KR20020065755A

KR20020065755A - 상피세포의 분리방법과 분리된 상피세포를 포함하는인공피부 구조물 또는 인공진피 구조물의 제조방법

Info

Publication number: KR20020065755A
Application number: KR1020010005934A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 박현숙; 김천호; 강현주; 김창환; 김윤영; 최영주; 이수현
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2001-02-07
Publication date: 2002-08-14
Also published as: KR100648405B1

Abstract

본 발명은 인체의 피부조직 또는 내부 장기조직을 트립신/EDTA 처리함과 동시에 자기교반을 하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면, 분리된 상피세포 집단의 세포 획득율, 콜로니 형성 효율 및 콜로니 크기가 현저히 증가되며, 간세포의 비율이 증가하여 자가이식 혹은 동종이식을 통한 손상된 인체조직의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

상피세포의 분리방법과 분리된 상피세포를 포함하는 인공피부 구조물 또는 인공진피 구조물의 제조방법{Method for isolating primary epithelial cells and reconstructing skin equivalents or dermis equivalents with primary culture cells}

본 발명은 상피세포의 분리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부조직 또는 내부 장기조직을 트립신/EDTA 처리함과 동시에 자기교반(magnetic stirring)하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법에 관한 것이다.

인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘어지는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비한 여러 세포외간물질(extracellular matrix)로 이루어진다.

피부상피세포는 위치한 층에 따라 세포의 연령과 분화 정도가 달라진다. 이는 기저층에 있는 간세포(stem cell)가, 세포분열을 반복함에 따라, 인테그린 리셉터의 활성을 잃으면서 상층부로 이동해가기 때문이다. 상피세포는 위로 올라가면서 더욱 분화하여 맨 상층부에 이르면 핵을 잃고, 케라틴만 남아 이들이 융합되면서 각질층을 형성한다. 피부 상피세포의 주된 기능이 각질을 만들어 체외를 보호하는 것이기 때문에 이들을 각질세포라 부르기도 한다. 각질층은 주기적으로 표피층에서 탈락되고, 기저층 세포들이 세포분열하여 탈락된 세포의 수를 보충함으로써 표피층의 세포 수를 일정하게 유지한다. 기저층에 존재하는 세포는 간세포와 간세포에서 분열한 딸세포(transit amplifying cells)들로 구성되는데, 이들 중 간세포를 식별하는 일은 어려운 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근 간세포의 β1-인테그린(integrin) 과발현과 이로 인한 기저막(basement membrane)에 대한 높은 부착성 등이 딸세포로부터 구별되는 특성이라는 여러 보고가 있었다. β1-인테그린(integrin) 과발현세포(간세포)는 기저층의 망상 융기 영역(rete ridge regions) 상부에 위치한다고 보고되었으며, 이들이 전체 기저세포의 약 4-10%를 차지한다고 알려져 있다(Bickenbach and Chism 1998 ECR 244:184-195; Jones and Watt et al 1993 Cell 73:713-724). 이 세포들을 배양접시에서 배양하면, 높은 콜로니 형성 효율과 느린 세포분열 속도 등 간세포의 전형적인 특성을 보여준다고 한다(Bickenbach and Chism 1998 ECR 244:184-195; Jones and Watt et al 1993 Cell 73:713-724).

간세포는 피부표피층 외에도 모든 상피조직에 존재하는데, 각막의 경우, 각막연부(limbus)라 불리는 부분의 기저층에 존재하는 것으로 알려져 있다. 인체의내부 장기조직 중 식도와 질의 경우에도 간세포는 기저층에 존재한다고 알려져 있다. 위, 소장, 대장처럼 선상(gland) 구조를 형성하는 점막 상피조직의 경우, 상피세포가 다층이 아닌 한 층으로 구성되어 있지만, 이 경우에도 간세포는 선상 구조의 가장 깊은 곳에 자리잡고 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 모든 상피조직의 간세포는 쉽게 노출되지 않는 부분에 깊숙이 숨어있다고 볼 수 있고, 이러한 간세포가 위치한 부분을 함요(stem cell niche)라고 부른다. 따라서 간세포는 다른 세포에 비해 분리가 쉽지 않을 것으로 예상된다.

피부조직 또는 내부 장기조직은 화상, 외상, 궤양 등으로 인해 조직의 일부가 손상될 수 있는데, 이 경우 손상된 조직의 치유를 목적으로 하거나 또는 성형을 목적으로 본인 혹은 타인의 피부조직 또는 내부 장기조직으로부터 상피(각질)세포를 분리, 배양하여 이를 손상된 피부 또는 장기 부위에 이식하는 방법이 사용되고 있다. 이를 위해 상피세포를 효과적으로 분리하는 기술이 절실히 요구된다. 그러나, 분리된 세포 중 간세포의 비율이 높아야만 체외에서의 높은 세포 확장률(expansion potential)과 이식의 성공률을 보장할 수 있다.

그런데, 종래에는, Rheinwald 및 Green이 개발한 세포 분리법(이하, `그린 방법': Green's method)이 초기화 인간 각질상피세포의 분리 및 배양을 위한 통상적인 방법이 되어왔다(Rheinwald and Green 1975). 이 방법에 따르면, 표피세포(epidermal cells)를 부드러운 진탕(shaking)과 함께, 또는 없이, 트립신/EDTA, 또는 트립신을 처리하여 세포를 분리한다. 그러나, `그린 방법'은 연구를 목적으로 한 세포분리에는 충분한 세포획들율을 제공하지만 조직공학적 목적의 세포분리에는 불충분한 세포획들율을 제공한다.

