誘発する際のワクチンの有効性をインビトロで評価するための方法であって、ヒト血漿の存在下、ワクチンの存在下で抗原提示樹状細胞へと発達および転換されたヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とをヒト血漿の存在下で共培養する段階; CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 培養物における得られた活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるCD4+ CD45RA+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞の第2集団および活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、当該ワクチンがヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞はその後、CD45RO+ T細胞へ分化する。1つの態様において、ヒト血漿はヒトPPPである。
1つの態様において、ワクチンに対する免疫応答を誘発する際のワクチンの有効性をインビトロで評価するための方法であって、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤およびヒト血漿の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達および転換されたヒト樹状細胞の第1および第2集団を提供する段階; ヒト乏血小板血漿の存在下でヒト樹状細胞の第1集団とヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを共培養する段階; CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の共培養物をヒト血漿の存在下でインキュベートする段階; 培養物における得られた活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物におけるCD4+ CD45RA+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト樹状細胞の第2集団および活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、当該ワクチンがヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞はその後、CD45RO+ T細胞へ分化する。1つの態様において、ヒト血漿はヒトPPPである。
1つの態様において、ワクチンに対する免疫応答を誘発する際のワクチンの有効性をインビトロで評価するための方法であって、ヒトコラーゲンを含む細胞外マトリックスのクッションを提供する段階、コラーゲンが成熟することを可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階、細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階、ヒト血漿の存在下でコンフルエントな単層へヒトECを培養する段階、熱で不活化されていないヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞のコンフルエントな単層にヒトMCまたはCD33+かつ/もしくはCD14+単球を導入する段階、MCまたは単球がヒト内皮細胞のコンフルエントな単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階、ならびに遊出しなかったヒトMCまたは単球を除去することによって予め調製された組織構築体に、ヒト血漿の存在下でワクチンを導入する段階; 遊出ヒトMCまたは単球がヒトECのコンフルエントな単層に逆遊出するのに十分な期間、組織構築体をインキュベートする段階; ワクチンの存在下で抗原提示樹状細胞へと発達した逆遊出したMCを回収する段階; ヒト血漿の存在下でヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とヒト樹状細胞とを共培養する段階; CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階; 活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を、ヒト血漿の存在下でヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階; 培養物における活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞のさらなる活性化および増殖を引き起こすのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で樹状細胞および活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞を共培養する段階; ならびにサイトカインの産生について分析する段階を含み、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在によって、当該ワクチンがヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される、前記方法が本明細書において提供される。1つの態様において、活性化ヒトCD4+ CD45RA+ T細胞はその後、CD45RO+ T細胞へ分化する。1つの態様において、ヒト血漿はヒトPPPである。
本明細書に記載されるインビトロでの有効性試験方法の他の態様において、その他の免疫細胞をCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の代わりに用いることができる。非限定的な例は、B細胞、CD8+ T細胞(ナイーブCD45RA+および記憶/活性化CD45RO+)およびCD4+ T細胞(ナイーブCD45RA+および記憶/活性化CD45RO+)、ナチュラルキラー(NK) T細胞、ならびに調節性T細胞である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験において用いられるヒト樹状細胞の集団は、本明細書に記載される組織構築体を作出する方法およびTCを用いて産生される。記載される方法のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の集団は、本明細書に記載される組織構築体を作出する方法およびTCを用いてヒト血漿の存在下、アジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤の存在下で産生される。1つの態様において、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験において用いられるヒト樹状細胞の集団は、抗原提示樹状細胞である。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験において用いられるヒト樹状細胞の集団は、予め凍結保存されたものである。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、インビトロでのワクチン有効性試験において用いられるヒト樹状細胞の第1の、第2の、または追加の集団は、同じアジュバント/抗原/ワクチン/免疫応答刺激剤を用いて産生される。
記載される方法のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の集団、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPは自家性であり、それらが1人のドナーより; 言い換えれば、同じ個人のドナーに由来するかまたはそれから得られることを意味する。
記載される方法のいずれかの他の態様において、ヒト乏血小板血漿は、ヒト樹状細胞の集団およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞と一体的に自家性ではない。1つの態様において、ヒト樹状細胞、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒト乏血小板血漿は、同年齢のドナー由来である。例えば、ヒト乏血小板血漿は、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験において用いられる成熟したヒト樹状細胞の集団およびヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞に対して同種または異種である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞はCD45RO陰性である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の集団、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPは、新生児、または成人、または青年、または小児から得られるかまたはそれに由来する。言い換えれば、ヒト樹状細胞の集団、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPは、新生児、成人、青年、小児である1人の個人から得られるかまたはそれに由来する。1つの態様において、ヒト樹状細胞、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPが成人または青年から得られるかまたはそれに由来する場合、細胞および血漿は同年齢のドナー由来である。言い換えれば、細胞および血漿は、21〜30歳の年齢層の成人だけ、または31〜40歳の年齢層の成人だけ、または41〜50歳の年齢層の成人だけ、または51〜60歳の年齢層の成人だけ、または61〜70歳の年齢層の成人だけ、または70歳を上回る年齢層の成人だけの成人由来である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、自家ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、ヒト樹状細胞およびヒトPPPは、新生児から得られるかまたはそれに由来し、それらが1人のヒト新生児ドナーに由来することを意味する。したがって、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞が用いられる。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの別の態様において、ヒト新生児MCまたはヒト新生児CD33+かつ/もしくはCD14+選択単球に由来するヒト樹状細胞が用いられる。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの別の態様において、ヒト新生児PPPが用いられる。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、細胞および血漿は、新生児の臍帯から得られるかまたはそれに由来する。1つの態様において、新生児の臍帯は予め凍結保存されたものである。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト乏血小板血漿は、熱で不活化されていない。「熱で不活化されていない」とは、少なくとも約30分間56℃でインキュベートしてないことを意味する。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、培養下のCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化または培養下のCD4+ CD45RA+活性化T細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間は、少なくとも1日間である。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの他の態様において、当該期間は少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの他の態様において、培養下のCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化または培養下のCD4+ CD45RA+活性化T細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間は、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間、約14日間、約15日間、約16日間、約17日間、約18日間、約19日間、約20日間、または約21日間である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの他の態様において、培養下のCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化または培養下のCD4+ CD45RA+活性化T細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間は、少なくとも7日間、約7日間、または約7〜約21日間である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、評価されるワクチンは、本明細書に記載される組織構築体が用いられるヒト樹状細胞の第1および第2集団を産生するために、インビトロで用いられるワクチンである。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験において任意のアジュバント、抗原、ワクチン製剤または免疫応答刺激剤を評価できるものと考えられる。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、本方法は、培養下の活性化CD4+ CD45RA+ T細胞の増殖を分析する段階をさらに含み、ここで、ヒト樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖または細胞数の増加によって、当該アジュバント、抗原、ワクチン製剤または免疫応答刺激剤がヒト免疫応答を刺激するのに有効であることが示される。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、本方法はサイトカイン分析および細胞増殖の前に、培養物における活性化CD4+ CD45RA+ T細胞を、ヒト血漿の存在下、ヒト樹状細胞の第1および第2集団と同じアジュバント、抗原、ワクチン製剤または免疫応答刺激剤に曝露されたヒト樹状細胞の第3集団に曝す段階をさらに含む。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団は、評価されている同じアジュバント、抗原、ワクチン製剤または免疫応答刺激剤を用いて産生される。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団は自家性であり、それらが1人のドナーに由来するかまたはそれから得られることを意味する。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NK T細胞、調節性T細胞、ならびにヒト乏血小板血漿は自家性であり、それらが1人のドナーに由来するかまたはそれから得られることを意味する。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞ならびにヒトPPPは、新生児、成人、青年、または小児から得られるかまたはそれに由来する。1つの態様において、ヒト樹状細胞、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPが成人または青年から得られるかまたはそれに由来する場合、細胞および血漿は同年齢のドナー由来である。例えば、ヒト樹状細胞、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞およびヒトPPPは、21〜30歳の年齢層の成人だけ、または31〜40歳の年齢層の成人だけ、または41〜50歳の年齢層の成人だけ、または51〜60歳の年齢層の成人だけ、または61〜70歳の年齢層の成人だけ、または70歳を上回る年齢層の成人だけの成人から得られるかまたはそれに由来する。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、自家ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団ならびにヒトPPPは、新生児から得られるかまたはそれに由来し、それらが1人のヒト新生児ドナーに由来することを意味する。したがって、記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞が用いられる。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの別の態様において、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団は、ヒト新生児MCまたはヒト新生児CD33+かつ/もしくはCD14+選択単球に由来する。記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの別の態様において、ヒト新生児PPPが用いられる。1つの態様において、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、ヒト樹状細胞の第1、第2および第3集団ならびにヒトPPPは自家性である。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、自家ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、ヒト新生児樹状細胞の第1、第2および第3集団ならびにヒト新生児PPPは、新生児の臍帯から得られるかまたはそれに由来する。1つの態様において、新生児の臍帯は予め凍結保存されたものである。
記載されるインビトロでのワクチン有効性試験のいずれかの1つの態様において、分析されるサイトカインは、IL-1、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γおよびTNF-αからなる非限定的な群より選択される。
活性化T細胞によって産生されるサイトカインを測定するさまざまな方法、例えば、酵素免疫測定法(ELISA)が当技術分野において公知である。1つの態様において、活性化T細胞によって産生されるサイトカインは、共培養において用いられる細胞培地へ分泌される。活性化T細胞によって産生されるサイトカインの量が、成熟したヒト樹状細胞の添加がない場合と比べて増加している場合、当該ワクチンがヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。いくつかの態様において、産生されるサイトカインの増加は、成熟したヒト樹状細胞の添加がない場合にT細胞によって産生されるサイトカインの量と比べて少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%だけ、少なくとも25%だけ、少なくとも30%だけ、少なくとも35%だけ、少なくとも40%だけ、少なくとも45%だけ、少なくとも50%だけ、少なくとも55%だけ、少なくとも60%だけ、少なくとも65%だけ、少なくとも70%だけ、少なくとも75%だけ、またはそれ以上である。
例えば、細胞数計によりおよびH3-チミジン取り込みにより、細胞増殖を測定するさまざまな方法が当技術分野において公知である。成熟したヒト樹状細胞の添加がない場合のT細胞の細胞増殖と比べての成熟したヒト樹状細胞と共培養されたT細胞の細胞増殖の増加によって、当該ワクチンがヒト免疫応答の刺激における有効なワクチンであることが示される。いくつかの態様において、細胞増殖の増加は、成熟したヒト樹状細胞と共培養されていないT細胞の細胞増殖の量と比べて少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%だけ、少なくとも25%だけ、少なくとも30%だけ、少なくとも35%だけ、少なくとも40%だけ、少なくとも45%だけ、少なくとも50%だけ、少なくとも55%だけ、少なくとも60%だけ、少なくとも65%だけ、少なくとも70%だけ、少なくとも75%だけ、またはそれ以上である。
1つの態様において、本明細書に記載されるTCを作出するためのキットが本明細書において提供される。このキットは、TCを調製するのに必要な成分を含み、この成分は、少なくとも、TCを保持または含有するための容器、例えば、組織培養容器、少なくとも1つの細胞外マトリックス、ヒトEC、およびグルコース-6-リン酸を含むが、これらに限定されることはない。したがって、少なくとも、TCを保持または含有するための容器; 少なくとも1つの細胞外マトリックス; およびグルコース-6-リン酸を含むキットが本明細書において提供される。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、少なくとも1つの細胞外マトリックスはコラーゲンを含む。1つの態様において、コラーゲンはヒトコラーゲンである。1つの態様において、ヒトコラーゲンはI型コラーゲンである。別の態様において、ヒトコラーゲンはグリコシル化または糖化されている。
記載される任意の方法またはTCまたはキットの1つの態様において、ヒトコラーゲンはヒト線維芽細胞に由来する。
本明細書に記載されるキットの別の態様において、少なくとも1つの細胞外マトリックスはフィブロネクチンを含む。1つの態様において、フィブロネクチンはヒトフィブロネクチンである。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、キットはヒトECをさらに含む。1つの態様において、ヒト内皮細胞はヒト初代ECである。1つの態様において、キットのヒトECは単一のドナー由来である。
本明細書に記載されるキットの別の態様において、キットは、ヒト初代ECを収集および/または調製するための使用説明書および成分、例えば組織培養皿、細胞培地、および組織を消化するための酵素、例えば、コラゲナーゼをさらに含む。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、キットはヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球をさらに含む。1つの態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、単一のドナー由来である。本明細書に記載されるキットの別の態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、新生児または成人から得られるかまたはそれに由来する。本明細書に記載されるキットの別の態様において、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球は、青年または小児から得られるかまたはそれに由来する。
本明細書に記載されるキットの別の態様において、キットはヒト骨髄、循環末梢血または臍帯血サンプルに対して、ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+選択単球を収集および/または調製するための使用説明書および成分をさらに含む。本明細書に記載されるキットの別の態様において、キットは、ヒト骨髄、循環末梢血または臍帯血サンプルを回収するための使用説明書および成分をさらに含む。1つの態様において、キットは、ヒト骨髄、循環末梢血または臍帯血サンプルから細胞を単離するための成分、および血漿を単離するための成分をさらに含む。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、キットは、新生児または成人に由来してもよいヒト血漿をさらに含む。他の態様において、ヒト血漿は青年または小児由来である。他の態様において、ヒト血漿は単一のドナー由来である。別の態様において、ヒト血漿は2人以上のドナーからプールされる。1つの態様において、ヒト血漿は2人以上の新生児からプールされた血漿である。1つの態様において、ヒト血漿は予め凍結保存されたものである。1つの態様において、ヒト血漿は熱で不活化されていない。別の態様において、ヒト血漿は熱で不活化されている。さらなる態様において、ヒト血漿はインタクトであり、すなわち、血漿および二価陽イオンが実質的に枯渇していない。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、キットは、ヒト血清アルブミンをさらに含む。他の態様において、ヒト血清アルブミンは新生児または成人由来である。他の態様において、ヒト血清アルブミンは青年または小児由来である。別の態様において、ヒト血清アルブミンは2人以上のドナーからプールされる。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは2人以上の新生児からプールされた血漿である。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは予め凍結保存されたものである。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは熱で不活化されていない。1つの態様において、ヒト血清アルブミンは発熱物質を含まない。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、キットは、ヒトPPPをさらに含む。他の態様において、ヒトPPPは新生児または成人由来である。他の態様において、ヒトPPPは青年または小児由来である。他の態様において、ヒトPPPは単一のドナー由来である。別の態様において、ヒトPPPは2人以上のドナーからプールされる。1つの態様において、ヒトPPPは2人以上の新生児からプールされた血漿である。1つの態様において、ヒトPPPは予め凍結保存されたものである。1つの態様において、ヒトPPPは熱で不活化されていない。別の態様において、ヒトPPPは熱で不活化されている。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、ヒト内皮細胞、ヒトMCならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球は、1つの代表的なクラスのドナー由来であり、各キットのヒトEC、ヒトMCならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が成人だけに由来し、青年だけに由来し、新生児だけ、または小児だけに由来することを意味する。1つの態様において、ドナーの成人または小児は同年齢である。あるいは、キットは、ヒトEC、ヒトMCならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が2人以上の代表的なクラスのドナー由来であり、例えば、ヒトEC、ヒトMCならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が51〜60歳の年齢層の成人由来であり、かつ同様にヒトEC、ヒトMCならびにヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球が新生児由来であることを提供する。この選択肢から、キットの使用者は、成人免疫系でのワクチンの有効性を試験するための成人の組織構築体を作出することが可能になり、同様に、新生児の免疫系でのワクチンの有効性を試験するための新生児の組織構築体を作出することが可能になる。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、ヒト血清アルブミン、ヒトPPPまたはヒト血漿は、カルシウムまたはマグネシウムのような二価イオンが実質的に枯渇していない。1つの態様において、ヒト血清アルブミン、ヒトPPPまたはヒト血漿は、キレート剤の存在下では調製されない。1つの態様において、ヒト血清アルブミン、ヒトPPPまたはヒト血漿は、ヘパリンの存在下で調製される。
