RU2654686C1 - Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы - Google Patents
Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2654686C1 RU2654686C1 RU2017120134A RU2017120134A RU2654686C1 RU 2654686 C1 RU2654686 C1 RU 2654686C1 RU 2017120134 A RU2017120134 A RU 2017120134A RU 2017120134 A RU2017120134 A RU 2017120134A RU 2654686 C1 RU2654686 C1 RU 2654686C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- diaphragm
- tissue
- functional
- engineering
- rat
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000013125 spirometry Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 5
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000021970 Abdominal wall defect Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000008808 ABL800 Flex Methods 0.000 description 1
- 241001057184 Axion Species 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical group OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020591 Hypercapnia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037020 contractile activity Effects 0.000 description 1
- 230000008828 contractile function Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000001619 diaphragma pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000018875 hypoxemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000009756 muscle regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 201000003144 pneumothorax Diseases 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Algebra (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Computational Mathematics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Educational Technology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для оценки функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы в эксперименте. Для этого используют диафрагму крысы, полученный матрикс которой рецеллюляризируют путем нанесения на него суспензии аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костномозгового происхождения. После подтверждения ин витро адгезии, жизнеспособности, пролиферации клеток и их способности к направленной дифференцировке полученную конструкцию ортотопически имплантируют крысе в место предварительно смоделированного дефекта диафрагмы. Через 21 день ин виво проводят функциональные исследования: спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, определение сократимости мышечной ткани. Проводят также патоморфологическое исследование эксплантированного графта. При выявлении показателей проведенного исследования, сравнимых с таковыми при функционировании нативной ткани диафрагмы, устанавливают функциональное соответствие и полноценное участие восстановленной диафрагмы в акте дыхания. Способ обеспечивает всесторонний анализ качества тканеинженерной конструкции диафрагмы. 1 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, торакальной хирургии, педиатрии для создания тканеинженерной конструкции в качестве трансплантата для замещения врожденных и/или приобретенных дефектов диафрагмы с восстановлением функционального состояния нативного органа. Тканевая инженерия является весьма перспективным направлением в репарации или замещении поврежденных органов и тканей и включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) и/или искусственных каркасов (носителей), а также оценку и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними. Для исключения развития реакции отторжения биологические каркасы подвергают децеллюляризации при условии сохранения исходной трехмерной структуры ткани и внеклеточного матрикса (ВКМ). В течение последних лет каркасы, полученные путем децеллюляризации успешно используют для замещения утраченных или поврежденных органов и тканей, в том числе, диафрагмы, сосудов и др. [Conconi М.Т. et al. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineering approach to abdominal wall-defect repair // Biomaterials. 2005. Vol. 26 (15). P. 2567-2574; Kannan R.Y. et al. The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of micro-vascular networks: a review //Biomaterials. 2005. Vol. 26 (14). P. 1857-1875; Quint C. et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108: 9214-9219]. В настоящее время большой интерес представляет попытка создания функционирующей скелетной мускулатуры, так как именно восстановление функции и отсутствие фибротического перерождения является основной проблемой регенерации мышцы. Тканевая инженерия мышечной ткани потенциально может быть использована для замещения крупных врожденных дефектов и восстановления функционального состояния органа благодаря использованию каркасов, поддерживающих миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток, способных полноценно выполнять нативные функции.
Диафрагма представляет собой мышечный орган, главными функциями которого является участие в акте дыхания с сокращением при вдохе и расслаблением на выдохе.
В литературе описано множество малоинвазивных хирургических методов для реконструкции врожденных и приобретенных дефектов диафрагмы у детей и взрослых. К сожалению, хирургические вмешательства с использованием естественных или искусственных лоскутов ткани сопряжены с риском повторного возникновения дефекта и высоким уровнем заболеваемости и смертности.
Известен способ создания трансплантата диафрагмы таза с матрицей-носителем [Гольдштейн Д.В. и др. Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения. Патент РФ №2330675. Опубл. 10.08.2008. Бюл. №22], который характеризуется исключительно восстановлением дефектов соединительной ткани, но при этом абсолютно не содержит мышечных клеток и неспособен, соответственно, осуществлять функциональную активность, связанную с сокращением, что является ключевым требованием для тканеинженерной конструкции при восстановлении мышечной диафрагмы, расположенной между грудной и брюшной полостями и участвующей в акте дыхания и других физиологических процессах.