최근에는, 먼저 효소처리로 표피-진피를 분리한 후, 다시 표피를 효소처리 하여 상피(각질)세포를 분리하는 2단계 효소 처리방법(이하 서모라이신 처리법 또는 디스페이즈 처리법)이 도입 되었다(Germain et al 1993 Burns 19:99-104, Simon and Green 1985 Cell 40:677-683). 이 방법은 피부 조직을 서모라이신(thermolysin)(Germain et al 1993 Burns 19:99-104) 또는 디스페이즈(dispase)(Simon and Green 1985 Cell 40:677-683)로 전처리 하여 표피층(epidermis)과 진피층(dermis)을 분리시킨 다음 표피층을 트립신/EDTA 처리하여 개별 표피세포로 분리한다. 서모라이신은 데스모좀(desmosomes)을 파괴하지 않고 수포성 유천포창 항원(bullous pemphigoid antigen)과 라미닌(laminin) 부위 사이에서 피부의 진피-표피 접합을 특이적으로 분리시킨다고 알려져 있다. 서모라이신 또는 디스페이즈에 의하여 진피로부터 표피층을 분리하면 섬유아세포 오염의 기회를 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 그러나, 2단계 효소 처리방법에 의한 경우 서모라이신이나 디스페이즈의 작용을 중단시킬 수 없다는 단점이 있다. 이들 효소는 제거 후에도 효소-기질 복합체로 오랫동안 그 효과가 지속되는 것으로 알려져 있어 세포분리가 종료된 후에도 세포에 손상을 유발할 수 있다. 이러한 가능성은 본 발명자들의 결과에서도 2단계 효소 처리방법으로 분리된 상피세포의 낮은 콜로니 형성 효율(Colony Forming Efficiency: CFE)로 입증되었다(도 4 참조).

그린방법이나 2단계 효소처리방법과 같은 기존의 방법으로 분리한 상피(각질)세포는 초기화 배양 시에 제한된 횟수의 세포 증식(propagation)만을 하고, 자가이식 후 이식세포의 일부만이 환자의 피부에 잔류한다고 보고되고 있고, 이것이 상피세포 이식치료의 큰 문제점으로 대두되고 있다. 이는 아마도 분리된 세포 중 포함된 간세포(stem cell)의 비율이 낮기 때문일 것이다. 종래의 세포 분리방법을 이용하는 경우, 복잡한 망상 융기 구조 및 기저막에 대한 기저세포의 강한 결합능을 고려할 때 효소(트립신) 또는 킬레이팅제 처리 만으로 기저 세포, 특히 간세포를 기저막으로부터 분리시키기 어렵기 때문일 것으로 사료된다. 세포 분리 후 남은 조직의 조직표본이 이를 입증하여 주는데, 즉, 이들 방법으로 세포를 분리하고 남은 조직의 조직표본은 기저세포의 상당한 비율이 분리되지 않고 남아있다는 것을 보여주었다(도 1).

이에, 본 발명자들은 트립신/EDTA 처리에 추가하여 강한 물리적 교반(physical agitation)을 동시에 적용하면 기저세포가 더욱 효율적으로 분리되리라고 가정하였다. 아울러 이 방법으로 간세포의 획득율도 상당히 증가되리라고 예상하였다. 즉, 세포 분리공정에 트립신/EDTA 처리에 부가적으로 자력을 이용한 자기교반(magnetic stirring)을 적용하여 상피세포를 분리함으로써(이하, 자기교반법) 세포 분리방법을 개선하였다. 본 발명자들은 또한 자기교반법이 고농축된(enriched) 간세포(stem cell) 집단을 포함하는 상피세포를 분리하는 효율적인 방법이라는 사실을 입증하기 위하여, 자기교반법과 기존의 세포 분리방법인 `그린 방법', 서모라이신(thermolysin)처리법 및 디스페이즈(dispase)처리법 등 4 가지 세포 분리법에 의하여 피부조직으로부터 상피세포를 분리한 후 세포 획득율, 분리된 세포의 콜로니 형성 효율 및 콜로니 크기(세포수/콜로니)를 비교하였다. 그결과, 본 발명에 의한 자기교반법의 세포 획득율, 콜로니 형성 효율 및 콜로니 크기가 다른 3 가지 세포 분리법에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다.

본 발명의 목적은 종래 세포 분리방법의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 세포 획득율이 현저히 증가되고, 콜로니 형성 효율 및 콜로니 크기(간세포의 비율)가 증가된 새로운 상피세포의 분리방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 분리된 상피세포를 이용하여 이식능력이 뛰어난 생인공피부 또는 생인공진피의 제조방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 분리된 상피세포 또는 생인공피부혹은 생인공진피를 화상, 외상, 궤양 등으로 인해 손상된 피부 또는 내부 장기에 이식함으로써 손상된 피부조직 또는 내부 장기조직을 효과적으로 치료하는 방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 성인 포피조직의 세포 분리과정에 따른 헤마톡실린 & 에오신 염색 사진이고

도 2는 다양한 상피세포 분리방법의 개략도이고,

도 3은 다양한 세포 분리법에 따른 세포 획득율을 나타낸 그래프이고,

도 4는 다양한 세포 분리법에 따른 콜로니 형성 효율을 나타낸 그림이고,

도 5는 다양한 세포 분리법에 따른 콜로니 형성 효율 및 콜로니 형성세포 개수의 상대값을 비교한 그래프이고,

도 6은 다양한 세포 분리법에 따른 각질상피세포의 유동 세포측정법에 의한 β1 인테그린 발현을 나타낸 그래프이고,

도 7은 다양한 세포 분리법에 따른 초기화 각질상피세포의 인볼루크린의 면역형광염색사진이고,

도 8은 다양한 세포 분리법에 따른 초기화 각질상피세포의 인볼루크린, 팬-사이토케라틴, α2 인테그린에 대한 면역형광염색사진이고,

도 9는 본 발명에 따라 분리된 각질상피세포를 섬유아세포와 함께 누드마우스에 이식하는 과정을 나타낸 그림이고,

도 10은 누드마우스에 이식된 각질상피세포와 섬유아세포가 형성한 피부 구조물의 (a)헤마톡실린 & 에오신 염색사진과 (b)팬-사이토케라틴에 대한 면역염색염색사진, (c)바이멘틴에 대한 면역염색염색사진이고,

도 11은 본 발명의 세포 분리법으로 분리한 각질상피세포가 탈표피된 진피상에서 다층상피로 분화한 것을 보여주는 (a)헤마톡실린 & 에오신염색사진과 (b)팬-사이토케라틴에 대한 면역염색사진이고,

도 12는 분리 배양된 섬유아세포를 BAS^TM에 접종하고 14 일 간 배양한 후 섬유아세포의 주사전자현미경사진이고,

도 13은 분리 배양된 섬유아세포를 탈표피된 진피(DED)에 접종하고 21 일 간 배양한 후 섬유아세포의 (a)주사전자현미경사진과 (b)헤마톡실린 & 에오신염색사진이고,

