CN113660962A - 一种用于类器官生物移植的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含类器官的用于生物移植的组合物及其用途。根据一个实施例，胶原、明胶和/或纤维蛋白胶作为类器官移植的支架的使用，获得了高移植率、高成活率高和所需要的稳定性。

Description

一种用于类器官生物移植的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于类器官移植的组合物及其用途。

背景技术

类器官被认为是基本的实验模型、可植入组织的来源以及用于药物筛选的生理相关平台。与永生化细胞的培养不同，例如，肠道类器官包含位于隐窝样叶中的活干细胞，经过不断的再生和分化循环以产生多种功能细胞类型，并重复肠道发育和体内平衡的关键方面。

上皮类器官可以由人类结肠、腺瘤和腺癌组织形成，并通过个性化医疗、患者来源的隐窝或体外培养，并为使用干细胞培养和体外增殖进行自体移植开辟了可能性。尽管原始组织的组织学准确性无与伦比，但来自胃肠道(GI道)的干细胞衍生类器官有几个限制，其中一个主要限制是依赖基质胶作为3D支架。

基质胶是一种广泛使用的商业产品，可为所有细胞类型的类器官的生长提供3D支架。它用于培养肠、视网膜、肾、肝、胃、前列腺、乳房、内耳、心肌纤维、肝内皮、胰腺、输卵管和脑类器官。它还用于从包括鸡、大鼠和人类在内的各种物种中培育类器官。然而，依赖基质胶或类似的天然衍生生物聚合物基质作为类器官生长的支架，对由此产生的类器官的研究和使用造成了一些重大限制。基质胶来源于富含ECM的小鼠肉瘤的基底膜，因此当给予患者时，具有传播免疫原或病原体的高风险，特别是在与免疫抑制后感染相关的严重患者死亡和发病领域中的问题，并且众所周知其促进血管生成和癌症发展。

此外，基质胶的批次间差异会导致细胞行为不一致，从而引入未知和潜在的混杂变量，使基础研究和转化研究的解释复杂化。此外，虽然基质胶是当前类器官培养模型的关键要素，但其在类器官形成中的作用尚未阐明。

因此，需要开发一种足以在类器官领域替代基质胶并且适合于体内移植的用于人体注射的支架。

发明内容

技术问题

本发明的一个方面是提供一种用于生物移植的组合物，其包含类器官；以及明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合。

本发明的另一方面是提供一种用于类器官移植的方法，该方法包括将明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合与类器官混合的步骤，以及将混合物施用于受试者的步骤。

技术方案

本发明的一个方面提供了一种用于生物移植的组合物，其包含类器官；以及明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合。

效果

根据本发明的一方面，当胶原、明胶或纤维蛋白胶用作类器官移植的支架时，类器官的移植率和存活率高，稳定性也优异。

附图说明

图1是对每个支架在移植结肠类器官后第7天测量从移植到结肠组织的类器官发出的GFP信号的照片。

图2是显示在移植结肠类器官后第7天移植到结肠组织的类器官的面积的图。

图3是结肠类器官移植后第7天结肠组织切片观察结果的照片。

图4是结肠类器官移植后第7天移植类器官的结肠形态照片。

图5是表示在移植结肠类器官后第7天计算移植类器官的结肠的重量/长度的结果图。

图6是结肠类器官移植后形成次级类器官后GFP信号的确认结果的照片。

图7是表示在结肠类器官移植后形成次级类器官后测定表达GFP的类器官的数量而测定与移植面积的相关性的结果图。

图8a是为EDTA诱导的急性结肠损伤模型制作过程示意图。

图8b是说明根据一个实施例的类器官移植过程的示意图。

图8c是示出根据一个实施例的类器官移植后的组织分析结果的结果。

具体实施方式

本发明的另一方面提供了一种细胞治疗产品，该产品包含类器官；以及明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合。

如本文所用，术语“类器官”是指具有3D三维结构的细胞团，是指通过人工培养过程制备的器官的微型化和简化版本，不是从动物采集或获得的。构成类器官的细胞的来源不受限制。类器官可以来源于组织、干细胞，例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞，并且可以从其自我更新和分化能力进行三维培养。类器官可能具有在细胞生长过程中允许与周围环境相互作用的环境。因此，本发明中的3D类器官几乎完全模拟了体内相互作用的器官，可以成为观察疾病治疗剂发展的极好模型。它可以类似地复制人体的生理活动功能，通过从患者的组织中构建器官类似物，可以根据患者的遗传信息进行疾病建模，并通过重复测试进行药物筛选。对于该功能，要求移植到活体时具有优异的移植率、移植效率、存活率和稳定性。本文所用术语“明胶”是指通过分解和纯化动物皮肤、软骨、肌腱等中的天然蛋白质而获得的一种蛋白质。

