JP5557084B2 - 組織再生方法 - Google Patents
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- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
再生医工学的な手法により生体組織を再生するためには、その組織由来の細胞、或いはその組織の細胞に分化し得る幹細胞が接着して増殖するための足場として、また、形成される生体組織の支持体としての多孔質材料が必要である。このような多孔質材料には、多孔質性や生体親和性や生体吸収性などの性質が要求され、従来、ポリL‐乳酸(PLLA)、ポリグリコール酸(PGA)や乳酸とグリコール酸の共重合体(PLGA)などの生体吸収性合成高分子と、コラーゲンやヒアルロン酸などの生体吸収性天然高分子で調製した多孔質材料がよく用いられている。これらの多孔質材料は細胞の機能制御と組織再生の促進に関して一応の効果が得られたが、生体内で細胞を取り込む細胞外マトリックスと同様の構造と機能を与えることは困難であった。これに対して、組織や臓器を脱細胞化して得られるマトリックスは生体内と同様な細胞外マトリックスを保っているので、再生医工学への応用が注目されている。しかしながら、脱細胞化マトリックスはほとんど、同種、或いは異種の動物からの組織が使われて、強い免疫拒絶反応が起こり、失敗した例が多く見られる。従って、細胞外マトリックスの特長を活かしながら、免疫拒絶反応を避けられる自家由来のマトリックス材料の開発が強く求められている。
発明者は、特許文献2に示すように、動物由来のコラーゲンなどの天然高分子と生体吸収性の合成高分子材料からなるメッシュ体とを一体化した足場材を提案している。
しかし、この種の足場材に対して、基材となる材料に対する免疫拒絶反応や炎症反応は避けられず、その使用には限界があった。
前記細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて、前記対象生体由来の細胞を培養して全自家の再生組織を再生する工程と、を有することを特徴とする。
7.架橋処理と脱細胞化の順序はどちらでもよい。すなわち、細胞を架橋処理した後に脱細胞化しても、脱細胞化した後に架橋処理してもよい。細胞外マトリックスのみで十分な保形性を有するのであれば、架橋処理を行わないのがより望ましい。
8.架橋処理の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。細胞外マトリックスを架橋処理する方法として、紫外線照射による光架橋や熱架橋などの物理的架橋法、ガス状或いは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法がある。細胞外マトリックスを壊さなければ、どの架橋処理方法でもよい。紫外線照射による架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、紫外線照射により架橋処理する。240nm〜280nmの紫外線で10分間から24時間照射するが、望ましいのは250nm〜260nmの紫外線で30分間から10時間照射する。熱架橋は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、0.01Torrから1Torrまでの減圧条件下で100℃から140度までの高温で48時間から96時間加熱することにより行う。溶液状或いはガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法の架橋化剤としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなグリシジルエーテル類や、ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン1、5−ジイソシアネート、4、4−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−4、4、4、−トリイソシアネートのようなイソシアネート類や、メタノールやエタノールのようなアルコール類、グルコン酸カルシウムなどが挙げられる。溶液状の架橋化剤での架橋処理は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを上記の架橋化剤の溶液に30分間から72時間まで浸漬することにより行う。架橋処理温度は4℃から37℃までである。望ましいのは4℃で1時間から48時間、室温で30分間から24時間架橋処理する。ガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法による架橋処理は、上記の架橋化剤をガス状にして用いることができる。脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、一定温度で一定濃度の架橋化剤水溶液で飽和した架橋化剤の蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。架橋温度は通常、20℃〜40℃に設定される。架橋時間は、1時間から12時間である。
なお、ガス状或いは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法では、架橋処理の最終段階で、グリシン水溶液などにより架橋化剤を失活させる必要がある。
12.生体組織再生に利用できる細胞外マトリックス多孔質足場材は再生する組織由来の細胞でもよいし、他の組織由来の細胞でもよいが、調製が容易で目的組織の再生に最も有効な細胞外マトリックス多孔質足場材が最も望ましい。
13.生体組織の再生に利用できる細胞として、胚性幹細胞、体性幹細胞と分化した体細胞がある。体性幹細胞には、間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、上皮由来幹細胞などがある。体細胞には、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮角化細胞、骨格筋細胞、羊膜細胞、角膜細胞、粘膜細胞などがある。再生組織由来の体細胞やその体細胞に分化し得る幹細胞を1種類以上用いる。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体(多孔質培養床)を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
<細胞の播種と培養>