도 14는 분리 배양된 섬유아세포를 인공진피 구조물(Integra^R, Terumdermis)에 접종하고 14 일 간 배양한 후의 헤마톡실린 & 에오신염색 사진이고,

도 15는 분리 배양된 섬유아세포를 인공진피 구조물(Integra^R, Terumdermis)에 접종하고 14 일 간 배양한 후 누드마우스의 등에 implant하는 과정을 나타낸 그림이고,

도 16은 인공진피 구조물 혹은 생인공진피 구조물을 implant하고 28 일 후의이식 부위의 융기정도를 보여주는 사진과 인공진피 구조물(Integra^R, Terumdermis)의 헤마톡실린 & 에오신염색사진이고,

도 17은 도 16의 인공진피 구조물 혹은 생인공진피 구조물의 높이 변화를 보여주는 사진과 도표이고,

도 18은 BAS^TM상에 정적(static)방법으로 혹은 동적(dynamic)방법으로 접종한 섬유아세포의 세포성장과 분열능을 세포밀도를 이용하여 비교한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 피부조직 또는 내부 장기조직을 트립신/EDTA 처리함과 동시에 자기교반(magnetic stirring) 하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 종래의 '그린 방법'(Green's method)을 변형한 것으로서 트립신/EDTA 처리에 의한 효소 작용 뿐만 아니라 강한 물리적 교반에 의한 물리적 힘을 가하여 단일 세포 현탁액을 획득한다.

본 발명에서, 상기 피부조직 또는 내부 장기조직은 동물의 어떤 피부 또는장기로부터 유래될 수도 있으나, 피부조직은 포피(foreskin) 또는 겨드랑이 혹은 엉덩이 또는 유방 혹은 두피 혹은 치골부 또는 음낭으로부터 유래되는 것이 바람직하며, 내부 장기조직은 구강점막 혹은 식도 또는 위장점막 또는 장점막 또는 비강 또는 인후 또는 기관지 또는 신장 또는 요도 또는 자궁 점막 또는 방광 혹은 신장 혹은 각막 또는 질에서 유래되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 트립신/EDTA 처리는 잘 알려진 그린방법에 따라 수행될 수 있다(Rheinwald and Green 1975). 처리되는 트립신/EDTA의 양은 트립신이 0.025-0.25%, EDTA가 0.005-0.02% 인 것이 바람직하다. 트립신/EDTA의 양이 이보다 낮은 경우에는 세포의 분리가 잘 일어나지 않고, 높은 경우에는 세포에 손상을 입혀 생존하는 콜로니의 수가 현저하게 감소한다.

본 발명에서, 상기 자기교반(magnetic stirring)은 10분~4시간동안 60~700rpm이 가능한데, 150-500 rpm의 속도로 하는 것이 바람직하다. 60rpm 이하인 경우에는 세포의 분리가 잘 일어나지 않고, 700rpm 초과인 경우에는 세포에 손상을 입혀 생존하는 콜로니의 수가 현저하게 감소한다. 본 발명의 자기교반은 기저막에 대한 기저세포의 결합능을 약화시켜 세포의 분리를 촉진시킨다.

또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 자기교반법으로 분리된 상피세포를 인공진피 구조물 또는 탈표피된 진피(DED)에 단독으로 또는 섬유아세포와 함께 동시에 혹은 순차적으로 접종하여 생인공피부를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 진피 구조물은 상용화된 어떠한 인공진피 구조물도 사용가능하며, 예컨대, 중화키토산 스폰지 또는 중화키토산/콜라겐 혼합스폰지(MTT사의BAS^TM) 혹은 FDA 허가된 또는 진행 중인 TransCyte^TM및 Dermagraft^TM, (Advanced TissueScience사) 또는 Integra^R(Integra LifeSciences사) 또는 Apligraf^R(Organogenesis Inc.) 또는 Graftskin 또는 Alloderm (LifeCell사) 또는 Terudermis (Terumo Co.) 혹은 Beschitin W (Unitika Ltd.) 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 탈표피된 진피(DED)는 인간의 사체 또는 동물에서 유래되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 바람직하게는 인공진피 구조물에 멜라닌세포, 모낭세포 또는 진피초(dermal sheath)를 함께 접종하여 만들어진 생인공피부를 제조하는 방법이 제공된다.

또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 섬유아세포를 인공진피 구조물 또는 탈표피된 진피(DED)에 접종하여 생인공진피를 제조하는 방법과 이를 상처의 치유를 위해 이식하거나, 조직의 확장이나 성형을 목적으로implant하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 진피 구조물은 상용화된 어떠한 인공진피 구조물도 사용가능하며, 상기 탈표피된 진피(DED)는 인간의 사체 또는 동물에서 유래되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 바람직하게는 인공진피 구조물에 혈관내피세포를 함께 접종하여 만들어진 생인공진피를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 생인공피부 또는 생인공진피의 제조방법에서는, 상기 분리, 배양된 상피세포 및/또는 섬유아세포를 진피 구조물에 1 ×10⁴∼ 1 ×10⁶cells/cm2 scaffold의 농도로 접종(loading)한다. 접종하는 방법은 진탕기(shaker)를 이용하여 플로우(flow)를 주면서 세포를 진피 구조물에 부착시킨 후(dynamic seeding), 진탕기를 이용하여 플로우를 주면서 배양하는 동적 방법(dynamic culture)과 플로우를 주지 않으면서 세포를 진피 구조물에 부착시키고 배양하는 정적 방법(static seeding and static culture)을 모두 사용하였다.

또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 세포 분리방법으로 분리된 상피세포를 단독으로 혹은 진피 섬유아세포와 함께 동물의 손상된 피부조직 또는 내부 장기조직에 이식하여 손상된 피부 또는 내부 장기를 치료하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 본 발명의 세포 분리방법으로 분리된 상피세포 및/또는 섬유아세포를 인공진피 구조물에 접종하여 만들어진 생인공피부 또는 생인공진피를 동물의 손상된 피부조직 또는 내부 장기조직에 이식하여 손상된 피부 또는 내부 장기를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 분리된 세포의 이식방법은 당업계에 잘 알려진 방법(Wang et al 2000 JID 114:674-680)에 따라 자가 이식 또는 동종이식을 하여 수행할 수 있다(실시예 4 참조).