Тканеинженерный подход, который предполагает использование биологических каркасов для замены или восстановления диафрагмальных дефектов, может избавить от необходимости использовать несоответствующие аутологичные замещающие ткани или имплантировать синтетические нежизнеспособные материалы. Применение таких конструкций позволило бы решать как этические, так и иммунологические проблемы трансплантологии. Неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру внеклеточного матрикса привела к необходимости использования децеллюляризированных естественных внеклеточных матриксов, полученных от доноров, либо матриксов, полученных из полимерных материалов, и полностью воспроизводящих структуру нативного органа. В настоящее время осуществляют попытки поиска клеток, способных дифференцироваться в мышечную ткань и выполнять сократительные функции. Результаты работы показали, что децеллюляризированный матрикс не является токсичным для клеток и способствует клеточной адгезии. Но вопрос о механизмах взаимодействия получаемых каркасов и клеток, способных сохранять не только жизнеспособность на децеллюляризированном матриксе, но и потенцию к дифференцировке в зрелую мышечную ткань, способную функционировать подобно нативной диафрагме, а также сроках появления функционирующих тканеинженерных конструкций в моделях ин витро и ин виво по-прежнему остается открытым. С учетом высокой смертности от врожденных и приобретенных дефектов диафрагмы, весьма актуальной является разработка способа создания тканеинженерной конструкции для протезирования и восстановления функциональных свойств нативного органа, особенно в педиатрической практике.
В частности, известен способ децеллюляризации диафрагмы [Conconi М.Т. et al. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineering approach to abdominal wall-defect repair // Biomaterials. 2005 Vol. 26 (15). P. 2567-2574]. Протокол включает в себя обработку биологического матрикса фосфатным буфером, очищенной водой, детергентами и ферментами: 4% раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой типа I в течение 93 часов. Контроль качества полученного каркаса определяют рутинными гистологическими методами. Основными недостатками данного способа являются:
1) длительность проведения децеллюляризации, повышающая риск бактериальной контаминации;
2) отсутствие комплексного подхода при оценке качества выполненной децеллюляризации, так как способ предусматривает контроль получаемого биоинженерного каркаса диафрагмы только по данным гистологического исследования, что влечет за собой повышенный риск послеоперационных осложнений, вплоть до летальности;
3) недостаточная «функциональность» получаемого трансплантата, так как указанная конструкция не способствует восстановлению функциональных свойств нативного органа (сокращения, участия в акте дыхания, поддержания оптимального физиологического газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, участия в качестве одного из ключевых элементов, формирующих и регулирующих внутрибрюшное давление), а может только механически замещать имеющийся дефект;
4) отсутствие регламентированного алгоритма создания и оценки качества получаемой тканеинженерной конструкции приводит к широкой вариабельности механических свойств трансплантата, что в свою очередь может приводить к рецидиву грыжевых выпячиваний и нарушению герметичности грудной полости, требуя повторных оперативных вмешательств, увеличивающих вероятность неблагоприятного исхода при лечении пациентов с дефектами диафрагмы.
Способ неэффективен из-за указанных выше недостатков, поэтому остается актуальной задачей разработка способа создания тканеинженерных конструкций, обеспечивающих восстановление функциональных качеств диафрагмы.
За ближайший аналог принят способ создания тканеинженерной конструкции диафрагмы [Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В. и др. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012, Том VII, №4, С. 20-27], заключающийся в щадящем способе получения качественного матрикса диафрагмы крыс при обработке нативной диафрагмы очищенной водой, детергентами и ферментами (4% раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой типа 1) при совмещении перфузии и ротации диафрагмы в биореакторе в течение 24 часов. Контроль качества тканеинженерных каркасов проводят путем проведения рутинных гистологических методов окраски, оценки сохранности адекватных биомеханических свойств, жизнеспособности клеток на каркасах [RU 2547799 С1, 10.04.2015].