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、DMEM血清培地で3.0×105cells/mLの間葉系幹細胞を調製した。
このDMEM血清培地は10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリンおよび50mg/Lアスコルビン酸、150mg/Lアスコルビン酸リン酸を含有する。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体(直径10.4mmの円盤状、多孔質培養床)に、200μLの3.0×105cells/mLの間葉系幹細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも200μLの3.0×105cells/mLの間葉系幹細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で5日間培養した。
<脱細胞>
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄した後、MilliQ水で3回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをMilliQ水に浸漬し、−80℃で4時間凍結した。凍結したサンプルを−80℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、MilliQ水で3回洗浄した。各回の洗浄時間は10分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを6回行った。その後、サンプルを25mMのアンモニア水に30分間浸漬しつづいて、MilliQ水で6回洗浄した。
<多孔質培養床の除去>
PLGAメッシュ体を除くために、サンプルを0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。取り出したサンプルを、MilliQ水で6回洗浄した。
PLGAメッシュ体を除いた後の残留物を−80℃で4時間凍結し、減圧条件下(7.7Pa)で24時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図1に示す。
電顕写真より、間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックスのみから構成されていて、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。
実施例1で継代培養した間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、DMEM無血清培地で1回洗浄した後、DMEM無血清培地で1.0×106cells/mLの間葉系幹細胞を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例1の間葉系幹細胞由来の細胞外マトリックス多孔質足場材に100μLの間葉系幹細胞を滴加し、細胞を播種した。その後、細胞を播種した多孔質足場材をポリプロピレンのチューブに移して、3mLの軟骨分化誘導用の培地を加え、4週間培養した。培地は2日ごとに交換した。軟骨分化誘導培地は血清を含まない、抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリンおよび50mg/Lアスコルビン酸、100nMデキサメタゾン、1%ITS+1、10ng/mLTGFβ3を含有するDMEMである。4週間培養後には、軟骨組織が再生されていた。
再生した組織をトルイジンブルー染色を行った結果の写真を示したものが図2である。丸みを帯びた細胞とトルイジンブルー染色性細胞外マトリックスが認められ、軟骨組織を再生したことが分かった。
得られた軟骨組織は、実施例5の線維芽細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原(MHC)を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体(多孔質培養床)を用いてヒト軟骨細胞を6日間培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
<細胞の播種と培養>
まず、Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を、10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリンおよび50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、5.0×105cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体(直径10.4mmの円盤状、多孔質培養床)に、200μLの5.0×105cells/mLの軟骨細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも200μLの5.0×105cells/mLの軟骨細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6日間培養した。
<脱細胞>
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄した後、MilliQ水で3回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをMilliQ水に浸漬し、−80℃で4時間凍結した。凍結したサンプルを−80℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、MilliQ水で3回洗浄した。各回の洗浄時間は10分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを6回行った。その後、サンプルを25mMのアンモニア水に30分間浸漬した。さらに、取り出したサンプルをMilliQ水で6回洗浄した。
<多孔質培養床の除去>
多孔質培養床であるPLGAメッシュ体を除去するために、サンプルを0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。その後、MilliQ水で6回洗浄した。