本明細書に記載されるキットの1つの態様において、ヒトMC、ヒトCD33+かつ/またはCD14+選択単球ならびにヒト乏血小板血漿は、自家性でありかつ1人のドナー由来である。
本発明は、以下の番号付きパラグラフのうちのいずれかにおいて定義することができる。
[1](a) 内皮細胞を、単層を得るのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上で培養する段階;
(b) 内皮細胞の単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
(c) ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間、培養する段階;
(d) 段階cにおける期間の後に、遊出しなかったMCを除去する段階;
(e) 段階dの培養物および細胞外マトリックスのクッションに、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階;
(f) ヒトMCが内皮細胞の単層から逆遊出することを可能にするのに十分な期間、該培養物をインキュベートする段階; ならびに
(g) 該作用物質の存在下で遊走樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階
を含む、方法。
[2]細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
[3]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[4]コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[5]コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[6]コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7]ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項3に記載の方法。
[8]コラーゲンが糖化されている、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
[9]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項3、6、7または8のいずれか一項に記載の方法。
[10]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項9に記載の方法。
[11]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で最大5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項1、2または3に記載の方法。
[12]細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
[13]フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項12に記載の方法。
[14]内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
[15]ヒト初代内皮細胞がヒト新生児血漿の存在下で培養される、請求項14に記載の方法。
[16]ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項14または15に記載の方法。
[17]ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項14、15または16に記載の方法。
[18]ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
[19]コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項18に記載の方法。
[20]コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項18または19に記載の方法。
[21]単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
[22]単層を得るための期間が約24時間〜3日間である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
[23]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
[24]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
[25]ヒト血漿が、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項15〜24のいずれか一項に記載の方法。
[26]ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
[27]ヒト血漿が、ヒト臍帯血、胎盤血または循環末梢血から得られる、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法。
[28]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項15〜27のいずれか一項に記載の方法。
[29]ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
[30]ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
[31]ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
[32]ヒト血漿がヒト新生児血漿である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
[33]ヒトMCが、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
[34]ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
[35]ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
[36]ヒトMC細胞が、予め凍結保存された細胞である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
[37]ヒトMCが、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
[38]ヒトMCがヒト新生児MCである、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
[39]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
[40]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項39に記載の方法。
[41]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、2人以上のドナーからプールされていない、請求項39に記載の方法。
[42]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
[43]ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球が、ヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
[44]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
[45]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項44に記載の方法。
[46]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項45に記載の方法。
[47]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項45〜46のいずれか一項に記載の方法。
[48]ヒトMCが、外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
[49]ヒトMCが、GM-CSFの存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
[50]ヒトMCが、IL-4の存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
[51]ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
[52]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜51のいずれか一項に記載の方法。
[53]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項39〜52のいずれか一項に記載の方法。
[54]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
[55]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
[56]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
[57]前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
[58]前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
[59]前記作用物質がワクチン製剤である、請求項57に記載の方法。
[60]前記作用物質がアジュバントである、請求項57に記載の方法。
[61]前記作用物質が病原体である、請求項57、58または59に記載の方法。
[62]前記病原体が、その断片/不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項61に記載の方法。
[63]ヒト新生児乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
[64]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
[65]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
[66]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約100%で用いられる、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
[67]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
[68]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。
[69]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約48時間である、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
[70]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
[71]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。
[72]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。
[73]以下の段階を含む、ヒト新生児樹状細胞の集団をインビトロで調製する方法：
(a) 組織構築体にヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階であって、組織構築体が以下の段階によってあらかじめ調製されている、段階：
細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階;
細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階;
ヒト血漿の存在下でコンフルエントな単層へとヒト内皮細胞を培養する段階;
ヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞の単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
ヒトMCがヒト内皮細胞の単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階; および
遊出しなかったヒトMCを除去する段階;
(b) 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織培養物をインキュベートする段階; ならびに
(c) 該作用物質の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階。
[74]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項73に記載の方法。
[75]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項74に記載の方法。
[76]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項75に記載の方法。
[77]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
[78]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項73〜77のいずれか一項に記載の方法。
[79]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項73〜78のいずれか一項に記載の方法。
[80]ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
[81]ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
[82]ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
[83]ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
[84]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[85]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
[86]前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項73〜85のいずれか一項に記載の方法。
[87]前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項73〜86のいずれか一項に記載の方法。
[88]前記作用物質がワクチンである、請求項86に記載の方法。
[89]前記作用物質がアジュバントである、請求項87に記載の方法。
[90]前記作用物質が病原体である、請求項86、87または88に記載の方法。
[91]前記病原体が、その断片もしくは不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項90に記載の方法。
[92]ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項73〜91のいずれか一項に記載の方法。
[93]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項73〜92のいずれか一項に記載の方法。
[94]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項73〜93のいずれか一項に記載の方法。
[95]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて100%で用いられる、請求項73〜94のいずれか一項に記載の方法。
[96]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項73〜95のいずれか一項に記載の方法。
[97]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項73〜96のいずれか一項に記載の方法。
[98]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、48時間である、請求項73〜97のいずれか一項に記載の方法。
[99]ヒト血漿、ヒト新生児乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項73〜98のいずれか一項に記載の方法。
[100]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項73〜99のいずれか一項に記載の方法。
[101]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
[102]以下の段階を含む、抗原に対するヒト抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
(a) 請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
(b) CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
(c) 段階bの培養物由来の活性化T細胞を、ヒト乏血小板血漿の存在下で、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階;
(d) 段階bの培養物における活性化T細胞をさらに活性化するのに十分な期間、段階cの樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
(e) サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。
[103]ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞がCD45RO陰性である、請求項102に記載の方法。
[104]ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、樹状細胞およびヒト新生児乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項103に記載の方法。
[105]ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項102、103または104に記載の方法。
[106]培養物におけるナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも1日間である、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
[107]培養物における新生児ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも7日間、約7日間、または約7〜15日間である、請求項102〜106のいずれか一項に記載の方法。
[108]評価される作用物質が、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1および第2集団を産生するためにインビトロで用いられる作用物質である、請求項102〜107のいずれか一項に記載の方法。
[109]細胞増殖について段階eの細胞を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖または細胞数の増加によって、前記抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
[110]段階dの培養物における細胞を、サイトカインおよび/または細胞増殖の分析の前に、段階aおよびdにおけるヒト新生児樹状細胞の第1および第2集団の場合と同じ作用物質に曝露された請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第3集団に曝す段階をさらに含む、請求項102〜109のいずれか一項に記載の方法。
[111]ヒト樹状細胞の第3集団も、評価される同じ作用物質で産生される、請求項110に記載の方法。
[112]分析されるサイトカインが、IL-1、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γおよびTNF-αからなる群より選択される、請求項102〜111のいずれか一項に記載の方法。
[113]以下の段階を含む、抗原に対するヒトナイーブ抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
(a) 以下の段階によって予め調製された組織構築体に、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階:
細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階;
細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階;
ヒト血漿の存在下で単層へとヒト初代内皮細胞を培養する段階;
ヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞の単層を有する培養ウェルにヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
ヒトMCがヒト内皮細胞の単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階; および
遊出しなかったヒトMCを除去する段階;
(b) 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織構築体をインキュベートする段階;
(c) 該作用物質の存在下で成熟樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階;
(d) 段階cの成熟樹状細胞と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
(e) CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
(f) 段階cのヒト成熟樹状細胞の第2集団を、段階eの培養物における活性化したT細胞に導入する段階;
(g) 段階eの培養物におけるすでに活性化したT細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間、段階fのヒト成熟樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
(h) サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該作用物質がヒトナイーブ新生児抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。
[114]段階hの細胞の細胞増殖を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖の増加によって、該抗原がヒト免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項113に記載の方法。