본 발명에서, 상기 피부조직은 화상, 외상, 궤양 등으로 인한 피부 손상 부위뿐만 아니라, 피부 성형이나 외부 조직확대를 위한 부위도 포함한다.

본 발명에서, 상기 내부 장기조직은 구강점막 혹은 식도 또는 위장점막 또는장점막 또는 비강 또는 인후 또는 기관지 또는 신장 또는 요도 또는 자궁 점막 또는 방광 혹은 신장 혹은 각막 또는 질 부위 등을 포함한다.

더욱이, 본 발명에 따라 제조된 생인공피부 또는 생인공진피는 각종 임상적용 또는 연구용 혹은 시험용 모델로 이용될 수 있다. 예를 들면, 화장품 원료의 독성 혹은 효능을 시험하기 위한 모델; 의약품의 피부 투과 시험 혹은 효능 혹은 독성을 시험하기 위한 모델; 발모제의 효능을 시험하기 위한 모델; 상처치유를 연구하기 위한 모델; 세포의 이동 혹은 암세포의 침투 또는 암세포의 전이 혹은 암의 진행을 연구하기 위한 모델; 혈관신생을 연구하기 위한 모델 또는 혈관신생촉진제 혹은 혈관신생억제제의 효능을 시험하기 위한 모델; 세포의 분화 혹은 상피세포와 기질세포와 혈관내피세포의 상호작용 혹은 단백질의 기능 혹은 유전자의 기능을 연구하기 위한 모델 등으로 사용될 수 있다.

본 발명자들은 분리된 상피세포의 세포 획득율, 콜로니 형성 효율 및 콜로니 크기(세포수/콜로니)면에서 본 발명에 따른 자기교반법과 종래의 그린 방법, 서모라이신 처리법(Germain et al 1993 Burns 19:99-104) 및 디스페이즈 처리법(Simon and Green 1985 Cell 40:677-683)을 비교하였다. 그 결과 다른 세포 분리법들에 대한 자기교반법의 세포 획득율의 상대값은 6.3(그린방법), 2.2(서모라이신법) 및 4.9(디스페이즈법)이었고(도 2, 3); 다른 세포 분리법들에 대한 자기교반법의 콜로니 형성 효율의 상대값은 1.2(그린방법), 4.2(서모라이신) 및 1.4(디스페이즈법)이었다(도 4). 포피(foreskin) 한 샘플 당 획득할 수 있는 콜로니 형성 세포(간세포)의 총 개수는 세포 획득율을 콜로니 형성 효율(CFE)로 곱함으로써 얻어지므로,다른 세포 분리법들에 대한 자기교반법의 상대값은 7.2(Greens), 9.2(thermolysin) 및 6.9(dispase)이었다(도 5).

또한, 본 발명에 따른 자기교반법의 경우, 표면 β1 인테그린의 발현 정도가 자기교반법에 의해 오른쪽으로 이동(상승)하였으며(도 6), 이는 간세포의 표지자인 인테그린-브라이트 세포(인테그린을 과발현하는 세포집단)의 비율이 증가되었음을 의미한다. 그러나, 분화(terminally differentiating)한 세포의 표지자인 인볼루크린(involucrin)-양성세포의 비율은 다른 분리법들에 비해 자기교반법이 낮았다(도 7). 결국, 본 발명인 자기교반법에 따른 세포 분리법은 세포 획득율 및 콜로니 형성 효율에서 향상된 결과를 제공하는 반면, 말단 분화는 억제한다는 점에서, 체외에서 세포의 분화-노화는 낮추면서 그 수를 확장하기에 가장 적절한 세포 분리법이며, 아울러 증가된 간세포의 비율로 피부 이식에 사용하기에도 좋은 방법이라 할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 분리 및 배양

초기화 각질상피세포를 성인의 포피(foreskins)로부터 분리하였다. 잘려진(circumcised) 포피를 분리절차를 수행하기까지 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 250 ng/ml의 펀자이존(fungizone: Gibco, Cat. No. 15240-062)을 함유하는 E-배지에 4℃에서 방치하였다. 세포는 외과 수술 후 24시간이내에 분리하였다.

포피 샘플을 5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 인산완충용액(PBS)에 적어도 8회 세척하였다. 대부분의 피하(subcutaneous) 조직을 진피로부터 멸균 외과용 가위로 제거하고, 잔류 피부를 1-2mm 스퀘어 이하의 미세 조각으로 잘게 썰었다.

세포를 분리하기 위한 4 가지 방법은 본 발명에 의한 (i)번의 자기교반법과, 기존방법인 (ii)번의 그린 방법, (iii)번의 서모라이신(thermolysin) 처리법 및 (iv)번의 디스페이즈(dispase) 처리법으로, 참고문헌에 준하여 비교 수행하였다(도 2 참조).

(i) 자기교반법(Magnetic stirring method)

조직의 작은 조각들을 10ml의 0.125% 트립신 및 0.01% EDTA에서 30분 동안 100rpm의 속도로 자기교반 시켰다. 분리된 세포를 20% 우태혈청을 함유하는 10ml의 E-배지에서 세척하여 트립신 효과를 중단시키고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 KGM(Cat No. CC-3111, Clonetics BioWhittaker, Walkersville)에 재현탁시키고, 5*10³/cm²로 접종시켰다. 이 공정은 2회 더 반복하였다.

(ii) 그린 방법(Green's method)

조직의 작은 조각들을 10ml의 0.25% 트립신 중에 5분에 한번씩 보르텍스(vortex)하면서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 분리된 세포를 20% 우태 혈청을 함유하는 10ml의 E-배지에서 세척하여 트립신 효과를 중단시키고, 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 KGM(Cat No. CC-3111, Clonetics BioWhittaker,Walkersville)에 재현탁시키고, 배양물에 5*10³/cm²로 접종시켰다. 이 공정은 2회 더 반복하였다.