本文所用的术语“胶原蛋白”是指在人体内分布最广的蛋白质，虽然它是结缔组织的主要成分，主要存在于骨骼和皮肤中，但它是分布在我们身体各处的成分，例如关节、每个器官的膜和头发。硬蛋白也可称为“胶原蛋白”。

本文所用的术语“纤维蛋白胶”是指由纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙和抗纤溶酶抑制剂组成的组织粘合剂，用于缝合周围神经、缝合微血管、颅神经手术、骨科手术如骨粘连和撕裂伤患者的止血。当组织受伤时，它是指通过从切口周围的毛细血管中泄漏纤维蛋白原和血液成分而形成纤维蛋白的物质。

明胶、胶原蛋白和纤维蛋白胶在体内均具有优异的生物相容性和稳定性。

如本文所用，术语“生物移植”或“生物植入”是指将用于生物移植的组合物施用于受试者并在植入部位沉降的现象。

对于生物移植，要求移植部位不受影响，并具有较高的成活率和移植率。

类器官不限于此，只要它是可以使用明胶、胶原、纤维蛋白胶或其组合作为支架植入的类器官。具体地，类器官可以选自由肠类器官、视网膜类器官、肾类器官、肝类器官、胃类器官、前列腺类器官、乳腺类器官、内耳类器官、心肌纤维类器官、肝内皮类器官、胰腺类器官、输卵管类器官和脑类器官组成的组。

基于组合物的总重量，其中明胶的含量可为约2.5-10％(w/v)。如果明胶含量超过10％(w/v)，由于明胶的内毒性，移植的类器官可能会发生细胞毒性。

基于组合物的总重量，其中胶原蛋白的含量可以为约10-20％(v/v)。

基于组合物的总重量，其中纤维蛋白胶的含量可以为约10-15％(v/v)。

如果纤维蛋白胶超过15％(v/v)，则组合物可能会过快硬化，并且类器官的移植率可能会降低。

明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶可以通过购买市售的、分离天然存在的或合成它们来使用。

该组合物还可包含移植和培养类器官时通常可包含的材料。

在该组合物中，类器官、明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶可以是附着在用于移植的医疗装置上的形式。医疗装置可以选自由例如但不限于支架、别针、缝线、裂口、起搏器、人造皮肤和杆组成的组。

根据本发明的一个实施方案的组合物可以包括药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，无菌水、生理盐水、常规缓冲液(磷酸、柠檬酸、其他有机酸等)、稳定剂、盐类、抗氧化剂(抗坏血酸等)、表面活性剂、悬浮剂、等渗剂或防腐剂等。对于局部给药，也可以结合有机材料如生物聚合物、无机材料如羟基磷灰石，特别是胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等用于局部给药。

本文所用术语“细胞治疗产品”或“细胞治疗剂”是指通过对人体细胞和组织进行分离、培养和特殊操作而制成的药物，用于通过一系列作用进行治疗、诊断和预防，例如在体外增殖和选择同种异体或异种细胞，或以其他方式改变细胞的生物学特性。

根据本发明的一方面，细胞治疗剂可用于治疗粘膜本身丧失的病症，例如炎症性肠病或粘膜损伤。

本发明的另一方面提供了一种用于类器官移植的方法，包括将明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或其组合与类器官混合的步骤，并且将混合物施用于受试者的步骤。

明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶和类器官如上所述。

受试者可以是需要通过移植类器官形成的受试者。

受试者包括人和哺乳动物，具体包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、牛、狗、马、猪。

如本文所用，术语“施用”、“引入”和“移植”可互换使用，并且根据本发明的一个实施方案，可以指导致组合物至少部分定位到期望部位或将组合物按照途径放置到受试者体内的方法。给药可以通过任何合适的途径将根据一个实施方案的组合物的细胞或细胞组分的至少一部分递送至活体受试者的期望部位。