[115]サイトカインおよび細胞増殖の分析の前に、段階hの培養物における細胞に、段階a〜段階eにしたがって調製された逆遊出した樹状細胞の第3のバッチを導入する段階をさらに含む、請求項114に記載の方法。
[116]以下の段階を含む、組織構築体を調製する方法：
(a) 細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
(b) 細胞外マトリックスのクッション上でヒト内皮細胞を、該細胞が単層を形成するのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で培養する段階;
(c) ヒト内皮細胞の単層にヒトMCを添加する段階;
(d) MCがヒト内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成するのに十分な期間、MCを培養する段階。
[117]細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項116に記載の方法。
[118]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[119]コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[120]コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[121]コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項116〜120のいずれか一項に記載の方法。
[122]ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項121に記載の方法。
[123]コラーゲンが糖化されている、請求項116〜121のいずれか一項に記載の方法。
[124]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項116、120、121または122のいずれか一項に記載の方法。
[125]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項124に記載の方法。
[126]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で、最大5日間、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項124に記載の方法。
[127]細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項116〜126のいずれか一項に記載の方法。
[128]フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項127に記載の方法。
[129]内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項116〜128のいずれか一項に記載の方法。
[130]ヒト初代内皮細胞がヒト血漿の存在下で培養される、請求項129に記載の方法。
[131]ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項129または130に記載の方法。
[132]ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項129、130または131に記載の方法。
[133]ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項129〜132のいずれか一項に記載の方法。
[134]コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項133に記載の方法。
[135]コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項133または134に記載の方法。
[136]単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項116〜135のいずれか一項に記載の方法。
[137]単層を得るための期間が約24時間〜5日間である、請求項116〜136のいずれか一項に記載の方法。
[138]ヒト血漿が、新生児または成人の血漿である、請求項116〜137のいずれか一項に記載の方法。
[139]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項138に記載の方法。
[140]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項138に記載の方法。
[141]ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項138〜140のいずれか一項に記載の方法。
[142]ヒト新生児血漿がヒト臍帯血から得られる、請求項138〜141のいずれか一項に記載の方法。
[143]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項138〜142のいずれか一項に記載の方法。
[144]ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項116〜143のいずれか一項に記載の方法。
[145]ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項116〜144のいずれか一項に記載の方法。
[146]ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項116〜145のいずれか一項に記載の方法。
[147]ヒトMCが、新生児または成人の単核細胞である、請求項116〜146のいずれか一項に記載の方法。
[148]ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項116〜147のいずれか一項に記載の方法。
[149]ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項116〜148のいずれか一項に記載の方法。
[150]ヒトMCが、予め凍結保存された細胞である、請求項116〜149のいずれか一項に記載の方法。
[151]ヒト新生児MCがヒト臍帯血から得られる、請求項147〜150のいずれか一項に記載の方法。
[152]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項116〜151のいずれか一項に記載の方法。
[153]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項152に記載の方法。
[154]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項152に記載の方法。
[155]ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項152〜154のいずれか一項に記載の方法。
[156]ヒトMCがヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項116〜155のいずれか一項に記載の方法。
[157]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項156に記載の方法。
[158]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項155または156に記載の方法。
[159]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項155〜158のいずれか一項に記載の方法。
[160]ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項116〜159のいずれか一項に記載の方法。
[161]ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項116〜160のいずれか一項に記載の方法。
[162]ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項116〜161のいずれか一項に記載の方法。
[163]ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項116〜162のいずれか一項に記載の方法。
[164]MCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項116〜163のいずれか一項に記載の方法。
[165]ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項116〜164のいずれか一項に記載の方法。
[166]ヒト血漿がインタクトな血漿である、請求項116〜165のいずれか一項に記載の方法。
[167]インタクトなヒト血漿が、血小板が枯渇していない、請求項116〜166のいずれか一項に記載の方法。
[168]請求項116〜167のいずれか一項に記載の方法によって作出された組織構築体。
[169](a) 細胞外マトリックスのクッション;
(b) 該クッションの上の単層のヒト内皮細胞; および
(c) ヒト内皮細胞の単層を通って遊出し、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成したヒト単核細胞
を含む、組織構築体。
[170]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項169に記載の組織構築体。
[171]ヒトコラーゲンがI型である、請求項170に記載の組織構築体。
[172]ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項171に記載の組織構築体。
[173](a) 組織培養ウェル;
(b) コラーゲンを含む細胞外マトリックス; および
(c) グルコース-6-リン酸
を含む、キット。
[174]ヒト初代内皮細胞をさらに含む、請求項173に記載のキット。
[175]新生児または成人のものでありうるヒト血漿をさらに含む、請求項174に記載のキット。
[176]ヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項175に記載のキット。
[177]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項176に記載のキット。
[178]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項176に記載のキット。
[179]ヒト血漿が2人以上の新生児からプールされた血漿である、請求項176に記載のキット。
[180]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項176に記載のキット。
[181]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項175に記載のキット。
[182]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項175に記載のキット。
[183]細胞外マトリックスがヒトコラーゲンであることを含む、請求項173に記載のキット。
[184]ヒトコラーゲンがI型である、請求項183に記載のキット。
[185]ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項184に記載の装置。
[186]コラーゲンのグリコシル化を達成するのに十分な期間、グルコース-6-リン酸とともにコラーゲンをインキュベートする段階を含む、成熟コラーゲンを調製する方法。
[187]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項186に記載の方法。
[188]ヒトコラーゲンがI型である、請求項187に記載の方法。
[189]コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が少なくとも48時間である、請求項186に記載の方法。
[190]コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が、少なくとも48時間でありかつ最大5日間であり、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間である、請求項186に記載の方法。
[191]請求項186〜190のいずれか一項に記載の方法によって調製された、成熟コラーゲン。
[192]糖化されている、請求項191に記載の成熟コラーゲン。
[1](a) 内皮細胞を、単層を得るのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上で培養する段階;
(b) 内皮細胞の単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
(c) ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間、培養する段階;
(d) 段階cにおける期間の後に、遊出しなかったMCを除去する段階;
(e) 段階dの培養物および細胞外マトリックスのクッションに、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階;
(f) ヒトMCが内皮細胞の単層から逆遊出することを可能にするのに十分な期間、該培養物をインキュベートする段階; ならびに
(g) 該作用物質の存在下で遊走樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階
を含む、方法。
[2]細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
[3]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[4]コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[5]コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
[6]コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7]ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項3に記載の方法。
[8]コラーゲンが糖化されている、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
[9]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項3、6、7または8のいずれか一項に記載の方法。
[10]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項9に記載の方法。
[11]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で最大5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項1、2または3に記載の方法。
[12]細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
[13]フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項12に記載の方法。
[14]内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
[15]ヒト初代内皮細胞がヒト新生児血漿の存在下で培養される、請求項14に記載の方法。
[16]ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項14または15に記載の方法。
[17]ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項14、15または16に記載の方法。
[18]ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
[19]コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項18に記載の方法。
[20]コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項18または19に記載の方法。
[21]単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
[22]単層を得るための期間が約24時間〜3日間である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
[23]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
[24]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
[25]ヒト血漿が、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項15〜24のいずれか一項に記載の方法。
[26]ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
[27]ヒト血漿が、ヒト臍帯血、胎盤血または循環末梢血から得られる、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法。
[28]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項15〜27のいずれか一項に記載の方法。
[29]ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
[30]ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
[31]ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
[32]ヒト血漿がヒト新生児血漿である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
[33]ヒトMCが、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
[34]ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
[35]ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
[36]ヒトMC細胞が、予め凍結保存された細胞である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
[37]ヒトMCが、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
[38]ヒトMCがヒト新生児MCである、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
[39]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
[40]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項39に記載の方法。
[41]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、2人以上のドナーからプールされていない、請求項39に記載の方法。
[42]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
[43]ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球が、ヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
[44]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
[45]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項44に記載の方法。
[46]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項45に記載の方法。
[47]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項45〜46のいずれか一項に記載の方法。
[48]ヒトMCが、外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
[49]ヒトMCが、GM-CSFの存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
[50]ヒトMCが、IL-4の存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
[51]ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
[52]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜51のいずれか一項に記載の方法。
[53]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項39〜52のいずれか一項に記載の方法。
[54]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
[55]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
[56]ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
[57]前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
[58]前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
[59]前記作用物質がワクチン製剤である、請求項57に記載の方法。
[60]前記作用物質がアジュバントである、請求項57に記載の方法。
[61]前記作用物質が病原体である、請求項57、58または59に記載の方法。
[62]前記病原体が、その断片/不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項61に記載の方法。
[63]ヒト新生児乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
[64]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
[65]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
[66]ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約100%で用いられる、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
[67]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
[68]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。
[69]内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約48時間である、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
[70]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
[71]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。
[72]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。
[73]以下の段階を含む、ヒト新生児樹状細胞の集団をインビトロで調製する方法：
(a) 組織構築体にヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階であって、組織構築体が以下の段階によってあらかじめ調製されている、段階：
細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階;
細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階;
ヒト血漿の存在下でコンフルエントな単層へとヒト内皮細胞を培養する段階;
ヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞の単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
ヒトMCがヒト内皮細胞の単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階; および
遊出しなかったヒトMCを除去する段階;
(b) 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織培養物をインキュベートする段階; ならびに
(c) 該作用物質の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階。
[74]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項73に記載の方法。
[75]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項74に記載の方法。