Основными недостатками данного способа являются:
1) выполнение полученными тканеинженерными конструкциями только механического замещения дефекта, без восстановления функциональных свойств и физиологической целостности органа;
2) определение исключительно тканеспецифической функциональности, заключающейся в оценке проходимости сосудистого русла, но абсолютно без учета функциональных свойств целостной нативной диафрагмы, включая ее сокращение, участие в акте дыхания, способность поддержать оптимальный физиологический газовый состав крови и кислотно-щелочной баланс, а также участие в качестве одного из ключевых элементов в формировании и регуляции внутрибрюшного давления. Таким образом, способ отличается отсутствием функциональных качеств у получаемой тканеинженерной конструкции и неэффективен из-за указанных выше недостатков.
Задача: восстановление функциональных качеств диафрагмы путем создания тканеинженерной конструкции, обладающей функциональными свойствами целостной нативной диафрагмы, включая ее сокращение, участие в акте дыхания, способность поддержать оптимальный физиологический газовый состав крови и кислотно-щелочной баланс, а также участие в качестве одного из ключевых элементов в формировании и регуляции внутрибрюшного давления.
Сущностью предложенного изобретения является то, что после децеллюляризации матрикс последовательно: рецеллюляризируют путем нанесения на него суспензии аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных стволовых клеток (ММСК) костномозгового происхождения, ин витро подтверждают адгезию, жизнеспособность, пролиферацию и способность клеток к направленной дифференцировке на децеллюляризированном матриксе в динамике, после чего тканеинженерную конструкцию ортотопически имплантируют в место предварительно хирургически смоделированного дефекта, через 21 день ин виво проводят функциональные исследования: спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, патоморфологическое исследование эксплантированного графта и их соответствие должностным показателям, а также сократимость мышечной ткани оценивают как восстановление функционального состояния полученной тканеинженерной конструкции, полноценное участие диафрагмы в акте дыхания.
Технический результат способа обусловлен строгой последовательностью получения тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированной диафрагмы, заселенной аллогенными мультипотентными мезенхимными стромальными стволовыми клетками (ММСК) костномозгового происхождения с последующим ин витро подтверждением адгезии, жизнеспособности, пролиферации и дифференцировочного потенциала клеток на децеллюляризированном матриксе в динамике, способной как протезировать анатомический дефект органа, так и восстанавливать его функциональную активность и сократительную способность. Другие использовавшиеся протоколы способствовали созданию конструкций, обеспечивающих лишь механическое замещение дефекта, предлагаемые ранее тканеинженерные конструкции не обеспечивали полноценного участия в актах сокращения и расслабления диафрагмы при дыхании. Также, важным в способе создания тканеинженерной конструкции, в отличие от ближайшего аналога, был выбор наиболее безопасных и приближенных к клиническому использованию клеток, таких как ММСК костномозгового происхождения, которые не только способствуют рецеллюляризации каркаса, но и в предлагаемом способе создают микроокружение, позволяющее привлекать собственные клетки реципиента для более полноценной интеграции тканеинженерного имплантата. После проведения ортотопической трансплантации тканеинженерную конструкцию тщательно проверяют на способность поддерживать функциональную активность, контрактильные свойства, поддержание барьера между грудной и брюшной полостями без выпячиваний, эвентрации, оценивают степень дыхательной недостаточности, а также изменения в газовом составе крови (с целью исключения гиперкапнии и гипоксемии). Еще одним из важнейших особенностей способа является всесторонний патоморфологический анализ эксплантата на степень фиброза, направленности дифференцировки клеток, неоангиогенеза, иннервации, мезотелизации. Технический результат, получаемый от использования данного способа, обеспечен только за счет соблюдения именно такой последовательности приемов.