在上述方法中，可以对需要移植类器官的病变部位进行给药。内窥镜设备可用于给药，但不限于此。例如，使用内窥镜对食道、胃、十二指肠、大肠或结肠给药是典型的，此外，通过外科手术对身体的所有器官进行给药，如唾液腺、泪腺、肌肉、肺、肝脏、胰腺、肾脏、子宫、前列腺等均可给药。例如，当黏膜本身丢失，如炎症性肠病或黏膜损伤时，可以通过移植类器官来替代受损的黏膜。

该方法使用胶原蛋白、明胶或纤维蛋白胶作为类器官移植的支架，从而表现出与常规使用的基质胶相似的移植稳定性和移植效率，并且在临床上也可安全使用。

如上所述，类器官即使在体外也可以分化为具有成人特征的类器官，最重要的是，由于它们利用的是患者自身的成体细胞，因此不存在如免疫原性等技术问题和伦理问题，这些问题成为未来用作组织疗法的障碍。

实施例

在下文中，将通过示例更详细地描述。然而，这些实施例是为了说明一个或多个实施例，本发明的范围不限于这些实施例。

参考实施例1.结肠类器官的制备与培养

从EGFP小鼠中分离结肠组织，使用酶分离结肠隐窝，基质胶和结肠类器官培养基以1:1的比例混合，接种到未包被的48孔板中。将其置于培养箱中，20分钟后，确认基质胶已硬化。然后，添加结肠类器官培养基并培养5天以制备用于生物移植的结肠类器官以供下文使用。

实施例1.用于生物移植的类器官的制备和移植

1.1.结肠组织损伤模型构建

产生类器官的结肠组织损伤模型制备如下。将要移植结肠类器官的野生型小鼠暴露于0.5M EDTA 5分钟，并用电动牙刷施加物理损伤以去除结肠内壁的隐窝2分钟。

1.2.用于生物移植的类器官的制备和移植

制备结肠类器官以使上述制备的结肠类器官表达GFP。所有结肠类器官在移植前一天用类器官培养基中的10μM Y-27632处理，以最大限度地提高存活率。此外，培养过程中使用的基质通过用细胞回收溶液处理而完全去除。

此后，将以下三种支架在下述条件下混合并以50μl的体积移植到1.1中制备的结肠组织损伤小鼠模型的肛门中。

1)明胶：将GFP+结肠类器官与5％明胶在PBS中混合，溶解在明胶：类器官＝1:2比例的培养基中并移植。此时，含有类器官的培养基中含有10μM的Y-27632。

2)胶原：将GFP+结肠类器官混合在100％胶原原液中，溶解于胶原：类器官＝1：9比例的培养基中并移植。此时，含有类器官的培养基中含有10μM的Y-27632。

3)纤维蛋白胶：将GFP+结肠类器官与45μl含有10μM Y-27632的结肠样培养基混合制备结肠样溶液，将纤维蛋白以1:1的比例混合在凝血酶在PBS中以1:100稀释的溶液中，总共制备5μl溶液。然后，将5μl溶液与制备的45μl结肠样溶液混合并移植。

基质胶用作对照组。

基质胶通过将其混合在含有10％浓度的类器官的结肠样培养基中进行移植。此时，含有类器官的培养基中含有10μM的Y-27632。

移植后，用10μl 3M Vetbond封闭肛门，14小时后松开缝线，诱导正常肠道活动。

实施例2.类器官移植率评价

为了根据实施例1中移植的结肠类器官的支架评价移植率，其进行如下。

在结肠类器官移植后的第7天，对结肠组织进行尸检以测量从移植的类器官中释放的GFP信号。具体而言，将植入类器官的结肠组织垂直切开以形成平面结构，并将该组织薄薄地铺在载玻片上并在其上盖上玻璃盖。这时，地穴向下。将制备好的载玻片置于荧光显微镜载物台上，观察GFP荧光表达区域。

图1是测量每个支架在结肠类器官移植后第7天从移植到结肠组织的类器官发出的GFP信号的照片。

图2是结肠类器官移植后第7天移植到结肠组织中的类器官面积图。

如图1和2所示，在没有支架的情况下，GFP信号最弱，移植率低。另一方面，证实了当使用明胶、胶原蛋白和纤维蛋白胶作为支架时，移植率和移植面积与使用阳性对照基质胶作为支架时的移植率和移植面积相似。

因此，当明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶用作类器官移植的支架时，类器官的移植率显著提高。