(iii) 서모라이신(Thermolysin) 처리법

조직의 작은 조각들을 4시간동안 37℃에서 서모라이신(thermolysin: 250 ㎍/ml, Cat No. P1512, Sigma-Aldrich Korea)으로 처리하였다. 표피층을 분리하고, 세척한 후, 10ml의 0.05% 트립신 및 EDTA에서 30분간 37℃에서 때때로 진탕과 함께 더욱 배양하였다. 분리된 세포를 20% 우태 혈청을 함유하는 10ml의 E-배지에서 세척하여 트립신 효과를 중단시키고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 KGM(Cat No. CC-3111, Clonetics BioWhittaker, Walkersville)에 재현탁시키고, 배양 플레이트에 5*10³/cm²로 접종시켰다.

(iv) 디스페이즈(Dispase) 처리법

조직의 작은 조각들을 4시간동안 37℃에서 디스페이즈 II용액(dispase II solution: 2.4 U/ml, Cat No. 165859, Roche, Mannheim)으로 처리하였다. 표피층을 분리하고, 세척한 후, 10ml의 0.05% 트립신 및 EDTA 중에서 30분간 37℃에서 때때로 진탕과 함께 더욱 배양하였다. 분리된 세포를 20% 우태 혈청을 함유하는 10 ml의 E-배지에서 세척하여 트립신 효과를 중단시키고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 KGM(Cat No. CC-3111, Clonetics BioWhittaker, Walkersville)에 재현탁시키고, 배양 플레이트에 5*10³/cm²로 접종시켰다.

4 가지 다른 방법으로 분리된 세포는 세포 획득율을 확인(발명의 효과 1 참조)한 후, 이상에 기술된 밀도로 커버슬립(coverslip)에 접종하여 실시예 3의 방법으로 순도를 확인(발명의 효과 2 참조)하거나, 인테그린 발현을 확인(발명의 효과 4 참조)하거나, 인볼루크린의 발현을 확인(발명의 효과 5 참조)하였다. 또한, 배양접시에 접종된 세포는 2 주일간 배양 후 콜로니 형성 효율(CFE)을 확인(발명의 효과 3 참조)하거나, 실시예 2에서와 같이 간세포 표지자인 β1-인테그린 bright cell의 비율을 유동 세포측정법으로 확인하거나, 실시예 4에서와 같은 방법으로 누드마우스에 이식하여 피부로의 분화유무를 확인하거나(발명의 효과 6 참조), 실시예 5에서와 같은 방법으로 탈표피된 진피에 접종하여 피부로의 분화유무를 확인하였다(발명의 효과 7 참조).

실시예 2: 형광활성화세포분류법(FACS)

실시예 1에서 얻어진 세포 중 간세포의 지표로 알려진 β1-인테그린을 많이 발현하는 세포군(β1-인테그린 bright cell)의 비율을 확인하기 위하여 형광활성화세포분류법으로 β1-인테그린의 발현정도를 비교하였다. 네 가지 방법에 의해 각각 분리된 세포를 β1-인테그린 항체(chemicon, Cat. No. MAB1959)와 배양 후, FITC-결합된 염소-항-마우스 항체와 함께 45분간 빙상에서 배양하였다. 각 단계사이에, 세포를 5% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. 염색절차의 마지막에, 세포를 1*10⁶세포/ml로 재현탁하고, FACStar^Plus(Beckton Dickinson)를 사용하여 분류(sorting)하였다. 실험당 최소 10,000 세포를 유동 세포측정법(flow cytometirc analysis)으로 분석하였다. 매 실험마다 자연형광 및 isotype 컨트롤을 사용하여 결과를 보정하였다(발명의 효과 4와 도 6 참조).

실시예 3: 면역염색(Immunostaining)

실시예 1에서 얻어진 각질상피세포를 coverslip에서 배양한 후 10분간 4℃로 아세톤/메탄올(1:1)에서 고정시켰다. 분리 배양된 세포가 상피세포만으로 이루어 졌는지 확인하기 위하여 고정된 세포를 상피세포의 표지자인 팬-사이토케라틴 항체로 염색하였다(도 8, 발명의 효과 2 참조). 또한, 분리 배양된 세포가 기저세포의 특징을 나타내는 지 확인하기 위하여 α2 인테그린 항체로 염색하였고(도 8, 발명의 효과 4 참조), 분화되는 세포의 비율을 확인하기 위하여 인볼루크린 항체로 염색하였다(도 8, 발명의 효과 5 참조). 인테그린 α2(chemicon), β1(chemicon)에 대한 마우스 모노클론 항체, 및 팬-사이토케라틴(pan-cytokeratin; 1:10, Novocastra, 각질상피세포의 표지자), 인볼루크린(involucrin; Biomedical Technologies, 1:50, 각질상피세포의 분화표지자)에 대한 래빗 폴리클론 항체를 사용하였다. 초기화 항체로 배양 후에 표준 ABC염색으로 kit(Vector Laboratories)를 이용하여 염색하였다.

실시예 4: 누드마우스에 이식된 각질상피세포의 피부로의 분화

분리된 인체 각질상피세포의 완벽한 피부로의 분화 여부를 생체 내에서(in vivo) 평가하기 위하여 누드마우스에 이식하였다(도 9, 발명의 효과 6 참조). 먼저 직경 1cm의 원형으로 full thickness의 상처를 누드마우스의 등에 낸 다음, 상처에 플라스틱 챔버를 이식한다. 실시예 1에서 배양한 각질상피세포(5 ×10⁵세포/cm²)및 진피 섬유아세포(1 ×10⁵세포/cm²)를 KGM에 혼합한 세포 현탁액을 누드마우스의 등에 미리 이식해둔 챔버 내에 접종하였다. 1주 후에 플라스틱 챔버를 제거하여 표피의 분화를 유도하였다. 재생된 피부조직을 분리하여, 3.7% 포르말린/인산완충용액에 고정하고, 헤마톡실린 & 에오신 및 필요한 조직염색을 실시하여 접종된 세포의 피부로의 분화를 확인하였다(도 10 참조).