[76]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項75に記載の方法。
[77]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
[78]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項73〜77のいずれか一項に記載の方法。
[79]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項73〜78のいずれか一項に記載の方法。
[80]ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
[81]ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
[82]ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
[83]ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
[84]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[85]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
[86]前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項73〜85のいずれか一項に記載の方法。
[87]前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項73〜86のいずれか一項に記載の方法。
[88]前記作用物質がワクチンである、請求項86に記載の方法。
[89]前記作用物質がアジュバントである、請求項87に記載の方法。
[90]前記作用物質が病原体である、請求項86、87または88に記載の方法。
[91]前記病原体が、その断片もしくは不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項90に記載の方法。
[92]ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項73〜91のいずれか一項に記載の方法。
[93]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項73〜92のいずれか一項に記載の方法。
[94]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項73〜93のいずれか一項に記載の方法。
[95]ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて100%で用いられる、請求項73〜94のいずれか一項に記載の方法。
[96]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項73〜95のいずれか一項に記載の方法。
[97]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項73〜96のいずれか一項に記載の方法。
[98]MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、48時間である、請求項73〜97のいずれか一項に記載の方法。
[99]ヒト血漿、ヒト新生児乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項73〜98のいずれか一項に記載の方法。
[100]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項73〜99のいずれか一項に記載の方法。
[101]ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
[102]以下の段階を含む、抗原に対するヒト抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
(a) 請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
(b) CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
(c) 段階bの培養物由来の活性化T細胞を、ヒト乏血小板血漿の存在下で、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階;
(d) 段階bの培養物における活性化T細胞をさらに活性化するのに十分な期間、段階cの樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
(e) サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。
[103]ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞がCD45RO陰性である、請求項102に記載の方法。
[104]ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、樹状細胞およびヒト新生児乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項103に記載の方法。
[105]ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項102、103または104に記載の方法。
[106]培養物におけるナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも1日間である、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
[107]培養物における新生児ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも7日間、約7日間、または約7〜15日間である、請求項102〜106のいずれか一項に記載の方法。
[108]評価される作用物質が、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1および第2集団を産生するためにインビトロで用いられる作用物質である、請求項102〜107のいずれか一項に記載の方法。
[109]細胞増殖について段階eの細胞を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖または細胞数の増加によって、前記抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
[110]段階dの培養物における細胞を、サイトカインおよび/または細胞増殖の分析の前に、段階aおよびdにおけるヒト新生児樹状細胞の第1および第2集団の場合と同じ作用物質に曝露された請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第3集団に曝す段階をさらに含む、請求項102〜109のいずれか一項に記載の方法。
[111]ヒト樹状細胞の第3集団も、評価される同じ作用物質で産生される、請求項110に記載の方法。
[112]分析されるサイトカインが、IL-1、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γおよびTNF-αからなる群より選択される、請求項102〜111のいずれか一項に記載の方法。
[113]以下の段階を含む、抗原に対するヒトナイーブ抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
(a) 以下の段階によって予め調製された組織構築体に、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階:
細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階;
細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階;
ヒト血漿の存在下で単層へとヒト初代内皮細胞を培養する段階;
ヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞の単層を有する培養ウェルにヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
ヒトMCがヒト内皮細胞の単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階; および
遊出しなかったヒトMCを除去する段階;
(b) 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織構築体をインキュベートする段階;
(c) 該作用物質の存在下で成熟樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階;
(d) 段階cの成熟樹状細胞と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
(e) CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
(f) 段階cのヒト成熟樹状細胞の第2集団を、段階eの培養物における活性化したT細胞に導入する段階;
(g) 段階eの培養物におけるすでに活性化したT細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間、段階fのヒト成熟樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
(h) サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該作用物質がヒトナイーブ新生児抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。
[114]段階hの細胞の細胞増殖を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖の増加によって、該抗原がヒト免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項113に記載の方法。
[115]サイトカインおよび細胞増殖の分析の前に、段階hの培養物における細胞に、段階a〜段階eにしたがって調製された逆遊出した樹状細胞の第3のバッチを導入する段階をさらに含む、請求項114に記載の方法。
[116]以下の段階を含む、組織構築体を調製する方法：
(a) 細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
(b) 細胞外マトリックスのクッション上でヒト内皮細胞を、該細胞が単層を形成するのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で培養する段階;
(c) ヒト内皮細胞の単層にヒトMCを添加する段階;
(d) MCがヒト内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成するのに十分な期間、MCを培養する段階。
[117]細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項116に記載の方法。
[118]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[119]コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[120]コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
[121]コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項116〜120のいずれか一項に記載の方法。
[122]ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項121に記載の方法。
[123]コラーゲンが糖化されている、請求項116〜121のいずれか一項に記載の方法。
[124]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項116、120、121または122のいずれか一項に記載の方法。
[125]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項124に記載の方法。
[126]ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で、最大5日間、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項124に記載の方法。
[127]細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項116〜126のいずれか一項に記載の方法。
[128]フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項127に記載の方法。
[129]内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項116〜128のいずれか一項に記載の方法。
[130]ヒト初代内皮細胞がヒト血漿の存在下で培養される、請求項129に記載の方法。
[131]ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項129または130に記載の方法。
[132]ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項129、130または131に記載の方法。
[133]ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項129〜132のいずれか一項に記載の方法。
[134]コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項133に記載の方法。
[135]コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項133または134に記載の方法。
[136]単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項116〜135のいずれか一項に記載の方法。
[137]単層を得るための期間が約24時間〜5日間である、請求項116〜136のいずれか一項に記載の方法。
[138]ヒト血漿が、新生児または成人の血漿である、請求項116〜137のいずれか一項に記載の方法。
[139]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項138に記載の方法。
[140]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項138に記載の方法。
[141]ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項138〜140のいずれか一項に記載の方法。
[142]ヒト新生児血漿がヒト臍帯血から得られる、請求項138〜141のいずれか一項に記載の方法。
[143]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項138〜142のいずれか一項に記載の方法。
[144]ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項116〜143のいずれか一項に記載の方法。
[145]ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項116〜144のいずれか一項に記載の方法。
[146]ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項116〜145のいずれか一項に記載の方法。
[147]ヒトMCが、新生児または成人の単核細胞である、請求項116〜146のいずれか一項に記載の方法。
[148]ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項116〜147のいずれか一項に記載の方法。
[149]ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項116〜148のいずれか一項に記載の方法。
[150]ヒトMCが、予め凍結保存された細胞である、請求項116〜149のいずれか一項に記載の方法。
[151]ヒト新生児MCがヒト臍帯血から得られる、請求項147〜150のいずれか一項に記載の方法。
[152]ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項116〜151のいずれか一項に記載の方法。
[153]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項152に記載の方法。
[154]ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項152に記載の方法。
[155]ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項152〜154のいずれか一項に記載の方法。
[156]ヒトMCがヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項116〜155のいずれか一項に記載の方法。
[157]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項156に記載の方法。
[158]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項155または156に記載の方法。
[159]ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項155〜158のいずれか一項に記載の方法。
[160]ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項116〜159のいずれか一項に記載の方法。
[161]ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項116〜160のいずれか一項に記載の方法。
[162]ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項116〜161のいずれか一項に記載の方法。
[163]ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項116〜162のいずれか一項に記載の方法。
[164]MCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項116〜163のいずれか一項に記載の方法。
[165]ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項116〜164のいずれか一項に記載の方法。
[166]ヒト血漿がインタクトな血漿である、請求項116〜165のいずれか一項に記載の方法。
[167]インタクトなヒト血漿が、血小板が枯渇していない、請求項116〜166のいずれか一項に記載の方法。
[168]請求項116〜167のいずれか一項に記載の方法によって作出された組織構築体。
[169](a) 細胞外マトリックスのクッション;
(b) 該クッションの上の単層のヒト内皮細胞; および
(c) ヒト内皮細胞の単層を通って遊出し、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成したヒト単核細胞
を含む、組織構築体。
[170]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項169に記載の組織構築体。
[171]ヒトコラーゲンがI型である、請求項170に記載の組織構築体。
[172]ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項171に記載の組織構築体。
[173](a) 組織培養ウェル;
(b) コラーゲンを含む細胞外マトリックス; および
(c) グルコース-6-リン酸
を含む、キット。
[174]ヒト初代内皮細胞をさらに含む、請求項173に記載のキット。
[175]新生児または成人のものでありうるヒト血漿をさらに含む、請求項174に記載のキット。
[176]ヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項175に記載のキット。
[177]ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項176に記載のキット。
[178]ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項176に記載のキット。
[179]ヒト血漿が2人以上の新生児からプールされた血漿である、請求項176に記載のキット。
[180]ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項176に記載のキット。
[181]ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項175に記載のキット。
[182]ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項175に記載のキット。
[183]細胞外マトリックスがヒトコラーゲンであることを含む、請求項173に記載のキット。
[184]ヒトコラーゲンがI型である、請求項183に記載のキット。
[185]ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項184に記載の装置。
[186]コラーゲンのグリコシル化を達成するのに十分な期間、グルコース-6-リン酸とともにコラーゲンをインキュベートする段階を含む、成熟コラーゲンを調製する方法。
[187]コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項186に記載の方法。
[188]ヒトコラーゲンがI型である、請求項187に記載の方法。
[189]コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が少なくとも48時間である、請求項186に記載の方法。
[190]コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が、少なくとも48時間でありかつ最大5日間であり、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間である、請求項186に記載の方法。
[191]請求項186〜190のいずれか一項に記載の方法によって調製された、成熟コラーゲン。
[192]糖化されている、請求項191に記載の成熟コラーゲン。
組織構築体および方法の態様は、限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本出願を通じて引用された全ての参考文献の内容、ならびに図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
当業者は通常の実験により本明細書に記載される本発明の特定の態様と同等な多く態様を認識し、または確認することができる。そのような同等な態様は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図される。
材料および方法
本試験において用いられる略語は、表1において見出される。
本試験において用いられる略語は、表1において見出される。
ワクチン
例示的な試験において利用されたワクチンには、13価肺炎球菌結合型ワクチン(PCV) PREVNAR13(商標) (Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PA)、B型肝炎ワクチン(HBV)であるRECOMBIVAX(登録商標) (Merck & Co., Inc.; Whitehouse Station, NJ)、ジフテリア、破傷風および無細胞百日咳(DTaP; TRIPEDIA(登録商標)、Sanofi Pasteur Inc.; Swiftwater, PA)、EASYFIVE(登録商標) (5つのワクチン: ジフテリア、破傷風、全細胞百日咳、B型肝炎(rDNA)、およびヘモフィルスb型結合型ワクチンの組み合わせ; Panacea Biotec Ltd., India)、ならびにBCG (ウシ結核菌デンマーク株1331; Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)が含まれる。ワクチンを自家血漿中での希釈により10分の1または100分の1(体積比)の用量で成人の組織培養物(ATC)および新生児の組織培養物(NTC)に投与した。公知の新生児ワクチンを表2に示す。
例示的な試験において利用されたワクチンには、13価肺炎球菌結合型ワクチン(PCV) PREVNAR13(商標) (Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PA)、B型肝炎ワクチン(HBV)であるRECOMBIVAX(登録商標) (Merck & Co., Inc.; Whitehouse Station, NJ)、ジフテリア、破傷風および無細胞百日咳(DTaP; TRIPEDIA(登録商標)、Sanofi Pasteur Inc.; Swiftwater, PA)、EASYFIVE(登録商標) (5つのワクチン: ジフテリア、破傷風、全細胞百日咳、B型肝炎(rDNA)、およびヘモフィルスb型結合型ワクチンの組み合わせ; Panacea Biotec Ltd., India)、ならびにBCG (ウシ結核菌デンマーク株1331; Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)が含まれる。ワクチンを自家血漿中での希釈により10分の1または100分の1(体積比)の用量で成人の組織培養物(ATC)および新生児の組織培養物(NTC)に投与した。公知の新生児ワクチンを表2に示す。