实施例3.类器官存活率和植入率的评估

为了根据实施例1中移植的结肠类器官的支架评价存活率和植入率，其进行如下。

每个支架实验组使用10-13只动物，并且在将GFP类器官移植到结肠后1周进行组织尸检。通过将结肠中表达GFP的动物分类为植入成功的动物，将没有GFP表达的动物分类为植入失败的动物，计算移植动物的数量占动物总数的百分比，从而计算最终的植入率。并通过计算移植后7天内死亡的动物计算最终存活率。

结果如表1所示。

表1

如表1所示，当使用明胶、胶原蛋白和纤维蛋白胶作为支架时，成活率分别为76.92％、100％和90％，植入率分别高达69.23％、90％和90％。因此，证实成活率和植入率优异性。这与使用基质胶(阳性对照)的情况相似。图3是结肠类器官移植后第7天结肠组织切片的观察结果照片。

如图3所示，当明胶、胶原蛋白和纤维蛋白胶用作支架时，证实了类器官成功沉降形成结肠隐窝。

实施例4.稳定性评估

为了评价实施例1中移植的结肠类器官的稳定性，在移植后第7天进行尸检，并检查尸检组织的形状和病变的发生。

图4是显示在结肠类器官移植后第7天移植类器官的结肠形状的照片。

如图4所示，当使用明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶作为支架时，在尸检组织中未观察到移植类器官的结肠可能出现的水肿或血便。

图5是表示在结肠类器官移植后第7天计算移植了类器官的结肠的重量/长度的结果的图。

如图5所示，通过计算移植类器官的结肠的重量/长度来检查炎症发生时可能出现的水肿体积。结果，与使用基质胶的对照组相比，没有显着差异。

因此，证实了当使用明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶作为支架移植类器官时，稳定性非常好。

实施例5.对来自移植组织的正常类器官形成的评估

为了评价是否由实施例1中移植的结肠类器官形成正常类器官，由移植的结肠组织形成第二结肠类器官(次级类器官)。

具体来说，用荧光显微镜检查移植的结肠组织的GFP后，用手术剪剪断，放入含有隐窝螯合缓冲液的试管中，在37℃的振荡培养箱中反应20分钟。然后，将其放入装有18号针头的10ml注射器中，通过研磨20次分离隐窝。将分离的隐窝离心、收集、通过70μm过滤器过滤，与添加了Y-27632的培养基和基质胶以1:1的比例混合，并以20μl/孔的浓度接种于48孔板中。将基质胶放入37℃的培养箱中使其硬化30分钟后，加入补充有Y-27632的培养基并培养5天。在培养的第5天，对表达GFP的结肠类器官进行追踪。

图6是结肠类器官移植后形成次级类器官后GFP信号的确认结果照片。

如图6所示，当使用明胶、胶原蛋白或纤维蛋白胶作为支架时，可以有效地形成表达GFP的次级类器官。这被证实与使用基质胶的阳性对照处于相似的水平。

图7是示出通过测量结肠类器官移植后形成次级类器官后表达GFP的类器官的数量来测量与植入面积的相关性的结果图。

如图7所示，证实了次级类器官的数量和面积按比例增加。

因此，这表明明胶、胶原蛋白和纤维蛋白胶不会显着影响正常的类器官形成。

根据本发明的一个方面，当胶原、明胶或纤维蛋白胶用作类器官移植支架时，类器官的移植率和存活率高，稳定性也很好，因此包含它们的组合物可用于体内生物移植。

Claims (6)

1.一种用于生物移植的组合物，其特征在于，所述组合物包括类器官；以及明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合。

2.根据权利要求1所述的用于生物移植的组合物，其中，所述类器官选自由肠类器官、视网膜类器官、肾类器官、肝类器官、胃类器官、前列腺类器官、乳腺类器官、内耳类器官、心肌纤维类器官、肝内皮类器官、胰腺类器官、输卵管类器官和脑类器官组成的组。

3.根据权利要求1所述的用于生物移植的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所述明胶的含量为2.5-10％(w/v)。

4.根据权利要求1所述的用于生物移植的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所述胶原蛋白的含量为10-20％(w/v)。

5.根据权利要求1所述的用于生物移植的组合物，其中，基于组合物的总重量，所述纤维蛋白胶的含量为10-15％(w/v)。

6.一种移植类器官的方法，其特征在于，所述方法包括将明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶或它们的组合与类器官混合，并将混合物施用于受试者。

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