실시예 5: 탈표피된 진피(DED)에서 각질상피세포의 계층화된 피부 표피층으로의 분화

세포와 섬유아세포의의 완벽한 피부로의 분화 여부를 생체 밖에서(in vitro) 평가하기 위하여 인체 사체에서 표피를 제거하여 얻은 탈표피된 진피(de-epidermized dermis: DED)에 접종하여 3 주간 배양하였다(도 11, 발명의 효과 7 참조). 1 ×10⁵세포/cm²의 밀도로 진피 섬유아세포를 DED의 아래쪽(dermal reticulus)으로, 하루 뒤 1 ×10⁵세포/cm^{2 의}밀도로 각질상피세포를 위쪽(dermal papillarus)으로 접종하였다. 1주간 물에 잠긴 조건으로, 그리고 2주간 공기-액체 계면에서 E-배지로 배양하였다. 3.7% 포르말린/인산완충용액에 고정하고, 헤마톡실린 & 에오신 및 필요한 조직염색을 실시하여 접종된 세포의 피부로의 분화를 확인하였다.

실시예 6-7

생인공피부는 진피층을 구성하는 섬유아세포를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있는데, 섬유아세포를 포함하는 인공피부의 재건을 위해서는 진피층의 섬유아세포를 분리하여 배양한 후 직접 생체 내에 접종하여 진피층이 형성되도록 하거나(도 9, 10, 발명의 효과 6), 생체 밖에서(in vitro) 인공진피에 접종하여 생인공진피를 만든 후(도 11, 12, 13, 14, 발명의 효과 7), 생체 내에 이식하여야 한다(도 15, 발명의 효과 8).

실시예 6: 인공진피 구조물에 분리 배양한 섬유아세포의 접종

실시예 1의 방법으로 포피의 진피부분을 가위로 잘라내거나(자기교반법, Green's method), 서모라이신이나 디스페이즈 처리 후 분리된 진피층(서모라이신법, 디스페이즈법)을 0.07% collagenase용액 10ml에 담그어 섭씨 37도에서 2시간 배양한 후 피펫팅하여 섬유아세포를 획득한다. 이렇게 분리된 섬유아세포는 F-media(DMEM: F-12=3:1, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)에서 배양한 후 바로 인공진피 구조물에 접종하거나, 냉동저장액 (DMEM 50%, 우태아혈청 40%, DMSO 10%)에 보관했다가 필요한 때에 해동하여 진피 구조물에 접종하였다. 진피 구조물은 지름 8mm에서 100mm의 크기로 무균 후드에서 천공하여 24 well과 지름 100mm 배양접시에 각 각 놓는다. 지름이 8mm인 생인공진피 제조에는 1X10⁵개의 생존 세포(트립판블루용액으로 판정)를 최소 부피의 DMEM배양액으로 희석하여 진피 구조물(MTT사의 Bioartificial skin(BAS^TM)(도 12, 발명의 효과 8 참조), 혹은 Advanced TissueScience사의 TransCyte^TM및 Dermagraft^TM, 또는 Integra LifeSciences사의 Integra^R(도 14, 발명의 효과 8 참조), Artificial skin 또는 Organogenesis Inc.의Apligraf^R, Graftskin 또는 LifeCell사의 Alloderm 또는 일본 Terumo Co.의 Terudermis(도 14, 발명의 효과 8 참조), 혹은 일본 Unitika Ltd.의 Beschitin W), 탈표피된 진피(de-epidermized demis, DED)(도 13, 발명의 효과 8 참조)의 조각 위에 부착할 수 있도록 골고루 접종한다. 5% CO₂와 37^oC 상태에서 3-5시간 방치한 후에 50μl의 DMEM 배양액을 가한 후, 24시간 후에 1ml의 배지를 각각의 well에 첨가하여 배양한다. 이러한 생인공진피는 일정한 혼잡도를 이루기 위하여 3-4주 동안 같은 조건에서 유지하고, 배양액은 일주일에 세 번씩 교환하여 생인공진피를 제조한다.

실시예 7: 생인공진피와 인공진피의 누드마우스에 대한 implant실험

실시예 6에서와 같은 방법으로 Integra^R와 Terudermis에 섬유아세포를 접종하여 만들어진 생인공진피 혹은 Integra^R와 Terudermis(인공진피)를 누드마우스의 등에 implant하고 조직의 확장에 대한 효과를 확인하였다(도 15, 16, 발명의 효과 9 참조). 누드마우스는 무균실에서 사육한다. 누드마우스의 등에 1 cm 길이의 incision을 가로로 낸다. 핀셋을 이용하여 지름 8mm의 생인공진피 혹은 인공진피를 근막 바로 위에 implant하고 수술용 봉합사로 꿰맨 후, 소독된 거즈로 도포한다. 감염을 방지하기 위하여 엠피실린과 스트렙토마이신의 항생제를 식수에 첨가한다. 실험동물의 이식부위의 높이를 매일 검사하며 28 일 후에 치사한다. 실험동물로부터 정상피부와 implant 부위를 모두 포함하는 조직을 분리하여 조직검사 시료로 사용한다. 시료는 3.7% 포르말린/인산완충용액으로 고정한 후 파라핀 블록으로 제작하고, 절편화과정을 거쳐 헤마톨실린 & 에오신용액으로 염색한다.

1. 세포 획득율

세포를 네 가지 방법으로 각 각 분리한 다음, 남은 조직을 고정하고 헤마톡실린 & 에오신염색하여 분리되지 않고 남아있는 세포를 확인하였다. 자기교반법으로 세포를 분리하고 남은 조직에는 잔류하는 세포가 거의 없는 반면, 다른 분리법으로 세포를 분리하고 남은 조직에는 많은 기저세포가 잔류함을 확인 할 수 있었다(도 1). 이와 같은 세포의 완전한 분리는 자기교반에 의한 효과이며, 분리된 세포수를 측정함으로써 더욱 검증되었다(표 1, 도 2, 3). 본 특허에 의한 자기교반법은 그린방법에 비해 약 700%의 세포 획득율의 상승을 나타낸다.