アジュバント
水酸化アルミニウム(Statens Serum Institut; Copenhagen, Denmark)を5 μg/mLまたは50 μg/mLの用量でATCまたはNTCに投与した。水酸化アルミニウムを乏血小板血漿(PPP)自家血漿で希釈した。本試験において利用されたToll様受容体(TLR)アゴニストには、10 μg/mLで試験されたPam3CysK4 (TLR2; InVivogen)、ならびに5および50 μMで試験されたイミダゾキノリンR848 (Resiquimod; TLR7/8)および3M-002 (TLR8/7; 3M Pharmaceuticals, St Paul, MN)を含めた。逆遊出した白血球および培養上清を収集する前にアジュバントでNTCおよびATCを48時間刺激した。
水酸化アルミニウム(Statens Serum Institut; Copenhagen, Denmark)を5 μg/mLまたは50 μg/mLの用量でATCまたはNTCに投与した。水酸化アルミニウムを乏血小板血漿(PPP)自家血漿で希釈した。本試験において利用されたToll様受容体(TLR)アゴニストには、10 μg/mLで試験されたPam3CysK4 (TLR2; InVivogen)、ならびに5および50 μMで試験されたイミダゾキノリンR848 (Resiquimod; TLR7/8)および3M-002 (TLR8/7; 3M Pharmaceuticals, St Paul, MN)を含めた。逆遊出した白血球および培養上清を収集する前にアジュバントでNTCおよびATCを48時間刺激した。
内毒素試験
内毒素の混入は、KTA2試薬(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA)を用いたカイネティック比濁(KTA) LALによって除いた。本試験において用いられた全ての試薬には、0.2 EU/mL未満が含有された。
内毒素の混入は、KTA2試薬(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA)を用いたカイネティック比濁(KTA) LALによって除いた。本試験において用いられた全ての試薬には、0.2 EU/mL未満が含有された。
血液
成人血液を、その時点でいずれの急性または慢性病原体にも感染していなかった年齢26歳〜45歳に及ぶ成人から200〜300 mLずつ一回の末梢静脈穿刺によって回収した。臍帯血を、帝王切開によって分娩された胎盤および臍帯から回収した。発熱、急性もしくは慢性感染、またはHIV感染を有することが分かっている母親についての出生は、本試験から除外された。
成人血液を、その時点でいずれの急性または慢性病原体にも感染していなかった年齢26歳〜45歳に及ぶ成人から200〜300 mLずつ一回の末梢静脈穿刺によって回収した。臍帯血を、帝王切開によって分娩された胎盤および臍帯から回収した。発熱、急性もしくは慢性感染、またはHIV感染を有することが分かっている母親についての出生は、本試験から除外された。
血漿
血漿は、白血球画分から、室温で10分間の0.5相対遠心力(RCF)での新鮮血の遠心分離によって収集した。血漿を細胞画分から分離し、その後、室温にて3.0 RCFで30分間、再び遠心分離した。この遠心分離からの清澄な血漿(乏血小板血漿; PPP)を、TCにて用いるために融解されるまで-20℃で貯蔵した。融解後の残屑を除去するために、血漿サンプルを30分間3.0 RCFで遠心分離し、上清をTCのために添加し使用した。
血漿は、白血球画分から、室温で10分間の0.5相対遠心力(RCF)での新鮮血の遠心分離によって収集した。血漿を細胞画分から分離し、その後、室温にて3.0 RCFで30分間、再び遠心分離した。この遠心分離からの清澄な血漿(乏血小板血漿; PPP)を、TCにて用いるために融解されるまで-20℃で貯蔵した。融解後の残屑を除去するために、血漿サンプルを30分間3.0 RCFで遠心分離し、上清をTCのために添加し使用した。
単核細胞(MC)の単離および凍結保存
血漿調製物由来のペレット中の細胞画分を、Ficoll密度勾配分離による単核細胞単離のために用いた。FICOLL-PAQUE(商標) PREMIUM (1.077±0.001 g/ml) 15 mLを滅菌ACCUSPIN(商標) (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)コニカル試験管の上部に重層し、30秒間0.8 RCFで回転させた。成人末梢血または臍帯血を、血液から収集された血漿の量に等しい体積の1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で再懸濁した。この再懸濁された血液細胞画分をACCUSPIN(商標)試験管の上部に重層し、30分間0.5 RCFで遠心分離した。MCをFICOLL密度勾配の中間バフィーコート層から採取した。これらの細胞を1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で2回洗浄し、血球計を用いてトリパンブルー(0.2%) (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)により生存性についてカウントした。生存細胞を低温1.8 mL試験管(Nunc; Rochester, NY)に入れた溶液1 mL中100×106個の生存MCの濃度で10% DMSO (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)、および90%自家PPP中にて凍結保存した。これらの試験管を凍結保存容器(「Mr. Frosty」, Nalgene; ThermoFisher Scientific Rochester, NY)の中に配し、その後、TCコロニー形成に用いるまで液体窒素貯蔵タンクの気相中での貯蔵前に24時間-80℃に置いた。
血漿調製物由来のペレット中の細胞画分を、Ficoll密度勾配分離による単核細胞単離のために用いた。FICOLL-PAQUE(商標) PREMIUM (1.077±0.001 g/ml) 15 mLを滅菌ACCUSPIN(商標) (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)コニカル試験管の上部に重層し、30秒間0.8 RCFで回転させた。成人末梢血または臍帯血を、血液から収集された血漿の量に等しい体積の1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で再懸濁した。この再懸濁された血液細胞画分をACCUSPIN(商標)試験管の上部に重層し、30分間0.5 RCFで遠心分離した。MCをFICOLL密度勾配の中間バフィーコート層から採取した。これらの細胞を1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で2回洗浄し、血球計を用いてトリパンブルー(0.2%) (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)により生存性についてカウントした。生存細胞を低温1.8 mL試験管(Nunc; Rochester, NY)に入れた溶液1 mL中100×106個の生存MCの濃度で10% DMSO (SIGMA ALDRICH(登録商標), St. Louis, MO)、および90%自家PPP中にて凍結保存した。これらの試験管を凍結保存容器(「Mr. Frosty」, Nalgene; ThermoFisher Scientific Rochester, NY)の中に配し、その後、TCコロニー形成に用いるまで液体窒素貯蔵タンクの気相中での貯蔵前に24時間-80℃に置いた。
CD33+単球(Mo)およびナイーブCD4+の単離
凍結保存されたMCを融解し、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄した。生存MCをその後、トリパンブルー排除(0.2%, SIGMA ALDRICH(登録商標); St. Louis, MO)を用いてカウントした。生存MCをその後、15分間、抗CD33磁気マイクロビーズ(MACS, Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, FRG)で標識し、洗浄し、その後、CD33+細胞の陽性選択のために磁気LSカラム(MACS, Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, FRG)を通過させた。CD33+細胞をその後、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄して、すべての残留マイクロビーズを除去し、生存CD33+細胞をトリパンブルー(0.2%)排除によってカウントした。生存CD33+細胞をその後、下記のようにTCに加えた。あるいは、凍結保存されたMCを融解し、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄した。生存MCをトリパンブルー排除によってカウントし、その後、MACS(登録商標) Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II (Miltenyi)で標識した。CD4+ナイーブT細胞をLS磁気カラム(Miltenyi)にて陰性選択し、1×DPBSで洗浄し、培養の前にトリパンブルー排除を用いて生存細胞を数え上げた。
凍結保存されたMCを融解し、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄した。生存MCをその後、トリパンブルー排除(0.2%, SIGMA ALDRICH(登録商標); St. Louis, MO)を用いてカウントした。生存MCをその後、15分間、抗CD33磁気マイクロビーズ(MACS, Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, FRG)で標識し、洗浄し、その後、CD33+細胞の陽性選択のために磁気LSカラム(MACS, Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, FRG)を通過させた。CD33+細胞をその後、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄して、すべての残留マイクロビーズを除去し、生存CD33+細胞をトリパンブルー(0.2%)排除によってカウントした。生存CD33+細胞をその後、下記のようにTCに加えた。あるいは、凍結保存されたMCを融解し、1×DPBS (GIBCO(登録商標), Carlsbad, California)で洗浄した。生存MCをトリパンブルー排除によってカウントし、その後、MACS(登録商標) Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II (Miltenyi)で標識した。CD4+ナイーブT細胞をLS磁気カラム(Miltenyi)にて陰性選択し、1×DPBSで洗浄し、培養の前にトリパンブルー排除を用いて生存細胞を数え上げた。
組織構築体(TC)
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) (Lonza, Walkersville, MD USA)を、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG) (100×ストック) (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および50%の組成が明らかなウシ胎仔血清(FBS) (Hyclone, Logan, UT)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて、37℃、5% CO2インキュベータ中で増殖させた。HUVECは単一のドナーに由来し、それらをTC上に播種する前に、T-75フラスコ中で、その後、T-150フラスコ中でコンフルエントになるまで増殖させた。2日ごとに培地を交換し、EDTAを有する0.25%トリプシン(INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて継代を行った。およそ細胞105個/cm2 (およそHUVEC 32,000個/ウェル)を平底96ウェルプレート中のプレキャスト細胞外マトリックスゲルの上部に播種した。細胞外マトリックスゲルは、それぞれ順番に加えられた8:1:5の比率の1型コラーゲン(PURECOL(登録商標)またはVITRACOL(登録商標))、10×M199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および0.1 N NaOHを用いて、製造元の推奨(Advanced Biomatrix, San Diego, CA)にしたがいPURECOL(登録商標)を使ってキャストされた。あるいは、ヒト細胞外マトリックスゲルは、上記のように製造元の推奨(Advanced Biomatrix, San Diego, CA)によってVITRACOL(登録商標)キャストを用いて形成された。ヒト細胞外マトリックスゲルは、HUVECの培養に用いる前に5日間、225 mMの中性(pH 7.0)にしたグルコース-6-リン酸(SIGMA ALDRICH(登録商標) St. Louis, MO)を用いて改変された。37℃、5% CO2インキュベータ中で、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG) (100×ストック) (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および50% FBS (CD33+単球-樹状細胞(MoDC)-リンパ球の共培養には使われないTCの場合のみ)または50%のプールされた熱で不活化された新生児PPP (MoDC-リンパ球の共培養試験に使われる完全にヒトのTCの場合のみ)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)の存在下において細胞外マトリックス上で95〜100%コンフルエントまでHUVECを増殖させた(ウシマトリックスの場合はおよそ5日またはヒトマトリックスの場合は1日)。コンフルエントなTCをその後、融解された凍結保存MCまたはCD33+ Moの遊出に用いた。融解されたMCを1×DPBSで洗浄し、トリパンブルー排除を用いてカウントした。生存MC 5×105個を遊出のために各TCウェルに加えた。新たに単離されたCD33+ MoをMo 105個/TCウェルで加えた。遊出は、1% PSG (INVITROGEN(商標))および0.1%ヒト血清アルブミン(Talecris Biotherapeutics; Clayton, North Carolina)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて無血清条件下で1.5時間のインキュベーションの間に行われた。遊出後、遊出しなかった細胞を、1×DPBS (INVITROGEN(商標))を用いてTCから洗い流した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) (Lonza, Walkersville, MD USA)を、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG) (100×ストック) (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および50%の組成が明らかなウシ胎仔血清(FBS) (Hyclone, Logan, UT)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて、37℃、5% CO2インキュベータ中で増殖させた。HUVECは単一のドナーに由来し、それらをTC上に播種する前に、T-75フラスコ中で、その後、T-150フラスコ中でコンフルエントになるまで増殖させた。2日ごとに培地を交換し、EDTAを有する0.25%トリプシン(INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて継代を行った。およそ細胞105個/cm2 (およそHUVEC 32,000個/ウェル)を平底96ウェルプレート中のプレキャスト細胞外マトリックスゲルの上部に播種した。細胞外マトリックスゲルは、それぞれ順番に加えられた8:1:5の比率の1型コラーゲン(PURECOL(登録商標)またはVITRACOL(登録商標))、10×M199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および0.1 N NaOHを用いて、製造元の推奨(Advanced Biomatrix, San Diego, CA)にしたがいPURECOL(登録商標)を使ってキャストされた。あるいは、ヒト細胞外マトリックスゲルは、上記のように製造元の推奨(Advanced Biomatrix, San Diego, CA)によってVITRACOL(登録商標)キャストを用いて形成された。ヒト細胞外マトリックスゲルは、HUVECの培養に用いる前に5日間、225 mMの中性(pH 7.0)にしたグルコース-6-リン酸(SIGMA ALDRICH(登録商標) St. Louis, MO)を用いて改変された。37℃、5% CO2インキュベータ中で、1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG) (100×ストック) (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)および50% FBS (CD33+単球-樹状細胞(MoDC)-リンパ球の共培養には使われないTCの場合のみ)または50%のプールされた熱で不活化された新生児PPP (MoDC-リンパ球の共培養試験に使われる完全にヒトのTCの場合のみ)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)の存在下において細胞外マトリックス上で95〜100%コンフルエントまでHUVECを増殖させた(ウシマトリックスの場合はおよそ5日またはヒトマトリックスの場合は1日)。コンフルエントなTCをその後、融解された凍結保存MCまたはCD33+ Moの遊出に用いた。融解されたMCを1×DPBSで洗浄し、トリパンブルー排除を用いてカウントした。生存MC 5×105個を遊出のために各TCウェルに加えた。新たに単離されたCD33+ MoをMo 105個/TCウェルで加えた。遊出は、1% PSG (INVITROGEN(商標))および0.1%ヒト血清アルブミン(Talecris Biotherapeutics; Clayton, North Carolina)を含有するM199 (INVITROGEN(商標) Carlsbad, CA)を用いて無血清条件下で1.5時間のインキュベーションの間に行われた。遊出後、遊出しなかった細胞を、1×DPBS (INVITROGEN(商標))を用いてTCから洗い流した。
DCの作出ならびに遊走RT-APCおよびマトリックス常在白血球の成熟
コロニー形成されたTCを、100%自家血漿のみ(非刺激対照)または刺激剤(例えば、アジュバントもしくはワクチン)を含有する自家血漿とともに培養した。刺激は37℃/5% CO2での48時間のインキュベーションの間に行われ、その後、培養上清を液相の上部から注意深く取り出し、-20℃で貯蔵した。逆遊出した抗原提示細胞(RT-APC)をTCの上部から収集し、5 mLの丸底試験管中にプールした。プールされた生存RT-APCをトリパンブルー排除により数え上げ、フローサイトメトリーのために染色し、共焦点顕微鏡検査のために染色した。収集されたTCを10%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の前に4℃で貯蔵した。遊出細胞およびマトリックス常在細胞の表現型検査では、コラゲナーゼ(Liberase; DL Research Grade; ROCHE(登録商標), Indianapolis, IN) 50 μLによる15分の処理を利用した。液化したECMをその後、HUVEC単層とは別々に収集し、フローサイトメトリー染色のためにプールした。この技法は、トリパンブルー排除を用いた遊出細胞および常在細胞のカウンティングにも用いられた。
コロニー形成されたTCを、100%自家血漿のみ(非刺激対照)または刺激剤(例えば、アジュバントもしくはワクチン)を含有する自家血漿とともに培養した。刺激は37℃/5% CO2での48時間のインキュベーションの間に行われ、その後、培養上清を液相の上部から注意深く取り出し、-20℃で貯蔵した。逆遊出した抗原提示細胞(RT-APC)をTCの上部から収集し、5 mLの丸底試験管中にプールした。プールされた生存RT-APCをトリパンブルー排除により数え上げ、フローサイトメトリーのために染色し、共焦点顕微鏡検査のために染色した。収集されたTCを10%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の前に4℃で貯蔵した。遊出細胞およびマトリックス常在細胞の表現型検査では、コラゲナーゼ(Liberase; DL Research Grade; ROCHE(登録商標), Indianapolis, IN) 50 μLによる15分の処理を利用した。液化したECMをその後、HUVEC単層とは別々に収集し、フローサイトメトリー染色のためにプールした。この技法は、トリパンブルー排除を用いた遊出細胞および常在細胞のカウンティングにも用いられた。
フローサイトメトリー
TC由来白血球の免疫表現型検査では、Coherent Sapphire 488 nm、Dako赤色ダイオード635 nm、Coherent Radius 405 nmレーザーおよびBeckman Coulter Summit v4.3ソフトウェアを備えたBeckman Coulter MoFlo Legacyを用いた6〜7色のフローサイトメトリーを利用した。細胞を結合型Abにより、製造元の仕様書によって推奨される濃度で染色した。用いたAbには、CD14-APC-Cy7、HLA-DR-PE-Cy7、CD16-PE、CD3-APC、CD19-PerCP-Cy5.5、CD123-FITC、CD45RO-PE-Cy7、CD45RA-FITC、CD56-APC、CD8-PE、HLA-DR-PerCP-Cy5.5 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey)を含めた。製造元の仕様書(Becton, Dickinson and Company)にしたがって非特異的な結合を判定するために、対応するアイソタイプ対照抗体(Ab)を各実験において用いた。補正には、製造元の推奨にしたがってプロファイルにおける色ごとに上記のAbに結合されるABC(商標)抗マウス・ビーズのキット(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)を利用した。白血球の染色には、Abとのインキュベーション(30分)、遠心分離(10分)、1×DPBSによる洗浄後、4%パラホルムアルデヒドによる固定を用いた。フローサイトメトリーデータは、上記のMOFLO Legacyシステムを用いて取得され、FLOWJOソフトウェア(Tree Star, Inc. Ashland, OR)を用いて分析された。成熟DCはCD14低, HLA-DR高, CCR7+, CD86+またはCD83+細胞と定義された。
TC由来白血球の免疫表現型検査では、Coherent Sapphire 488 nm、Dako赤色ダイオード635 nm、Coherent Radius 405 nmレーザーおよびBeckman Coulter Summit v4.3ソフトウェアを備えたBeckman Coulter MoFlo Legacyを用いた6〜7色のフローサイトメトリーを利用した。細胞を結合型Abにより、製造元の仕様書によって推奨される濃度で染色した。用いたAbには、CD14-APC-Cy7、HLA-DR-PE-Cy7、CD16-PE、CD3-APC、CD19-PerCP-Cy5.5、CD123-FITC、CD45RO-PE-Cy7、CD45RA-FITC、CD56-APC、CD8-PE、HLA-DR-PerCP-Cy5.5 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey)を含めた。製造元の仕様書(Becton, Dickinson and Company)にしたがって非特異的な結合を判定するために、対応するアイソタイプ対照抗体(Ab)を各実験において用いた。補正には、製造元の推奨にしたがってプロファイルにおける色ごとに上記のAbに結合されるABC(商標)抗マウス・ビーズのキット(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)を利用した。白血球の染色には、Abとのインキュベーション(30分)、遠心分離(10分)、1×DPBSによる洗浄後、4%パラホルムアルデヒドによる固定を用いた。フローサイトメトリーデータは、上記のMOFLO Legacyシステムを用いて取得され、FLOWJOソフトウェア(Tree Star, Inc. Ashland, OR)を用いて分析された。成熟DCはCD14低, HLA-DR高, CCR7+, CD86+またはCD83+細胞と定義された。
細胞生存性および逆遊出(RT)の指数
細胞生存性をNikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ10倍でトリパンブルー排除により判定した。血球計および0.2%トリパンブルーを用いて、細胞およそ50〜150個/4分割をカウントするために1分の1、5分の1、10分の1、または100分の1の希釈で細胞を希釈した。トリパンブルー染色の欠如によって生存細胞を特定した。総細胞数および%生存性を得るために死細胞もカウントした。生存総細胞数をフローサイトメトリー分析と併用して、内腔の区画に逆遊出した総細胞種(例えば、CD14+細胞)の百分率を決定した。