Способ восстановления целостности и функционального состояния диафрагмы с использованием тканеинженерной конструкции осуществляют следующим образом, в строгой последовательности с разработанным алгоритмом. Для децеллюляризации диафрагмы используют предварительно гепаринизированных крыс (интраперитонеально вводят 100 ЕД гепарина). Диафрагму очищают от жира и промывают стерильным раствором фосфатного буфера. При децеллюляризации диафрагмы применяют ротационный метод с обработкой очищенной водой, стерильными растворами дезоксихолата натрия 4%, фосфатного буфера, свиной панкреатической ДНКазы I, ЭДТА. Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами рутинного гистологического исследования, иммуногистохимического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии для подтверждения сохранности архитектоники и компонентов внеклеточного матрикса диафрагмы и отсутствия клеточных элементов на децеллюляризированном матриксе, путем определения предельных биомеханических параметров на одноосное растяжение и циклические испытания на двухосное нагружение с целью обеспечения соответствия биомеханических свойств матрикса нативной ткани. Оценку иммуногенности полученного каркаса проводят с использованием количественного анализа ДНК в децеллюляризированных матриксах, иммуногистохимического исследования на определение компонентов главного комплекса гистосовместимости (MHCI и МНСII класса) по стандартным протоколам, проведением гетеротопических трансплантаций (подкожные тесты) и последующей патоморфологической оценкой эксплантата. Для определения токсичности каркасов и их адгезионных свойств проводят статичное засеивание децеллюляризированных образцов аллогенными ММСК костномозгового происхождения: ММСК культивируют до 3-4 пассажа и используют для засеивания полученных децеллюляризированных матриксов. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют путем колориметрического анализа с использованием ХТТ-реагента в целях установления биосовместимости полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации (Cell proliferation assay ХТТ, AphliChem GmbH, Германия). Также оценивают способность клеток к спонтанной дифференцировки после 3-недельного культивирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистохимическим окрашиванием с использованием специфических антител. Рецеллюляризированные матриксы диафрагмы ортотопически трансплантируют крысам с замещением предварительно хирургически смоделированного дефекта около 80% левого купола диафрагмы. Группой сравнения являются ложнооперированные животные, которым дефект замещают нативной тканью. Через 21 день животным проводят функциональные исследования, включающие в себя спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, изучение газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, а также проводят патоморфологическoе исследование эксплантированного графта. Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (диафрагмы) экспериментальных животных (крысах). Результаты полностью подтверждают решаемые задачи. Получены естественные матриксы органов, с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур, проведена рецеллюляризация, аллогенными ММСК, получена тканеинженерная конструкция, ортотопически имплантированная животным для замещения 80% левого купола. Для создания полноценно функционирующей диафрагмальной мышцы принципиально важным является восстановление не только барьерной функции между грудной и брюшной полостью (адекватная биомеханика тканеинженерной конструкции, отсутствие пневмоторакса, нормальное расположение оси сердца, отсутствие выпячиваний и инвентраций), что обнаружено при проведении компьютерной томографии и рентгенологического исследования, но и принципиально важным является восстановление контрактильных свойств, необходимых для осуществления активного дыхания. Появление мышечных сокращений, сопоставимых с нативной тканью в трансплантате через 21 день после операции, является ключевым результатом предлагаемого способа. При этом в нашем исследовании подчеркивается различие между восстановлением функции в моделях ин витро и ин виво. Под действием естественного микроокружения быстрее происходят процессы регенерации, что способствует адекватному восстановлению функции. Диафрагма должна быть покрыта мезотелием, что обнаружено при проведении биотинового теста. Кроме того, тканеинженерная конструкция должна способствовать сохранности целостности компонентов дыхательной системы, не вызывать развитие дыхательной недостаточности и респираторной и гемодинамической гипоксии. При сравнении спирометрии крысы после ортотопической трансплантации видно, что через 21 день показатели дыхания, отраженные в петле частота-объем статистически не отличаются от интактных (неоперированных) животных.