표 1. 세포 획득율 - 포피당 총 세포수(X 10⁷)

방법	자기교반	그린방법	서모라이신법	디스페이즈법
평균¹	4.24 ±0.57	0.68 ±0.07	1.97 ±0.51	0.87 ±0.30
범위	2.34 - 6.76	0.60 - 0.88	0.36 - 3.25	0.11 - 2.24

1: Mean ±SEM

2. 세포의 순도

각질상피세포의 표지자인 팬-사이토케라틴의 항체를 이용하여 분리 배양된 세포를 형광염색한 결과, 분리 배양된 세포 중에 오염(contamination)된 다른 종류의 세포의 존재를 확인하고자하였다. 팬-사이토케라틴-양성 세포(상피세포)의 비율이 100%인 것으로 보아 분리 배양된 세포는 섬유아세포를 포함하지 않는 순수한 각질상피세포군임을 확인할 수 있었다(도 8). 다른 세포 분리법들에 의해 분리 배양된 세포에서의 팬-사이토케라틴-양성 세포의 비율에서도 차이가 없었다. 따라서 자기교반법으로 분리 배양된 세포의 순도는 다른 분리법과 동일하다는 것을 보여준다.

3. 콜로니 형성 효율(CFE)

간세포의 존재는 콜로니-형성 효율(CFE)로 확인 할 수 있다. 자기교반법에 의해 분리된 각질상피세포군의 CFE가 가장 높았다(표 2, 도 4). 특히, 큰 콜로니(>128 세포/콜로니)의 형성빈도(CFE)는 더욱 월등한 증가를 보여주었다(표 2). 이러한 결과는 자기교반법에 의해 분리 배양된 각질상피세포 중에 간세포의 비율이 현저하게 증가함을 나타낸다.

표 2. 콜로니 형성 효율(%)¹

콜로니	자기교반법	그린방법	서모라이신법	디스페이즈법
<32	0.979 ±0.419	0.416 ±0.177	0.265 ±0.123	0.571 ±0.136
>32	1.149 ±0.319	0.947 ±0.345	0.275 ±0.122	0.826 ±0.298
32-100	0.485 ±0.122	0.488 ±0.199	0.163 ±0.076	0.419 ±0.169
>100	0.672 ±0.213	0.461 ±0.147	0.112 ±0.048	0.407 ±0.140

1: 총 10,000 세포가 6-웰 플레이트에 접종되어 2주간 배양되었다.

따라서, 본 발명의 자기교반법에 의해 분리된 세포는 콜리니형성 효율(CFE) 및 세포 획득율면에서 다른 세포 분리법보다 높은 값을 보여주었다. 따라서, 자기교반을 통해 적용된 물리적 힘이 세포 획득율 및 콜로니 형성 효율을 증가시킴을 알 수 있다. 결과적으로, 본 발명에 따르면 포피샘플 당 콜로니 형성 세포의 총 개수는 9배 이상 증가하였다(도 5).

또한, 배양물 내 간세포의 부족으로 유발되는 성인 환자의 피부 이식의 낮은 흡수율(intake rate)은 본 발명의 방법에 의해 보완될 수 있을 것이다.

4. 인테그린 발현

면역염색법에 의한 결과를 보면 분리 배양된 모든 각질상피세포는 기저층에 있는 세포(기저세포)만이 발현하는 α₂인테그린을 발현하였으며(도 8), 이는 세포의 시험관내(in vitro) 팽창이 기저 각질상피세포의 분열에 의한 것임을 보여준다.

β1-인테그린의 유동 세포측정은 각각의 방법으로 분리 배양된 피부각질상피세포 중 간세포의 표지자인 β1-인테그린-브라이트 세포의 비율을 상대적으로 보여준다. 본 발명에 의한 자기교반법에 의해 분리 배양된 피부각질상피세포에서 β1-인테그린-브라이트 세포의 분포가 오른쪽으로 치우쳐진 것으로 보아 이 방법에 의해 분리된 세포군에서 간세포의 비율이 가장 높다는 것을 알 수 있다(도 6).

5. 인볼루크린 발현

각질상피세포의 분화표지자인 인볼루크린은 항상 낮은 빈도로 배양상피세포 중에 발현되는데(도 8) 그 비율은 자기교반법에서 7%, 그린방법에서 7%, 서모라이신법에서 17% 및 디스페이즈법에서 23% 이다(표 3, 도 7). 인볼루크린을 발현하는 세포는 분화-노화하여 사멸하고 만다. 따라서, 본 발명에 의한 자기교반법과 그린방법에 의해 분리 배양된 피부각질상피세포는 시험관 배양 시, 분화와 노화로 인해 세포 수가 감소하는 비율이 서모라이신과 디스페이즈법의 40%임으로 세포수의 확장에 보다 유리함을 나타낸다.

표 3. 인볼루크린 발현의 비율

	자기교반법	그린방법	서모라이신법	디스페이즈법
인볼루크린+세포	7 ±2(%)	7 ±1(%)	17 ±2(%)	23 ±6(%)
P-값			<0.005	<0.05

6. 각질상피세포의 생체내(in vivo) 분화

누드마우스의 등에 이식된 피부 각질상피세포 및 진피 섬유아세포의 현탁액도 표피와 진피, 기저막으로 구성된 완전한 피부를 형성하였다(도 10). 상피세포는 인간-특이적 팬-사이토케라틴에 대해 양성을 나타내었고, 진피세포는 인간-특이적 바이멘틴에 대해 양성인 것으로 보아, 이들 상피세포와 섬유아세포가 모두 인간에서 유래되어 이식해준 세포임을 알 수 있다. 또한, 누드마우스의 상처 부위에서 생존한 이들 상피세포와 섬유아세포는 함께 이동하여, 각 각 표피층과 진피층으로 분화하였음을 알 수 있다.

7. 각질상피세포의 시험관 내(in vitro) 분화

자연상태에서 각질상피세포는 계층화된 다중층 표피로 분화된다. 본 발명의 자기교반법으로 분리 배양한 각질상피세포의 다중층 표피로의 분화능을 살펴보기 위해 탈표피된 진피(DED)에 직접 접종하여 3주 후, 조직을 고정하고, 헤마톡실린 & 에오신염색하였다. 그 결과 팬-사이토케라틴에 대해 양성인상피세포가 다중층을 형성하였다(도 11).