細胞生存性をNikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ10倍でトリパンブルー排除により判定した。血球計および0.2%トリパンブルーを用いて、細胞およそ50〜150個/4分割をカウントするために1分の1、5分の1、10分の1、または100分の1の希釈で細胞を希釈した。トリパンブルー染色の欠如によって生存細胞を特定した。総細胞数および%生存性を得るために死細胞もカウントした。生存総細胞数をフローサイトメトリー分析と併用して、内腔の区画に逆遊出した総細胞種(例えば、CD14+細胞)の百分率を決定した。
内皮の完全性
10%パラホルムアルデヒド溶液でコラーゲンクッション上部の内皮層を固定することにより、TCの内皮単層を評価した。固定されたクッションを製造元の指示書(VWR International, LLC)にしたがってヘマトキシリンおよびエオシンYで染色した。クッションをNikon TS100倒立顕微鏡にて、対物レンズ(Nikon Instruments Inc., Melville, NY) 10倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べ、加えられた刺激が細胞活性化をもたらしたかどうか評価した。
10%パラホルムアルデヒド溶液でコラーゲンクッション上部の内皮層を固定することにより、TCの内皮単層を評価した。固定されたクッションを製造元の指示書(VWR International, LLC)にしたがってヘマトキシリンおよびエオシンYで染色した。クッションをNikon TS100倒立顕微鏡にて、対物レンズ(Nikon Instruments Inc., Melville, NY) 10倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べ、加えられた刺激が細胞活性化をもたらしたかどうか評価した。
初期細胞遊走指数および細胞滞留指数
TCを上記のように固定し、ヘマトキシリン/エオシンを用いて染色し、次いで撮像のためにスライドグラスにマウントした。染色されたクッションを、明視野顕微鏡検査(TE2000 microscope, Nikon Instruments Inc.; Melville, NY)を用い、対物レンズ20倍およびソフトウェアに基づく画像収集(Slidebook software; Denver, CO)を使って撮像した。長さが30、10 μMずつ300 μmに及ぶ5つの個々の画像スタックを撮ることにより、各条件を撮像した。条件ごとに3つのクッションを撮像した。得られた画像スタックを、ImageJソフトウェアを用いてそれらを8ビットのグレースケール画像に変換することによって、および染色細胞を取得するために閾値設定を用いて処理した。次いで、クッション内部に残存した染色細胞の数をカウントするために、画像を用いた。残屑をカウントすることを回避するために、25〜135 μmの直径を有する対象物だけ、および平均サイズの標準偏差の範囲内に入った細胞だけをカウントした。個々のカウントの標準偏差の中間に位置する細胞を次いで、正規化されたカウントとして用いた。最初の1.5時間の遊走後にTCマトリックスへ遊走していたPBMC、CMBC、またはCD33+ Moの数をカウントすることにより、初期細胞遊走指数を決定した。その後48時間の刺激中に逆遊出しなかった残存MCをカウントすることにより、細胞滞留指数を決定した。
TCを上記のように固定し、ヘマトキシリン/エオシンを用いて染色し、次いで撮像のためにスライドグラスにマウントした。染色されたクッションを、明視野顕微鏡検査(TE2000 microscope, Nikon Instruments Inc.; Melville, NY)を用い、対物レンズ20倍およびソフトウェアに基づく画像収集(Slidebook software; Denver, CO)を使って撮像した。長さが30、10 μMずつ300 μmに及ぶ5つの個々の画像スタックを撮ることにより、各条件を撮像した。条件ごとに3つのクッションを撮像した。得られた画像スタックを、ImageJソフトウェアを用いてそれらを8ビットのグレースケール画像に変換することによって、および染色細胞を取得するために閾値設定を用いて処理した。次いで、クッション内部に残存した染色細胞の数をカウントするために、画像を用いた。残屑をカウントすることを回避するために、25〜135 μmの直径を有する対象物だけ、および平均サイズの標準偏差の範囲内に入った細胞だけをカウントした。個々のカウントの標準偏差の中間に位置する細胞を次いで、正規化されたカウントとして用いた。最初の1.5時間の遊走後にTCマトリックスへ遊走していたPBMC、CMBC、またはCD33+ Moの数をカウントすることにより、初期細胞遊走指数を決定した。その後48時間の刺激中に逆遊出しなかった残存MCをカウントすることにより、細胞滞留指数を決定した。
共焦点顕微鏡検査
共焦点顕微鏡検査のために、逆遊出した細胞を収集し、24ウェル平底組織培養プレート(Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)中のBD BIOCOAT(商標)ポリ-L-リジンコート・ガラス・カバースリップ(直径12 mm丸型)上に播種した。各TCウェルの培地を穏やかに再懸濁し、条件ごとにTCウェル5〜10個からおよそ70μL/ウェルを取り、これらをカバースリップの円に移すことにより(総体積およそ350〜700 uL)、加温されたNTCプレートを素早く処理した。プールした逆遊出した抗原提示細胞(RT-APC) (別名、逆遊出した樹状細胞)を分割して、アイソタイプ対照Abおよび試験Abを試験した。RT-APCを24ウェルプレート中で37℃/5% CO2にて30〜60分間インキュベートして、細胞を定着および付着させた。付着した細胞を1×DPBSで洗浄し、次にBD CITOFIX/CYTOPERM(商標) (Becton, Dickinson and Company)を用いて固定/透過処理し、続いて37℃で10分間インキュベーションした。その後の洗浄には、BD洗浄用緩衝液を利用した。500 μL/ウェルのDPBS/0.5%ヒト血清アルブミンを各ウェルに加え、その後、HLA-DR-FITC結合Ab (Becton, Dickinson and Company) 20 μL、DRAQ5(商標)色素(eBiosciences, Inc.; San Diego, CA) 1 μL、およびALEXA FLUOR(登録商標) 594ファロイジンF-アクチン色素(Molecular Probes, Inc.; Eugene, OR) 2.5 μLを各ウェルに加えた。対応するアイソタイプ対照Abを陰性対照ウェルに加えた。細胞を30〜60分間37℃にて暗所中で染色した。マウンティングには、50%グリセロール50% DPBSを用いた。蛍光顕微鏡(AXIOVERT 200m蛍光顕微鏡, ZEISS(登録商標); Thornwood, NY)にてSLIDEBOOK(商標)ソフトウェアを用いて画像を取得した。
共焦点顕微鏡検査のために、逆遊出した細胞を収集し、24ウェル平底組織培養プレート(Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)中のBD BIOCOAT(商標)ポリ-L-リジンコート・ガラス・カバースリップ(直径12 mm丸型)上に播種した。各TCウェルの培地を穏やかに再懸濁し、条件ごとにTCウェル5〜10個からおよそ70μL/ウェルを取り、これらをカバースリップの円に移すことにより(総体積およそ350〜700 uL)、加温されたNTCプレートを素早く処理した。プールした逆遊出した抗原提示細胞(RT-APC) (別名、逆遊出した樹状細胞)を分割して、アイソタイプ対照Abおよび試験Abを試験した。RT-APCを24ウェルプレート中で37℃/5% CO2にて30〜60分間インキュベートして、細胞を定着および付着させた。付着した細胞を1×DPBSで洗浄し、次にBD CITOFIX/CYTOPERM(商標) (Becton, Dickinson and Company)を用いて固定/透過処理し、続いて37℃で10分間インキュベーションした。その後の洗浄には、BD洗浄用緩衝液を利用した。500 μL/ウェルのDPBS/0.5%ヒト血清アルブミンを各ウェルに加え、その後、HLA-DR-FITC結合Ab (Becton, Dickinson and Company) 20 μL、DRAQ5(商標)色素(eBiosciences, Inc.; San Diego, CA) 1 μL、およびALEXA FLUOR(登録商標) 594ファロイジンF-アクチン色素(Molecular Probes, Inc.; Eugene, OR) 2.5 μLを各ウェルに加えた。対応するアイソタイプ対照Abを陰性対照ウェルに加えた。細胞を30〜60分間37℃にて暗所中で染色した。マウンティングには、50%グリセロール50% DPBSを用いた。蛍光顕微鏡(AXIOVERT 200m蛍光顕微鏡, ZEISS(登録商標); Thornwood, NY)にてSLIDEBOOK(商標)ソフトウェアを用いて画像を取得した。
多重サイトカイン分析
TC上部の、48時間培養後の培養上清を用いて、サイトカインプロファイルを分析した。製造元の使用説明書にしたがって蛍光ビーズに基づく多重アッセイ法(MILLIPLEX(商標) MAP 26-plex Human Cytokine/Chemokineパネル, MILLIPORE(登録商標); Billerica, MA)を用いてサイトカインを測定した。全ての培養上清は、一回の凍結融解サイクルの後に適切な(neat)濃度で試験された。
TC上部の、48時間培養後の培養上清を用いて、サイトカインプロファイルを分析した。製造元の使用説明書にしたがって蛍光ビーズに基づく多重アッセイ法(MILLIPLEX(商標) MAP 26-plex Human Cytokine/Chemokineパネル, MILLIPORE(登録商標); Billerica, MA)を用いてサイトカインを測定した。全ての培養上清は、一回の凍結融解サイクルの後に適切な(neat)濃度で試験された。
自家ナイーブCD4+リンパ球およびDCの共培養
エンドポイントにMoDC-リンパ球共培養を含む実験の場合、CD33+Moコロニー形成TCを利用した。刺激のないまたはワクチン刺激されたCD33+Moコロニー形成TCからの生存RT-APC (トリパン)を、新鮮な陰性選択された自家CD4+CD45RA+ナイーブT細胞に、1個のRT-APC対10個のCD4+CD45RA+ナイーブT細胞の比率で加えた。丸底96ウェルプレート中にて10%自家血漿を含有するRPMI Medium 1640 (INVITROGEN(商標); Carlsbad, CA) 200 μL中でRT-APCおよびナイーブCD4+ T細胞を共培養した。37℃/5% CO2での一次応答のために7日間、共培養を維持した。培地の半分を3日ごとに交換し、サイトカイン分析のために-20℃で貯蔵した。二次応答を測定する実験では、第2のTCから新たに収集されたRT-APCによるT細胞の再刺激の前に、共培養物を最大で20日まで休止させた。BCG、PCVおよびHBVを比較するいくつかの実験の場合、ワクチンは、インビボでの臨床投薬に用いられる体積に応じて投与された。例えば、BCGの体積用量(0.05 mL)がPCVの体積用量(0.5 mL)よりも10倍低い場合、本発明者らは10倍低いBCG体積比、例えば、20分の1希釈のBCG vs. 2分の1希釈のPCVを投与した。
エンドポイントにMoDC-リンパ球共培養を含む実験の場合、CD33+Moコロニー形成TCを利用した。刺激のないまたはワクチン刺激されたCD33+Moコロニー形成TCからの生存RT-APC (トリパン)を、新鮮な陰性選択された自家CD4+CD45RA+ナイーブT細胞に、1個のRT-APC対10個のCD4+CD45RA+ナイーブT細胞の比率で加えた。丸底96ウェルプレート中にて10%自家血漿を含有するRPMI Medium 1640 (INVITROGEN(商標); Carlsbad, CA) 200 μL中でRT-APCおよびナイーブCD4+ T細胞を共培養した。37℃/5% CO2での一次応答のために7日間、共培養を維持した。培地の半分を3日ごとに交換し、サイトカイン分析のために-20℃で貯蔵した。二次応答を測定する実験では、第2のTCから新たに収集されたRT-APCによるT細胞の再刺激の前に、共培養物を最大で20日まで休止させた。BCG、PCVおよびHBVを比較するいくつかの実験の場合、ワクチンは、インビボでの臨床投薬に用いられる体積に応じて投与された。例えば、BCGの体積用量(0.05 mL)がPCVの体積用量(0.5 mL)よりも10倍低い場合、本発明者らは10倍低いBCG体積比、例えば、20分の1希釈のBCG vs. 2分の1希釈のPCVを投与した。
H3-チミジン取り込みアッセイ法: RT-APCおよびナイーブCD4+細胞の共培養物を望ましい時間維持し、その時点で1 μCiのH3-チミジン(PERKINELMER(登録商標); Waltham, MA)を各ウェルに加え、ガラス繊維フィルタマット(PERKINELMER(登録商標) Waltham, MA)への細胞収集(HARVESTER96(商標), TomTec; Hamden, CT)の前に18時間インキュベートした。1450 Microbeta (PERKINELMER(R) Waltham, MA)を用いてトリチウムをカウントした。全ての条件を三つ組で試験した。
結果
単核細胞がコロニー形成した組織構築体の作出。
培養されたコンフルエントなHUVEC単層で覆われたキャストされた細胞外マトリックスクッションを利用し、それによって微小血管化間質をモデル化し、TCを作出した。キャストされた細胞外マトリックス(ECM)クッションは、これらのマトリックスクッションの上でコンフルエントになるまでHUVECを培養する前に、ヒト1型コラーゲンおよびヒトフィブロネクチンから構成された。予め凍結保存された単核細胞(MC)をTCの内部に遊出させた。TCは、遊出した単球から抗原提示細胞を自律的に作出する。NTCおよびATCを発達させるため、それぞれCBMCまたはPBMCを1.5時間にわたり遊出させ、TCマトリックスにコロニー形成させた(図1)。非遊走細胞の除去後、インタクトな自家血漿を、刺激ありまたはなしで各TCに加えた。TCをその後、37℃/5% CO2で48時間培養し、その間にMC由来APCは内腔のTC区画へ自律的に逆遊出し、未成熟MoDCに分化した。
単核細胞がコロニー形成した組織構築体の作出。
培養されたコンフルエントなHUVEC単層で覆われたキャストされた細胞外マトリックスクッションを利用し、それによって微小血管化間質をモデル化し、TCを作出した。キャストされた細胞外マトリックス(ECM)クッションは、これらのマトリックスクッションの上でコンフルエントになるまでHUVECを培養する前に、ヒト1型コラーゲンおよびヒトフィブロネクチンから構成された。予め凍結保存された単核細胞(MC)をTCの内部に遊出させた。TCは、遊出した単球から抗原提示細胞を自律的に作出する。NTCおよびATCを発達させるため、それぞれCBMCまたはPBMCを1.5時間にわたり遊出させ、TCマトリックスにコロニー形成させた(図1)。非遊走細胞の除去後、インタクトな自家血漿を、刺激ありまたはなしで各TCに加えた。TCをその後、37℃/5% CO2で48時間培養し、その間にMC由来APCは内腔のTC区画へ自律的に逆遊出し、未成熟MoDCに分化した。
CBMCは、障害された遊出を示すが、強力な逆遊出を示す。TCにおける新生児および成人の白血球を特徴付けるうえでの第1段階として、CBMCおよびPBMCの遊出、TCでの滞留および逆遊出を比較した。CBMCは成人PBMCと比べて比較的高い比率のナイーブCD4 T細胞ならびに低い比率の記憶CD4およびCD8 T細胞を含有していたのに対し、成人PBMCは、より大きな比率のCD14+ CD16- Mo、ナイーブCD8+ T細胞ならびに記憶CD4+およびCD8+ T細胞を示した(図2)。ボストン小児病院の中核研究所によって提供された臨床参照基準との比較によって、凍結保存がさまざまなMC種の相対頻度を変化させないことが示唆された。遊出した細胞の免疫表現型をフローサイトメトリーにより検査することによって、ATCと比べてNTCは少ないCD14+CD16+ Moおよび少ない記憶CD4+ Tリンパ球を有することが明らかにされた(図3)。成人TC (ATC)において遊出したMCと比べて、新生児(NTC)において遊出した新生児MCは、比較的高い比率のナイーブCD4+ T細胞ならびに低い比率のCD45RO+記憶T細胞、CD14+CD16+ Moおよび形質細胞様樹状細胞(DC)を示している。方法の項において記載されたように、7色の多色フローサイトメトリーによって遊走白血球の表現型を評価した。
新生児CBMCおよび成人PBMCがTCにコロニー形成する全体的能力の比較で、PBMCが示すよりもCBMCが顕著に低い数の遊出CD14+ MCを示すことに気付いた(図4A)。遊出した新生児MCは、ATCにおいて遊出した成人MCよりも顕著に低い数のCD14+ Moを示した。方法の項において記載されたように細胞生存性をトリパンブルー排除によって判定し、免疫表現型を多色フローサイトメトリーによって判定した。
それにもかかわらず、48時間の培養後、NTCは、TCの細胞外マトリックス区画における白血球滞留がATCと比べて顕著に低かった(図5)ことに関連して、ATCと比べてほぼ同等の数の逆遊出した細胞を示した(図4B)。図4Bは、より低い新生児MCの遊出にもかかわらず、NTCおよびATCが48時間の培養後に類似した数の逆遊出した(RT) MCを作出したことを示し、反内腔側から内腔側の方向に内皮を横切る強力な能力を有する遊出した新生児MCの比較的低減された組織常在性を示唆している。図5は、48時間の培養後、逆遊出した細胞が、TCの固定ならびにヘマトキシリンおよびエオシンでの染色の前に除去されたことを示す。顕微鏡検査およびImageJソフトウェアを用いた自動細胞計数によって細胞密度を評価した。これらの所見によって、TCマトリックスから逆遊出し、反内腔側から内腔側の方向に内皮層を横切る新生児CBMCの選択的能力が示される。
細胞外培地は、MoDCの遊走およびTCのサイトカイン産生に重大な影響を及ぼす。新生児の血漿中の可溶性因子は、全血における免疫応答を調節することができ[2, 6, 16]、細胞外培地も同様に、TCにおける白血球機能を調節しうるという可能性を提起している。この目的を達成するために、異なる比率の自家血漿中で培養されたTCにおける白血球の生物活性を比較した。細胞外培地中の新生児または成人の血漿の比率を1〜10〜100% (体積比)増加させたことは、より少数の逆遊出した細胞に関連していた(図6)。MCがコロニー形成したTCを、処理せずに放置し(φ)、または1%、10%もしくは100% (体積比)の自家血漿の存在下においてミョウバン(50 μg/mL)もしくはR848 (TLR7/8; 50 μM)で刺激した。48時間の培養後、逆遊出した細胞を収集し、トリパンブルーを用いてカウントした。より高濃度の自家血漿は、より低レベルの逆遊出と関連するように見受けられた。
白血球機能に及ぼす液相の影響の別の指標として、種々の非自家培地の影響を、NTCにおけるTLR媒介性のサイトカイン誘導に関して、自家の新生児血漿と比べて評価した(図7)。MCがコロニー形成したNTCを、100%のインタクトな自家血漿、他家成人血漿、熱処理されたプール済み市販他家成人AB血清、ウシ胎仔血清または無血清の市販XVIVO-15培地中にてTLR2アゴニストPam3Cysk4 (TLR2; 10 μg/mL)で48時間刺激した。培養上清を収集し、多重蛍光ビーズに基づくアレイシステムを用いてIL-1β、IL-10、IL-12(p70)、TNF-αおよびIFN-γのサイトカイン濃度を決定した。非自家条件により誘導された変化を強調するため、自家血漿の場合の変化に対する百分率として結果をプロットした。全ての非微小生理学的条件により、Pam3Cysk4のサイトカイン誘導能が増大された。非自家培地条件では、IFN-γを低減するように見受けられたウシ胎仔血清を除き、サイトカイン誘導を増大させるように見受けられた。全ての非微小生理学的条件により、Pam3Cysk4のサイトカイン誘導能が増大された。非自家培地条件では、IFN-γを低減するように見受けられたウシ胎仔血清を除き、サイトカイン誘導を増大させるように見受けられた。したがって、その後の実験では自家血漿条件を利用した。
MCがコロニー形成したTCは、アジュバントおよびワクチンに応答する。ここで作出されたNTCモデルの検証を探索するうえで、NTCがワクチンに対して既知の新生児免疫応答を再現しうるかどうか?を評価するためにNTCを試験した。アジュバントおよびワクチンがTC由来DCの成熟を誘導する能力を評価するため、一般的なワクチンアジュバントであるミョウバンを2つのTLRアゴニスト候補アジュバント: 合成小分子イミダゾキノリンR-848 (TLR7/8)および3M-002 (TLR8/7)、ならびに新生児(BCG)および幼児(DTaPおよびPCV)に日常的に投与されているいくつかの認可されたワクチンと比較した。BCGは単回用量として投与され、安全であり、耐容性良好かつ有効な、CD4+ T細胞応答を誘導することが知られている新生児ワクチンであるため、NTCを検証するためのベンチマークまたは基準としてBCGワクチンを選択した。試験したアジュバントおよびワクチン全てが、NTC由来の成熟MoDCの数を増大させるように見受けられた(図8)。ATCおよびNTCでMCをコロニー形成させ、以下のアジュバントまたはワクチンで(全て体積比100分の1および10分の1希釈にて)刺激した: 水酸化ミョウバン(5および50 μg/mL); 3M-002 (TLR8/7; 5および50 μM); R848 (TLR7/8; 5および50 μM); PCV、DTaPおよびBCGワクチン。48時間のインキュベーション後、方法の項において記載されたように逆遊出した成熟DCを収集し、数え上げた。これらの研究により、アジュバントおよびワクチンがNTCおよびATCの両方からのMoDCの逆遊出に効果を及ぼしうることが明らかになった。
注目すべきことに、試験されたワクチンは、保持されたMCおよび逆遊出したMCの数に異なった影響を及ぼした。PCV、DTaPおよびBCGの影響をTCマトリックスにおけるMCの滞留に関して比較した(図9)。サブユニットワクチンPCVおよびDTaPは、マトリックスにおけるMCの滞留を低減し(図9A)、それに対応してTCウェルあたりの総数DCが増加した(図9B)。対照的に、BCGは滞留指数を低減させず(図9A)、TCウェルあたりのDCの総数も増加させなかった(図9B)。図9Aでは、48時間の培養後、方法の項において記載されたように逆遊出した細胞を収集し、DCの数をフローサイトメトリーおよび生体染色によって数え上げた。図9Bでは、48時間の培養後、逆遊出した細胞を収集し、TC内部に保持された細胞の数を、ヘマトキシリンおよびエオシンでTCを染色して顕微鏡検査およびImageJソフトウェアを用いた自動細胞カウンティング分析で細胞密度を評価することによって得た。保持された細胞の相対数を、1と定義された、非刺激群における相対数に対して正規化した。逆遊出したDCの相対数を、1と定義された、非刺激群における相対数に対して正規化した。DTaPおよびBCGは、成熟DCの顕著な増加を誘導し、HLA-DR、CD86、およびCCR7の発現を増加させた(図10)。ATCおよびNTCにおいてMCをコロニー形成させ、DTaP (体積比1:100)およびBCG (体積比1:10)で刺激した。48時間のインキュベーション後、方法の項において記載されたように、逆遊出した成熟DCを収集し、多色フローサイトメトリーによってCD86、HLA-DRおよびCCR7について免疫表現型を判定した。データは、1と定義された非刺激条件に対する比率として表現されている。
ATCおよびNTCに及ぼす反応性ワクチンの効果。
TCにおいて比較的高い反応性を有するワクチンの影響を評価するため、全細胞百日咳(wP)を含有する五価の混合ワクチン(「EASYFIVE」)を本試験において利用した。wPは、その反応性のために米国市場から除外されたことに留意されたい。48時間後、単層を1×DPBSで洗浄して、残存するすべてのMC残屑を除去した。TC内皮単層/マトリックスクッションを10%パラホルムアルデヒドで固定し、Nikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ4倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べた。DTwPを含有するEasyFiveワクチンで刺激されたTCは、高い反応性を示唆する欠落した内皮細胞の非集密パッチを示した。刺激されていないATC HUVEC単層は無傷に見受けられた(図11A)が、1:100および1:10 (体積比)でDTwPを含有するEasyFiveワクチンの添加は、DTaP条件(図11DおよびE)では観察されなかった内皮単層(図11BおよびC)への著しい損傷から明らかなように、TCへの明らかな損傷を引き起こした。より高い損傷は内皮細胞の喪失によって確認される。このエンドポイントは、ワクチン反応性/毒性を評価するのに適当でありうる。NTCに及ぼすDTwP含有EasyFive(商標)ワクチンの損傷効果は、さらにいっそう顕著であった(図12BおよびC)。図12では、48時間後、単層を1×DPBSで洗浄して、残存するすべてのMC残屑を除去した。TC内皮単層/マトリックスクッションを10%パラホルムアルデヒドで固定し、Nikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ4倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べた。DTwPを含有するEASYFIVEワクチンで刺激されたTCは、高い反応性を示唆する欠落した内皮の非集密パッチを示した。