Пример: диафрагма эксплантирована у крыс-самцов линии Lewis весом 250±20 грамм после предварительного введения летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1972 г.), «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986). Сначала диафрагму фиксировали в биореакторе, после чего начали проведение децеллюляризации: в течение 24 часов проводили последовательную обработку децеллюляризирующими растворами: фосфатным буфером, 4% водным раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой I, очищенной водой, с равной продолжительностью воздействия, что являлось важным для осуществления следующего этапа предлагаемого способа. Далее контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляли методами рутинного гистологического исследования (окрашивание гематоксилин-эозином, по Массону, окрашивание по Ван Гизону); путем биомеханических испытаний при моделировании физиологических условий; определяли способность каркаса вызывать иммунологическое отторжение путем проведения гетеротопических трансплантаций (подкожные тесты) с последующей патоморфологической оценкой степени воспалительной реакции, что является облигатным условием перед проведением следующего этапа рецеллюляризации. Установлено, что в результате экспериментов по децеллюляризации получен каркас диафрагмы с сохранением гистологической архитектоники и белков внеклеточного матрикса, который продемонстрировал биосовместимость и нетоксичность по отношению к клеткам, которыми он был засеян. Рецеллюляризацию децеллюляризированного матрикса проводили с использованием аллогенных ММСК, полученных из костного мозга крыс-доноров и культивированных до 3-4 пассажа. После проведения ин витро тестирования и контроля адгезии, жизнеспособности, пролиферации и способности клеток к направленной дифференцировке, рецеллюляризированный матрикс ортотопически трансплантировали крысе-реципиенту линии Lewis весом 250±20 грамм с хирургически моделированным дефектом левого купола диафрагмы. Далее, через 21 день, выполняли комплексный функциональный контроль ин виво:
- спирометрию - выполнялась на оборудовании Spirometer Power Lab 8/35 (ADInstruments, Австралия),
- электромиографию - выполнялась на оборудовании NeuroBioLab (NeuroBioLab LTD, DL312АМ-401, Россия),
- рентгенологическое исследование - проводилось во фронтальной проекции на оборудовании Axion Icon R200 (Германия),
- компьютерную томографию - выполнялась в положении лежа на конусно-лучевом томографе Rayscan Symphony V (Samsung Electronics, Южная Корея),
- регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса - проводили на оборудовании Radiometer ABL800 Flex (Radiometer Medical ApS, Дания),
- патоморфологическое исследование эксплантированного графта. Таким образом, на основании совокупности выполненных в строгой последовательности действий по созданию тканеинженерной конструкции и комплексной оценки качества полученного трансплантата удалось достичь положительного (эффективного технического) результата, как в механическом восстановлении целостности диафрагмы данного животного с хирургически моделированным дефектом ее левого купола, так и функциональном соответствии сократительной и дыхательной активности восстановленного органа нативной ткани диафрагмы.
Claims (1)
- Способ оценки функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы в эксперименте, отличающийся тем, что используют диафрагму крысы, полученный матрикс которой рецеллюляризируют путем нанесения на него суспензии аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костномозгового происхождения и, после подтверждения ин витро их адгезии, жизнеспособности, пролиферации, способности к направленной дифференцировке, ортотопически имплантируют крысе в место предварительно смоделированного дефекта диафрагмы, при этом через 21 день ин виво проводят функциональные исследования: спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, определение сократимости мышечной ткани, а также патоморфологическое исследование эксплантированного графта, и при выявлении показателей проведенного исследования, сравнимых с таковыми при функционировании нативной ткани диафрагмы, устанавливают функциональное соответствие и полноценное участие восстановленной диафрагмы в акте дыхания.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017120134A RU2654686C1 (ru) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017120134A RU2654686C1 (ru) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2654686C1 true RU2654686C1 (ru) | 2018-05-21 |
Family
ID=62202353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017120134A RU2654686C1 (ru) | 2017-06-07 | 2017-06-07 | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2654686C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2730924C1 (ru) * | 2019-12-17 | 2020-08-26 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеч | Способ оценки жизнеспособности тканеинженерной конструкции при закрытии критического дефекта трахеи на модели экспериментального животного |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2330675C2 (ru) * | 2006-07-28 | 2008-08-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения |
| JP5557084B2 (ja) * | 2009-03-17 | 2014-07-23 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | 組織再生方法 |
| RU2547799C1 (ru) * | 2013-12-24 | 2015-04-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Росийской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России) | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы |
| RU2550286C1 (ru) * | 2014-06-03 | 2015-05-10 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ, Минздрава России) | Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе |
| US9220810B2 (en) * | 2010-12-10 | 2015-12-29 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Mesenchymal stem cells (MSC) expansion methods and materials |
-
2017
- 2017-06-07 RU RU2017120134A patent/RU2654686C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2330675C2 (ru) * | 2006-07-28 | 2008-08-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения |
| JP5557084B2 (ja) * | 2009-03-17 | 2014-07-23 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | 組織再生方法 |
| US9220810B2 (en) * | 2010-12-10 | 2015-12-29 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Mesenchymal stem cells (MSC) expansion methods and materials |
| RU2547799C1 (ru) * | 2013-12-24 | 2015-04-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Росийской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России) | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы |
| RU2550286C1 (ru) * | 2014-06-03 | 2015-05-10 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ, Минздрава России) | Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KANNAN R.Y. et al. The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of micro-vascular networks: A review. Biomaterials. 2005; 26 (14): 1857-1875. * |
| MARIA Т. et al. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineered approach to abdominal wall-defect repair. Biomaterials 2005; 26:2567-2574. * |
| ГУБАРЕВА Е.А. и др. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012, Том VII, N 4. * |
| ГУБАРЕВА Е.А. и др. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012, Том VII, N 4. KANNAN R.Y. et al. The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of micro-vascular networks: A review. Biomaterials. 2005; 26 (14): 1857-1875. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2730924C1 (ru) * | 2019-12-17 | 2020-08-26 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеч | Способ оценки жизнеспособности тканеинженерной конструкции при закрытии критического дефекта трахеи на модели экспериментального животного |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7286708B2 (ja) | 臓器および組織の脱細胞化および再細胞化 | |
| JP6609595B2 (ja) | 肺臓の組織工学 | |
| ES2540242T3 (es) | Estructura tridimensional de tejido | |
| Gubareva et al. | Orthotopic transplantation of a tissue engineered diaphragm in rats | |
| JP2022107023A (ja) | 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法 | |
| EP1803472B1 (en) | Biomaterial for suture | |
| Zhao et al. | The role of tissue engineering and biomaterials in cardiac regenerative medicine | |
| CN108699522A (zh) | 血管细胞外基质水凝胶 | |
| Zhou et al. | Development of decellularized aortic valvular conduit coated by heparin–SDF-1α multilayer | |
| CN113660962A (zh) | 一种用于类器官生物移植的组合物 | |
| Inglis et al. | Harnessing human decellularized blood vessel matrices and cellular construct implants to promote bone healing in an ex vivo organotypic bone defect model | |
| RU2654686C1 (ru) | Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы | |
| RU2550286C1 (ru) | Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе | |
| US20160339149A1 (en) | Method of producing cross-linked polyvinylalcohol-extracelluar matrix composite and polyvinylalcohol-extracelluar matrix composite produced thereby | |
| Movileanu et al. | Preclinical testing of living tissue-engineered heart valves for pediatric patients, challenges and opportunities | |
| Iyer et al. | Allogeneic decellularized muscle scaffold is less fibrogenic and inflammatory than acellular dermal matrices in a rat model of skeletal muscle regeneration | |
| JP2005278711A (ja) | ハニカムフィルムを用いた機能的人工組織の生産 | |
| Fahrenholtz et al. | Development of a heart valve model surface for optimization of surface modifications | |
| RU2547799C1 (ru) | Способ создания биоинженерного каркаса легкого крысы | |
| Boehm et al. | Tissue Engineering for the Diaphragm and its Various Therapeutic Possibilities–A Systematic Review | |
| Conconi et al. | Biological fate of tissue-engineered porcine valvular conduits xenotransplanted in the sheep thoracic aorta | |
| Ikada | Global Design for Clinical Trials | |
| JP2003180819A (ja) | 移植用材料及び細胞保持担体 | |
| Compton | Regeneration of the Ventricular Endocardium Within Acellular Whole Rabbit Hearts Using a Layer-by-Layer Seeding Method | |
| Schuldt | Regenerating the Mammalian Heart: Potential Roles for Cardiomyocyte Proliferation, Cardiac Stem Cells, and Fibroblasts |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190608 |