8. 인공진피 구조물에 섬유아세포를 접종하여 제조한 생인공진피

플로우(flow)를 접종시와 배양시에 제공한 동적접종을 사용했을 때, 정적접종을 시행하였을 때에 비해, BAS에 부착된 섬유아세포의 수가 증가하였다(도 16). BAS에 접종된 섬유아세포의 주사전자현미경사진은 부착된 세포가 세포외간질을 풍부하게 분비하고 있음을 확인시켜 준다(도 12). 따라서, 생인공진피의 세포가 기능적으로도 생체 내에서와 같음을 알 수 있다. 한편, DED에 접종된 섬유아세포는 BAS에서 세포가 표면에만 주로 부착된 데에 비해, DED의 깊은 부분까지, 그리고, 비교적 고르게 분포하여 실제 진피층에서 발견되는 것과 비슷한 정도의 세포 혼잡도를 보여주었다(도13). 인테그라(Integra)와 테루더미스(Terumdermis)에 접종된 섬유아세포도 DED에서와 비슷한 혼잡도와 고른 세포의 분포를 보여준다(도 14).

9. 누드마우스에 implant된 생인공진피와 인공진피의 구조

테루더미스와 인테그라에 섬유아세포를 접종하고 14 일 후(생인공진피)(도 14), 혹은 테루더미스와 인테그라를 직접(인공진피) 누드마우스에 이식(도 15) 하고 28 일 후 접종된 생인공진피 혹은 인공진피를 헤마톡실린 & 에오신염색으로 살펴보았다(도 15, 16). 이식부위나 주변조직에서 염증반응의 징후는 보이지 않았고, 이식부위는 주변 조직과 잘 융합되어 있었고, 원래 크기의 상당부분이 그대로 유지되었다(도 16). 섬유아세포와 혈관의 유입이 이식부위 전반에서 골고루 발견되었고, 이식부위의 섬유아세포 혼잡도는 마우스 진피에서와 유사하였다(도 16). 이식부위의 높이 변화를 미세자(calibre)를 이용하여 측정하려 하였으나, 이식물의 높이가 측정가능범위 보다 작아, 조직 표본의 염색사진을 이용하여 높이를 측정하였다(도 16). 테루더미스와 인테그라 모두 이식 후 부피 감소가 일어났는데, 이는 콜라겐의 수축과 이식물의 분해에 의한 것으로 생각된다. 세포를 접종시킨 생인공진피가 인공진피보다, 그리고, 인테그라가 테루더미스보다 이식물의 부피 감소 폭이 작았다(표 4 참조).

표 4. 인공진피와 생인공진피의 이식 28 일 후의 높이변화

	이식부위의 높이¹	전체 높이²
	테루더미스	인테그라	테루더미스	인테그라
인공진피	0.5-0.6	0.6-0.7	1.4-1.5	1.5-1.9
생인공진피	0.7-0.9	0.8-0.9	1.5-2.1	1.7-2.1

1:진피 구조물의 원래 높이(1)에 대한 이식 28 일 후 진피 구조물 높이의 상대 값. 2:누드마우스의 근막으로부터 각질층까지의 높이(1)에 대한 이식 28 일 후 진피 구조물 높이의 상대 값.

한편, 본 발명에 의한 생인공피부나 생인공진피는 화상과 같이 상처 부위가 커서 또는 당뇨와 같이 상처 주변의 세포 이동이 어려운 경우에도 사용 가능하며, 성형 등 함몰된 조직 재생에도 바로 사용 가능한 생인공피부 또는 생인공진피를 얻을 수 있다.

Claims

피부조직 또는 내부 장기조직을 트립신 또는 트립신/EDTA 처리함과 동시에 자기교반하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 피부조직은 포피 또는 겨드랑이 또는 엉덩이 또는 유방 혹은 두피 혹은 각막 혹은 치골부 또는 음낭으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 내부 장기조직은 구강점막 혹은 식도 또는 위장점막또는 장점막 또는 비강 또는 인후 또는 기관지 또는 신장 또는 요도 또는 자궁 점막 또는 방광 혹은 신장 혹은 질에서 유래되는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트립신 처리하는 경우는 0.025% ~ 0.25%의 양으로 처리하고, 트립신/EDTA 처리하는 경우는 0.025% ~ 0.25%/0.005 ~ 0.02% 처리하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자기교반은 10분~4시간 동안 60~700rpm의 속도로 교반하는 것을 특징으로 하는 상피세포의 분리방법.
섬유아세포를 인공진피 구조물 또는 탈표피된 진피(DED)에 접종하는 것을 특징으로 하는 생인공진피의 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법으로 분리된 상피세포를 제 5 항의 방법으로 만들어진 생인공진피에 접종하거나, 인공진피 구조물 또는 탈표피된 진피(DED)에 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법으로 분리된 상피세포만 혹은 섬유아세포와 함께 접종하는 것을 특징으로 하는 생인공피부의 제조방법.
제 7 항의 방법으로 제조된 인공피부 구조물에 멜라닌세포를 함께 접종하여만들어진 인공피부 구조물을 제조하는 기술.
제 7 항이나 제 8 항의 방법으로 제조된 인공피부 구조물에 모낭세포 혹은 진피초(dermal sheath)를 함께 접종하여 만들어진 인공피부 구조물을 제조하는 기술.
제 7 항이나 제 8 항이나 제 9 항의 방법으로 제조된 인공피부 구조물에 혈관내피세포를 접종하여 만들어진 인공피부 구조물을 제조하거나 제 6 항의 방법으로 제조된 인공진피 구조물에 혈관내피세포를 접종하여 만들어진 인공진피 구조물을 제조하는 기술.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 방법으로 분리된 상피세포를 단독으로 혹은 섬유아세포와 함께 손상된 피부조직 또는 내부 장기조직에 이식하여 손상된 피부 또는 내부 장기를 치료하는 방법.
제 6 항의 방법으로 제조된 생인공진피 또는 제 7 항 또는 제 8 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항의 방법으로 제조된 생인공피부를 손상된 피부조직에 이식하여 치료 또는 제 7 항 또는 제 10 항의 방법으로 제조된 생인공피부를 손상된 내부 장기조직에 이식하여 손상된 내부 장기를 치료하는 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 내부 장기조직은 암절제 수술 후 혹은 방사성 치료 후 혹은 조직의 절제 후 조직의 복구나 재생을 필요로 하는 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 피부조직은 화상, 외상, 궤양 등으로 인한 피부 손상 부위 또는 피부 성형이나 외부 조직확대 또는 각막 이식을 위한 부위인 것을 특징으로 하는 방법.