TCにおいて比較的高い反応性を有するワクチンの影響を評価するため、全細胞百日咳(wP)を含有する五価の混合ワクチン(「EASYFIVE」)を本試験において利用した。wPは、その反応性のために米国市場から除外されたことに留意されたい。48時間後、単層を1×DPBSで洗浄して、残存するすべてのMC残屑を除去した。TC内皮単層/マトリックスクッションを10%パラホルムアルデヒドで固定し、Nikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ4倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べた。DTwPを含有するEasyFiveワクチンで刺激されたTCは、高い反応性を示唆する欠落した内皮細胞の非集密パッチを示した。刺激されていないATC HUVEC単層は無傷に見受けられた(図11A)が、1:100および1:10 (体積比)でDTwPを含有するEasyFiveワクチンの添加は、DTaP条件(図11DおよびE)では観察されなかった内皮単層(図11BおよびC)への著しい損傷から明らかなように、TCへの明らかな損傷を引き起こした。より高い損傷は内皮細胞の喪失によって確認される。このエンドポイントは、ワクチン反応性/毒性を評価するのに適当でありうる。NTCに及ぼすDTwP含有EasyFive(商標)ワクチンの損傷効果は、さらにいっそう顕著であった(図12BおよびC)。図12では、48時間後、単層を1×DPBSで洗浄して、残存するすべてのMC残屑を除去した。TC内皮単層/マトリックスクッションを10%パラホルムアルデヒドで固定し、Nikon TS100倒立顕微鏡にて対物レンズ4倍を用いて撮像した。内皮層を単層完全性および細胞形態について調べた。DTwPを含有するEASYFIVEワクチンで刺激されたTCは、高い反応性を示唆する欠落した内皮の非集密パッチを示した。
MCがコロニー形成したTCの、BCG、PCVおよびDTaPワクチンに対するサイトカイン応答。次に、MCがコロニー形成したTCによるサイトカイン生成に及ぼすワクチンの影響を、48時間の刺激後に培養上清を収集することによって評価した。基本条件(刺激を加えず)の下でもPCV、DTaPおよびBCGでの刺激によっても、ATCと比べてNTCの場合に新生児のIFN-γ産生のかなりの障害が見受けられた(図13)。図13では、方法に記載されたように、IFN-γを測定するために培養上清を収集する前に、MCがコロニー形成したNTCおよびATCを、1:100または1:10 (体積比)のDTaP-、PCV-またはBCG-ワクチン接種で48時間刺激した。非刺激条件の下でもワクチンによる刺激条件の下でもワクチン誘導性のIFN-γ産生の障害。
CD33+単球は組織構築体においてコロニー形成し、MoDCを作出することができる。DC機能の重要な局面は、適応性免疫に対する段階としてナイーブリンパ球を活性化するその能力である。しかしながら、MCがコロニー形成したTCは、等しくない数の新生児のおよび成人の逆遊出したMoDCを作出し、かつ、TCへのリンパ球遊出を可能にし、下流のリンパ球共培養を混同させる可能性がある。下流のリンパ球活性化試験に向けて、共遊走したリンパ球のない、純粋なNTC由来のMoDCの評価を可能にするために、陽性選択されたCD33+ Moを混合MCの代わりにTCコロニー形成に利用した。CD33+Moがコロニー形成したTCをBCGまたはR848 (TLR7/8)で刺激して、T細胞刺激試験の前にDCの発達および成熟を評価した。R848 (50 μM)およびBCG (1:10)は、NTCおよびATCから成熟MoDCを顕著に誘導した(図14)。図14は、刺激されていない組織構築体(TC)と比べての逆遊出した成熟MoDCの増加倍率によって成熟が明らかにされたことを示す。精製された新生児および成人CD33+ Moは、TCへ遊出し、刺激なしでまたはR848 (TLR7/8; 50 μM)もしくはBCGワクチン(体積比1:10)で刺激して48時間培養した。方法の項において記載されたようにフローサイトメトリーおよび生体染色によって、TCあたりの、逆遊出した生存成熟DCの数を数え上げた。
共焦点顕微鏡検査によって、BCGをパルスしたNTC由来のMoDCが樹状形態を有し、HLA-DRの表面発現を上方調節したことが示された(図15)。NTCおよびATCにおいて、精製された新生児のおよび成人のCD33+ Moをコロニー形成させ、これをその後、刺激なしでまたはBCG (体積比1:10)を添加して血漿中で培養した。48時間後、方法に記載されているように、逆遊出したMoDCを収集し、透過処理し、HLA-DR、アクチンフィラメントおよびDNAについて染色し、共焦点顕微鏡検査によって分析した。BCG刺激は、MoDC成熟の誘導と一致し、HLA-DR分子の表面局在に関連していた。
ヒトコラーゲンを、完全にヒト化された細胞外マトリックスを産生するように改変することができる。MoDC-リンパ球間の相互作用を研究するために、完全にヒト化されたTCを開発した。そのようなヒト化されたTCは、異種(ウシ)成分（例えば、FBSおよびウシコラーゲン）による潜在的な免疫応答を回避する。完全にヒトのTCを開発するうえで、I型ヒトコラーゲンは、通常は未成熟な状態で線維芽細胞により産生され、細胞付着にいっそう適した形態には、グリコシル化を介した成熟を要することが知られている [17, 18]。最も商業的な供給源の成熟ヒトコラーゲンは、死体ドナーから抽出され、高価であり、かつ高レベルの内毒素を含有するので、TCの作出で用いるために、大量の、純粋な、内毒素を含まないコラーゲンをインビトロで成熟しうるかどうかを評価した。この目的を達成するために、糖化促進剤(pro-glycation agent)であるグルコース-6-リン酸(G6P)の効果を、ヒトコラーゲンクッションおよびHUVEC細胞付着に関して評価し、2、3および5日間、50 mM、100 mMおよび225 mM G6P中でのヒトコラーゲンのインキュベーションについて比較した。ヒトI型コラーゲンを5日間のコラーゲン成熟のため50 mM、100 mMおよび225 mMのpH中性化グルコース-6-リン酸で処理した。225 mM G6Pで5日間成熟したコラーゲンを含有するマトリックスは、HUVECの播種1日以内に完全にコンフルエントな「石畳状の」内皮単層を作出した。ウシコラーゲンを含有する細胞外マトリックスにFBSを用いることでは、1日ではコンフルエントなHUVEC層を得られない。対照的に、G6Pで成熟したヒトコラーゲンクッションを用いることにより、HUVECは、同等の播種密度を用いて1日後にコンフルエントな単層を迅速に樹立することが可能になり、これは、50% (体積比)のヒト新生児の、加熱処理された乏血小板プール血漿(HI-HNPP)を含めることで、完全にヒトのTCをもたらす。5日間、225 mMのG6P中でのコラーゲンのインキュベーションが、完全にコンフルエントな「石畳状の」内皮細胞単層を作出することが分かった(図16)。さらに、HUVEC細胞は、熱で不活化されたヒト新生児の乏血小板プール血漿(HI-HNPP)を用いてG6P処理ヒトコラーゲン上にコンフルエントな単層を迅速に樹立した。注目すべきことに、TC調製でのこれらの改変によって完全にヒトの構築体が提供され、それにより異種(ウシ)成分の潜在的な影響なしに適応性免疫応答の研究が可能になるだけでなく、コンフルエントなHUVEC単層を得るために必要とされる時間枠が、およそ5日(ウシコラーゲンクッション/FBS)からおよそ1日(インビトロで熟成されたヒトコラーゲン/HI-HNPP)へと大幅に短縮される。図23および24を参照されたい。
BCGをパルスしたMoDCは、自家ナイーブリンパ球の増殖を増強する。MoDC-リンパ球間の相互作用をモデル化するため、刺激なしまたはBCGで刺激した、CD33+Moがコロニー形成したヒトコラーゲンに基づくTCからMoDCを収集し、その後、DC:T細胞の比率1:10で自家ナイーブCD4 T細胞(陰性選択、99% CD3+CD45RA+)と共培養した(図17)。CD33 Moがコロニー形成したNTCおよびATCを、刺激なしで(例えば、自家血漿だけで)または10分の1希釈のBCGで発達させた。TC由来のMoDCをその後、DC:Tの比率1:100および1:10で自家ナイーブCD4+ CD45RA+ T細胞と共培養した。リンパ球の増殖を、収集18時間前に3H-チミジンを添加することにより共培養3、5および7日目に評価した。リンパ球の増殖(3H-チミジンの取込み)を対照群(刺激なし、T細胞のみ、およびT細胞のみ＋BCG)について共培養3、5および7日目に評価したところ、増殖は無視できるほどであった。注目すべきは、BCGをパルスした成人MoDCと同様に、BCGをパルスした新生児MoDCは、自家新生児ナイーブCD4 T細胞の強力な増殖を刺激した。
DC:T細胞共培養物由来の培養上清のサイトカイン分析。ナイーブCD4 Tリンパ球の刺激におけるTC由来のMoDCのエフェクタ機能をさらに特徴付けるため、DC:T細胞共培養物によるサイトカイン産生を分析した。全ての新生児MoDC-リンパ球共培養物は、Th2極性化サイトカインIL-4の恒常的放出およびIFN-γ産生の障害を示したが、BCGで刺激されたMoDCだけが、BCGをパルスしたATC由来のMoDC:リンパ球共培養物のものに匹敵する検出可能なレベルのIL-2および強力なTNF-α産生を示した(図18)。BCGをパルスしたCD33がコロニー形成したNTCおよびATCに由来するMoDCを、ナイーブ自家CD4+CD45RA+ T細胞と共培養した。インキュベーション後、(図18A) IFN-γ、(図18B) IL-2、(図18C) IL-4、および(図18D) TNF-αを含む多重サイトカイン分析のために培養上清を回収した。
自家ナイーブCD4 Tリンパ球の増殖に及ぼすワクチンの効果。次に、BCG、PCVおよびHBVをパルスしたTC由来のMoDCが自家ナイーブTリンパ球の増殖を誘導する能力を比較した。評価した3つのワクチンのうちBCGワクチンを接種したNTCおよびATCが、最も強いナイーブリンパ球増殖誘導能を示した(図19)。3H-チミジン取込みアッセイ法に関してBCG、PCVおよびHBVワクチンの能力を比較するため、インビボで用いられる相対的な体積用量にしたがってTCを刺激し、これにより、その抗原投与量に基づいた結果の潜在的な歪みを回避した。TCあたり50 μLの最終体積で、BCG (体積比1:20)、HBVおよびPCV (ともに1:2希釈の体積比で)。非刺激群により得られた応答に対して正規化することにより予備結果(N=3〜5人のドナー)を比較したところ、BCGワクチンを接種したNTCおよびATCが、最も強いナイーブリンパ球増殖誘導能を示した。PCVをパルスしたTC由来のMoDCは、中間レベルのリンパ球増殖を誘導した。3日目の後にHBVをパルスしたNTC由来のMoDCは不十分な刺激能を示したが、HVをパルスしたATC由来のMoDCはより強力な誘導を示した。PCVは、NTCおよびATCの両方について中間レベルのリンパ球増殖を示した。HBVに関して、ATCは3日目の後にリンパ球増殖を示したが、しかしHBVをパルスしたNTC由来のMoDCは無視できるほどのリンパ球増殖を誘導しただけであった。
NTC由来のMoDC:リンパ球の共培養により、ワクチン誘導性のサイトカイン分極化の特徴付けが可能になる。NTCは可溶性メディエータの放出の測定に適している。実際に、7日間のMoDC:リンパ球共培養の各時点で培養上清を回収して凍結保存し、サイトカインの産生を26-Cytokine多重ビーズアレイによって分析した(Milliplex, Millipore; 図25)。
ワクチンをパルスしたTC由来のMoDCを、自家血漿(体積比10%)の存在下で自家ナイーブCD4+ T細胞と7日間共培養した。培養上清を3、5および7日目に収集し、サイトカインを蛍光定量的ビーズアレイ(Milliplex, Millipore)によって測定した。対数レーダープロットは10〜10,000 pg/mLに及び、機能区分によってサイトカインを分類する: 抗炎症性IL-10; Th1極性化IL-2、IL-3、IL-12(p70)、TNFおよびIFN-γ; Th2極性化IL-4、IL-5、IL-6およびIL-13; ならびにTh17極性化IL-17。色付きの星印は、試験条件(図上の色凡例)に適合し、非刺激MoDCおよびワクチンをパルスしたMoDCの比較を示す。条件によって年齢層間のサイトカイン産生を比較する類似の分析によって、全ての条件について成人よりも新生児が顕著に多くのIL-4を分泌することが示唆された。1群あたりN = 5; 2元配置ANOVA (ボンフェローニ事後検定)は所見に適合した; ＊<0.05; ＊＊<0.01; ＊＊＊<0.001。
新生児のものの共培養物は、成人のものの共培養物よりも顕著に高いIL-4の恒常的分泌、つまり新生児の免疫応答のTh2極性化に寄与しうる傾向を示した。全体的に見て、より高いリンパ球増殖に応じて、BCGをパルスしたMoDCとの自家リンパ球培養物は、HBVまたはPCVをパルスしたMoDCとの共培養物の場合よりも高レベルの多様なサイトカインを産生した。例えば、5日目の時点で、NTC由来のBCGをパルスしたMoDCを含有する新生児のものの共培養物は、有意かつ相当な濃度のTh1 (TNF-αおよびIFN-γ)、Th2 (IL-6、IL-13)、ならびに抗炎症性(IL-10)サイトカインを産生した(図25B)。BCGをパルスしたMoDCおよび自家リンパ球を含有する新生児のものの共培養物によるTh1-エフェクタサイトカインTNF-αおよびIFN-γの産生は、これらのサイトカインがインビボでBCGにより誘導されるので、特に注目に値する。
NTCは、抗原特異的免疫応答をモデル化するために用いることができる。NTC開発の重要な目標は、抗原特異的免疫応答をモデル化することである。本発明者らは最初の試験ワクチンとしてBCGを選択し、インビトロでの免疫および抗原特異的免疫応答の検出という概念の実証を展開した。BCGをパルスしたTC-MoDCを自家ナイーブT細胞と共培養し、その後、第2ラウンドの刺激には、単一の関連抗原をパルスした自家TC-MoDCを利用した。本発明者らは、MTのほかにBCGに存在する抗原85複合体(天然に存在する異なる3種の変種のうちの1つAg85C)を選択し、陰性対照として、本発明者らは、MTにのみ存在するESAT-6を選択した。本発明者らは次に、(比率1:10のBCG-TC-MoDCおよび自家ナイーブCD4 T細胞の共培養から) 13日間増殖させたT細胞を得て、それらを、Ag85CまたはESAT-6のどちらかで刺激された新しい自家TC-MoDCとともに1:7の比率で再プレーティングした(図26)。手短に言えば、BCGをパルスしたTC-MoDCによって刺激されて増殖したT細胞5,000個を、その後、自家細胞でコロニー形成された第2/後続のTCに由来する、自家Ag85複合体またはESAT-6で(各0.9 μMで)パルスした自家TC-MoDC 714個と共培養した。代表的な実験は四つ組で行った(＊p < 0.05, 対応のないt検定, 両側)。
インビトロでのリンパ球増殖性のリコール応答のために単一の抗原を用いたこれらの結果は、新生児ワクチンのT細胞依存的な抗原性を試験するために本明細書において具現化されたTCを用いることの正当性を立証している。11日間の培養後、明らかにAg85C特異的な増殖応答が顕著であった(図26)。本発明者らは、この結果を、NTCおよびATCによる単一抗原特異性の実現可能性の概念実証と見なす。
この例示的な研究は、外因性サイトカインの添加なしに自家血漿条件下でヒト新生児および成人のMoDCの自律的作出を可能にする、完全にヒトの三次元マイクロ生理的細胞培養系の開発について報告するものである。この系により、初めて、アジュバントおよびワクチンに対する新生児MCおよび自律的に発達したMoDCの応答の照合が可能になる。多数の研究により、全血でのまたは単核細胞画分としての新生児の白血球の応答が特徴付けられており、新生児のおよび幼児のMoの異なる性質への重要な洞察が提供されている[5, 15, 19]。しかし、新生児のAPCに焦点を合わせた研究の数は、はるかにもっと少ない[4]。これらの報告は、高濃度のGM-CSFおよびIL-4の外因性投与とともにウシ胎仔血清の存在下において作出されたMoDCについて主に研究しており、これらの細胞と、インビボに存在するものとの関係を不確かなままにしている。外因性サイトカインの添加なしにMoDCの強力な産生を達成できることが分かった。
NTCに適用されたCBMCはATCに適用されたPBMCと比べて障害された遊出を示した。この相違は、新生児白血球の遊走の、記述された障害に関連している可能性がある[20]。炎症誘発性サイトカインの表現型および高い抗原提示能を有することが知られている成人CD16+ Moは、TCに選択的にコロニー形成する[9]。対照的に、本研究において、新生児CD16+ Moは成人CD16+ Moと比べて障害された遊出を示し、恐らく、新生児Moの抗炎症性の表現型を反映していた。それにもかかわらず、新生児MoDCの強力な逆遊出がほぼ同等の数のRT MoDCをもたらし、それによってインビトロでの研究に十分であった。NTC由来のMoDCは、共焦点顕微鏡検査によって典型的なDC形態のほかに低発現のCD14および高HLA-DRを示した。
白血球を培養するために用いられる血漿のタイプおよび濃度は、インビトロでのその挙動に影響を与えることが本明細書で実証された。TC中の血漿の割合は、逆遊出した白血球の数を調節し、血漿の比率依存的に逆遊出を低減した。さらに、細胞外培地のタイプは、刺激誘導性のTCサイトカイン産生に著しい効果を及ぼした。事前の研究において、本発明者らは、ヒト新生児血漿が全血におけるTLR2媒介性のMo TNF-α誘導を阻害することを実証した[15]。したがって、成人血漿、加熱処理されたプールされた成人AB血清、ウシ胎仔血清または市販の無血清培地のような非自家培地の使用により、MCがコロニー形成したNTCにてTLR2アゴニストPam3Cysk4によるサイトカイン誘導の劇的な増加がもたらされた。したがって、NTCおよびATCは、自律的に作出されたMoDCの挙動に及ぼす可溶性の生理学的因子の影響の評価を可能にするプラットフォームである。
NTCは、ワクチン製剤の反応性効果を評価するためのインビトロのモデルを提供する。例えば、全細胞百日咳を含有する五価の「EASYFIVE」ワクチンの添加は、TC HUVEC単層へのかなりの損傷を誘導した。全細胞百日咳はその後、発熱および熱性発作の高発生率のため、米国市場から除外された[21]。
BCGは、NTCにおいて特に強力な免疫応答を誘導した。BCGをパルスしたMoDCは、副刺激分子の上方調節およびサイトカインの産生を示した。さらに、BCGでパルスすることによって、NTC由来のMoDCは、自家ナイーブリンパ球の増殖を増強することができた。インビトロで新生児のAPCおよびリンパ球を強力に活性化するBCGの能力は、幼少時に播種性結核感染を防ぐ出生時の免疫応答を誘導するその能力に対応しうる[22]。実際に、BCGはインビボにおいてヒト新生児でのTh1極性化免疫応答を誘導することが分かった[23]。注目すべきは、BCGはまた、恐らく非特異的な免疫増強効果によって、結核とは関係ない死亡率を低減しうる[24]。新生児APCおよびリンパ球の活性化の、BCGによる強力な誘導は、そのような防御に寄与しうる。
免疫記憶を伝えるTCの能力を示すための研究を行った。最近になって、自家記憶CD4 T細胞応答に関する研究を開始した(年齢層あたりのドナーN= 1)。成人ドナーはHBVをワクチン接種され、PPD陽性(TB検査)であった; 新生児ドナーはワクチンを受けていない。T細胞は、記憶T細胞およびナイーブT細胞を含む陰性選択されたCD4+ T細胞であった。TCにインビトロで、10分の1および100分の1希釈のワクチンBCGおよびHBVをワクチン接種した。RT Mo-DCを収集し、その後、10%の自家PPPを含有する培地により無傷の自家CD4+ T細胞と共培養した。NTCはATCと比べてHBVに対する非常に低いリンパ球増殖応答を有することによりインビボで再現された(データは示されていない)。それにもかかわらず、新生児CD4+ T細胞は、培養の時間経過の後期にBCGに応答することができた(選択されたナイーブT細胞での所見に適合していた)。BCGに対するATCの応答は、非常に強く、成人ドナーPPD陽性の記録と一致していた。
インビボで関連性のある免疫応答をモデル化することを目指して生理的関連性を最適化するために、いくつかのNTCデザイン特性を選択した: (A) インビトロでの免疫応答が試験化合物またはワクチン抗原に対するものであり、かついずれの他家成分/異種成分に対するものでもないことを確実にする、ヒト細胞外マトリックス、年齢特異的な初代MCまたはMoおよび自家ナイーブTリンパ球を含むヒト成分を用いること、(B) 強力な免疫調節特性を有する自家血漿を用いること[2]、ならびに(C) 評価のためにGMP等級のワクチン製剤および内毒素を含まない成分を用いること。NTCのこれら新規の特徴を図20に示し、詳細に記載している。表3を参照されたい。
重要なことに、開示した組織免疫工学によって、インビボでの新生児免疫応答の重要な特徴を再現するTC系が作出された: (A) 白血球遊走の障害[20]、(B) 血漿の免疫調節効果[25]、(C) IFN-γ産生の典型的障害を含む、偏ったサイトカイン産生[12]、(D) 反応性ワクチン(全細胞百日咳を含有する)の毒性効果[21]、および(E) 自家ナイーブTリンパ球の増殖を誘因する、BCGをパルスしたMoDCの能力の著しい増加を含む、出生時に有効であることが知られているワクチンBCGによる強力な刺激[22]、および(F) 有効性には複数回の追加接種を要するHBVまたはPCVワクチンでパルスされたMoDCに応じた比較的少ないリンパ球増殖[2]。
結論として、自家血漿条件下でマイクロ生理的なTCにおいて自律的に発達したヒト新生児MoDCおよび成人MoDCが、本研究によって初めて特徴付けらる。年齢特異的な免疫応答を評価するための新規のプラットフォームとして、NTCは新生児免疫学の研究におけるかなり大きな進歩に相当し、これによってワクチンの安全性および有効性をモデル化し、その結果、新生児および乳児に合わせた新規のワクチン製剤の開発の情報を与えることができる。
本明細書においておよび本明細書を通じて引用される参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
参考文献
参考文献
（表１）略語
（表２）ヒト新生児および乳児において認可および/または試験されたワクチン。新生児は出生時から28日齢までである; 乳児は1ヶ月齢から2歳までである。
（表３）
Claims (192)
- a. 内皮細胞を、単層を得るのに十分な期間、細胞外マトリックスのクッション上で培養する段階;
b. 内皮細胞の単層にヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
c. ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間、培養する段階;
d. 段階cにおける期間の後に、遊出しなかったMCを除去する段階;
e. 段階dの培養物および細胞外マトリックスのクッションに、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階;
f. ヒトMCが内皮細胞の単層から逆遊出することを可能にするのに十分な期間、該培養物をインキュベートする段階; ならびに
g. 該作用物質の存在下で遊走樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階
を含む、方法。 - 細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
- コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
- コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
- コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項2に記載の方法。
- コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項3に記載の方法。
- コラーゲンが糖化されている、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項3、6、7または8のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項9に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で最大5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
- フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項12に記載の方法。
- 内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がヒト新生児血漿の存在下で培養される、請求項14に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項14または15に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項14、15または16に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項18に記載の方法。
- コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項18または19に記載の方法。