PLGAメッシュ体を除いた後の残留物を−80℃で4時間凍結し、減圧条件下(7.7Pa)で24時間凍結乾燥した。得られた軟骨細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、その構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図3に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来の細胞外マトリックスのみにより、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。
実施例1で継代培養した間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、DMEM無血清培地で1回洗浄した後、DMEM無血清培地懸濁させて1.0×106cells/mLの間葉系幹細胞液を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例3の細胞外マトリックス多孔質足場材に100μLの間葉系幹細胞を滴加し、細胞を播種した。その後、細胞を播種した多孔質材料をポリプロピレンのチューブに移して、3mLの軟骨分化誘導培地を加え、4週間培養した。培地は、2日ごとに交換した。軟骨分化誘導培地は血清を含まない、抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリンおよび50mg/Lアスコルビン酸、100nMデキサメタゾン、1%ITS+1、10ng/mLTGFβ3を含有するDMEMである。4週間培養後には、軟骨組織が再生された。
再生した組織のトルイジンブルー染色を行った結果の写真が図4である。丸みを帯びたとトルイジンブルー染色性細胞外マトリックスが認められ、軟骨組織が再生されたことが確認された。
実施例3の細胞を得た生体と、実施例4で用いた間葉系幹細胞を得た生体は同一生体であれば、得られた軟骨組織は、実施例3と4の細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原(MHC)を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体(多孔質培養床)を用いてヒト皮膚線維芽細胞を培養し、脱細胞処理を行い、この多孔質培養床であるPLGAメッシュ体を溶出し、線維細胞由来の細胞外マトリックスからなる多孔質足場材を作製した。詳細を以下に示す。
<細胞の播種と培養>
まず、クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚線維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。2回継代培養した皮膚線維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、5.0×105cells/mL線維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体(直径10.4mmの円盤状、多孔質培養床)に、200μLの5.0×105cells/mLの線維芽細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも200μLの5.0×105cells/mLの軟骨細胞を播種し、上記のDMEM血清培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6日間培養した。
<脱細胞>
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄した後、MilliQ水で3回洗浄した。洗浄したサンプルを凍結・解凍の繰り返しとアンモニア水を組み合わせた方法で脱細胞処理を行った。洗浄したサンプルをMilliQ水に浸漬し、−80℃で4時間凍結した。凍結したサンプルを−80℃のフリーザーから取り出し、室温で解凍し、MilliQ水で3回洗浄した。各回の洗浄時間は10分間であった。この凍結・解凍の繰り返しを6回行った。その後、サンプルを25mMのアンモニア水に30分間浸漬した。その後、取り出したサンプルをMilliQ水で6回洗浄した。
<多孔質培養床の除去>
多孔質培養床であるPLGAメッシュ体を除くために、サンプルを0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、サンプルとリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、MilliQ水で6回洗浄した。
PLGAメッシュ体を除いた後の残留物を−80℃で4時間凍結し、減圧条件下(7.7Pa)で24時間凍結乾燥した。得られた線維芽細胞由来材料の細胞外マトリックス多孔質体を白金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図5に示す。
電顕写真より、作製した線維芽細胞由来の細胞外マトリックスのみにより、前記多孔質培養床と同様な形状の多孔質足場材であることが分かった。
実施例5で継代培養した線維芽幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、106S(2%ウシ胎児血清を添加した)培地で2.5×105cells/mLの線維芽細胞の溶液を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した実施例5の線維芽由来の細胞外マトリックス多孔質足場材に100μLの線維芽細胞を滴加し、細胞を播種し、2週間培養した。3日間ごとに培地を交換した。
再生した組織のHE(ヘマトオキシリンとエオシン)染色を行った結果の写真が図6である。図より、一定の厚みをもつ真皮組織が再生されたことが分かった。
得られた真皮組織は、実施例5の線維芽細胞を得た生体又はこれと同様な組織適合性抗原(MHC)を有する生体に適用した場合は、免疫拒絶反応や炎症反応を生じる恐れをなくすものとなる。
Claims (1)
- 生体組織の再生方法であって、
多孔質培養床に対象生体由来の細胞を培養し、脱細胞化してから、前記多孔質培養床を溶出して細胞外マトリックス多孔質足場材を作成する工程と、
前記細胞外マトリックス多孔質足場材を用いて、前記対象生体由来の細胞を培養して全自家の再生組織を再生する工程と、を有することを特徴とする組織再生方法。
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