- 単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 単層を得るための期間が約24時間〜3日間である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項15〜22のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項15〜24のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が、ヒト臍帯血、胎盤血または循環末梢血から得られる、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項15〜27のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿がヒト新生児血漿である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、新生児、成人、青年または小児由来である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMC細胞が、予め凍結保存された細胞である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがヒト新生児MCである、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項39に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、2人以上のドナーからプールされていない、請求項39に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCまたはヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球が、ヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項44に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項45に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項45〜46のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、GM-CSFの存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、IL-4の存在下では培養されない、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が、ヒト臍帯血、胎盤血または骨髄から得られる、請求項39〜51のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項39〜52のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが内皮細胞の単層から自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質が、樹状細胞へと成熟するようにヒトMCの発達を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質がワクチン製剤である、請求項57に記載の方法。
- 前記作用物質がアジュバントである、請求項57に記載の方法。
- 前記作用物質が病原体である、請求項57、58または59に記載の方法。
- 前記病原体が、その断片/不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項61に記載の方法。
- ヒト新生児乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト新生児乏血小板血漿が段階dにおいて約100%で用いられる、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項1〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 内皮細胞の単層からのヒトMCの逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約48時間である、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト新生児樹状細胞の集団をインビトロで調製する方法：
a. 以下を含む組織構築体に、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階:
i. 細胞外マトリックスのクッション;
ii. 該クッションの上の単層のヒト内皮細胞; および
iii. ヒト内皮細胞の単層を通って遊出し、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成したヒト単核細胞;
b. 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織培養物をインキュベートする段階; ならびに
c. 該作用物質の存在下で抗原提示樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階。 - ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項73に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項74に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項75に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項73〜77のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項73〜78のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項73〜80のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/もしくはCD14+単球またはヒトMCならびにヒト乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が予め凍結保存されている、請求項73〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激しうる任意の作用物質である、請求項73〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質が、抗原提示樹状細胞へのヒトMCの発達および転換を誘導または刺激するその能力について試験される任意の作用物質である、請求項73〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記作用物質がワクチンである、請求項86に記載の方法。
- 前記作用物質がアジュバントである、請求項87に記載の方法。
- 前記作用物質が病原体である、請求項86、87または88に記載の方法。
- 前記病原体が、その断片もしくは不完全な部分またはインタクトな病原体全体である、請求項90に記載の方法。
- ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項73〜91のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて少なくとも50%で用いられる、請求項73〜92のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて約50%〜100%で用いられる、請求項73〜93のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト乏血小板血漿が段階bにおいて100%で用いられる、請求項73〜94のいずれか一項に記載の方法。
- MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、少なくとも24時間である、請求項73〜95のいずれか一項に記載の方法。
- MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、約24〜48時間である、請求項73〜96のいずれか一項に記載の方法。
- MCの、内皮細胞の単層を越える逆遊出を可能にするのに十分な期間が、48時間である、請求項73〜97のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト新生児乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤を含有しない、請求項73〜98のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがヘパリンを用いて調製される、請求項73〜99のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿、ヒト乏血小板血漿またはヒト血清アルブミンがキレート剤の非存在下で調製される、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、抗原に対するヒト抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
a. 請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1集団と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
b. CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
c. 段階bの培養物由来の活性化T細胞を、ヒト乏血小板血漿の存在下で、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第2集団に導入する段階;
d. 段階bの培養物における活性化T細胞をさらに活性化するのに十分な期間、段階cの樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
e. サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。 - ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞がCD45RO陰性である、請求項102に記載の方法。
- ヒト新生児CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞、樹状細胞およびヒト新生児乏血小板血漿が、それらが1人のドナーに由来することを意味する自家性である、請求項103に記載の方法。
- ヒト乏血小板血漿が熱で不活化されていない、請求項102、103または104に記載の方法。
- 培養物におけるナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも1日間である、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
- 培養物における新生児ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間が、少なくとも7日間、約7日間、または約7〜15日間である、請求項102〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 評価される作用物質が、請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第1および第2集団を産生するためにインビトロで用いられる作用物質である、請求項102〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞増殖について段階eの細胞を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖または細胞数の増加によって、前記抗原がヒトナイーブ抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項102〜105のいずれか一項に記載の方法。
- 段階dの培養物における細胞を、サイトカインおよび/または細胞増殖の分析の前に、段階aおよびdにおけるヒト新生児樹状細胞の第1および第2集団の場合と同じ作用物質に曝露された請求項1〜101のいずれか一項に記載のヒト樹状細胞の第3集団に曝す段階をさらに含む、請求項102〜109のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト樹状細胞の第3集団も、評価される同じ作用物質で産生される、請求項110に記載の方法。
- 分析されるサイトカインが、IL-1、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、IFN-γおよびTNF-αからなる群より選択される、請求項102〜111のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の段階を含む、抗原に対するヒトナイーブ抗原特異的免疫応答の誘発における作用物質の有効性をインビトロで評価するための方法：
a. 以下の段階によって予め調製された組織構築体に、ヒト乏血小板血漿の存在下で作用物質を導入する段階:
細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
コラーゲンの成熟を可能にするのに十分な期間、グルコース-6-リン酸の存在下で細胞外マトリックスをインキュベートする段階;
細胞外マトリックスのクッションにヒト内皮細胞を播種する段階;
ヒト血漿の存在下で単層へとヒト初代内皮細胞を培養する段階;
ヒト血清アルブミンの存在下でヒト内皮細胞の単層を有する培養ウェルにヒト単核細胞(MC)を導入する段階;
ヒトMCがヒト内皮細胞の単層から自律的に遊出することを可能にするのに十分な期間インキュベートする段階; および
遊出しなかったヒトMCを除去する段階;
b. 遊出したヒトMCがヒト内皮細胞の単層を越えて逆遊出するのに十分な期間、組織構築体をインキュベートする段階;
c. 該作用物質の存在下で成熟樹状細胞へと発達した逆遊出したヒトMCを回収する段階;
d. 段階cの成熟樹状細胞と、ヒトCD4+ CD45RA+ナイーブT細胞とを、ヒト乏血小板血漿の存在下で共培養する段階;
e. CD4+ CD45RA+ナイーブT細胞の活性化を引き起こすのに十分な期間、樹状細胞およびナイーブT細胞の共培養物をインキュベートする段階;
f. 段階cのヒト成熟樹状細胞の第2集団を、段階eの培養物における活性化したT細胞に導入する段階;
g. 段階eの培養物におけるすでに活性化したT細胞のさらなる活性化を引き起こすのに十分な期間、段階fのヒト成熟樹状細胞および活性化T細胞を共培養する段階; ならびに
h. サイトカインについて該共培養の培地を分析する段階であって、樹状細胞の添加がない場合と比べてのサイトカインの存在の増加によって、該作用物質がヒトナイーブ新生児抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、段階。 - 段階hの細胞の細胞増殖を分析する段階をさらに含み、樹状細胞の添加がない場合と比べての細胞増殖の増加によって、該抗原がヒト免疫応答を刺激するのに有効であることが示される、請求項113に記載の方法。
- サイトカインおよび細胞増殖の分析の前に、段階hの培養物における細胞に、段階a〜段階eにしたがって調製された逆遊出した樹状細胞の第3のバッチを導入する段階をさらに含む、請求項114に記載の方法。
- 以下の段階を含む、組織構築体を調製する方法：
a. 細胞外マトリックスのクッションを提供する段階;
b. 細胞外マトリックスのクッション上でヒト内皮細胞を、該細胞が単層を形成するのに十分な期間、ヒト血漿の存在下で培養する段階;
c. ヒト内皮細胞の単層にヒトMCを添加する段階;
d. MCがヒト内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成するのに十分な期間、MCを培養する段階。 - 細胞外マトリックスのクッションがコラーゲンを含む、請求項116に記載の方法。
- コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
- コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
- コラーゲンがブタコラーゲンである、請求項117に記載の方法。
- コラーゲンが1型コラーゲンである、請求項116〜120のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンがヒト1型コラーゲンである、請求項121に記載の方法。
- コラーゲンが糖化されている、請求項116〜121のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で成熟させたヒトコラーゲンである、請求項116、120、121または122のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で少なくとも48時間成熟されている、請求項124に記載の方法。
- ヒトコラーゲンが、グルコース-6-リン酸の存在下で、最大5日間、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間成熟させたヒトコラーゲンである、請求項124に記載の方法。
- 細胞外マトリックスのクッションがフィブロネクチンをさらに含む、請求項116〜126のいずれか一項に記載の方法。
- フィブロネクチンがヒトフィブロネクチンである、請求項127に記載の方法。
- 内皮細胞がヒト初代内皮細胞である、請求項116〜128のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がヒト血漿の存在下で培養される、請求項129に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞が単一のドナーから得られる、請求項129または130に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がヒト臍帯から得られる、請求項129、130または131に記載の方法。
- ヒト初代内皮細胞がコンフルエントな単層へと培養される、請求項129〜132のいずれか一項に記載の方法。
- コンフルエントな単層が少なくとも90%コンフルエントである、請求項133に記載の方法。
- コンフルエントな単層が約90%〜100%コンフルエントである、請求項133または134に記載の方法。
- 単層を得るための期間が少なくとも24時間である、請求項116〜135のいずれか一項に記載の方法。
- 単層を得るための期間が約24時間〜5日間である、請求項116〜136のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が、新生児または成人の血漿である、請求項116〜137のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項138に記載の方法。
- ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項138に記載の方法。
- ヒト血漿が、2人以上のドナーからプールされた血漿である、請求項138〜140のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト新生児血漿がヒト臍帯血から得られる、請求項138〜141のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項138〜142のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が少なくとも40%で用いられる、請求項116〜143のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が約40%〜100%で用いられる、請求項116〜144のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿が約50%で用いられる、請求項116〜145のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、新生児または成人の単核細胞である、請求項116〜146のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが1人のドナーに由来する、請求項116〜147のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが2人以上のドナーからプールされていない、請求項116〜148のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが、予め凍結保存された細胞である、請求項116〜149のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト新生児MCがヒト臍帯血から得られる、請求項147〜150のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがヒトCD33+かつ/またはCD14+単球である、請求項116〜151のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が1人のドナー由来である、請求項152に記載の方法。
- ヒトCD33+かつ/またはCD14+単球が2人以上のドナーからプールされていない、請求項152に記載の方法。
- ヒト新生児CD33+かつ/またはCD14+単球がヒト臍帯血から得られる、請求項152〜154のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがヒト血清アルブミンの存在下で培養される、請求項116〜155のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項156に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項155または156に記載の方法。
- ヒト血清アルブミンが、臨床等級のヒト血清アルブミンである、請求項155〜158のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが外因性サイトカインまたは免疫応答刺激剤の存在下では培養されない、請求項116〜159のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがGM-CSFの存在下では培養されない、請求項116〜160のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCがIL-4の存在下では培養されない、請求項116〜161のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、少なくとも0.5時間である、請求項116〜162のいずれか一項に記載の方法。
- MCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約0.5時間〜4時間である、請求項116〜163のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトMCが内皮細胞の単層を通って自律的に遊出して細胞外マトリックスのクッションにコロニー形成することを可能にするのに十分な期間が、約1.5時間〜2時間である、請求項116〜164のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血漿がインタクトな血漿である、請求項116〜165のいずれか一項に記載の方法。
- インタクトなヒト血漿が、血小板が枯渇していない、請求項116〜166のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項116〜167のいずれか一項に記載の方法によって作出された組織構築体。
- a. 細胞外マトリックスのクッション;
b. 該クッションの上の単層のヒト内皮細胞; および
c. ヒト内皮細胞の単層を通って遊出し、かつ細胞外マトリックスのクッションに埋まってコロニー形成したヒト単核細胞
を含む、組織構築体。 - コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項169に記載の組織構築体。
- ヒトコラーゲンがI型である、請求項170に記載の組織構築体。
- ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項171に記載の組織構築体。
- a. 組織培養ウェル;
b. コラーゲンを含む細胞外マトリックス; および
c. グルコース-6-リン酸
を含む、キット。 - ヒト初代内皮細胞をさらに含む、請求項173に記載のキット。
- 新生児または成人のものでありうるヒト血漿をさらに含む、請求項174に記載のキット。
- ヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項175に記載のキット。
- ヒト血漿が熱で不活化されていない、請求項176に記載のキット。
- ヒト血漿が熱で不活化されている、請求項176に記載のキット。
- ヒト血漿が2人以上の新生児からプールされた血漿である、請求項176に記載のキット。
- ヒト血漿が予め凍結保存されている、請求項176に記載のキット。
- ヒト血清アルブミンが熱で不活化されていない、請求項175に記載のキット。
- ヒト血清アルブミンが発熱物質を含まない、請求項175に記載のキット。
- 細胞外マトリックスがヒトコラーゲンであることを含む、請求項173に記載のキット。
- ヒトコラーゲンがI型である、請求項183に記載のキット。
- ヒトコラーゲンが糖化されている、請求項184に記載の装置。
- コラーゲンのグリコシル化を達成するのに十分な期間、グルコース-6-リン酸とともにコラーゲンをインキュベートする段階を含む、成熟コラーゲンを調製する方法。
- コラーゲンがヒトコラーゲンである、請求項186に記載の方法。
- ヒトコラーゲンがI型である、請求項187に記載の方法。
- コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が少なくとも48時間である、請求項186に記載の方法。
- コラーゲンの糖化を達成するのに十分な期間が、少なくとも48時間でありかつ最大5日間であり、2〜5日間、2〜3日間、2〜4日間、3〜4日間、4〜5日間、または3〜5日間である、請求項186に記載の方法。
- 請求項186〜190のいずれか一項に記載の方法によって調製された、成熟コラーゲン。
- 糖化されている、請求項191に記載の成熟コラーゲン。
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